Summary
Denne protokollen beskriver bruken av en treghets MicroFluidics basert bufferbytte strategi for å rense mikro / nanopartikkel modifiserte cellene med effektiv uttømming av ubundne partikler.
Abstract
Ingeniør celler med aktiv ingrediens lastet mikro / nanopartikler (NPS) blir en stadig mer populær metode for å forbedre innfødte terapeutiske egenskaper, gjør at bio bildebehandling og kontrollere cellefenotyp. En kritisk, men en tilfredsstill problemet er betydelig antall av partikler som forblir ubundet etter cellemerking som ikke lett kan fjernes ved vanlig sentrifugering. Dette fører til en økning i biologisk avbildning bakgrunnsstøy, og kan formidle transformerende effekter bort på nærliggende ikke-målceller. I denne protokollen, presenterer vi en treghets MicroFluidics basert buffer utveksling strategi betegnes som Dean Flow Fraksjone (DFF) for å effektivt skille merkede celler fra frie NPs i en høy gjennomstrømning måte. Den utviklede spiral microdevice letter sammenhengende samling (> 90% celle gjenvinning) av rensede celler (THP-1 og MSC) suspendert i ny buffer-oppløsning, samtidig som man oppnår> 95% reduksjon av ubundet fluorescerende fargestoff eller fargestoff belastede NPS (silica eller PLGA). Dette enkelt-trinn, gjør det mulig størrelse basert celle rensestrategi høy celle behandling gjennomløp (10 6 celler / min), og er meget nyttig for stor-volum celle rensing av mikro / nanopartikkel konstruert for celler for å oppnå støyfri klinisk anvendelse.
Introduction
Ingeniør celler ved nestleder lastet mikro / nanopartikler (NPS) er en enkel, genomisk integrering fritt, og allsidig metode for å forbedre Bioimaging evne og styrke / supplere sin opprinnelige terapeutiske egenskaper i regenerativ medisin. 1-3 Cellular modifikasjoner oppnås ved å merke plasma membran eller cytoplasma med et overskudd konsentrasjon av nestleder belastede NPs å mette bindingssteder. Imidlertid er en stor ulempe ved denne metode er de store mengder av ubundne partikler som er igjen i oppløsningen etter cellemerkeprosesser, noe som kan forvirre presis identifisering av partikkel-konstruerte celler eller komplisere terapeutiske resultater. 4,5 I tillegg, eksponering for NPS inneholdende transformerende agenter (vekstfaktorer, kortikosteroider, etc.) ved for høy konsentrasjon kan føre cytotoksisitet og irrelevante eksponering kan forårsake utilsiktede konsekvenser på ikke-målceller. Selv partikkel bærere bestående of "biokompatible" materialer [f.eks poly (melkesyre co-glykolsyre), PLGA] kan egge potente immuncellere under visse forhold også. 6 Dette er spesielt risikabelt i personer med nedsatt immunforsvar (for eksempel reumatoid artritt) som potensielt forsinkelser systemisk clearance nanopartikkel. 7 således effektiv fjerning av frie partikler før innføring av partikkel konstruerte celler som er av stor viktighet for å minimalisere toksikologisk profil og redusere feilsendt eksponering til agenten belastet partiklene in vivo.
Konvensjonell gradient sentrifugering blir ofte brukt for å separere modifiserte cellene fra frie partikler, men er arbeidskrevende og drives i batch-modus. Videre skjærspenninger oppleves av celler under høyhastighetssentrifugering og bestanddelene av tettshetsgradient medium kan kompromittere celle integritet og / eller innflytelse celle atferd. 8 Microfluidics er et attraktivt alternativ med sevtater separasjonsteknologier, inkludert determinissideveis forskyvning (DLD) 9, dieletrophoresis 10,11 og acoustophoresis 12 utviklet for små partikler separasjon og buffer børs applikasjoner. Imidlertid er disse fremgangsmåter lider av lav gjennomstrømning (1-10 ul x min - 1) og er utsatt for tilstopping problemer. Aktive separasjoner som dielectrophoresis-baserte metoder krever også forskjeller i indre dielectrophoretic celle fenotyper eller ekstra celle merking skritt for å oppnå separasjon. En mer lovende tilnærming innebærer treghet MicroFluidics - lateral migrasjon av partikler eller celler over strømlinje å fokusere på forskjellige posisjoner på grunn av dominerende løftekraft (F L) ved høy Reynolds tall (Re) 13 På grunn av sin høye strømningsforhold og overlegen størrelse oppløsning. har det ofte vært utnyttet til størrelse basert celleseparasjon 14,15 og buffer børs applikasjoner. 16-18 However, forblir bufferbytte ytelsen dårlig med ~10-30% forurensningsoppløsning som de separerte celler som vanligvis er nær grensen mellom opprinnelige og nye bufferløsninger. 16-18 Viktigere er det at størrelsesfordelingen av målceller må være lik for å oppnå nøyaktig treghets fokusering og separasjon fra den opprinnelige bufferoppløsning som utgjør et problem, spesielt i behandlingen av heterogene størrelse celletyper slik som stamceller (MSC). 19
Vi har tidligere utviklet en ny treghets MicroFluidics cellesortering teknikk betegnes Dean Flow Fraksjonering (DFF) for å isolere sirkulerende tumorceller (CTCs) 20 og bakterier 21 fra helt blod ved hjelp av en to-innløp, 2-utløp spiral microchannel enhet. I denne video-protokollen, vil vi beskrive prosessen for merking av THP-1 (human akutt monocyttisk leukemicellelinje) suspensjon monocyttiske celler (~ 15 nm) og MSC (10-30 um) med calcein-loaded NPs, etterfulgt av fremstilling og drift av DFF spiral microdevice for en effektiv utvinning av merkede celler og fjerning av ubundne NPS. 22 Denne enkelttrinnsrensestrategi muliggjør kontinuerlig utvinning av merket suspensjon og adherente celler suspendert i frisk bufferløsning uten sentrifugering. Videre kan det behandle opptil 10 millioner celler · ml -1, en celle tetthet mottagelig for regenerativ medisin applikasjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Nanopartikler (NPS) Merking av stamceller og monocytter
- Kultur mesenchymale stamceller (MSC) i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) supplementert med 10% føtalt bovint serum (FBS) og antibiotika til ≥80% konfluens før merking. Tilsvarende kultur THP-1-celler (ATCC) i Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640-medium supplert med 10% FBS til en tetthet på ~ 10 6 celler / ml.
- Load silika NPs (~ 500 mikrometer) med calcein fargeløsning (200 mm) ved hjelp av natten omrøring. Fremstille PLGA-calcein AM (CAM) ved bruk av en protokoll som er beskrevet tidligere. 22
- Oppløs 250 ug CAM og 100 mg PLGA (50:50) i kloroform ved 4 ° C.
- Generere enkelt emulsjon NPs bruker en høyhastighets homogenisator (13600 xg, 60 sek) ved romtemperatur. Fordampe kloroform i en kjemisk hette (≥3 timer) før samlingen ved hjelp sentrifugering (3400 xg i 5 min), vasker (doble utmerlled vann), frysetørking og lagring i -20 ° C.
- Inkuber CAM-PLGA NPS (1 mg) eller calcein silika NPS (150 ug) i 0.01% poly-L-lysin (PLL) oppløsning ved romtemperatur i 15 - 20 min.
- Sentrifuger ved 3400 xg i 5 minutter for å fjerne overskudd av PLL supernatanten før NPS resuspensjon i 1 ml av respektive kulturmedium.
- Inkuber NPs med celler (MSC eller THP-1, ~ 1 - 2 x 10 6 celler i totalt) i ca 24 timer (0,1 mg · ml -1 merking konsentrasjon).
- Dissosiere og høste de merkede adherente MSC ved hjelp av 2 ml av 0,25% trypsin (5 min, 37 ° C) og tilsett 6 ml DMEM. Spinn ned cellene ved (1000 xg, 4 min) og resuspender til en konsentrasjon på 10 5 til 10 juni celler / ml for mikrofluid behandling. Bruke merkede THP-1 celler (10 juni 5 til 10 celler / ml) direkte til MicroFluidics rensing.
2. microfluidic enhet Forberedelse
- Enhets Fabrication
- Fremstille mikrofluidspiralanordningen (500 um (vekt) x 115 um (h)) med polydimetylsiloksan (PDMS) fra et kommersielt kit ved anvendelse av standard myklitografi trinn. 23
- Bland 30 g base prepolymer og 3 g herdemiddel grundig i en veie båt. De-gass-blandingen i en eksikator i 60 minutter for å fjerne eventuelle luftbobler.
- Hell blandingen PDMS på silikonplaten hoved formen mønstret med den spiralkanalutformingen forsiktig til en høyde på ~ 5 - 10 mm.
- De-gass-blandingen i en eksikator vakuum i 60 min på nytt for å fjerne eventuelle luftbobler. Gjenta prosessen til alle bobler er eliminert.
- Kurere PDMS blandingen i en 80 ° C ovn i 2 timer inntil PDMS er angitt. Sikre skiven ikke står på skrå under herdingen for å ha en konstant enhet høyde.
- Skjær ut PDMS spiral enheten ved hjelp av en skalpell og nøye skrelle PDMS skive fra master mold.
- trim kantene av enheten med en skalpell for å sikre jevn overflate for binding.
- Punch to hull (1,5 mm) for de viker og to hull (1,5 mm) for uttak på PDMS enheten ved hjelp av en 1,5 mm biopsi puncher.
- Vask enheten med isopropanol (IPA) for å fjerne eventuelle rester og tørke enheten i en 80 ° C ovn i 5 min.
- Rengjøre bunnen av PDMS enhet (med kanalfunksjoner) med maskeringstape.
- Rent den ene side av en glassplate (2 "av 3") ved hjelp av maskeringstape.
- Plasser forsiktig og avsløre de rensede overflater av PDMS enheten og glass lysbilde i kammeret av en plasma renere og utsette dem for vakuum i 60 sek. Deretter slår på plasma-strømmen til maksimum og senke kammertrykket inntil kammeret blir rosa farge.
- Expose overflatene til luft plasma for 60 sek. Plasmaet skaper reaktive arter på de eksponerte overflater av PDMS og glass som muliggjør tett binding når de bringes i fysiskal kontakt. Slå av plasma makt og slipp trykket fra plasma renere å hente enheten og glass lysbilde.
- Binde PDMS-enheten og objektglass sammen ved å trykke på plasma-eksponerte overflater tett og sikrer at ingen bobler er fanget mellom de to flater.
- Oppvarme den bundne enhet ved hjelp av en varmeplate innstilt på 80 ° C i 2 timer for å styrke bindingen.
- Operasjon Device
- Skjær to stykker av rør (1,52 mm OD) på ~ 15 - 20 cm for innløps- sprøyter og feste en sprøytespiss (måleren 23) på den ene ende av hver slange.
- Klipp to stykker av rør (1,52 mm OD) av ~ 5 - 10 cm for uttak og koble til uttaket hullene i PDMS enheten.
- Før prøve å kjøre manuelt prime enheten med en sprøyte som inneholder 70% etanol før den renner ut av utløpet slangen. La etanol sitte i 30 sek til 1 min å sterilisere enheten.
- Last 30 ml filtrert(0,2 um porestørrelse) slire buffer (fosfat-buffret saltvann (PBS) med 0,1% bovint serumalbumin (BSA)) i 60 ml sprøyte og feste sprøyten på en sprøytepumpe. Sett pumpen til de riktige innstillingene (Sprøyte størrelse: 60 ml, Volum: 60 000 mikroliter).
Merk: Tilsetning av BSA til PBS er å minimalisere celle-cellebinding og ikke-spesifikk binding mellom celler og den PDMS-enheten. - Belastning 3 ml merkede celler inn i 3 ml sprøyte og feste sprøyten på en separat sprøytepumpe. Sett pumpen til de riktige innstillingene (Sprøyte størrelse 3 ml, Volum: 3000 mL).
- Sjekk at ingen luftbobler er fanget i sprøytene for å sikre en stabil flyt. Fjern eventuelle luftbobler ved å mate noen dråper ut av dysen.
- Koble inntakssprøyte tips og rør til sprøytene, og sette dem inn i de respektive viker av enheten (skjede og prøveinngang). Sikre at det ikke er noen bobler langs produksjonsrøret.
- Monter enhetene på en inverted fasekontrastmikroskop for sanntids avbildning under cellesorteringsprosessen.
- Sikre et lite avfall beger og to 15 ml rør nær enheten på mikroskopet scenen ved hjelp av lim.
- Plasser utløpsslanger inn avfallet beger.
- Angi at strømningsforholdet for prøve å kappe buffer til 1:10 og begynne begge sprøytepumper for å initiere sorteringsprosess (Eksempel: 120 ul / min for prøve sprøyte og 1,200 ul / min for skjede sprøyte, kanal strømningshastighet ~ 0,38 m / sek ).
- Kjøre enheten i 1,5 min for strømningshastigheten for å stabilisere. Dette kan bekreftes ved tilstedeværelsen av treghets fokuserte celler nær kanalen indre veggen under lyse-feltet med fasekontrast ved hjelp av et høyhastighetskamera (~ 5000 - 10 000 bilder per sekund (fps), eksponeringstid: 10-50 usekunder).
- Plasser utløpsslanger i forskjellige rør for å samle utvasking fra cellen uttaket og avløp.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Etter merking av cellene med bio avbildningsmiddel belastede NPS over natten, blir de merkede celler (inneholdende frie partikler) høstet og renset ved DFF spiral microdevice for å fjerne frie NPS i en enkelttrinnsprosess (figur 1A). Den 2-innløp, 2-uttak spiral microchannel er designet av engineering programvare og microfabricated bruker SU-8 fotoresist. Den mønstrede silikonplaten blir deretter anvendt som et templat for PDMS replika støping ved bruk av myke litografiske teknikker (figur 1B). For å utføre cellesortering, blir celleprøven pumpes inn i den ytre veggen innløpet til spiralen microdevice mens den indre vegg innløpet løper frisk bufferoppløsning ved en høyere strømningshastighet (1:10) for å klemme celleprøvestrømmen. Separasjon oppnås ved treghets fokusering av større merkede celler ved den indre vegg og Dean-indusert resirkulasjon av små ubundne NPS mot den ytre vegg (figur 2A). Enheten var første apparaed å sortere merket suspensjon monocyttiske celler (THP-1) fra fluorescerende silika NPs lastet med calcein (~ 500 nm i størrelse). Høye separasjonsvirkningsgrader ble oppnådd som bekreftet ved høy hastighet imaging (figur 2A) og flow cytometri-analyse (figur 2B). Bilder fra elueringsmidler oppsamlet fra enheten celleuttaket også angitt effektiv fjerning av silisiumdioksyd og PLGA NPS (~ 1 - 5 um) fra THP-1-celler. I tillegg er fluorescensavbildning viste at internalis NPS i de merkede THP-1-celler ble også opprettholdes under DFF rensing (innfellinger) (figur 3). På grunn av MSC størrelse heterogenitet, ble den spiralmicrochannel geometrien senere modifiseres ved å endre kanalhøyden og forgreningen utforming for å muliggjøre effektiv innsamling av MSC (figur 4).
Figur 1. (A) Overall arbeidsflyt for rask ettrinns mikro / nanopartikler (NPS) fjerning fra suspensjon og tilhenger celler post-merking ved hjelp av Dean Flow Fraksjone (DFF) microfluidic teknologi. (B) Den DFF spiral enheten er designet av engineering programvare og mønstret på silisium wafer hjelp microfabrication. PDMS enheter senere blir produsert av myke litografi metoder. Eksperimentelle oppsettet består av 2 sprøytepumper å sette merkede celler og friskt saltvann buffer ved forskjellige strømningsrater inn i enheten for kontinuerlig rensing og innsamling av merkede celler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Nanopartikler fjernes fra merkede THP-1-celler via DFF. (A) IllustrasjonDFF separasjonsprinsippet. Større merkede celler oppleve sterke treghet løftekraft (F, L, røde piler) og Dean motstandskreftene (F D, gule piler) og fokus nær microchannel innervegg. Mindre NPs og bufferløsning er utelukkende rammet av Dean dra og resirkulere til ytterveggen for å oppnå separasjon. Representant høy hastighet og fluorescens bilder som angir likevektsposisjoner THP-1 celler (røde piler) og silica NPs lastet med calcein fargestoff ved utløpet regionen. (B) Separasjon forestilling basert på flowcytometri analyse med gating bestemmes av størrelse (FSC-A) og detaljnivå (SSC-A) egenskaper. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3.
Figur 4. Nanopartikler fjerning fra mesenchymale stamceller (MSC) via DFF. (A) Representant høyhastighets bilde som illustrerer effektiv separasjon av MSC (røde piler) og PLGA NPs (blå piler) i ulike utsalgssteder. Gul stiplede linjer indikerer den omtrentlige posisjonen til microchannel veggene. (B) Separasjon ytelsen til MSC fra silika og PLGA NPs.pg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den DFF celle rensemetoder som er beskrevet her gjør det mulig hurtig og kontinuerlig separering av merkede celler i en høy gjennomstrømning måte. Denne separering tilnærmingen er ideell for stort prøvevolum eller høy cellekonsentrasjonen prøvebehandling, og er bedre enn konvensjonelle membran-baserte filtrering som er utsatt for tilstopping etter lang tids bruk. Tilsvarende krever affinitets-baserte magnetisk separasjon ytterligere celle merketrinn som er arbeidskrevende og kostbart. De rensede celler er vist å beholde sine merkede midler og cellemorfologi brønnen (figur 3) med minimal strømnings / skjær-induserte effekter (skjærspenning τ, ~ 200-250 dyn / cm 2) på grunn av kort oppholdstid inne i kanalen (< 1 sek) 20,24. I tillegg kan brukeren velge den eluerte løsningen av de sorterte merkede celler ved ganske enkelt å erstatte kappen buffer (saltvann) med de ønskede media eller bufferoppløsning.
Det er viktig atdet er ingen skitt eller rusk i microchannel før bruk som kan påvirke celle fokus atferd. Dette kan oppnås ved å rense inntakshullene grundig med IPA, så vel som ved hjelp av maskeringstape for å rengjøre overflaten PDMS før plasmabinding. Siden microdevice arbeider under høye strømnings-betingelser (~ 1 til 1,5 ml / min), er det også viktig å oppvarme de sammenføyde PDMS enheter på en varmeplate for å sikre sterk binding mellom PDMS og glass-slide. Under drift av enheten, hvis cellene ikke fokuserer godt, betyr det at strømningshastigheten er ikke tilstrekkelig. Man kan feilsøke ved å kontrollere enheten innløpsområdet og sprøyte tips for å sikre at det ikke er noen lekkasjer.
Fjerning av ubundne NPs fra merkede celler er ikke trivielt, siden felles laboratorieseparasjonsteknikker (f.eks sentrifuge) kan ikke separate partikler / celler i forskjellige størrelser (f.eks ubundne partikler og merkede celler). Mens man kan argumentere for at gjentatt vaskingog endring av dyrkningsmedier kan fjerne frie NPS fra adherente celler til en viss grad, er prosessen er arbeidskrevende og ineffektivt for suspensjon cellekulturer. Den DFF mikrofluid anordningen benytter størrelse basert sortering og er svært allsidig ettersom den kan brukes for både fjæring og festede celler med et stort størrelsesområde, samt fjerning av NPS av forskjellige materialer. Hvis målcellene er av forskjellige størrelser, kan det DFF enheten optimaliseres ved å endre strømningsbetingelsene eller kanal geometri (for eksempel kanal høyde og forholdet mellom indre og ytre kanalbredde) for å oppnå effektiv separering. Det har tidligere blitt vist at vippekretsen er overlegen sammenlignet med konvensjonelle sentrifugering i NPS fjernelse med minimalt tap av celle. 22 Videre forble celle-gjenvinning ytelse høy (> 90%) når prøven konsentrasjonen ble øket til 10 7 celler / ml. Dette er en viktig forbedring i forhold til eksisterende treghet microfluidic celle separasjonsmetoder som er genereltly begrenset til 10 5 celler / ml kapasitet på grunn av celle-celle-interaksjon og celleoverbefolkning ved likevektsposisjoner. 25
Mens DFF teknologi oppnår separasjon basert på størrelse forskjell, kan den ikke brukes for andre celle tekniske prosesser som for eksempel separasjon av merkede og umerkede celler på grunn av ubetydelig forandring i cellestørrelse. Celleoverflatemarkører for affinitet basert sortering og andre vanlige separasjons modaliteter (magnetisk susceptibilitet og elektrisk ledningsevne) kan anses for slike potensielle bruksområder. DFF-teknologien er heller ikke egnet for den multipleksfordelte cellesortering basert på fluorescens. Et bedre alternativ ville være å bruke fluorescens-aktivert cellesortering (FACS) for ett-trinns sortering av merkede celler med forskjellig fluorescens som opererer ved høy gjennomstrømning, men krever kostbart og plasskrevende utstyr.
Endelig er denne protokollen meget nyttige for rensing av konstruerte celler nårNPs inneholder transformative agenter (vekstfaktorer, narkotika, kortikosteroider, etc.) brukes for Bioimaging og / eller celleterapi. Dette er fordi rest gratis NPs kan utøve off-target transformative effekt på naboceller eller immunceller som reagerer på disse fremmede partikler når injiseres in vivo. Det kan også utilsiktet generere signaler som kan være misvisende i løpet Bioimaging. Fjerning av disse gratis NPs før bruk og dermed redusere risikoen for ikke-målceller, minimere samlinger i immunsystemet, og redusere forurensning problemer mellom trinnene under merking / engineering av celler sekvensiell. Dens vellykket implementering blir enklere celle merking og gir forstyrrelser, fri bruk av partikkelbaserte celle engineering i terapi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noe å avsløre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell lines & Media | |||
| Mesenchymal Stem Cells (MSCs) | Lonza | PT-2501 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Lonza | 12-614F | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10270-106 | |
| THP-1 monocyte cells (THP-1) | ATCC | TIB-202 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 media | Lonza | 12-702F | |
| Reagents & Materials | |||
| 0.01% poly-L-lysine (PLL) | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| 3 ml Syringe | BD | 302113 | Syringe 3 ml Luer-Lock |
| 60 ml Syringe | BD | 309653 | Syringe 60 ml Luer-Lock |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Biowest | P6154-100GR | |
| Calcein, AM (CAM) | Life Technologies | C1430 | |
| Calcein | Sigma-Aldrich | C0875 | |
| Isopropanol | Fisher Chemical | #P/7507/17 | HPLC Grade 2.5 L |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Lonza | 17-516Q/12 | |
| Plain Microscope Slides | Fisher Scientific | FIS#12-550D | 75 x 25 x 1 mm3 |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | SYLGARD® 184 | |
| Scotch tape | 3M | 21200702044 | 18 mm x 25 m |
| Silica NPs (∼200 μm) | Sigma-Aldrich | 748161 | Pore size 4 nm |
| Syringe Tip | JEC Technology | 7018302 | 23 G 0.013 x 0.25 |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Life Technologies | 25200-056 | |
| Tygon Tubing | Spectra-Teknik | 06419-01 | 0.02 x 0.06" 100 |
| Poly (D,L-lactide-co-glycolide) (PLGA; 50:50) | Sigma-Aldrich | P2191 | |
| Equipment | |||
| Biopsy punch | Harris Uni-Core | 69036-15 | 1.50 mm |
| Dessicator | Scienceware | 111/4 IN OD | |
| High-speed Camera | Phantom | V9.1 | |
| Inverted phase-contrast microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-002 | |
| Syringe Pump | Chemyx | CX Fusion 200 |
References
- Wiraja, C., et al. Aptamer technology for tracking cells' status & function. Mol. Cell. Ther. 2, 33 (2014).
- Yeo, D. C., Wiraja, C., Mantalaris, A., Xu, C. Nanosensors for Regenerative Medicine. J. Biomed. Nanotech. 10, 2722-2746 (2014).
- Naumova, A. V., Modo, M., Moore, A., Murry, C. E., Frank, J. A. Clinical imaging in regenerative medicine. Nat. Biotechnol. 32, 804-818 (2014).
- Soenen, S. J., et al. Cellular toxicity of inorganic nanoparticles: Common aspects and guidelines for improved nanotoxicity evaluation. Nano Today. 6, 446-465 (2011).
- Donaldson, K., Poland, C. A. Nanotoxicity: challenging the myth of nano-specific toxicity. Curr. Opin. Biotechnol. 24, 724-734 (2013).
- Veiseh, O., et al. Size- and shape-dependent foreign body immune response to materials implanted in rodents and non-human primates. Nat. Mater. 14, 643-651 (2015).
- Jones, S. W., et al. Nanoparticle clearance is governed by Th1/Th2 immunity and strain background. J. Clin. Invest. 123, 3061-3073 (2013).
- Marchi, L. F., Sesti-Costa, R., Chedraoui-Silva, S., Mantovani, B. Comparison of four methods for the isolation of murine blood neutrophils with respect to the release of reactive oxygen and nitrogen species and the expression of immunological receptors. Comp. Clin. Pathol. 23, 1469-1476 (2014).
- Morton, K. J., et al. Hydrodynamic metamaterials: Microfabricated arrays to steer, refract, and focus streams of biomaterials. Proc. Natl. Acad. of Sci USA. 105, 7434-7438 (2008).
- Hu, X., et al. Marker-specific sorting of rare cells using dielectrophoresis. Proc. Natl. Acad. of Sci USA. 102, 15757-15761 (2005).
- Cummings, E. B. Streaming dielectrophoresis for continuous-flow microfluidic devices. IEEE Eng. Med. Biol. Mag. 22, 75-84 (2003).
- Augustsson, P., Persson, J., Ekstrom, S., Ohlin, M., Laurell, T. Decomplexing biofluids using microchip based acoustophoresis. Lab Chip. 9, 810-818 (2009).
- Di Carlo, D., Irimia, D., Tompkins, R. G., Toner, M. Continuous inertial focusing, ordering, and separation of particles in microchannels. Proc. Natl. Acad. of Sci USA. 104, 18892-18897 (2007).
- Hur, S. C., Henderson-MacLennan, N. K., McCabe, E. R. B., Di Carlo, D. Deformability-based cell classification and enrichment using inertial microfluidics. Lab Chip. 11, 912-920 (2011).
- Mach, A. J., Di Carlo, D. Continuous scalable blood filtration device using inertial microfluidics. Biotechnol. Bioengin. 107, 302-311 (2010).
- Gossett, D. R., et al. Inertial manipulation and transfer of microparticles across laminar fluid streams. Small. 8, 2757-2764 (2012).
- Amini, H., et al. Engineering fluid flow using sequenced microstructures. Nat. Commun. 4, 1826 (2013).
- Sollier, E., et al. Inertial microfluidic programming of microparticle-laden flows for solution transfer around cells and particles. Microfluid. Nanofluid. 19, 53-65 (2015).
- Lee, W. C., et al. Multivariate biophysical markers predictive of mesenchymal stromal cell multipotency. Proc. Natl. Acad. of Sci USA. 111, E4409-E4418 (2014).
- Hou, H. W., et al. Isolation and retrieval of circulating tumor cells using centrifugal forces. Sci. Rep. 3, 1259 (2013).
- Hou, H. W., Bhattacharyya, R. P., Hung, D. T., Han, J. Direct detection and drug-resistance profiling of bacteremias using inertial microfluidics. Lab Chip. 15, 2297-2307 (2015).
- Yeo, D. C., et al. Interference-free Micro/nanoparticle Cell Engineering by Use of High-Throughput Microfluidic Separation. ACS Appl. Mater. Inter. 7, 20855-20864 (2015).
- Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft Lithography. Angew. Chem. Int. Edit. 37, 550-575 (1998).
- Lee, W. C., et al. High-throughput cell cycle synchronization using inertial forces in spiral microchannels. Lab Chip. 11, 1359-1367 (2011).
- Kuntaegowdanahalli, S. S., Bhagat, A. A., Kumar, G., Papautsky, I. Inertial microfluidics for continuous particle separation in spiral microchannels. Lab Chip. 9, 2973-2980 (2009).
