Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Parazit Mikro / Nanoparçacık Hücre Mühendisliği mikroakışkan Tampon Değişim

Published: July 10, 2016 doi: 10.3791/54327
Automatic Translation
1, 2, 2, 2,3, 1
1Lee Kong Chian School of Medicine, Nanyang Technological University, 2School of Chemical and Biomedical Engineering, Nanyang Technological University, 3NTU-Northwestern Institute of Nanomedicine, Nanyang Technological University

Summary

Bu protokol, bağlanmamış partiküllerin randımanlı bir şekilde azalması olan mikro / nanopartikül mühendislik hücrelerinin saflaştırılması için bir atalet Mikroakiskan tabanlı tampon değişimi stratejisi kullanımını tarif eder.

Abstract

Aktif-madde yüklü mikro / nano partiküller ile mühendislik hücreleri (NPS), yerli terapötik özellikleri geliştirmek biyo görüntüleme sağlamak ve hücre fenotipi kontrol etmek için giderek daha popüler bir yöntem haline geliyor. Kritik henüz yetersiz giderilen sorun kolayca geleneksel santrifüj kaldırılamaz hücre etiketleme sonra ilişkisiz kalır parçacıkların önemli bir sayıdır. Biyo görüntüleme plan gürültüsünde bir artışa yol açar ve komşu olmayan hedef hücreler üzerinde dönüştürücü etkisi kazandırabilir. Bu protokol, biz verimli bir yüksek verimli bir şekilde serbest NP etiketli hücreleri ayırmak için Dean Akış Fraksiyonu (DFF) olarak adlandırılan bir atalet Mikroakiskan tabanlı tampon değişimi stratejisi sunuyoruz. Bağlanmamış bir floresan boya veya boya yüklü NP (SIL>% 95 azalmasını elde ederken geliştirilmiş sarmal mikrovasıta, yeni bir tampon çözeltisi içinde süspansiyon haline saflaştınldı hücrelerinden (THP-1 ve MSC'ler) sürekli toplama (>% 90 hücre geri kazanım) kolaylaştırırica veya PLGA). Bu tek aşamalı, boyut tabanlı hücre arıtma stratejisi yüksek hücre işleme verimi (10 6 hücre / dak) sağlayan ve parazitsiz klinik uygulama sağlamak için mikro / nanoparçacık mühendislik hücrelerin büyük hacimli hücre arıtma için son derece yararlıdır.

Introduction

Ajan yüklü mikro / nano partiküller (NPS) hücreleri mühendislik bio yeteneği geliştirmek ve rejeneratif tıpta doğal tedavi edici özelliklere ek / artırmak için basit, genomik entegrasyon-free, ve çok yönlü bir yöntemdir. 1-3 Hücresel değişiklikler etiketleyerek elde edilir ajan yüklü NPS aşırı konsantrasyon ile plazma zarı ya da sitoplazma bağlayıcı siteleri doyurmak için. Bununla birlikte, bu yöntemin önemli bir sakıncası dönüştürücü ihtiva eden NP önemli potansiyel partikül işlenmiş hücrelerde tam kimlik bulandırabilir veya terapötik sonuçlar karmaşık hale getirmektedir. 4,5 Ayrıca hücre etiketleme işlemleri sonrası çözeltide kalan bağlanmamış parçacık miktarları, maruz olduğu aşırı derecede yüksek bir konsantrasyonda maddeler (büyüme faktörleri, kortikosteroidler, vs.) hedef olmayan hücreler üzerinde istenmeyen sonuçları indükleyebilir sitotoksisitesinin ve yanlış yönlendirilmiş riskini ortaya çıkarmaktadır. o içeren parçacıklı bir taşıyıcıf "biyolojik olarak uyumlu" malzemeler [örneğin, poli (laktik ko-glikolik asit), PLGA] güçlü bir bağışıklık hücresi, belirli koşullar altında yanıtlar da teşvik edebilir. 6 Bu bağışıklığı (örn, romatizmal artrit), potansiyel olarak gecikmeler olan kişilerde özellikle riskli sistemik nanopartikül izni. 7 Dolayısıyla, önceki parçacık işlenmiş hücrelerde giriş için serbest partiküllerin randımanlı bir şekilde çıkarılması toksisite profilini en aza indirmek ve in vivo madde yüklü parçacıklara yönlendirilmiş maruz kalmayı azaltmak için büyük bir önem taşımaktadır.

Konvansiyonel gradient santrifüj genellikle ücretsiz parçacıklardan mühendislik hücreleri ayırmak için kullanılan, ancak zahmetli ve toplu modunda çalıştırılır. Ayrıca, yüksek hızda santrifüj sırasında hücreler ve hücre bütünlüğü ve / veya etkisi hücre davranışını bozabilir yoğunluk gradyan ortamının bileşenleri yaşadığı kayma gerilmeleri. 8 Mikroakiskan sev ile cazip bir alternatifdeterministik yanal deplasman (Anti Blokaj Sistemi) 9, 10,11 dieletrophoresis ve küçük partiküllerin ayrılması ve tampon değişimi uygulamaları için geliştirilmiş 12 acoustophoresis dahil taraflı ayırma teknolojileri. Ancak, bu yöntemler düşük verim muzdarip (1-10 ul · dk - 1) ve sorunları tıkanma yatkındır. Böyle Dielektroforez tabanlı yöntemler olarak aktif ayrımları da içsel dielektroforetik hücre fenotipleri veya ayrılmasını sağlamak için ek hücre etiketleme adımlarla farklılıkları gerektirir. Karşısında parçacıkların veya hücrelerin yan göç nedeniyle yüksek akış koşulları ve üstün boyut çözünürlüğü nedeniyle yüksek Reynolds sayısı (Re) 13 baskın asansör güçleri (F L) farklı pozisyonlarda odaklanmak düzene - Daha umut verici bir yaklaşım eylemsiz mikroakışkanları içerir. , genellikle boyut temelli hücre ayırma 14,15 ve de tampon değişimi uygulamaları için istifade edilmiştir. 16-18 Howeveayrılan hücreler genellikle özgün ve yeni tampon çözeltileri arasındaki sınıra yakın kaldığı sürece r, tampon değişimi performansı ~10-30% kirletici solüsyonu ile yetersiz kalmaktadır. 16-18 Daha da önemlisi, hedef hücrelerin boyut dağılımı elde etmek için benzer olmak zorundadır özellikle mezenkimal kök hücreleri gibi heterojen boyutlu hücre tipleri (MKH) işlenmesinde bir sorunu teşkil orijinal tampon çözeltisinden hassas odaklama atalet ve ayırma. 19

Biz daha önce, yeni bir eylemsizlik Mikroakiskan hücre sıralama tekniği 2-giriş, 2-çıkış spiral mikro cihazı kullanılarak dolaşımdaki tümör hücrelerinin (KTC) tam kandan 20 ve bakteriler 21 izole etmek için Dean akış ayırma (DFF) olarak adlandırılan geliştirdik. Bu video protokolü, biz etiketleme THP-1 (insan akut monositik lösemi hücre hattı) süspansiyonu monositik hücreleri (~ 15 mikron) ve kalsein-l MKH (10-30 mikron) sürecini anlatacağızoaded NPler, işaretlenmiş hücreleri ve bağlanmamış NP kaldırılması verimli geri kazanımı için DFF sarmal mikrocihazda imalat ve işlem takip eder. 22. Bu tek aşamalı saflaştırma stratejisi etiketli süspansiyon ve santrifüj olmadan, taze tampon çözelti içinde süspanse yapışan hücrelerin sürekli bir iyileşme sağlar. Ayrıca, 10 milyon hücreleri · ml -1, bir hücre yoğunluğu rejeneratif tıp uygulamalarında mükellef kadar işleyebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Mezenkimal Kök Hücre ve Monositler 1. Nanopartiküller (NPS) Etiketleme

  1. Dulbecco tadil edilmiş Eagle ortamı (DMEM) içinde kültür mezenkimal kök hücreler (MSC'ler) Önceki etiketleme ≥80% konfluansa kadar% 10 cenin sığır serumu (FBS) ve antibiyotikler ile takviye edilmiştir. Benzer şekilde, Roswell Park Memorial Institute (RPMI) kültür, THP-1 hücreleri (ATCC), 1640 ortamında ~ 10 6 hücre / ml bir yoğunluğa,% 10 FBS ile takviye edilmiştir.
  2. Yük silis NPS (~ 500 mikron) bir gecede karıştırma kullanarak kalsein boya çözeltisi (200 uM) ile. Daha önce açıklanan protokol kullanılarak PLGA-kalsein AM (CAM) Üretiyor. 22
    1. 250 ug CAM ve 4 ° C'de, kloroform içinde 100 mg PLGA (50:50) içinde çözülür.
    2. Oda sıcaklığında yüksek hızlı bir homojenleştirici (13600 xg, 60 sn) kullanarak tek emülsiyon NPs oluşturun. (Çift DISTI, (3400 xg 5 dakika boyunca) santrifüj kullanılarak yıkama toplamadan önce bir kimyasal kaput (≥3 saat) kloroform buharlaşmasılled su), dondurarak kurutma ve saklama -20 ° C.
  3. 20 dakika - Cam-PLGA NP (1 mg) ya da 15, oda sıcaklığında,% 0.01 poli-L-lisin (PLL), çözelti içinde kalsein silika NPs (150 ug) inkübe edin.
  4. 5 dakika boyunca 3400 x g'de santrifüje ilgili kültür ortamının 1 ml NPS yeniden süspanse önce aşırı PLL süpernatan.
  5. Yaklaşık 24 saat (0.1 mg · mi -1 markalama konsantrasyon) - hücreleri (toplam 2 x 10 6 hücre MSC veya THP-1, ~ 1), NPs inkübe edin.
  6. Ayrıştırmaları ve% 0.25 tripsin (5 dakika, 37 ° C), 2 ml kullanılarak işaretli yapışma MKH'lerin hasat ve DMEM 6 ml ile söndürün. Mikroakışkan oluşu 10 6 hücre / ml - 10 5 bir konsantrasyona hücreleri (1000 xg, 4 dakika) ve tekrar süspansiyon dönerler. Şirketinden Mikroakiskan saflaştırma için - (10 6 hücre / ml 10 5) etiketli, THP-1 hücreleri kullanır.

2. Mikroakışkan Cihaz Hazırlık

  1. cihaz İmalatı
    1. Mikroakışkan spiral cihazı Üretiyor (500 mikron 115 mikron (h) x (w)) standart yumuşak litografi adımları kullanarak bir ticari kit gelen polidimetilsiloksan (PDMS) ile. 23
    2. Baz prepolimerin 30 g ve tartı tekne iyice sertleştirici 3 g karıştırın. Gazlardan, 60 dakika boyunca bir kurutucuda karışımı herhangi bir hava kabarcıklarını çıkarmak için.
    3. 10 mm - dikkatlice ~ 5 yüksekliğe sarmal kanal tasarımı ile desenli silikon gofret ana kalıp üzerine PDMS karışımı dökün.
    4. De-gaz 60 dakika boyunca bir kurutucu vakum karışım tekrar herhangi bir hava kabarcıklarını çıkarmak için. tüm kabarcıklar giderilinceye kadar işlemi tekrarlayın.
    5. PDMS ayarlanana kadar 2 saat için bir 80 ° C fırın içinde PDMS karışımı Cure. gofret sabit cihaz yüksekliği için kür sırasında eğik olmadığından emin olun.
    6. Bir neşter kullanılarak PDMS spiral cihazı kesin ve dikkatli bir şekilde ana kalıp PDMS levha soyun.
    7. Trbağlanma için düzgün bir yüzey sağlamak için bir neşter ile cihazın kenarları im.
    8. ağızlığı için iki delik (1,5 mm) ve 1.5 mm biyopsi zımba kullanarak PDMS cihazda çıkış için iki delik (1,5 mm) yumruk.
    9. 5 dakika boyunca 80 ° C fırın içinde cihazı kalıntıları çıkarmak ve kuruması için izopropanol (IPA) ile cihaz yıkanır.
    10. maskeleme bandı kullanarak (kanal özellikleri ile) PDMS cihazın alt yüzeyini temizleyin.
    11. maskeleme bandı kullanarak ( "3 ile" 2) cam slayt temiz bir tarafı.
    12. Dikkatle yerleştirin ve bir plazma temizleyici odasında PDMS cihaz ve cam slayt temizlenmiş yüzeyler ortaya çıkarmak ve 60 saniye boyunca vakum onları tabi. Sonraki maksimum plazma gücünü açma ve oda rengi pembe açılana kadar kamara basıncını düşürmek.
      1. 60 saniye boyunca hava plazmaya yüzeyleri Açığa. fizik içine sokulduğunda, plazma sıkı bağlama sağlar PDMS ve cam maruz kalan yüzeylerde reaktif türler oluşturanal temas. Plazma gücünü kapatın ve cihazı ve cam slayt almak için plazma temizleyici basıncı serbest bırakın.
    13. sıkıca plazma maruz kalan yüzeyleri basarak ve hiçbir kabarcıklar iki yüzey arasında sıkışıp sağlayarak bir araya PDMS cihaz ve cam slayt Bond.
    14. bağlama güçlendirmek için 2 saat boyunca 80 ° C'de ayarlanmış bir ocak gözünü kullanılarak bağlanmış cihazı ısıtın.
  2. cihazı Çalıştırma
    1. giriş şırınga için 20 cm ve her hortumun bir ucunda bir şırınga ucunu (gösterge 23) takmak - ~ 15 borusunun iki adet (1.52 mm OD) kesin.
    2. çıkışları için 10 cm ve PDMS cihazın çıkış delikleri eklemek - ~ 5 boru, iki adet (1.52 mm OD) kesin.
    3. o çıkış boru akana kadar elle başbakan,% 70 etanol içeren bir şırınga ile cihazı çalışan örnek önce. Cihazı sterilize etmek için, 1 dakika 30 saniye için etanol oturmaya bırakın.
    4. süzüldü ve 30 ml yük(0.2 um gözenek) kılıf tamponu, 60 ml şırıngaya (% 0.1 Sığır Serum Albumin (BSA) ile fosfat tamponlu tuz (PBS)) ve bir şırınga pompası şırınga sabitleyin. Doğru ayarlar için pompayı (60 ml, Cilt: 60.000 ul Şırınga boyutunu) ayarlayın.
      Not: PBS BSA ilave hücre-hücre bağlanması ve hücre ve PDMS cihaz arasında spesifik olmayan bağlanmayı en aza indirmektir.
    5. Yük 3 ml şırınga içine işaretli hücrelerin 3 ml ve ayrı bir şırınga pompası şırınga güvenli. Doğru ayarlar için pompayı (: 3 ml, Cilt: 3.000 ul Şırınga boyutunu) ayarlayın.
    6. hava kabarcıkları istikrarlı akışını sağlamak için şırınga içinde sıkışıp kalırlar emin olun. yavaşça memeden dışarı sıvı birkaç damla püskürtülmesiyle herhangi bir hava kabarcıklarını çıkarın.
    7. şırınga giriş şırınga ipuçları ve tüp bağlayın ve cihazın (kılıf ve örnek giriş) ilgili girişler içine yerleştirin. boru boyunca hava kabarcığı olmadığından emin olun.
    8. Bir invert üzerine cihazları montehücre sıralama işlemi sırasında gerçek zamanlı görüntüleme için ed faz-kontrast mikroskop.
    9. yapıştırıcılar kullanılarak mikroskop sahnede cihaza yakın küçük bir atık beher ve iki 15 ml tüpler sabitleyin.
    10. atık behere çıkış borulama yerleştirin.
    11. 1:10 kılıf tamponuna numune akış oranını ayarlamak ve sıralama işlemini başlatmak için her iki şırınga pompaları başlar (Örnek: 120 ul / dk örnek şırınga ve 1200 ul / dak kılıf şırınga için, kanal akış hızı ~ 0.38 m / sn ).
    12. Akış hızı stabilize etmek için 1.5 dakika süreyle cihazı çalıştırın. Bu yüksek hız kamerasını kullanarak faz kontrast ile parlak alan altında kanal iç duvarına yakın atalet odaklı hücrelerinin varlığı ile teyit edilebilir (~ 5000 - Saniyede 10.000 kare (fps), pozlama süresi: 10-50 mikro-sn).
    13. Hücre çıkışına ve atık çıkışından yürütücüler toplamak için farklı tüpler içine çıkış borulama yerleştirin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Gece boyunca biyo görüntüleme maddesi yüklenmiş NP ile hücrelerin etiketlenmesi sonra etiketli hücreler (serbest partikülleri içeren) toplandı ve bir tek aşamalı işlem, (Şekil 1A) serbest NPs kaldırma DFF sarmal mikrocihazda ile saflaştırılmıştır. 2-giriş, 2-çıkış spiral mikrokanal SU-8 fotorezist kullanarak mühendislik yazılımları tarafından tasarlanan ve mikrofabrike edilir. Desenli silikon yonga plâkası sonra yumuşak litografi teknikleri (Şekil 1B) kullanarak PDMS çoğaltma kalıplama için bir şablon olarak kullanılır. iç duvar giriş hücre örneği akışını sıkıştırmaya daha yüksek bir akış hızı (1:10) taze tampon çözeltisi çalışırken hücre sıralama yapmak için, hücre örneği sarmal mikrocihazda dış duvarı girişine pompalanır. Ayırma eylemsiz bir iç duvar ve dış duvar (Şekil 2A) doğru küçük bağlanmamış NPlerin Dean-kaynaklı yeniden çevrim oranında daha büyük bir işaretli hücrelerin odaklama ile elde edilir. Cihaz ilk başvurunun olduEd kalsein yüklü flüoresan silika NP etiketli süspansiyon monositik hücreleri (THP-1) sıralama (~ boyutu 500 nm). Yüksek hızlı görüntüleme (Şekil 2A) ile teyit ve analiz (Şekil 2B) akış sitometrisi gibi yüksek ayırma verimlilikleri elde edilmiştir. THP-1 hücrelerinden - (5 um ~ 1) Aygıt hücresi çıkışında toplanan yıkama sıvıları görüntüleri de silika ve PLGA NPlerin randımanlı bir şekilde uzaklaştırılmasını göstermektedir. Buna ek olarak, flüoresan görüntüleme etiketli, THP-1 hücrelerinde içsel NPler de DFF saflaştırma (ilaveler) (Şekil 3) sırasında da korunur olduğu tespit edilmiştir. MSC boyutu heterojenite nedeniyle, spiral mikro geometrisi sonradan MSC (Şekil 4) etkin bir koleksiyon sağlamak için kanal yüksekliği ve çatallanma tasarımını değiştirerek modifiye edildi.

Şekil 1
Şekil 1. (A) OvDean Akış Fraksiyonu (DFF) mikroakışkan teknolojisini kullanarak süspansiyon ve yapışan hücreler sonrası etiketleme gelen hızlı tek-adımlı mikro / nanoparçacık (NPS) kaldırılması için ERALL iş akışı. (B) DFF spiral cihaz mühendislik yazılımı tarafından tasarlanan ve mikrofabrikasyon kullanarak silikon gofret desenli. PDMS cihazları sonradan yumuşak litografi yöntemleri ile üretilmektedir. Deneysel kurulum etiketli hücreleri ve sürekli arınma ve işaretli hücrelerin toplanması için cihazın içine farklı akış hızlarında taze tuzlu tampon demlenmeye 2 şırınga pompaları oluşmaktadır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

şekil 2
DFF ile etiketlenmiş, THP-1 hücreleri, Şekil 2 Nanopartiküller çıkarılması (A). ÇizimiDFF ayırma ilkesi. Büyük etiketli hücreleri güçlü atalet kaldırma kuvvetlerinin (F L, kırmızı oklar) ve Dean sürükleme kuvvetleri (F D, sarı oklar) deneyim ve mikrokanal iç duvarına yakın odak. Daha küçük NPS ve tampon çözelti sadece Dean sürükle etkilenen ve ayrılmasını sağlamak için dış duvara sirküle edilir. Örnek yüksek hız ve çıkış bölgesinde kalsein boyası yüklendi THP-1 hücrelerinin (kırmızı oklar) ve silika NP denge konumlarını gösteren floresan ve görüntüler. (B) Ayırma performans boyutu (FSC-A) ve ayrıntı (SSC-A) karakteristikleri tarafından belirlenen yolluk ile flow sitometri analizi dayalı. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3,
Şekil 3. > DFF. Insets ilgili faz sözleşmesi (yukarıda) ve bireysel hücrelerin floresan mikroskobu görüntülerini göstermek kullanılarak THP-1 hücreleri (kırmızı oklar) ve NPS kaldırma verimliliği etiketli arıtılmış Temsilcisi parlak bir alan görüntüler. Bu büyük halini görmek için tıklayınız rakam.

Şekil 4,
Farklı çıkışları içine verimli MKH'lerin ayrılmasını (kırmızı oklar) ve PLGA NPS (mavi oklar) gösteren mezenkimal kök hücrelerin DFF üzerinden (MKH). (A) Temsilcisi yüksek hızlı görüntü gelen Şekil 4. Nanopartiküller kaldırma. Sarı çizgiler mikrokanal duvarları yaklaşık konumunu belirtmek kesik. Silika ve PLGA NPS den MKH (B) Ayırma performansı.pg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Burada tarif edilen DFF hücre saflaştırma tekniği, yüksek verimli bir şekilde etiketlenmiş hücrelerin hızlı ve sürekli ayırma sağlar. Bu ayırma yaklaşımı büyük örneklem hacmi veya yüksek hücre konsantrasyonu numune işleme için idealdir ve uzun süreli kullanım sonrasında tıkanmaya meyilli olan klasik membran bazlı filtreleme daha iyidir. Benzer bir şekilde, afinite bazlı manyetik ayırma zahmetli ve pahalı ek hücre etiketleme adımları gerektirir. Saflaştırılmış hücreleri (kanal içinde dolayı kısa süre kalmasından etiketlerinde maddeleri ve de hücre morfolojisi minimum akış / kesme kaynaklı etkileri ile (Şekil 3) (kesilme baskısı τ, ~ 200-250 din / cm2) tutmak için gösterilmiştir < 1 sn) 20,24. Buna ek olarak, kullanıcı sadece istenilen medya ya da tampon çözelti ile kılıf tamponu (tuzlu su) ikame sıralama kriteri: işaretli hücrelerin yıkandı çözümü seçebilirsiniz.

Bu çok önemlidirolumsuz hücre odaklama davranışını etkileyebilir mikrokanal önce kullanımda hiçbir kir veya enkaz var. Bu tamamen IPA giriş delikleri temizleme, hem de plazma Yapıştırmadan önce PDMS yüzeyi temizlemek için maskeleme bandı kullanılarak elde edilebilir. microdevice yüksek akış şartlarında çalıştığından (~ 1-1,5 ml / dak), PDMS ve cam slayt arasındaki güçlü bağ sağlamak için bir ocak bağlı PDMS cihazlar ısıtmak için de önemlidir. hücreler, odaklama değildir cihaz işlemi sırasında, bu akış hızı yeterli olmadığı anlamına gelir. Bir herhangi bir sızıntı olmadığından emin olmak için aygıt giriş bölgesini ve şırınga ipuçları kontrol ederek giderebilirsiniz.

Etiketli hücrelerden ilişkisiz NPS uzaklaştırılması ortak laboratuvar ayırma teknikleri (örneğin, santrifüj) beri önemsiz değildir olamaz ayrı parçacıklar / farklı boyutlarda (örneğin, bağlanmamış parçacıklar ve etiketli hücreleri) hücreleri. bir tekrarlanan yıkama iddia süreve kültür ortamı değişen proses süspansiyon hücre kültürleri için zahmetli ve etkisizdir, belirli bir dereceye kadar yapışık hücreler serbest NPs kaldırabilir. DFF mikroakışkan cihaz boyutu bazlı sıralama kullanır ve farklı malzemelerden NPlerin süspansiyon ve yapışkan hücreler geniş bir boyut aralığı ile, hem de kaldırma işlemleri için kullanılabilir gibi son derece çok yönlüdür. Hedef hücreler farklı boyutlarda ise, DFF cihazı etkin ayrılmasını sağlamak için akış şartları ve kanal geometrisi (örneğin, kanal yüksekliği ve iç ve dış kanalın genişlikleri oran) değiştirilerek optimize edilebilir. Daha önce, DFF en az hücre kaybıyla NPS çıkarılması geleneksel santrifüjleme ile karşılaştırıldığında üstün olduğu gösterilmiştir. 22 Bundan başka, hücre elde performansı yüksek kalmıştır (>% 90) bir numunesi, konsantrasyonu 10 7 hücre / ml 'e yükseltildiği zaman. Bu geneldir mevcut atalet mikroakışkan hücre ayırma yöntemleri üzerinde önemli bir gelişmedirly nedeniyle hücre-hücre etkileşimi ve hücre denge pozisyonlarında aşırı kalabalık 10 5 hücre / ml kapasiteli sınırlı. 25

DFF teknolojisi boyut farkına dayanarak ayırma elde birlikte, bunun nedeni, hücre boyutunda önemli bir değişim bu tür etiketli ve etiketsiz hücrelerinin ayrılması gibi diğer hücre tekniği süreçleri için kullanılamaz. afinite bazlı sıralama ve diğer ortak ayırma yöntemlerinin (manyetik duyarlılık ve elektriksel iletkenlik) Hücre yüzey belirteçleri gibi potansiyel uygulamalar için düşünülebilir. DFF teknolojisi, floresan göre çoklanmış hücre sıralama için uygun değildir. Daha iyi bir seçenek, yüksek kapasite ile çalışan, farklı floresan ile etiketlenmiş hücrelerin tek aşamalı sıralama için (FACS) floresan aktive hücre kullanılabilir, ancak pahalı ve hantal ekipman gerektirir olacaktır.

Son olarak, bu protokol işlenmiş hücrelerde olduğunda saflaştırılması için son derece yararlıdırDönüştürücü maddeler (büyüme faktörleri, ilaçlar, steroid, vb) içeren NPler bio ve / veya hücre tedavisi için kullanılır. Kalan serbest NPler, in vivo olarak enjekte edildiğinde bu yabancı parçacıkların yanıt komşu hücreler ya da bağışıklık hücreleri üzerinde hedef dışı dönüştürücü etkilere neden olmasıdır. Aynı zamanda istemeden Biyogörüntüleme sırasında yanıltıcı olabilir sinyalleri üretebilir. kullanımdan önce bu ücretsiz NPS uzaklaştırılması dolayısıyla, hedef olmayan hücrelere riskini azaltmak bağışıklık sisteminde derlemeler en aza indirmek ve hücrelerin ardışık etiketleme / mühendislik sırasında adımlar arasında kontaminasyon sorunlarını azaltmak. Onun başarılı bir şekilde uygulanması büyük ölçüde hücre etiketleme kolaylaştırır ve tedavide parçacık tabanlı cep mühendisliği parazitsiz kullanım sağlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell lines & Media
Mesenchymal Stem Cells (MSCs) Lonza PT-2501
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) Lonza 12-614F
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco 10270-106
THP-1 monocyte cells (THP-1) ATCC TIB-202
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 media Lonza 12-702F
Reagents & Materials
0.01% poly-L-lysine (PLL) Sigma-Aldrich P8920
3 ml Syringe BD 302113 Syringe 3 ml Luer-Lock
60 ml Syringe BD 309653 Syringe 60 ml Luer-Lock
Bovine Serum Albumin (BSA) Biowest P6154-100GR
Calcein, AM (CAM) Life Technologies C1430
Calcein Sigma-Aldrich C0875
Isopropanol Fisher Chemical #P/7507/17 HPLC Grade 2.5 L
Phosphate-Buffered Saline (PBS) Lonza 17-516Q/12
Plain Microscope Slides Fisher Scientific FIS#12-550D 75 x 25 x 1 mm3
Polydimethylsiloxane (PDMS) Dow Corning SYLGARD® 184
Scotch tape 3M 21200702044 18 mm x 25 m
Silica NPs (∼200 μm) Sigma-Aldrich 748161 Pore size 4 nm
Syringe Tip JEC Technology 7018302 23 G 0.013 x 0.25
Trypsin-EDTA (0.25%) Life Technologies 25200-056
Tygon Tubing Spectra-Teknik 06419-01 0.02 x 0.06" 100
Poly (D,L-lactide-co-glycolide) (PLGA; 50:50) Sigma-Aldrich P2191
Equipment
Biopsy punch Harris Uni-Core 69036-15 1.50 mm
Dessicator Scienceware 111/4 IN OD
High-speed Camera Phantom  V9.1
Inverted phase-contrast microscope  Nikon Eclipse Ti
Plasma cleaner Harrick Plasma PDC-002
Syringe Pump Chemyx CX Fusion 200

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wiraja, C., et al. Aptamer technology for tracking cells' status & function. Mol. Cell. Ther. 2, 33 (2014).
  2. Yeo, D. C., Wiraja, C., Mantalaris, A., Xu, C. Nanosensors for Regenerative Medicine. J. Biomed. Nanotech. 10, 2722-2746 (2014).
  3. Naumova, A. V., Modo, M., Moore, A., Murry, C. E., Frank, J. A. Clinical imaging in regenerative medicine. Nat. Biotechnol. 32, 804-818 (2014).
  4. Soenen, S. J., et al. Cellular toxicity of inorganic nanoparticles: Common aspects and guidelines for improved nanotoxicity evaluation. Nano Today. 6, 446-465 (2011).
  5. Donaldson, K., Poland, C. A. Nanotoxicity: challenging the myth of nano-specific toxicity. Curr. Opin. Biotechnol. 24, 724-734 (2013).
  6. Veiseh, O., et al. Size- and shape-dependent foreign body immune response to materials implanted in rodents and non-human primates. Nat. Mater. 14, 643-651 (2015).
  7. Jones, S. W., et al. Nanoparticle clearance is governed by Th1/Th2 immunity and strain background. J. Clin. Invest. 123, 3061-3073 (2013).
  8. Marchi, L. F., Sesti-Costa, R., Chedraoui-Silva, S., Mantovani, B. Comparison of four methods for the isolation of murine blood neutrophils with respect to the release of reactive oxygen and nitrogen species and the expression of immunological receptors. Comp. Clin. Pathol. 23, 1469-1476 (2014).
  9. Morton, K. J., et al. Hydrodynamic metamaterials: Microfabricated arrays to steer, refract, and focus streams of biomaterials. Proc. Natl. Acad. of Sci USA. 105, 7434-7438 (2008).
  10. Hu, X., et al. Marker-specific sorting of rare cells using dielectrophoresis. Proc. Natl. Acad. of Sci USA. 102, 15757-15761 (2005).
  11. Cummings, E. B. Streaming dielectrophoresis for continuous-flow microfluidic devices. IEEE Eng. Med. Biol. Mag. 22, 75-84 (2003).
  12. Augustsson, P., Persson, J., Ekstrom, S., Ohlin, M., Laurell, T. Decomplexing biofluids using microchip based acoustophoresis. Lab Chip. 9, 810-818 (2009).
  13. Di Carlo, D., Irimia, D., Tompkins, R. G., Toner, M. Continuous inertial focusing, ordering, and separation of particles in microchannels. Proc. Natl. Acad. of Sci USA. 104, 18892-18897 (2007).
  14. Hur, S. C., Henderson-MacLennan, N. K., McCabe, E. R. B., Di Carlo, D. Deformability-based cell classification and enrichment using inertial microfluidics. Lab Chip. 11, 912-920 (2011).
  15. Mach, A. J., Di Carlo, D. Continuous scalable blood filtration device using inertial microfluidics. Biotechnol. Bioengin. 107, 302-311 (2010).
  16. Gossett, D. R., et al. Inertial manipulation and transfer of microparticles across laminar fluid streams. Small. 8, 2757-2764 (2012).
  17. Amini, H., et al. Engineering fluid flow using sequenced microstructures. Nat. Commun. 4, 1826 (2013).
  18. Sollier, E., et al. Inertial microfluidic programming of microparticle-laden flows for solution transfer around cells and particles. Microfluid. Nanofluid. 19, 53-65 (2015).
  19. Lee, W. C., et al. Multivariate biophysical markers predictive of mesenchymal stromal cell multipotency. Proc. Natl. Acad. of Sci USA. 111, E4409-E4418 (2014).
  20. Hou, H. W., et al. Isolation and retrieval of circulating tumor cells using centrifugal forces. Sci. Rep. 3, 1259 (2013).
  21. Hou, H. W., Bhattacharyya, R. P., Hung, D. T., Han, J. Direct detection and drug-resistance profiling of bacteremias using inertial microfluidics. Lab Chip. 15, 2297-2307 (2015).
  22. Yeo, D. C., et al. Interference-free Micro/nanoparticle Cell Engineering by Use of High-Throughput Microfluidic Separation. ACS Appl. Mater. Inter. 7, 20855-20864 (2015).
  23. Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft Lithography. Angew. Chem. Int. Edit. 37, 550-575 (1998).
  24. Lee, W. C., et al. High-throughput cell cycle synchronization using inertial forces in spiral microchannels. Lab Chip. 11, 1359-1367 (2011).
  25. Kuntaegowdanahalli, S. S., Bhagat, A. A., Kumar, G., Papautsky, I. Inertial microfluidics for continuous particle separation in spiral microchannels. Lab Chip. 9, 2973-2980 (2009).

Tags

Biyomühendislik Sayı 113 Hücre Mühendisliği Hücre Ayrımı Dean Akış Fraksiyonu Microfluidics Nanoparçacıklar Rejeneratif Tıp
Parazit Mikro / Nanoparçacık Hücre Mühendisliği mikroakışkan Tampon Değişim
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tay, H. M., Yeo, D. C., Wiraja, C.,… More

Tay, H. M., Yeo, D. C., Wiraja, C., Xu, C., Hou, H. W. Microfluidic Buffer Exchange for Interference-free Micro/Nanoparticle Cell Engineering. J. Vis. Exp. (113), e54327, doi:10.3791/54327 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter