Abstract
, 생체 이물질 '독성 테스트 바이러스 감염 연구 및 간암을 대상으로 약물을 개발하기위한 목적으로, 시험 관내 간세포의 기능을 유지하는 능력은 세포 적당한 생화학 적 및 기계적 신호를 수신 한 플랫폼이 필요하다. 최근 간 조직 공학 시스템은 높은 수분 보유하고 세포에 필요한 기계적인 자극을 제공 할 능력이 주어 합성 또는 천연 하이드로 겔로 구성된 3 차원 지지체를 이용 하였다. 반전 콜로이드 결정 (ICC) 지지체에 대한 관심이 증가되고있다, 높은 공간 조직 동형과 이형 세포의 상호 작용뿐만 아니라, 세포 외 기질 (ECM)의 상호 작용을 가능하게하는 최근에 개발. 여기서, 우리는 폴리 (에틸렌 글리콜) 디 아크릴 레이트 (PEGDA) 및 입자 침출 방법을 이용하여 ICC 지지체를 제조하는 프로토콜을 기술한다. 간략하게, 격자는 미세 입자로부터 만들어지는 전 후 polymeR 용액 중합 적절히 첨가되고, 입자는 유기 용매 (예 : 테트라 히드로 푸란)을 사용하여 제거하거나 침출된다. 제어 된 기공 크기 및 미디어보다 쉽게 세포에 도달 할 수 있도록 상호 연관성이있는 다공성 지지체의 격자 결과의 용해. 이 독특한 구조는 세포뿐만 아니라 쉽게 기공 사이의 통신, 및 단백질과 PEGDA의 ICC 지지체는 전지 성능에 현저한 효과를 나타낸다 코팅 할 수있는 능력에 부착하기위한 고 표면적을 허용한다. 우리는 가능성의 관점에서, 골격의 형태뿐만 아니라, 간암 세포 (허 7.5) 동작을 분석하고 ICC 구조 ECM 코팅의 효과를 조사하는 기능을한다. 전반적으로,이 논문은 조직 공학에서 다양한 응용 프로그램, 특히 간 조직 공학을 가진 새로운 발판의 상세한 프로토콜을 제공합니다.
Introduction
간은 혈액 해독, 생체 이물질의 대사 및 혈청 단백질의 생산을 포함하여 다양한 기능을 가진 매우 혈관 기관이다. 간 조직은 여러 종류의 세포, 담즙 누소관, 정현파 및 다른 biomatrix 조성물 및 다른 산소 농도의 영역으로 포함하는 복잡한 3 차원 마이크로 구조를 갖는다. 이러한 복잡한 구조를 고려할 때 시험 관내 (1) 적절한 간 모델을 만드는 것이 어려웠다. 그러나, 시험 관내 모델에서 기능 테스트 약물 독성 2 플랫폼 인간 간세포를 호스팅 간 3과 관련된 질환을 연구하는 수요가있다.
현재 간암 조직 공학 플랫폼 조나의 생화학 적 조성물을 분리, 또는 간장의 파라미터 중, 몇 개의 셀 (4) 즉, 공존 배양을 집중하여 간암의 복잡성을 단순화 한L 개의 미세 환경 5 유동 역학 6,7 및 biomatrix 8의 구성. biomatrix 구성은 지지체 물질, 세포 외 기질 (ECM) 단백질 조성물, 매트릭스 경도뿐만 아니라 지지체의 디자인 및 구조와 같은 파라미터로 나눌 수있다. 조정 하이드로 겔의 기계적 특성, 생체 활성 및 열화 율에 기능 부여, 합성 하이드로 겔, 특히 폴리 (에틸렌 글리콜) (PEG)을 사용하여 하이드로 겔 9 조직 공학 연구의 증가가 있었다. 간 관련 연구와 관련하여, 생체 적합성 하이드로 겔은 간 질환 3의 바이러스 감염 연구에 적용 하였다. 간세포 플랫폼 설계로서 수많은 연구는 생체 내 미세 환경에서 모방 필수적인 차원 환경과 셀 ECM 및 세포 - 세포 상호 작용을 제공하기 위해 하이드로 겔 (12, 13) 내에서 간세포 샌드위치 배양 10,11 세포 캡슐화를 이용했다. 하우버전, 이러한 플랫폼은 지지체 (14)를 통해 비 균일 한 특성을 선도, 제어 및 공간 조직의 높은 수준을 가지고 있지 않습니다.
반전 결정 콜로이드 (ICC)는 14 비계 먼저 2000 년대 초반에 도입 된 세포 배양을위한 매우 조직 차원의 발판이다. 발판의 독특한 구조는 콜로이드 성 결정 가변 직경의 콜로이드 입자의 정 합체를 이용하여 간단한 제조 공정에 기인 할 수있다. 간략하게, 프로세스를 요약하기 위해, 입자는 깔끔하게 배치 격자를 형성하는 열을 이용하여 어닐링된다. 고 표면적을 갖는 육방 충전 구형 캐비티 (15)의 중합 된 겔 결과, 유기 용매에 의한이 격자의 침출. 이 높은 순서 지지체 이전 (아크릴 아미드) 16-21, 폴리 (락트산 - 코 - 글리콜 산), 폴리에 한정 15,22-30, 합성 및 천연 재료 모두에서 만들어진 포함하되되었는지폴리 (에틸렌 글리콜) (31, 32), 폴리 (2- 히드 록시 에틸 메타 크릴 레이트) 21,33-35, 키토산 36-39. 비 오염 물질로 만들어진 ICC의 발판이 공동 14,23,40 내에서 세포 회전 타원체를 촉진하는 경향이있다. 여러 종류의 세포가 성공적으로 셀 (43, 44)을 확산이 구성에서 차별화 기능 연골 41, 골수 간질 세포 (42)를 포함하고, 줄기 밝혀졌다. 간세포 대해서는 연구 된 ICC 나 2 SiO3과 폴리 (아크릴 아미드)로 이루어지는 지지체 아니라 PEG로 수행되었다. 간단한 바이오 콘쥬 게이션 전략 (즉, EDC / NHS를 통해 아민 커플 링), ECM 단백질 공역 PEG 기반의 발판이 환경과 같은 생체 내에서 더를하고 간 기능을 향상시키기 위해 더 많은 세포 결합 부위를 입증 할 수있는, 제조 할 수있다.
이 원고 및 관련 비디오에서 세부 사항에게 ICC 지지체의 제조를 우리(허 7.5) 배양 간암에 최적화 된 폴리 (에틸렌 글리콜) 디 아크릴 레이트 (PEGDA), 하이드로 겔 및 폴리스티렌 미세 구조 격자를 사용. 우리는 비계 토폴로지 및 전지 성능의 관점에서 일반적으로 비 접착식 베어 PEGDA의 ICC의 발판과 콜라겐 코팅 PEGDA의 ICC 지지체의 차이점을 보여줍니다. 세포 생존 및 기능이 허 - 7.5 셀 행동을 평가하는 정 성적 및 정량적으로 측정한다.
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Protocol
1. ICC의 비계 제작 (그림 1)
- 폴리스티렌 (PS) 울타리 (비드의 8-13 층 직경 = 6 mm)를 준비합니다.
- 40 μl의 수준에서 0.2 ml의 증발 증거의 microcentrifuge 튜브에서 팁을 절단, 금형을 제조 하였다. 방수 접착제 24 X 60mm (2) 현미경 커버 유리 전표에 컷 튜브의 상단을 준수합니다.
- 신중하게, 20 ml의 유리 병에 물 현탁액에 포함 된 PS 구 (직경 = 140 μm의)를 넣어 물 현탁액을 피펫, 그리고 유리 병에 18 ml의 70 %의 에탄올 용액을 추가합니다. 집계 구를 풀어 초음파 욕조에 구 솔루션을 넣습니다. 완전히 물 및 수용성 성분을 제거하기 위해 세정 공정이 여러 번 반복.
- 몰드에 에탄올 100 μL 피펫.
- 4mm하여 200 μL의 마이크로 피펫 팁의 상단을 잘라. 회를 달성하기 위해 200 ㎕를 마이크로 피펫을 사용하여 몰드로 분야의 25 μL 피펫각각의 금형에 50 μL의 총 부피.
- 120 rpm으로 하룻밤에 흔들 통에 금형을 놓습니다.
- 광학 현미경으로 각 금형의 구체의 배열을 확인합니다. 구체가 육방 정렬되지 않은 경우, 70 % 에탄올의 50 μL를 추가 한 구성을 정정하기 종횡 축 방향으로 수동으로 흔들.
- 이틀 동안 실온 (RT)에서 에탄올의 증발을 보자. 의 PS 구슬을 어닐링 6 시간 동안 130 ℃로 가열로에서 금형 및 비드 단지를 배치합니다.
- 베어와 ECM 코팅 PEGDA의 발판을 준비.
- (= 4.6 kDa의 승 M)를 선형 PEG의 거대 단량체를 아클을 위해 설립 프로토콜 45, 46을 사용하여 PEGDA의 거대 단량체를 합성.
- 탈 이온화 (DI) 물에 PEGDA 용액 (V / w) 50 %를 준비하고 로머가 제대로이 완전히 용해 될 때까지 4,713 XG에서 원심 분리하여 용해 할 수 있습니다.
- ECM 공액 ICC 지지체를 들어, 추가 용해10 % 50 % PEGDA 솔루션에 아크릴로 일 - PEG-NHS (M 3.4 = w kDa의) (V / w).
- 20 %를 준비 '2- 히드 록시 - (4)의 스톡 용액 (/ V w) - (2- 히드 록시에 톡시) -2- methylpropiophenone (PI) 70 % 에탄올이다.
- 20 % 50 % 1 ㎖ 당 (w / v)의 PI 원액의 50 μl를 추가 (W / V) PEGDA의. PEGDA의 분자량에 기초하여 PI 원액의 필요한 양을 조정한다.
- 소용돌이 1 분 동안 원심 분리 관에 가하여 균일 용액에 도달한다.
- 필 (단계 1.1.7에서) 유리 슬라이드에서 금형은 금형에서 접착제를 제거 조심스럽게 주걱을 사용하여 격자를 밀어 1.5 ML 튜브로 각각 배치합니다. 5 분 845 XG에서 PEGDA 솔루션 및 원심 분리기의 피펫 300 μL는 격자에 적절한 PEGDA 솔루션 침투를 허용합니다.
- 핀셋을 사용하여 튜브의 격자를 제거하고 조심스럽게 장갑 건조 초과 PEGDA 솔루션을시킨다. 평면 CIR과 파라핀 필름 피복 유리에 격자를 배치이 위를 향하도록 큘라면.
- 자외선 자리 램프를 사용하여 5 분 동안 365 nm의 자외선 (UV) 빛 (10.84 mW의 / cm 2)에 PEGDA 솔루션 침투 발판을 노출.
- 새로운 유리 병에 PEGDA 중합 결정 격자를 놓고 테트라 히드로 푸란 20 ㎖를 추가 (THF) (10 바이알 당 그릴 정도). 300 rpm으로 궤도 통에 유리 병을 흔들어. 1-2 시간의 간격으로 THF에게 적어도 3 회를 변경합니다.
참고 차례로 PS의 불완전한 제거를 일으킬 수있는 발판을 기포가 들어 가지 않도록하기 위해, THF를 변경할 때 완전히 THF를 제거하지 않는다. 격자를 커버하고 새로운 THF를 추가 할 수있는 충분한 솔루션을 둡니다.
주의 : THF 독성이다. 장갑, 실험실 코트와 고글을 착용 할 것. 흄 후드에서 작동하여 흡입을 피할 것. - PS 구가 사용 된 THF 용액에 물을 넣고 용액의 색을 관찰하여 용해되어 있는지 확인합니다. 의 PS 분야가 제대로 용해되지 않은 경우 단계를 반복 1.2.9.
참고 :이 솔루션의 색상이 변경됩니다백색 잔여 PS 분야가있는 경우.
- 바이오 안전성 캐비닛 (BSC)의 발판을 청소합니다.
- 골격을 살균, 지지체 당 70 % 에탄올 2 ㎖와 50 ㎖ 원심 분리 튜브를 준비하고, 주걱을 이용하여 튜브 내의 지지체를 배치. 골격이 1 시간 동안 에탄올에 담가 할 수 있습니다. 앞으로이 단계에서, BSC 모든 절차를 수행.
- 조심스럽게 에탄올을 부어 3 분 거품을 제거하기 위해 524 XG에 인산 완충 식염수 (PBS) (비계 당 2 ㎖) 및 원심 분리기로 교체합니다. 냉장고에 보관하고 1 ~ 2 시간의 간격으로 PBS를 몇 번 변경합니다.
- 콜라겐 유형, 콜라겐 타입 1 원액을 포함하는 다른 50 ML의 원심 분리기 튜브 (비계 당 1 ㎖) 준비 3 분 동안 524 XG에 주걱, 원심 분리기를 사용하여이 튜브에 소독 발판을 전송 발판을 나는 코팅. 30 분 동안 궤도 통에 400 rpm에서 공사장 공중 발판을 흔들어하고 냉장고에 튜브를 유지또는 밤새.
- PBS를 흡입 한 다음 신선한 PBS의 발판을 잠수에 의해 두 번 사용하기 전에 PBS로 발판을 씻으십시오.
주 : NHS의 화학 결합 (도 2)을 형성하는 아민기를 필요로하기 때문에 다른 ECM 단백질 대신 콜라겐 I 형으로 사용될 수있다.
ICC 제조 1. 개요도. PEG 기반 ICC의 발판 함께하고 ECM-작용하지 않고 미세 가공 기술을 사용하여 제조된다. ECM 코팅 ICC의 발판은 PEG-NHS뿐만 아니라 PEGDA (그림 2에 설명 된대로)가 필요합니다. 추신 격자 6 mm의 직경과 8-13 비드 층의 높이를 갖는다. PS, 폴리스티렌; PEGDA, 폴리 (에틸렌 글리콜) 디 아크릴 레이트; UV, 자외선; THF, 테트라 하이드로 푸란; ECM, 세포 외 기질. 이 그림은 수정 및 Wi에서 허가를 받아 사용되었습니다목초지 (47). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
2. ICC 구조 특성
- , 또는 공액 단백질없이 ICC 구조 분석 주사 전자 현미경 (SEM) (47)를 사용한다.
- 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)와 비계 해결 직렬 25, 50, 75, 95, 100 % 에탄올 솔루션을 탈수하고, 에탄올이 완전히 증발 될 때까지 -80 ℃에서 보관.
- 48 시간 동안 동결 건조기에서 건조 샘플.
- 스퍼터 코팅기에 탄소 테이프와 장소를 사용하여 샘플 홀더 상에 샘플을 부착합니다.
- 자동 진공 청소기로 청소 한 후, 20mA에서 60 초 동안 스퍼터링 10 나노 미터 두께의 Pt 막 코트를.
- 5 kV의 (도 3a,도 4a)의 전압을 사용하여 SEM 이미지 ICC 지지체.
- 기공을 측정하고공동 배선 직경은 이미지 분석 소프트웨어 (48) (도 3B, C 예 ImageJ에)을 이용하여 SEM 현미경 사진을 분석한다.
- 세포가없는 지지체에 접합 된 콜라겐, 형광 태그를 시각화하는 항체 (1 : 100)를 이용하여 콜라겐 공 초점 레이저 주사 현미경 (47)과 콜라겐 타입 I 화상에 대해 (CLSM을,도 4b).
3. 허 - 7.5 세포 배양 및 시드
- 10 ㎖ 둘 베코 변형 이글 배지에 10 % 소 태아 혈청 (FBS)으로 보충 (DMEM), 100 U / mL를 100mm 세포 배양 접시에서 2-2.5 × 106 세포 / ml의 접종 밀도로 배양 응 7.5 세포 BSC에 37 ° C에서 페니실린 - 스트렙토 마이신 (성장 미디어), 5 % CO 2. 변경 미디어 3 일마다 그들은 75-80%의 포화 상태에 도달 할 때까지.
- BSC에 세포의 파종을위한 발판을 준비합니다.
- 조심스럽게 scaff를 배치평면과 24 웰 플레이트에 어린이가 위를 향.
- 각 웰 발판을 포함하여 비계, 피펫 2 ml의 PBS를 세척합니다. PBS를 피펫 2ml를 각 웰에 신선한 PBS를 대기음.
- PBS를 성장 미디어 피펫 2 ml에 기음 (단계 3.1 참조), 30 분 동안 둡니다. 미디어를 기음과 비계가 1 시간 동안 건조 할 수 있습니다.
- 트립신 소화 방법을 사용하여 BSC의 문화 판에서 (3.1 단계)에서 합류 허 - 7.5 세포를 분리합니다.
- 접시에서 대기음 매체는 부착 세포를 씻어 4 ml의 PBS를 추가 한 후 PBS를 대기음.
- 피펫 37 ° C에서 인큐베이터에 0.75-1 ml의 0.25 % 트립신과 장소, 5 %의 3 분 CO 2.
- 트립신의 반응을 정지 인큐베이터와 피펫에서 5 ml의 미디어를 플레이트를 제거합니다. 15 ML 튜브에 피펫 미디어, 분리 된 세포 및 트립신 혼합물.
- 3 분 동안 524 XG에 원심 분리기, 뜨는을 제거하고 5 ml의 미디어 펠렛을 재현 탁.
- 혈구를 사용하여 세포를 세어 25 μL 당 대상 번호, N 0 세포를 포함하는 세포 현탁액의 양을 계산한다 (표준 실험을 위해, N 0는 1 × 10 6 세포이다).
세포 현탁액 부피 = (셀의 목표 개수) / (세포 현탁액의 농도) - 천천히 직접 (단계 3.1.4에서) 각 지지체 위에 세포 현탁액 (포함 N 0 세포)의 25 μl를 피펫. 인큐베이터에서 24 웰 플레이트를 놓습니다.
- 12 시간 후, 각 웰에 새로운 24 웰 플레이트 피펫에 주걱의 사용으로주의 깊게 미디어 2 ㎖을 발판을 전송합니다. 인큐베이터에서 24 웰 플레이트를 놓습니다.
- 3 일마다 미디어를 변경하거나 미디어는 단백질 분비 분석 (단계 5.1 참조)를 수집하는 경우에 따라 다릅니다.
4. 세포 생존
- 질적으로 세포 생존율을 분석하기 위해, C를 사용하여 세포와 이미지를 얼룩 형광 라이브 / 죽은 염색 키트를 사용하여LSM.
- 키트 지시에 따라, 4 μM의 칼 세인의 AM 8 μM 티듐 호모 다이머 -1 매체로하는 용액을 제조한다 (단계 3.1.3 참조).
참고 : 셀 수에 따라 최적화 할 수 있습니다. 세포 증식 및 (2 백만 정도) 수의 두 경우 시약의 두 배를 사용합니다. - BSC에에서 잘 발판 (단계 3.7) 및 피펫 제조 된 용액 500 μL와 각각 흡인 미디어. 1 시간 동안 37 ° C를 인큐베이터에서 샘플을 품어.
- 인큐베이터에서 접시를 제거 할 때 빛으로부터 샘플을 보호하기 위해 호일로 접시를 커버. CLSM49를 사용하여 이미지 샘플.
- 키트 지시에 따라, 4 μM의 칼 세인의 AM 8 μM 티듐 호모 다이머 -1 매체로하는 용액을 제조한다 (단계 3.1.3 참조).
- 정량적 (생균에서) 효소 활성을 측정하는 비색 분석법 (50)를 사용하여 세포 생존율을 평가하기 위해 (즉, 2- (2- 메 톡시 -4- 니트로 페닐) -3- (4- 니트로 페닐) -5- (2,4- 디 술포) -2H-테트라 졸륨 (모노 나트륨 소금 시약)).
- 국제 형사 재판소 플랫폼을위한 표준 곡선 (흡광도 (OD) V의 즉, 그래프 작성ersus) 휴대폰 번호 부여.
참고 : 세포 골격의 공동 통과 할 수 있기 때문에 셀 시드가, 다른 플랫폼에 비해 100 % 효율적이다.- 표준 곡선을 만들기 위해 사용되는 세포 시딩 번호, N 0을 결정한다.
참고 : 실험 추정되는 세포 수를 포함하는 범위를 선택합니다. 예를 들어, 초기 셀 수가 5 × 105 세포이고, 2.5 × 105, 5 × 105, 1 × 6, 2 개 선택 실험 마지막 날에 의해 약 2 ~ 3 배의 증가가 있으면 N 0과 같은 10 6 세포. - 단계 3.1-3.6에 설명 된대로 ICC의 비계 (25 μL의 시딩 볼륨 발판 당 하나의 N 0)에서 셀 시드를 수행합니다.
- 6 시간 후, 잘 다른 24 웰 플레이트에 발판을 전송합니다. 세포 부착을 허용하지만 확산 셀하지 않는 시간을 선택합니다.
- 전송 된 ICC 지지체에 세포 계산을 수행합니다.
- 발판으로 각 웰에 BSC와 피펫 500 μl의 1 배 MSR 솔루션에서 미디어 배로 10 배 모노 나트륨 소금 시약 (MSR) 솔루션을 희석. 1 시간 동안 37 ° C에서 24 웰 플레이트를 인큐베이션.
- 각 웰에서 웰 96 웰 플레이트에 100 μL 옮긴다. 빈, 피펫 96 웰 플레이트에 다른 우물에 신선한 1X 모노 나트륨 소금 시약 용액 100 ㎕로. 수동 광으로부터 보호하기 위해 호일의 96- 웰 플레이트 기포 드라이 피펫 팁을 이용하여 제거하고 커버 선물합니다.
- λ = 450 nm에서 측정 OD는 분광 광도계를 사용하여 읽기. 정확한 OD (51)를 찾기 위해 다른 값에서 빈 OD를 뺍니다.
- 혈구를 사용하여 지지체 (단계 4.2.1.3)을 전사 한 후 웰에 남아있는 세포의 수 (N의 L)를 계산.
참고 : 세포를 Trypsinize하는 트립신의 300 μl를 사용합니다. - 실제 세포 수, n은을 계산합니다.
실제 =초기는 - 잘 남아
N A = N 0 -N L - 대 실제 세포 수 (N A) 단계 4.2.1.4.3에서 얻은 OD를 플롯하여 표준 곡선을 확인하고 실험에서 세포 수를 추정 할 때 사용합니다.
주 : ICC 매개 변수 (즉, 기공 크기, 발판의 치수, ECM 단백질 등)이 변경되면 새로운 표준 곡선을 확인합니다.
- 표준 곡선을 만들기 위해 사용되는 세포 시딩 번호, N 0을 결정한다.
- 국제 형사 재판소 플랫폼을위한 표준 곡선 (흡광도 (OD) V의 즉, 그래프 작성ersus) 휴대폰 번호 부여.
5. 세포의 기능
- 효소에 의해 (단계 3.7)에서 수집 된 미디어에서 허 - 7.5 세포 (즉, 알부민, 요소)에 의해 단백질 분비 분석은 면역 분석법 (ELISA) (52)을 연결.
주 : 미디어 희석 시드 셀의 개수와 수집 매체의 양에 따라. 항체 예비 피복 된 웰에 도입되기 전에, 비 25 : 5 × 105 세포로 시딩 ICC를 들어, ~ 1를 사용한다. - 질적으로 세포 기능을 분석하기 위해, 특정 세포 내 단백질 발현 사이(즉, 알부민), 효소 (즉, CYP450), 얼룩 구조 구성 요소 (즉, 세포의 액틴)뿐만 아니라 핵 및 CLSM 49 사용 이미지입니다.
- 피펫 2 ml의 PBS (단계 3.7)에서 대기음 매체는 셀 - 라덴 ICC의 발판을 씻어.
- 피펫 한 4 % PFA ml의 고정을 실온에서 5 분 동안 배양한다.
- 2 ml의 PBS로 세척 배.
- 30 분 동안 0.1 % 4- (1,1,3,3- 테트라 메틸 부틸) 페닐 - 폴리에틸렌 글리콜 (계면 활성제)의 1 ml의 골격을 배양하여 막을 Permeabilize 하시려면.
- 2 씻을 배는 PBS는 누출 단백질을 제거 ml가.
- 피펫 500 ㎕의 1 % 소 혈청 알부민 (BSA)과 비특이적 결합을 차단하기 위해 1 시간 동안 RT에서 배양한다.
- 희석 차 항체 (즉, 알부민, CYP450) 솔루션을 준비합니다.
- 피펫 (500) 15 ㎖의 튜브에 1 % BSA 용액 μL와 총 5 ml를 0.1 %의 BSA 용액을 제조 4.5 mL의 0.1 % 계면 활성제 용액을 추가한다.
- 피펫 200 μL의 마이크로 원심 튜브에 0.1 % BSA 용액 98 μL와 1:50 생산할 차 항체 2 μL (차 항체를 0.1 %의 BSA) 차 항체 용액.
- 피펫 (40) 발판의 기본 항체 솔루션의 μL 및 파라핀 필름 기판을 커버한다. 알루미늄 호일로 24 웰 플레이트를 감싸고 밤새 4 ° C에서 접시를 저장합니다.
- 2 ml의 PBS로 세척 배 세척 사이에 부드럽게 판을 흔들어.
- 희석 바이오틴 차 항체 (즉, 안티 - 마우스 항체) 주식 솔루션을 준비합니다.
- (100) (차 항체 : 0.1 % BSA) 이차 항체 용액 198 ㎕를 피펫 0.1 % BSA 용액 2 ㎕의 제 1 항체를 생성한다.
- 0.1 %의 BSA 용액 중 로다 민 또는 형광 표지 팔로이 딘 (셀룰러 액틴 필라멘트 얼룩)의 0.1 % 스톡 용액을 준비한다.
- 피펫 용액 각 25 μL를 튜브와 혼합 승엘.
- 피펫 발판에있는 이차 항체 원액의 50 μL. 파라핀 필름 발판을 덮고 2 시간 동안 실온에서 알루미늄 호일 및 저장과 요리를 포장.
- 2 ml의 PBS로 세척 배.
- 피펫 0.2 % 4'-6-diamidino-2-페닐 인돌 200 μL (DAPI, 핵 얼룩) 발판에 솔루션 2-3 분 동안 실온에서 보관하십시오. 알루미늄 호일로 접시를 커버.
- 2 ml의 PBS로 세척 배.
- 점 적기를 사용하여 기판 상에 실장 미디어 방울을 놓는다.
- 조심스럽게 CLSM 47를 사용하여 유리 슬라이드 및 이미지에 발판을 넣어.
- 실시간 중합 효소 연쇄 반응 (qPCR의)에 의한 유전자 발현을 평가한다. 역전사 PCR (RT-PCR) (53)와 제조업체의 지침에 따라 qPCR에 (54)에 대한 표준 키트를 사용합니다. 아래에 설명 된대로 세포에서 RNA를 추출합니다.
- 1.5 ML의 microcentrifuge 관에서 (단계 3.7에서) 발판을 놓으십시오.
- 각각의 microcentrifuge 튜브에 클로로포름 200 μl를 피펫과 15 ~ 20 초 동안 손에 적극적으로 튜브를 흔들. 위상이 분리 될 때까지 2 ~ 3 분 동안 실온에서 튜브를 유지합니다.
- 13,000 XG, 15 분 동안 4 ° C에서 샘플을 원심 분리기와 위상이 혼합되지 않도록 조심스럽게 튜브를 제거합니다.
- 조심스럽게 초 미세 원심 관에 제 1 튜브의 상부 수성상의 500-600 μL 피펫.
- 이 두 번째 튜브에 이소프로판올의 동등한 볼륨 (500-600 μl를) 추가합니다.
- 튜브를 3-5 회 전환하고 10 분 동안 RT에서 서 튜브를 떠난다.
- 13,000 XG, 15 분 동안 4 ° C에서 샘플을 원심 분리기.
- 펠렛을 5 분 동안 다시 튜브, 원심 분리기의 하단에 표시되지 않는 경우.
주 : 여전히 가시적 펠릿이 없으면 RNA의 양이 불충분 할 수있다.
- 펠렛을 5 분 동안 다시 튜브, 원심 분리기의 하단에 표시되지 않는 경우.
- 나는튜브에 DEPC 물에 희석하여 1 ml의 70 % 에탄올에 뜨는 및 피펫을 폐기 열린 모자와 nvert 튜브.
- 펠렛은 튜브의 벽에서 분리 약간 튜브를 와동 후 튜브 공기 건조를 할 수 있습니다.
- 펠렛을 재현 탁하는 DPEC 물 50 μl를 추가합니다.
- 펠릿 용해 될 때까지 피펫을 유지합니다.
- 단일 가닥 RNA에 이중 가닥 RNA를 변성하기 위해 55 ° C에서 10 분 동안 유지.
- 가볍게 튜브 간단히 원심 분리 한 다음 (7,500 XG, 4 분, 4 ° C)를 튜브 바닥에 손가락을 드럼합니다.
- 56에서 설명한대로 역전사 효소 (55) 및 실시간 PCR을 수행 할 때까지 얼음 튜브를 유지한다.
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Representative Results
국제 형사 재판소 지지체의 구조 특성 및 간세포를 배양의 각 ICC의 발판 조건의 효능의 비교에 대한 대표적인 결과가 표시하고 아래에 설명되어 있습니다. 이러한 결과에서 사용 ICC 골격 조건은 0 μg의 / ㎖ (맨발), 20 ㎍ / ㎖ (콜라겐 20), 200 ㎍ / ㎖ (콜라겐 200) 및 400 ㎍ / ㎖ (400 콜라겐) 및 초기의 콜라겐 코팅되어 허-7.5 셀 시드 수는 1 × 6입니다.
ICC 기공 상호 및 발판 토폴로지의 특성.
SEM 영상은 ICC 지지체의 고정 및 동결 건조 후, 제 ICC 기공 사이의 적절한 상호 접속이 형성되었는지 여부를 결정하고, 골격 토폴로지 변화 콜라겐 농도의 접합의 효과를 확인 하였다. 두 (D)의 정량 분석imensional 베어 ICC SEM 이미지 (도 3a)은 ImageJ에 소프트웨어를 사용하여, 102.3 ± 9.3 ㎛의 평균 세공 직경은 38.6 ± 4.3 μm의 평균 직경은 배선 (도 3B, C)를 밝혀. 모공 사이의 상호 연결은 발판에 걸쳐 중요한 세포에 영양소의 적절한 확산에 역할뿐만 아니라 세포 - 세포 상호 작용을한다. 콜라겐 코팅은 더 콜라겐 접합 (도 4a)의 높은 농도에서 정의 된 섬유 메쉬 네트워크 결과. 공 촛점 이미지는 콜라겐 농도 (도 4b)의 증가와 캐비티 표면에 콜라겐 높은 표면적 커버리지에도 레이어 보여준다.
허-7.5 세포 생존 및 기능에 대한 ICC 플랫폼 조건의 효과.
허-7.5 세포는 형광 라이브 / 죽은 얼룩을 실시 하였다도 5에 도시 된 바와 같이, 검정 (4 μM의 칼 세인의 AM 8 μM을 EthD-1)를 보내고과 CLSM을 이미지화. 베어 비 접착 ICC 골격에 시드 셀은 기공 및 세포 - 세포 상호의 중심 사이에 응집하는 경향 모공 나중에 시간 (일 7, 10)에 보였다. 세포가 지지체 표면뿐만 아니라 초기 1 일째 세포 생존 같은 간 공극 세포 - 세포 상호 작용에 부착 허용 ICC 지지체에 콜라겐 코팅의 존재는 녹색 얼룩에 의해 표시된 시간에 따라 증가하고, 일반적으로 더 높았다 콜라겐 - 코팅 된 지지체에서 높은 녹색 형광으로 표시된 바와 같이되도록되어있다.도 6은 세포 생존에 ICC 차원 구조와 단백질 농도의 효과를 추가로 조사 정량적 MSR 결과를 나타낸다. 비색 세포 생존 분석을 t는 정규화 된 ICC 골격 조건뿐만 아니라, (450 nm에서 측정)는 2D 폴리스티렌 배양 접시와 흡광도 데이터에 배양 된 세포에서 수행 하였다그는 제어 (1 일). 2D 플레이트에서 배양 된 세포는 세포 생존을 유지하지만, 세포 증식의 증가가 관찰되지 않았다. 3D 베어 ICC 지지체 크게 차원 행렬의 중요성을 나타내는 2D 조건에 비해 세포의 증식을 강화. 콜라겐 코팅의 추가로,이도 5에 질적 관찰 확인 14 일째에 200 μg의 / ㎖ 코팅 ICC 지지체에 세포 증식 모두 콜라겐 농도에서 시간에 따라 증가하고 최대 증식이 발견되었다.
간세포 기능 ELISA 알부민에 의해 정량화 7 분비 혈청 알부민과의 양의 상관 관계를 도시한다. 알부민 분비의 변화뿐만 아니라 상이한 ICC 골격 조건 세 접착 단백질의 유전자 발현 프로파일을 모니터링하여 평가하고, 콜라겐의 농도로 결합시켰다 발판. 에서 배양 날 14 일, 허-7.5 세포400 μg의 / ㎖ 코팅 ICC 지지체는 상기 베어 골격에서 배양 것과 알부민보다 3 배의 양이 분비. E-cadherin의, N-cadherin의, 그리고 다른 ICC의 발판 조건에서 β1 단백질을 인테그린의 유전자 발현 프로파일에 대한 결과는 그림 8에 나타납니다. 나머지 코팅 조건 (도 8a)에 비해 400 μg의 / ㎖ 코팅 ICC 지지체에서 E-cadherin의 mRNA의 발현의 비율은 4 개 이상의 주름 증가 하였다. N-cadherin의 유전자 발현의 변화 배 콜라겐 코팅의 높은 농도에서 더 컸다. 그러나, 유전자 발현 β1 인테그린은 비교적 일정하게 체재 또는 200 μg의 / ㎖ 코팅 ICC의 발판을 제외한 모든 ICC의 발판 조건에서 감소했다.
NHS를 통해 PEGDA 지지체에 콜라겐 그림 2. 활용 화학. 생체 활성 지지체는 지지체에 결합을 허용하는 콜라겐의 아민 그룹에 반응하는 아민 반응성 숙신 이미 딜 (NHS) 에스테르가 PEG-NHS를 사용합니다. PEG, 폴리 (에틸렌 글리콜); NHS, N의 -hydroxysuccinimide; UV는 자외선. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
ICC 캐비티 및 배선의 크기도 3 분석. (A)가 ICC 지지체의 SEM 현미경 사진 (배율 바 = 100 μm의)은 ImageJ에 소프트웨어를 사용하여 분석하고 정량의 막대 그래프로 나타내었다 (B) 세공 직경 (C) 배선 직경. 이 그림은 수정 와일리 (47)로부터 허가를 받아 사용되었습니다."https://www.jove.com/files/ftp_upload/54331/54331fig3large.jpg"대상 = "_ 빈">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
ICC 골격 토폴로지 콜라겐 코팅도 4에 영향을 준다. (A) SEM 이미지와 (B) 공 촛점 이미지는 질적으로 20 ㎍ / ㎖로 피복 된 지지체의 표면 토폴로지를 200 ㎍ / ml의 평가 촬영 하였다 400 μg의 / ㎖ 의 콜라겐. 빨간 상자 아래에 더 높은 배율의 이미지에 표시된 구멍을 둘러싸고 있습니다. 스케일 바는 (A)이 5㎛, (B) 200 ㎛ 내지 100 ㎛의 (고배율). 이 그림은 수정 와일리 (47)의 허가를 받아 사용되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5. 질적 라이브 / 죽은 분석을 이용하여 세포 생존 및 형태에 ICC 플랫폼 조건의 효과. 다른 콜라겐 농도 코팅 (0, 20, 200 ICC의 발판에 시드 라이브 / 죽은 스테인드 허 - 7.5 세포의 공 초점 이미지, (400) μg의 / ml)을 1, 4, 7, 10 일 파종 후 촬영 하였다. (칼 세인) 녹색 얼룩은 살아있는 세포와 붉은 얼룩을 나타냅니다 (에티 디움은 호모 다이머-1) 세포 사멸을 나타냅니다. 스케일 바는 200 μm의를 나타냅니다. [이 그림은 수정 와일리 (47)의 허가로 사용되어왔다] 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6. 효과정량적 비색 세포 생존력 분석을 이용하여 세포 생존율에 대한 플랫폼 유형 및 ICC 플랫폼 조건. 차원 폴리스티렌 배양 접시에 다른 콜라겐 농도 코팅 (0, 20, 200 ICC 지지체에 파종 응 7.5 세포 및 400 ㎍ / ml의 ) 비색 MSR 생존력 분석 1, 4, 7, 10을 실시하고 있었다 십사일 파종 후. 450 nm에서 흡광도를 측정하고, 데이터는 1 일 흡광도 값으로 정규화되었다. (N = 3, SD 평균 ±; *** : P <각 그룹의 1 일에 대한 읽기 MSR 솔루션 흡광도에 비해 0.001.) [이 그림은 수정 와일리 (47)로부터 허가를 받아 사용되었습니다] 을 보려면 여기를 클릭하십시오 이 그림의 더 큰 버전.
ICC (p)의 그림 7. 효과분비 된 알부민 ELISA 분석을 이용하여 어 7.5 함수에 latform 조건. 알부민 ELISA 혈청 알부민의 분비를 정량화하는 데 사용 다른 콜라겐 코팅 농도 (0, 20, 200, 400 μg의 / ㎖) 일 1, 4, 7, 10, 및 파종 후 14 세포 함유 ICC 지지체로부터 수집 된 매체이다. 각 데이터 포인트는 3 샘플의 평균을 나타내고, 비색 MSR 세포 생존력 분석을 이용하여 발견 된 세포 수와 생성 된 표준 곡선에 정규화 (N = 3, 평균 ± SD). [이 그림은 수정 와일리 (47)의 허가로 사용되어왔다] 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
허-7.5에 ICC 플랫폼 상태 그림 8. 효과유전자 발현 분석을 이용하여 기능. 실시간 정량 PCR 다른 콜라겐 농도 코팅과 ICC 골격에서 배양 된 세포의 유전자 발현 프로파일을 사용 하였다 (0, 20, 200, 400 μg의 / ㎖) 일 1, 4 및 7 일 후에 시드. 세 접합 단백질, 즉 (A) E-cadherin의 (B) N-헤린 및 (C) 인테그린 베타 1 발현 수준은 GAPDH로 정상화 하였다의 mRNA를 선택 하였다. (N = 3, SD 평균 ± *. P <0.05 ** :.. P <0.01 일 (1) 각 그룹의 유전자 발현에 비해)이 그림은 수정 와일리 (47)로부터 허가를 받아 사용되었습니다] 여기를 클릭하십시오 이 그림의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.
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Discussion
조직 공학 발판 빠르게 모든, 재생 유지, 또는 약물, 질병을 연구, 개발, 장기 교체 응용 프로그램에 대한 조직을 복구하는 데 필요한 물리적, 생화학 적 단서, 그리고 많은 다른 57를 제공하기 위해 진화하고있다. 간 조직 공학에서 차 인간 간세포 빠르게 한 번 몸에서 격리 대사 기능, 엔지니어링 발판을위한 훌륭한 필요성을 생성하고 간 기능을 유지하기 위해 플랫폼 개발을 잃게됩니다. 체외 간세포 배양 플랫폼에서 현재는 다른 생체 재료를 사용했다. 이 분야의 연구는 이러한 ECM 단백질 구성 58, 59, 60, 61 공 배양하고 (62)과 같은 미세 가공 생체 간 미세 다양한 기능을 모방 중심으로하고있다. 그러나, 제어 다공성 및 높은 공간 조직과 비계의 부족이 있었다. 이와 관련하여, 설명 된 ICC 세포 배양 platfORM, 그 등방성 특성과 높은 조직이 무효을 해결합니다. 우리는 ICC PEGDA 지지체가 간암 세포, 간세포 모델 세포 유형을 배양하는 경우 적합한 플랫폼 입증하고 추가로 콜라겐 코팅은 셀 (47)의 동작을 향상시킨다.
실제로, ICC 지지체의 공극 크기는 PS 미립자의 크기에 의해 조정될 수있다. 또한, 지지체의 상호 크기는 시간 및 열처리 온도에 의해 제어 될 수있다; 높은 어닐링 온도 이상의 배선 직경의 긴 어닐링 시간 결과. 더 큰 상호 직경이 지지체의 기계적 안정성을 손상됩니다 따라서, 이러한 매개 변수는 신중하게 선택해야합니다. 이 연구에서, 직경 140 ㎛, PS 분야 그가의 중앙에 세포의 괴사를 방지하기 위해 베어 ICC 지지체의 결과 hepatospheres의 크기를 제한 간세포 세포 배양을 위해 선택했다patocyte 타원체. 대표적인 결과에 나타낸 바와 같이 63는 ICC 지지체의 3 차원 구조는 2D 폴리스티렌 플레이트 세포 배양에 비해 높은 어 7.5 세포 증식을 허용한다. 결과는 ICC 지지체의 상호 균일 한 충치는 충치 사이의 효율적인 세포 - 세포 상호 작용과 크로스 토크를 허용하는 것이 좋습니다.
콜라겐 타입 I 농도는 영향을받는 세포 형태, 생존과 기능을 코팅. 콜라겐 타입 I은 Disse, 간세포 (64)에 인접한 영역의 공간에 위치한 중요한 ECM 단백질이다. 비 접착식, 베어 PEGDA의 ICC 인공 지지체는 큰 표면적 선물을 활용하는 반면 간세포 회전 타원체 형성, 인공 지지체의 표면에 부착 된 발판의 생리 활성과 허 - 7.5 셀을 렌더링하는 콜라겐 코팅을 추진. 상향 조절 된 E-cadherin의, N-cadhe로 나타낸 바와 같이 ECM 단백질 코팅 ICC 지지체는 세포 ECM 상호 작용뿐만 아니라, 두 세포 - 세포 상호 작용을 향상세포 행동을 조절하는 역할을 린과 인테그린 β1 유전자 표현. 콜라겐 타입 I에게 200 μg의 용액 / 400 μg의 / ㎖의 농도는 세포 증식 및 알부민의 분비를 모두 개선 응 7.5 배양에 적합 하였다.
국제 형사 재판소 제조로 인한 주요 제한은 PS 구 정렬하고 그릴을 수를 제어 할 수 있습니다. 에탄올의 빠른 증발시켜 주형에 구체 넣기 격자에서 구체의 층의 상이한 수의 결과로 서로 다른 영역 밀도를 야기 할 수있다. 그러나, 물처럼 저 휘발성 용액의 사용은 단점이있다. 그것은 조립 시스템 (65)을 플로팅 적은 순서 CC들로 이어질 의한 메 니스 커스의 형성에 매우 곡면 지지체 표면의 가능성이 높다. 또 다른 한계는 상호 접속의 최대 효율을 보장하기 위해 금형 분야의 적절한 정렬된다. 진동 단계 (단계 1.1.5과 1.1.6)를 따라서 C이다ICC 제조 기법 ritical. 양호한 배열은 현미경으로 관찰되지 않는 경우, 1.1.6 단계를 반복한다.
전반적으로, ICC PEGDA 지지체는 간단한 제조 프로토콜, 3 차원 세포 배양 애플리케이션 플랫폼으로 편리하게 사용될 수있다. 단백질과 베어 발판의 생리 활성은 또한 그것의 기능적 특성 (14)을 향상시킵니다. 이 논문에서, 우리는에 제조 프로토콜을 맞춘 및 간 조직 공학 응용 프로그램에 대한 세포의 평가 분석을 선택했다. 그러나, 세포 유형의 범위는이 고유 골격 내에 배양 될 수 있으며, 각 세포 유형은, 특정 파라미터의 변경을 요구할 수있다. 생물 반응기를 사용하여 여러 ECM 단백질 종류, 공 배양, 동적 문화의 관점에서 복잡성 또한 모든 층을 더욱 전지 성능을 향상시키기 위해 첨가 될 수있다. 이 플랫폼은 간 질환을 연구하고, 이식을 위해 사용되는, 조직 재생 및 약물 개발에 도움이되는 가능성이있다.
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Acknowledgments
저자는 국립 연구 재단 원정대 (NRF -NRFF2011-01)과 경쟁 연구 프로그램 (NRF-CRP10-2012-07)의 지원을 인정하고 싶습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 ml PCR tube | Axygen Scientific | PCR-02D-C | Boil-proof |
| Gorilla Glue | Gorilla Glue, Inc. | Depends on vendor. This was purchased from a local store. | |
| Glass slides | VWR | 631-1575 | Dimensions: 24×60 mm2 |
| Polystyrene spheres | Fisher Scientific | TSS#4314A | Diameter = 140 µm; 3x104 particles per milliliter and 1.4% size distribution |
| Ethanol | Merck | 1.00983.1011 | absolute for analysis EMSURE; Dilute to 70% with Milli-Q water |
| Ultrasonic Bath | Elma | S10H | Equiment |
| Furnace | Nabertherm | N7/H | Equipment |
| 200 µl pipette tip | Axygen Scientific | T-210-Y-R-S | |
| Rocking shaker | VWR | 444-0142 | |
| Polyethylene Glycol (PEG) | Merck | 1.09727.0100 | Mw= 4 kDa; acrylation of PEG monomers and purification of the resulting precipitate produces a PEGDA macromer with Mw = 4.6 kDa |
| Centrifuge | Beckman Coulter | 392932 | Equipment |
| Acrylate-Poly(Ethylene Glycol) - Succinimidyl Valerate | Laysan Bio | ACRL-PEG-SVA-3400-1g | Mw = 3.4 kDa |
| 2-hydroxy-4'-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone | Sigma Aldrich | 410896 | |
| Vortex | VWR | 58816-123 | Equipment |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5404 000.413 | |
| Paraffin Film | Parafilm M | #PM996 | Kept at 9" with allows intensity of 10.84 mW/cm2 |
| Bluewave 200 UV spotlight | Blaze Technology | 120008, 122300 | |
| Tetrahydrofuran (THF) | Merck | 107025 | |
| Orbital shaker | Heidolph | 543-123120-00-5 | |
| Collagen Type I | Sigma Aldrich | C3867-1VL | From rat. 1x, w/o CaCl2 & MgCl2; pH = 7.2 |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 20012-027 | 16% W/V AQ. 10 x 10 ml |
| Paraformaldehyde | VWR | 43368.9M | Equipment |
| Freezone 4.5 freeze drier | Labconco | 7750020 | Equipment |
| Sputter coater | Jeol Ltd. | JFC-1600 | Equipment |
| Scanning Electron Microscope | Jeol Ltd. | JSM 5310 | |
| Anti-mouse primary antibodies against Collagen type I | Abcam | ab6308 | |
| Anti-mouse secondary antibody conjugated with Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A21121 | |
| Plate, Tissue Culture 24 Well, Flat Bottom (Nunclon) | Bio-Rev PTE LTD | 3820-024 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM) 2.5 g/L Glucose w/ L-Gln |
Lonza | 12-604F | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | A15-151 | |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | Life Tchnologies | 15140-122 E | |
| 100 mm Corning non-treated culture dishes | Sigma Aldrich | CLS430591 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | Equipment; 37 °C, 5% Humidity |
| Forma Steri-Cycle CO2 Incubators | Thermofisher Scientific | 371 | |
| Hausser Bright-Line Phase Hemacytometer | Thermofisher Scientific | 02-671-6 | |
| Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit for mammalian cells | Life Technologies | L3224 | |
| CCK-8 Assay | Dojindo Laboratories | CK04-11 | Monosodium-salt reagent (MSR) |
| Infinite 200 PRO microplate reader | Tecan | ||
| Albumin Human ELISA kit | Abcam | ab108788 | |
| Triton X-100 | Bio-Rad | #1610407 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153-50G | |
| Anti-mouse primary antibodies (against CYP3A4, albumin) | Santa Cruz Biotechnology | sc-53850; sc-271605 | |
| DAPI | Life Technologies | D3571 | |
| Alexa Fluor 555 labeled Phalloidin | Life Technologies | A34055 | |
| Trizol | Life Technologies | 15596-026 | |
| Chloroform | VWR | 22706.326 | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | 67-63-0 | |
| DPEC water | Thermofisher Scientific | AM9916 | |
| Nanodrop 2000c Spectrophotometer | Thermofisher Scientific | ND-2000 | |
| iScript Reverse Transcription Supermix | Bio-Rad Laboratories | 1708840 | |
| SYBR select Master Mix for CFX | Life Technology | 4472937 | |
| Primers (to be chosen) | |||
| CFX96 Real-Time System, C-1000 Touch Thermal Cycler | Bio Rad Laboratories | SOFT-CFX-31-PATCH |
References
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