Summary
Questo protocollo descrive l'uso di una strategia di scambio tampone microfluidica basata inerziale per purificare cellule ingegnerizzate micro / nanoparticelle con efficiente esaurimento delle particelle non legate.
Abstract
cellule Engineering con micro-ingrediente attivo-caricato / nanoparticelle (NP) sta diventando un metodo sempre più popolare per migliorare le proprietà terapeutiche nativi, abilitare l'imaging bio e controllare il fenotipo delle cellule. Un problema critico ancora affrontato in modo inadeguato è il numero di particelle che rimangono non legato dopo l'etichettatura delle cellule che non può essere facilmente rimosso per centrifugazione convenzionale. Questo porta ad un aumento della bio rumore delle immagini di sfondo e può impartire effetti trasformativi sulle cellule non bersaglio adiacenti. In questo protocollo, presentiamo una strategia inerziale microfluidica a base di buffer di scambio definito come Dean flusso Frazionamento (DFF) per separare in modo efficiente cellule marcate da NP liberi in un modo elevato throughput. Il Microdevice spirale sviluppato facilita raccolta continua (> il recupero delle cellule del 90%) delle cellule purificate (THP-1 e MSC) sospese in nuova soluzione tampone, oltre a raggiungere> 95% esaurimento di colorante fluorescente non legato o NP dye-caricato (silica o PLGA). Questo single-step, la strategia di purificazione delle cellule size-based permette un throughput di elaborazione ad alta cella (10 6 cellule / min) ed è molto utile per la purificazione delle cellule di grandi volumi di micro / cellule nanoparticelle progettato per realizzare applicazioni cliniche senza interferenze.
Introduction
Ingegneria delle cellule da agenti caricato micro / nanoparticelle (NP) è un metodo di integrazione libera e versatile semplice, genomica per migliorare la capacità bioimmagini e aumentare / integrare le sue proprietà terapeutiche nativi nella medicina rigenerativa. 1-3 modificazioni cellulari si ottengono l'etichettatura del membrana plasmatica o nel citoplasma con un eccesso di concentrazione di NP agente-caricato di saturare i siti di legame. Tuttavia, un grave inconveniente di questo metodo è la quantità significative di particelle non legate rimangono in soluzione dopo i processi di etichettatura delle cellule, che possono potenzialmente confondere precisa identificazione delle cellule di particelle-ingegnerizzato o complicare risultati terapeutici. 4,5 Inoltre, l'esposizione a NP contenenti trasformativa agenti (fattori di crescita, corticosteroidi, ecc) a eccessivamente alta concentrazione possono causare citotossicità e l'esposizione mal possono indurre conseguenze non volute sulle cellule non bersaglio. Anche i portatori di particolato composto of materiali "biocompatibili" [per esempio, poli (co-glicolico acido lattico), PLGA] possono incitano potenti risposte delle cellule immunitarie in determinate condizioni pure. 6 Ciò è particolarmente rischiosa in individui con sistema immunitario compromesso (per esempio, l'artrite reumatoide) che potenzialmente ritardi sistemica pallone nanoparticella. 7 Pertanto, rimozione efficiente di particelle libere prima dell'introduzione delle cellule particelle-ingegnerizzato è di grande importanza per minimizzare profilo di tossicità e ridurre l'esposizione alle particelle misdirected agenti caricata in vivo.
Conventional centrifugazione gradiente è spesso usato per separare le cellule ingegnerizzate da particelle libere, ma è laboriosa e gestito in modalità batch. Inoltre, sforzi di taglio con esperienza da parte delle cellule durante la centrifugazione ad alta velocità ed i costituenti del mezzo gradiente di densità possono compromettere l'integrità delle cellule e / o il comportamento delle cellule influenza. 8 microfluidica è un'alternativa attraente con SEVtecnologie di separazione rale tra cui spostamento laterale deterministico (DLD) 9, dieletrophoresis 10,11 e acoustophoresis 12 sviluppata per le piccole particelle di separazione e le applicazioni di scambio di buffer. Tuttavia, questi metodi soffrono di bassa produttività (1-10 ml · min - 1) e sono soggetti a intasamento problemi. separazioni attivi quali i metodi dielettroforesi basati richiedono anche le differenze di fenotipi cellulari dielettroforetica intrinseche o aggiuntive misure di etichettatura delle cellule per realizzare la separazione. Un approccio più promettente coinvolge microfluidica inerziale - la migrazione laterale di particelle o cellule attraverso semplifica mettere a fuoco in posizioni distinte a causa di forze di sollevamento dominanti (F L) ad alto numero di Reynolds (Re) 13 Grazie alle sue condizioni di alta portata e la risoluzione dimensione superiore. , è stato spesso sfruttato per applicazioni di scambio di dimensioni basate su separazione delle cellule 14,15 e di buffer. 16-18 HoweveR, le prestazioni di Exchange tampone rimane povero con una soluzione di contaminante ~10-30% come le cellule separate di solito rimangono in prossimità del confine tra soluzioni originali e nuovo buffer. 16-18 Ancora più importante, la distribuzione delle dimensioni delle cellule bersaglio deve essere simile a raggiungere precisa inerziale focalizzazione e separazione dalla soluzione tampone originale che pone un problema particolare nel trattamento di tipi cellulari eterogenei dimensioni come le cellule staminali mesenchimali (MSC). 19
Abbiamo già messo a punto una nuova tecnica di smistamento delle cellule inerziale microfluidica chiamato Dean flusso Frazionamento (DFF) per isolare le cellule tumorali circolanti (CTC) 20 e batteri 21 dal sangue intero con un 2-ingresso, 2-outlet dispositivo microcanali spirale. In questo protocollo video, descriveremo il processo di cellule THP-1 di etichettatura (acuta linea cellulare monocitica leucemia umana) sospensione monociti (~ 15 micron) e MSC (10-30 micron) con calceina-lNP oaded, seguita da realizzazione e di funzionamento della spirale Microdevice DFF per recupero efficiente di cellule marcate e rimozione delle NP non legati. 22 Questa strategia unica purificazione passo consente il ripristino continuo della sospensione etichettati e cellule aderenti sospese in soluzione tampone fresco senza centrifugazione. Inoltre, si può elaborare fino a 10 milioni di cellule · ml -1, una densità cellulare suscettibili per applicazioni di medicina rigenerativa.
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Protocol
1. Le nanoparticelle (NP) Etichettatura delle cellule staminali mesenchimali e monociti
- Le cellule staminali mesenchimali Cultura (MSC) in terreno di Dulbecco modificato Eagle (DMEM) supplementato con 10% siero fetale bovino (FBS) e antibiotici per ≥80% di confluenza prima di etichettatura. Analogamente, la cultura cellule THP-1 (ATCC) in Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 supplementato con 10% FBS ad una densità di ~ 10 6 cellule / ml.
- NP carico di silice (~ 500 micron), con soluzione colorante calceina (200 micron) con agitazione durante la notte. Realizzare PLGA-calceina AM (CAM) utilizzando un protocollo descritto in precedenza. 22
- Sciogliere CAM 250 mg e 100 mg PLGA (50:50) in cloroformio a 4 ° C.
- Generare NP emulsione singoli utilizzando un omogeneizzatore ad alta velocità (13.600 xg, 60 sec) a temperatura ambiente. Si evapora il cloroformio in una cappa chimica (≥3 ore) prima della raccolta mediante centrifugazione (3.400 xg per 5 min), lavaggio (doppia distinta sacqua riempito), congelare-essiccazione e stoccaggio in -20 ° C.
- Incubare CAM-PLGA NP (1 mg) o NP di silice calceina (150 mcg) a poli-L-lisina soluzione 0,01% (PLL) a temperatura ambiente per 15 - 20 min.
- Centrifugare a 3.400 xg per 5 minuti per rimuovere l'eccesso PLL surnatante prima risospensione NP in 1 ml di terreno di coltura rispettivo.
- Incubare le NP con le cellule (MSC o THP-1, ~ 1 - 2 x 10 6 cellule in totale) per circa 24 ore (0,1 mg · concentrazione ml -1 etichettatura).
- Dissociarsi e raccogliere le cellule staminali mesenchimali aderenti etichettati con 2 ml di 0,25% tripsina (5 min, 37 ° C) e spegnere con 6 ml di DMEM. Centrifugare le cellule a (1.000 xg, 4 min) e risospendere ad una concentrazione di 10 5 - 10 6 cellule / ml per l'elaborazione microfluidica. Utilizzare etichettati cellule THP-1 (10 Giugno 5-10 cellule / ml) direttamente per la purificazione microfluidica.
2. Preparazione dispositivo a microfluidi
- fabbricazione di dispositivi
- Realizzare il dispositivo a spirale microfluidica (500 micron (w) x 115 micron (h)) con polidimetilsilossano (PDMS) da un kit commerciale utilizzando passi litografia soft standard. 23
- Mescolare 30 g del prepolimero base e 3 g induritore accuratamente in una barca pesatura. De-gas la miscela in un essiccatore per 60 minuti per eliminare le bolle d'aria.
- Versare il composto PDMS sul master stampo di wafer di silicio modellata con il disegno del canale a spirale attenzione ad un'altezza di ~ 5 - 10 mm.
- De-gas la miscela sotto vuoto essiccatore per 60 minuti ancora per rimuovere eventuali bolle d'aria. Ripetere il processo fino a quando tutte le bolle vengono eliminati.
- Curare la miscela PDMS in un forno a 80 ° C per 2 ore fino a quando il PDMS è impostato. Assicurarsi che il wafer non sia inclinato durante l'indurimento ad avere un'altezza costante dispositivo.
- Tagliare il dispositivo a spirale PDMS con un bisturi e la buccia con attenzione la lastra PDMS dallo stampo master.
- Trim i bordi del dispositivo con un bisturi per assicurare superficie liscia per incollaggio.
- Punzone due fori (1,5 mm) per gli ingressi e due fori (1,5 mm) per le prese sul dispositivo PDMS utilizzando una biopsia perforatore 1,5 mm.
- Lavare il dispositivo con isopropanolo (IPA) per rimuovere eventuali detriti e asciugare il dispositivo in un forno a 80 ° C per 5 min.
- Pulire la superficie inferiore del dispositivo PDMS (con le caratteristiche del canale) con nastro adesivo.
- Pulire un lato di un vetrino (2 "3") mediante nastro adesivo.
- Posizionare con cura ed esporre le superfici pulite del dispositivo PDMS e vetrino nella camera di un pulitore plasma e sottoporli a vuoto per 60 sec. Successivamente, accendere il plasma potere al massimo e abbassare la pressione nella camera finché la camera diventa di colore rosa.
- Esporre le superfici a plasma ad aria per 60 sec. Il plasma crea le specie reattive sulle superfici esposte delle PDMS e vetro che consente di legame stretto quando entrano in fisicaal contatto. Spegnere l'alimentazione al plasma e rilasciare la pressione dal più pulito al plasma per recuperare il vetrino dispositivo e vetro.
- Incollare il dispositivo PDMS e vetrino insieme premendo le superfici plasma esposte ermeticamente, senza far bolle sono intrappolati tra le due superfici.
- Riscaldare il dispositivo accoppiato mediante una piastra fissata a 80 ° C per 2 ore per rafforzare il legame.
- Funzionamento del dispositivo
- Tagliare due pezzi di tubo (1,52 millimetri OD) di ~ 15 - 20 cm per le siringhe di aspirazione e collegare una siringa (calibro 23) su una estremità di ciascun tubo.
- Tagliare due pezzi di tubo (1,52 millimetri OD) di ~ 5 - 10 cm per le prese e fissare i fori di uscita del dispositivo PDMS.
- Prima di campionare esecuzione, manualmente adescare il dispositivo con una siringa contenente il 70% di etanolo fino fuoriesce dal tubo di uscita. Lasciare il sit etanolo per 30 secondi a 1 minuto per sterilizzare il dispositivo.
- Caricare 30 ml di filtrato(0,2 micron pori) tampone guaina (Phosphate-Buffered Saline (PBS) con 0,1% di sieroalbumina bovina (BSA)) nella siringa 60 ml e fissare la siringa su una pompa a siringa. Impostare la pompa per le impostazioni corrette (dimensioni della siringa: 60 ml, Volume: 60.000 ml).
Nota: L'aggiunta di BSA PBS è ridurre al minimo vincolante cellula-cellula e vincolante tra le cellule e il dispositivo PDMS non specifico. - Carico 3 ml di cellule marcate nella siringa 3 ml e fissare la siringa su una pompa a siringa separata. Impostare la pompa per le impostazioni corrette (dimensioni della siringa: 3 ml, Volume: 3.000 ml).
- Verificare che non bolle d'aria intrappolate nelle siringhe per garantire un flusso stabile. Rimuovere eventuali bolle d'aria estraendo delicatamente alcune gocce di liquido dall'ugello.
- Collegare le punte ingresso siringa e tubo per le siringhe, e inserirli nei rispettivi ingressi del dispositivo (guaina e ingresso campione). Assicurarsi che non vi siano bolle lungo il tubo.
- Montare i dispositivi su un invertitoEd microscopio a contrasto di fase per l'imaging in tempo reale durante il processo di selezione delle cellule.
- Fissare un piccolo bicchiere di rifiuti e due provette da 15 ml in prossimità del dispositivo sul palco microscopio con adesivi.
- Posizionare i tubi di scarico nel bicchiere rifiuti.
- Impostare il rapporto di flusso per il campione di tampone guaina a 1:10 e iniziare a entrambe le pompe siringa per avviare il processo di smistamento Esempio (: per siringa campione e 1200 microlitri per guaina siringa 120 microlitri / min / min; velocità di flusso del canale ~ 0,38 m / sec ).
- Eseguire il dispositivo per 1,5 min per il flusso si stabilizzi. Questo può essere confermato dalla presenza di cellule inerziale focalizzate vicino alla parete interna del canale in campo chiaro con contrasto di fase usando una macchina fotografica ad alta velocità (~ 5.000 - 10.000 fotogrammi al secondo (fps), il tempo di esposizione: 10-50 msec).
- Posizionare i tubi di uscita in diverse provette per raccogliere gli eluenti dalla presa cellulare e uscita dei rifiuti.
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Representative Results
Dopo l'etichettatura delle cellule con bio di imaging NP agente-caricato durante la notte, le cellule marcate (contenente particelle libere) vengono raccolte e purificate dal DFF spirale Microdevice per rimuovere NP liberi in un unico processo passo (Figura 1A). Il 2-ingresso, microchannel spirale 2-presa è stato progettato da un software di ingegneria e microfabbricazione usando SU-8 fotosensibile. Il wafer di silicio modellato viene quindi utilizzato come modello per stampaggio replica PDMS utilizzando tecniche di litografia morbidi (Figura 1B). Per eseguire selezione cellulare, il campione di cellule viene pompato all'interno del muro esterno della spirale Microdevice mentre l'ingresso parete interna corre soluzione tampone fresco ad una portata maggiore (1,10) pizzicare il flusso campione cellulare. La separazione si ottiene inerziale focalizzazione di cellule marcate grandi alla parete interna e ricircolo Dean-indotta di piccole NP non legati verso la parete esterna (Figura 2A). Il dispositivo è stato il primo appliEd per ordinare cellule in sospensione etichettato monociti (THP-1) da NP di silice fluorescenti carichi di calceina (~ 500 nm di dimensione). Alte efficienze di separazione sono stati ottenuti come confermato mediante imaging ad alta velocità (Figura 2A) ed analisi citofluorimetrica (Figura 2B). Immagini di eluenti raccolti dalla presa cellula dispositivo ha anche indicato la rimozione efficiente di silice e PLGA NP (~ 1-5 micron) da cellule THP-1. Inoltre, l'imaging di fluorescenza ha mostrato che NP comprese nei THP-1 cellule marcate sono state ben mantenuti durante DFF di depurazione (inserti) (Figura 3). A causa delle dimensioni MSC eterogeneità, la geometria a spirale microcanali è stata successivamente modificata cambiando l'altezza del canale e del design biforcazione per consentire un'efficiente raccolta delle MSC (Figura 4).
Figura 1. (A) OvFlusso di lavoro erall per la rimozione rapida a passo singolo micro / nanoparticelle (NP) da sospensione e cellule aderenti post-etichettatura con Dean flusso Frazionamento (DFF), la tecnologia microfluidica. (B) Il dispositivo a spirale DFF è stato progettato da un software di ingegneria e modellato su wafer di silicio utilizzando microfabbricazione. dispositivi PDMS vengono successivamente prodotti con metodi litografia soft. Apparato sperimentale è costituito da 2 pompe a siringa per infondere cellule marcate e tampone salina fresca a differenti velocità di flusso nel dispositivo per la purificazione continua e la raccolta di cellule marcate. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Rimozione nanoparticelle da etichettati cellule THP-1 tramite DFF. (A) Illustrazione diDFF principio di separazione. Cellule marcate grandi sperimentano forti forze d'inerzia di sollevamento (F L, frecce rosse) e le forze di resistenza Dean (F D, frecce gialle) e si concentrano vicino alla parete interna microcanali. I più piccoli NP e soluzione tampone sono influenzati esclusivamente da Dean trascinare e ricircolo alla parete esterna per realizzare la separazione. Rappresentante ad alta velocità e immagini di fluorescenza che indicano posizioni di equilibrio di cellule THP-1 (frecce rosse) e NP di silice carichi di colorante calceina alla zona di uscita. Prestazioni (B) Separazione sulla base di analisi di citometria a flusso con gating determinata dalla dimensione (FSC-A) e la granularità (SSC-A) caratteristiche. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3.
Figura rimozione 4. Le nanoparticelle da cellule staminali mesenchimali (MSC) tramite DFF. Immagine ad alta velocità Rappresentante (A) che illustrano efficiente separazione delle cellule staminali mesenchimali (frecce rosse) e PLGA NP (frecce blu) in diversi punti vendita. Giallo linee tratteggiate indicano la posizione approssimativa delle pareti microcanali. (B) le prestazioni Separazione delle cellule staminali mesenchimali da silice e PLGA NP.pg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
La tecnologia di purificazione delle cellule DFF qui descritta consente la separazione rapida e continua di cellule marcate in maniera elevata produttività. Questo approccio separazione è ideale per grandi volumi campione o campione di trasformazione alta concentrazione cellulare, ed è meglio di filtrazione su membrana a base convenzionale che è soggetta a intasamento dopo un uso prolungato. Analogamente, separazione magnetica affinità basata richiede ulteriori operazioni di etichettatura cellule che sono laboriosi e costosi. Le cellule purificate sono mostrati di conservare i loro agenti etichettati e morfologia cellulare e (Figura 3), con portata minima / effetti di taglio indotto (sollecitazione di taglio τ, ~ 200-250 dyne / cm 2) dovute al tempo di permanenza breve all'interno del canale (< 1 sec) 20,24. Inoltre, l'utente può scegliere la soluzione eluita delle cellule marcate filtrate semplicemente sostituendo il buffer guaina (salina) con i media desiderati o soluzione tampone.
E 'fondamentale chenon c'è sporcizia o detriti nel microcanali uso prima che possono influenzare negativamente il comportamento di messa a fuoco delle cellule. Ciò può essere ottenuto mediante la pulizia dei fori di ingresso accuratamente con IPA, così come usando nastro adesivo per pulire la superficie PDMS prima dell'incollaggio plasma. Poiché il Microdevice opera in condizioni di flusso elevato (~ 1 - sostituisce 1,5 ml / min), è anche importante per riscaldare i dispositivi PDMS aderenti, su una piastra per assicurare una forte adesione tra il PDMS e il vetrino. Durante il funzionamento del dispositivo, se le cellule non stanno concentrando bene, significa che le portate non sono sufficienti. Si può risolvere selezionando la zona di ingresso del dispositivo e le siringhe per garantire che non vi siano perdite.
Rimozione di NP non legati da cellule marcate non è banale in quanto tecniche di separazione comune di laboratorio (ad esempio, centrifugazione) non può particelle separati / cellule di diverse dimensioni (ad esempio, le particelle non legate e cellule marcate). Mentre si può sostenere che ripetuti lavaggie modifica dei mezzi di coltura può rimuovere NP liberi da cellule aderenti ad un certo punto, il processo è laborioso e inefficace per colture cellulari sospensione. Il dispositivo microfluidico DFF utilizza ordinamento basato sulle dimensioni ed è altamente versatile in quanto può essere utilizzato sia per sospensione e cellule aderenti con un'ampia gamma di dimensioni, così come la rimozione di NP di materiali diversi. Se le cellule bersaglio sono di dimensioni diverse, il dispositivo DFF può essere ottimizzata cambiando le condizioni di flusso o la geometria canali (ad esempio, altezza del canale e il rapporto delle larghezze di canale interno ed esterno) per realizzare la separazione efficiente. E 'stato precedentemente dimostrato che DFF è superiore rispetto a centrifugazione convenzionale rimozione NP con cellule perdita minima. 22 Inoltre, le prestazioni di recupero delle cellule mantenuto elevato (> 90%) quando la concentrazione del campione è stata aumentata a 10 7 cellule / ml. Si tratta di un miglioramento chiave rispetto ai metodi esistenti inerziali microfluidica di separazione delle cellule che sono in generalely limitata a 10 5 cellule / ml, a causa di interazioni cellula-cellula e cellula sovraffollamento posizioni di equilibrio. 25
Mentre la tecnologia DFF raggiunge separazione basata sulla differenza di formato, non può essere utilizzato per altri processi di ingegneria cellulare quali la separazione di cellule marcate e non marcate a causa del cambiamento trascurabile dimensione della cella. marcatori di superficie cellulare per l'ordinamento affinità-based e altre modalità di separazione comune (suscettibilità magnetica e conduttività elettrica) potrebbero essere presi in considerazione per questo tipo di applicazioni potenziali. La tecnologia DFF non è inoltre adatto per selezione cellulare multiplato base di fluorescenza. Una soluzione migliore sarebbe quella di utilizzare la fluorescenza delle cellule attivate (FACS) per un unico passaggio smistamento di cellule marcate con diversi fluorescenza che funziona ad alta produttività, ma richiede attrezzature costose e ingombranti.
Infine, questo protocollo è molto utile per la purificazione di cellule ingegnerizzate quandoNP contenenti agenti di trasformazione (fattori di crescita, farmaci, corticosteroidi, ecc) sono utilizzati per bioimmagini e / o di terapia cellulare. Questo perché NP libero residuo possono esercitare fuori bersaglio trasformativa effetti sulle cellule vicine o cellule immunitarie che rispondono a queste particelle estranee quando iniettato in vivo. Essa può anche involontariamente generare segnali che possono essere fuorvianti durante bioimmagini. La rimozione di questi NP liberi prima dell'uso ridurre così il rischio per le cellule non bersaglio, ridurre al minimo le compilation nel sistema immunitario e ridurre i problemi di contaminazione tra passaggi durante sequenziale etichettatura / ingegneria delle cellule. Il suo successo dell'attuazione facilita notevolmente l'etichettatura delle cellule e consente l'utilizzo senza interferenze di ingegneria cellulare particella base nella terapia.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell lines & Media | |||
| Mesenchymal Stem Cells (MSCs) | Lonza | PT-2501 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Lonza | 12-614F | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10270-106 | |
| THP-1 monocyte cells (THP-1) | ATCC | TIB-202 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 media | Lonza | 12-702F | |
| Reagents & Materials | |||
| 0.01% poly-L-lysine (PLL) | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| 3 ml Syringe | BD | 302113 | Syringe 3 ml Luer-Lock |
| 60 ml Syringe | BD | 309653 | Syringe 60 ml Luer-Lock |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Biowest | P6154-100GR | |
| Calcein, AM (CAM) | Life Technologies | C1430 | |
| Calcein | Sigma-Aldrich | C0875 | |
| Isopropanol | Fisher Chemical | #P/7507/17 | HPLC Grade 2.5 L |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Lonza | 17-516Q/12 | |
| Plain Microscope Slides | Fisher Scientific | FIS#12-550D | 75 x 25 x 1 mm3 |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | SYLGARD® 184 | |
| Scotch tape | 3M | 21200702044 | 18 mm x 25 m |
| Silica NPs (∼200 μm) | Sigma-Aldrich | 748161 | Pore size 4 nm |
| Syringe Tip | JEC Technology | 7018302 | 23 G 0.013 x 0.25 |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Life Technologies | 25200-056 | |
| Tygon Tubing | Spectra-Teknik | 06419-01 | 0.02 x 0.06" 100 |
| Poly (D,L-lactide-co-glycolide) (PLGA; 50:50) | Sigma-Aldrich | P2191 | |
| Equipment | |||
| Biopsy punch | Harris Uni-Core | 69036-15 | 1.50 mm |
| Dessicator | Scienceware | 111/4 IN OD | |
| High-speed Camera | Phantom | V9.1 | |
| Inverted phase-contrast microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-002 | |
| Syringe Pump | Chemyx | CX Fusion 200 |
References
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