Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Fabrikasjon av invertert Kolloidalt Crystal Poly (etylenglykol) Stillas: En Tredimensjonal Cell Culture plattform for Liver Tissue Engineering

Published: August 27, 2016 doi: 10.3791/54331
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1,2
1School of Materials Science and Engineering, Nanyang Technological University, 2School of Chemical and Biomedical Engineering, Nanyang Technological University

Abstract

Evnen til å opprettholde hepatocytt-funksjon in vitro, for det formål å teste xenobiotika 'cytotoksisitet, studere virusinfeksjon og utvikle medikamenter rettet mot leveren, krever en plattform der cellene får skikkelige biokjemiske og mekaniske signaler. Siste levervev tekniske systemer har ansatt tredimensjonale (3D) stillasene som består av syntetiske eller naturlige hydrogeler, gitt den høye vannretensjon og deres evne til å gi de mekaniske stimuli trengs av cellene. Det har vært en økende interesse for invertert kolloidale krystall (ICC) stillaset, en ny utvikling, noe som gir høy romlig organisering, homotypisk og heterotypic celle interaksjon, samt celle ekstracellulære matriks (ECM) interaksjon. Heri beskriver vi en protokoll for å fremstille ICC stillaset ved hjelp av poly (etylenglykol) diakrylat (PEGDA) og partikkel utvasking metoden. I korthet blir et gitter laget av mikropartikler, hvoretter en pre-polymer materialerr-løsning blir tilsatt, skal polymeriseres, og partiklene blir så fjernet, eller utlutes, ved hjelp av et organisk løsningsmiddel (for eksempel tetrahydrofuran). Oppløsningen av gitter resulterer i en svært porøs stillas med kontrollert porestørrelse og interconnectivities som tillater mediet å nå celler lettere. Denne unike struktur gjør det mulig med høyt overflateareal for cellene å overholde samt enkel forbindelse mellom porene, og evnen til å belegge PEGDA ICC stillas med proteiner viser også en markert effekt på celleytelse. Vi analyserer morfologien av stillaset, samt hepatokarsinom celle (Huh-7,5) oppførsel med hensyn til levedyktighet og funksjon for å utforske virkningen av ICC struktur og ECM belegg. Samlet sett gir dette papiret en detaljert protokoll av en fremvoksende stillaset som har brede programmer i tissue engineering, spesielt leveren tissue engineering.

Introduction

Leveren er en svært vaskularisert organ med en rekke funksjoner, herunder avgiftning av blod, metabolisme av xenobiotika, og produksjonen av serumproteiner. Levervev har en kompleks tredimensjonal (3D) mikrostruktur, bestående av flere celletyper, galle canaliculi, sinus, og soner med forskjellig BioMatrix sammensetning og forskjellige oksygenkonsentrasjoner. Gitt denne forseggjort struktur, har det vært vanskelig å lage en passende leveren modell in vitro 1. Imidlertid er det et økende behov for funksjonell in vitro-modeller hosting humane hepatocytter som plattformer for testing av legemiddeltoksisitet 2 og studere sykdommer forbundet med leveren 3.

Nåværende levervev tekniske plattformer har forenklet kompleksiteten av leveren ved å isolere en, eller fokusere på noen få, av leverens parametere, nemlig ko-kultur av celler 4, biokjemiske sammensetning av zonal microenvironments 5, strømningsdynamikk 6,7 og konfigurasjonen av BioMatrix 8. Konfigurasjon av BioMatrix kan deles inn i parametere som stillasmateriell, sammensetning av ekstracellulær matriks (ECM) proteiner, matrise stivhet såvel som utformingen og oppbyggingen av stillaset. Det har vært en økning i vev ingeniørstudier ved bruk av syntetiske hydrogeler, spesielt poly (etylenglykol) (PEG) hydrogeler 9, får muligheten til å justere hydrogel mekaniske egenskaper, bioaktivitet, og fornedrelse rate. Angående leverrelatert forskning ble biokompatible hydrogel søkt om virusinfeksjon studie av leversykdom tre. Som et hepatocytter plattform utforming, har en rekke studier benyttet hepatocytter sandwich-kulturer 10,11 og celle innkapsling innenfor en hydrogel 12,13 for å tilveiebringe 3D-miljøet og celle-ECM og celle-celle-interaksjon som er nødvendig for å etterligne in vivo mikromiljøet. However, har disse plattformene ikke har en høy grad av kontroll og romlig organisasjon, som fører til ikke-ensartede egenskaper gjennom stillaset 14.

Den omvendte krystall kolloidalt (ICC) 14 stillaset er en svært organisert 3D stillas for cellekultur som først ble introdusert på begynnelsen av 2000-tallet. Stillaset unike struktur kan tilbakeføres til den enkle fabrikasjonsprosessen ved hjelp av en kolloidal krystall, en ordnet gitter av kolloidale partikler av variabel diameter. Kort fortalt, for å oppsummere prosessen, partikler er pent ordnet og glødet ved hjelp av varme for å danne et gitter. Utlekking av dette gitter, med et organisk oppløsningsmiddel, i en polymerisert hydrogel resulterer i heksagonalt pakkede sfæriske hulrom 15 med høyt overflateareal. Denne svært bestilte stillas har tidligere blitt gjort med både syntetiske og naturlige materialer, inkludert, men ikke begrenset til, poly (akrylamid) 16-21, poly (melke-ko-glykolsyre) 15,22-30, Poly (etylenglykol) 31,32, poly (2-hydroksyetylmetakrylat) 21,33-35, og kitosan 36-39. ICC stillasene laget av ikke-tilgroingsmaterialer tendens til å fremme celleklumper inne i hulrommene 14,23,40. Flere celletyper har vist seg å kunne spre seg, differensiere og funksjon i denne konfigurasjonen, inkludert kondrocytter 41, stromale benmargsceller 42, og stamceller 43,44. Angå hepatocytter har studier utført med ICC stillaser laget av Na 2 SiO 3 og poly (akrylamid), men ikke PEG. Med enkle bioconjugation strategier (dvs. amin kopling gjennom EDC / NHS), kan ECM proteiner-konjugerte PEG-baserte stillasene være fabrikkert, som kan vise seg mer cellebindingsseter for å være en mer in vivo som miljø og forbedre leverfunksjon.

I dette manuskriptet og den tilhørende video, har vi detalj fremstillingen av ICC stillasetved bruk av poly (etylenglykol) diakrylat (PEGDA) hydrogel og en polystyren-mikrokule gitter, optimalisert for hepatokarsinom (Huh-7,5) kultur. Vi viser forskjellene mellom de generelt ikke-klebende nakne PEGDA ICC stillaser og kollagen-belagt PEGDA ICC stillas i form av stillas topologi og celleytelse. Cell levedyktighet og funksjon måles kvalitativt og kvantitativt vurdere Huh-7.5 celle atferd.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. ICC Stillas Fabrication (figur 1)

  1. Klargjør polystyren (PS) innhegninger (diameter = 6 mm; 8-13 lag med perler).
    1. For å forberede formen, kutt tips av fra 0,2 ml koke-bevis mikrosentrifugerør på 40 ul nivå. Følge toppen av cut-rør til 24 x 60 mm 2 mikroskop dekkglass slips med vanntett lim.
    2. Sett PS kuler (diameter = 140 mm) inneholdt i en vann-suspensjonen i et 20 ml hetteglass, forsiktig pipette ut vannet suspensjon, og tilsett 18 ml 70% etanolløsning i hetteglasset. Sett sfæren løsningen i et ultralydbad å løsne aggregerte kuler. Gjenta dette vasketrinn flere ganger for å fjerne vann og vannløselige komponenter helt.
    3. Pipetter 100 ul etanol i formene.
    4. Skjær toppen av en 200 mL mikropipette tips ved 4 mm. Pipetter 25 ul av kulene i formen to ganger ved hjelp av 200 ul mikropipette for å oppnå entotalvolum på 50 ul i hver støpeform.
    5. Sett formene på en gyngerister ved 120 rpm over natten.
    6. Sjekk anordningen av kulene i hver støpeform under et optisk mikroskop. Dersom kulene ikke er organisert heksagonalt, tilsett 50 ul av 70% ethanol og riste manuelt i den langsgående og tverraksen retning for å rette anordningen.
    7. La etanolen fordampe ved romtemperatur (RT) i to netter. Plasser formen og perlekomplekset i en 130 ° C ovn i 6 timer for å binde PS kulene.
  2. Forbereder nakne og ECM-belagt PEGDA stillaser.
    1. Syntetisere PEGDA makromerene gjennom etablerte protokoller 45,46 for acrylating lineære PEG makromerene (M w = 4,6 kDa).
    2. Fremstille 50% (vekt / volum) PEGDA oppløsning i deionisert (DI) vann, og la den makromeren til skikkelig å oppløse ved sentrifugering ved 4713 xg til det er helt oppløst.
      1. For ECM konjugert ICC stillaser, oppløse en ekstra10% (vekt / volum) akryloyl-PEG-NHS (Mw = 3,4 kDa) i 50% PEGDA oppløsning.
    3. Fremstille en 20% (w / v) stamløsning av 2-hydroksy-4 '- (2-hydroksyetoksy) -2-metylpropiofenon (PI) i 70% etanol.
    4. Tilsett 50 ul 20% (vekt / volum) PI lageroppløsning per 1 ml 50% (w / v) av PEGDA. Juster den nødvendige mengde av PI stamløsning, basert på molekylvekten av PEGDA.
    5. Vortex blandingen i sentrifugerør i 1 min for å oppnå en homogen løsning.
    6. Skrell formene fra glass-slide (fra trinn 1.1.7), fjerne lim fra formene, skyve gitre ut forsiktig med en slikkepott og plassere hver av dem inn i en 1,5 ml tube. Pipetter 300 pl av den PEGDA oppløsning og sentrifuger ved 845 xg i 5 minutter for å tillate riktig PEGDA oppløsning infiltrering inn i gitteret.
    7. Fjern gitteret fra røret ved hjelp av pinsett og forsiktig klatt tørr overflødig PEGDA løsning på hansker. Sett gitteret på en parafin film-dekket glass med flat CIRsielt siden opp.
    8. Utsett PEGDA løsning infiltrert stillaset til 365 nm ultrafiolett (UV) lys (10,84 mW / cm 2) i 5 minutter ved bruk av en UV sted lampe.
    9. Plasser PEGDA-polymeriserte krystallgitter i nye hetteglass (rundt 10 innhegninger per hetteglass) og legge til 20 ml tetrahydrofuran (THF). Rist hetteglasset på en orbital-rystemaskin ved 300 rpm. Endre THF minst 3 ganger med et intervall på 1-2 timer.
      Merk: Ikke fjern THF helt når du endrer THF for å hindre bobler fra å komme inn stillasene, som igjen kan føre til ufullstendig fjerning av PS. La det være nok løsning for å dekke de rister og legge til nye THF.
      Forsiktig: THF er giftig. Bruk hansker, laboratoriefrakk og briller. Unngå innånding av opererer under avtrekkshette.
    10. Sjekk om PS kuler ble løst ved å sette vann i det brukte THF-løsningen og observere oppløsningen farge. Gjenta trinn 1.2.9 hvis PS kulene ikke er skikkelig oppløst.
      Merk: Løsningen farge vil endres tilhvitt hvis det er noen gjenværende PS-kuler.
  3. Rengjør stillasene i biosikkerhet kabinettet (BSC).
    1. Å sterilisere stillasene, utarbeide en 50 ml sentrifugerør med 2 ml 70% etanol per stillas og plassere stillasene i røret med en slikkepott. Tillat stillasene til å suge i etanol i 1 time. Fra dette skritt fremover, gjennomføre alle prosedyrer i BSC.
    2. Hell forsiktig etanolen ut og erstatte med fosfatbuffer saltvann (PBS) (2 ml pr stillas) og sentrifuger ved 524 xg i 3 minutter for å fjerne bobler. Oppbevar den i kjøleskapet og endre PBS noen ganger med et intervall på 1-2 timer.
      1. For Kollagen type I-belagt stillas, forberede en ny 50 ml sentrifugerør inneholder kollagen type 1 stamløsning (1 ml per stillas), overføre steriliserte stillasene til dette røret med en slikkepott, og sentrifuger ved 524 xg i 3 min. Rist stillasene på 400 rpm på en orbital shaker i 30 min og holde røret i kjøleskapereller over natten.
      2. Vask stillasene med PBS to ganger før bruk ved å senke stillasene i frisk PBS og deretter aspire PBS.
        Merk: Andre ECM-proteiner kan også brukes i stedet for Collagen type I, fordi NHS kjemi kreves en amingruppe for å danne binding (figur 2).

Figur 1
Figur 1. Oversikt over ICC fabrikasjon. PEG-baserte ICC stillaser er fabrikkert ved hjelp microfabrication teknikker med og uten ECM-funksjon. ECM-belagte ICC stillasene krever PEG-NHS samt PEGDA (som beskrevet i figur 2). PS-gitter har en diameter på 6 mm og en høyde på 8-13 perlesjikt. PS, polystyren; PEGDA, poly (etylenglykol) diakrylat; UV, UV; THF, tetrahydrofuran; ECM, ekstracellulære matrise. Dette tallet har blitt endret og brukes med tillatelse fra Wiley 47. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

2. ICC Struktur Karakterisering

  1. For å analysere ICC struktur med eller uten konjugerte proteiner, bruk scanning elektronmikroskopi (SEM) 47.
    1. Fest stillasene med 4% paraformaldehyde (PFA), serielt tørke dem i 25, 50, 75, 95 og 100% etanol løsninger, og lagre dem ved -80 ° C inntil etanolen fordamper helt.
    2. Tørre prøver i en frysetørker i 48 timer.
    3. Fest prøven på prøveholderen ved hjelp av karbon tape og plasser i en frese belegger.
    4. Etter automatisk støvsuging, strøk den med en Pt film på 10 nm tykkelse ved spruting for 60 sek ved 20 mA.
    5. Bilde ICC stillasene ved hjelp av SEM ved en spenning på 5 kV (figur 3A, figur 4A).
  2. For å måle pore ogsamtrafikk diameter hulrom, analysere SEM mikrografer som bruker bildeanalyse programvare 48 (f.eks ImageJ, 3B, C).
  3. For å visualisere det konjugerte kollagen til stillaset uten celler fluorescensmerket tag kollagen ved anvendelse av antistoffer (1: 100) mot kollagen type I og bilde med konfokal laser-skanning mikroskopi 47 (CLSM, figur 4B).

3. Huh-7.5 Cell Culture og Seeding

  1. Kultur Huh-7,5-celler på en seeding tetthet på 2-2,5 x 10 6 celler / ml i 100 mm cellekulturskåler med 10 ml Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 100 U / ml penicillin-streptomycin (vekstmedier) ved 37 ° C og 5% CO 2. Endre media hver tredje dag i BSC før de har nådd 75-80% konfluens.
  2. Forbered stillasene for celle seeding i BSC.
    1. Plasser forsiktig av stillasåringer i en 24-brønns plate med den flate siden opp.
    2. Å vaske stillaset, pipette 2 ml PBS til hver brønn inneholdende et stillas. Aspirer PBS og pipette 2 ml frisk PBS i hver brønn.
    3. Aspirer PBS og pipette 2 ml vekstmedier (se trinn 3.1) og la stå i 30 min. Aspireres media, og la stillaset tørke i en time.
  3. Løsne sammenflytende Huh-7,5-celler (fra trinn 3.1) fra kulturplaten i BSC ved hjelp av trypsin fordøyelse metode.
    1. Sug media fra plate, tilsett 4 ml PBS for å vaske heftende celler og deretter aspirer PBS.
    2. Pipetter 0.75-1 ml 0,25% trypsin og plasser i en inkubator ved 37 ° C, 5% CO 2 for 3 min.
    3. Fjern platen fra inkubatoren og pipette 5 ml media for å stoppe trypsin reaksjon. Pipette media, frittliggende celler, og trypsin blandingen inn i et 15 ml rør.
    4. Sentrifuger ved 524 x g i 3 minutter, fjern supernatanten og resuspender pelleten i 5 ml medium.
  4. Cellene telles ved hjelp av et hemocytometer og beregne volumet av cellesuspensjon som inneholder celler ved målnummer, N 0, pr 25 ul (for standard forsøk, N 0 er 1 x 10 6 celler).
    Volum av cellesuspensjon = (target antall celler) / (konsentrasjon av cellesuspensjonen)
  5. Sakte pipette 25 ul av cellesuspensjon (inneholdende N-0-celler) direkte på toppen av hverandre stillas (fra trinn 3.1.4). Plasser 24-brønners plate i inkubatoren.
  6. Etter 12 timer, overfører stillasene forsiktig med bruk av en spatel inn i en ny 24-brønners plate og pipette 2 ml av mediet i hver brønn. Plasser 24-brønners plate i inkubatoren.
  7. Endre media hver 3 dager eller avhengig av når media samles for protein sekresjon analyse (se trinn 5.1).

4. celleviabilitet

  1. For å kvalitativt analysere celle levedyktighet, bruke fluorescerende levende / døde flekker kits å farge cellene og bilde ved hjelp av CLSM.
    1. Etter kit instruksjon, utarbeide en løsning med 4 mikrometer calcein AM og 8 mikrometer ethidium homo-dimer-en i media (se trinn 3.1.3).
      Merk: Optimaliser avhengig av celletallet. Bruk dobbelt så mye av reagens hvis celler spre og doble i antall (rundt 2 millioner).
    2. I BSC, aspirer media i hver brønn med et stillas (trinn 3.7) og pipette 500 mL av den tilberedte løsningen. Inkuber prøver i en 37 ° C inkubator i 1 time.
    3. Dekk platene i folie for å beskytte mot lys prøvene ved fjerning av platen ut av inkubatoren. Bilde prøver ved hjelp CLSM49.
  2. For å vurdere kvantitativt celleviabilitet, måle enzymatisk aktivitet (i levende celler) ved anvendelse av kolorimetriske assays 50 (det vil si 2- (2-metoksy-4-nitrofenyl) -3- (4-nitrofenyl) -5- (2,4-disulfofenyl) 2H-tetrazolium (monosodium-salt reagens)).
    1. Opprette en standardkurve for ICC plattformen (dvs. en grafisk fremstilling av absorbans (OD) vUtes gitt celle nummer).
      Merk: Cell seeding er ikke 100% effektiv i forhold til andre plattformer, siden cellene kan passere gjennom hulrom av stillas.
      1. Bestem celle seeding tall, N 0 som vil bli brukt til å lage standardkurven.
        Merk: Velg et område som omfatter celle tall som er anslått i forsøket. For eksempel, hvis den første celletallet er 5 x 10 5 celler, og det er en estimert ~ 3-gangers økning ved den siste dagen av forsøket ved å velge 2,5 x 10 5, 5 x 10 5, 1 x 10 til 6, og 2 x 10 6 celler som N 0.
      2. Utfør celle seeding i ICC stillasene (en N 0 per stillas med seeding volum på 25 pl) som beskrevet i trinnene 3,1-3,6.
      3. Etter 6 timer, overføre stillasene til en annen 24-brønns plate brønnen. Velg et tidspunkt som gjør at cellen tilslutning, men ikke celleproliferasjon.
      4. Utfør celle telling på den overførte ICC stillaset.
        1. Fortynnet 10x monosodium-salt reagens (MSR) løsning på 1x med media i BSC og pipette 500 mL 1x MSR løsning i hver brønn med et stillas. Inkuber 24-brønners plate ved 37 ° C i 1 time.
        2. Fra hver brønn, overføre 100 ul i en 96-brønns plate brønnen. Som en blank, pipette 100 ul frisk 1x mononatriumsalt-reagensoppløsningen inn i forskjellige brønner på en 96-brønns plate. manuelt fjerne eventuelle bobler til stede med en tørr pipette og dekke 96-brønns plate i folie for å beskytte mot lys.
        3. Mål OD ved λ = 450 nm lesing ved hjelp av et spektrofotometer. Trekk blank OD fra andre verdier for å finne den nøyaktige OD 51.
      5. Tell antall celler (N L) gjenværende i brønnen etter overføring av stillaset (trinn 4.2.1.3) ved anvendelse av et hemocytometer.
        Merk: Bruk 300 mL av trypsin til trypsineres cellene.
      6. Beregne de faktiske celle nummer, N A.
        selve =innledende - igjen i godt
        N A = N 0 N L
      7. Gjør standardkurve ved å plotte OD oppnådd i Trinn 4.2.1.4.3 vs. selve mobilnummer (N A) og bruke dette til å estimere celle nummer i forsøkene.
        Merk: Lag en ny standard kurve hvis noen ICC-parametere (dvs. porogen størrelse, dimensjoner av stillaset, ECM protein, etc.) er endret.

5. Cell Function

  1. Analyser protein sekresjon av Huh-7.5-celler (dvs. albumin, urinstoff) fra de innsamlede media (fra trinn 3.7) ved hjelp av enzymbundet immunosorbent assay (ELISA) 52.
    Merk: Fortynn media, avhengig av antall celler seeded og mengden av mediet oppsamlet. For 5 x 10 5 celler sådd i ICC, bruk en ~ 1 ratio 25, før innføre den til antistoff-forbelagte brønner.
  2. For å kvalitativt analysere cellefunksjon, immunfarging av spesifikke intracellulære proteiner(Dvs. albumin), enzymer (dvs. CYP450), flekkkonstruksjonsdeler (dvs. celle aktin) samt kjernene og bildet ved hjelp CLSM 49.
    1. Sug media (fra trinn 3,7) og pipette 2 ml PBS for å vaske celle-laden ICC stillaser.
    2. Pipetter 1 ml 4% PFA og inkuber i 5 minutter ved romtemperatur for fiksering.
    3. Vask 3x med 2 ml PBS.
    4. Permeabilize membraner ved å inkubere stillasene i 1 ml 0,1% 4- (1,1,3,3-tetrametylbutyl) fenyl-polyetylen-glykol (overflateaktivt middel) i 30 minutter.
    5. Vask 3 ganger med 2 ml PBS for å fjerne eventuelle lekkasjer proteiner.
    6. Pipetter 500 pl 1% bovint serumalbumin (BSA) og inkuber ved romtemperatur i 1 time for å blokkere ikke-spesifikk binding.
    7. Forbered fortynnet primært antistoff (dvs. albumin, CYP450) løsning.
      1. Pipetter 500 ul av 1% BSA-oppløsning i et 15 ml rør og tilsett 4,5 ml 0,1% overflateaktiv oppløsning for å fremstille en total 5 ml av 0,1% BSA-oppløsning.
      2. Pipetter 98 ul av 0,1% BSA-oppløsning inn i en 200 mL mikrosentrifugerør og 2 ul av det primære antistoff for å fremstille en 01:50 (primært antistoff: 0,1% BSA) primær antistoffoppløsning.
    8. Pipetter 40 ul av det primære antistoff løsning på stillaset og dekke substratet med parafin film. Pakk 24 brønners plate med aluminiumsfolie og lagre fatet ved 4 ° C over natten.
    9. Vask 3x med 2 ml PBS og rist platen forsiktig i mellom vask.
    10. Forbered fortynnet biotinylert sekundært antistoff (dvs. Anti-mus antistoff) stamløsning.
      1. Pipetter 198 ul 0,1% BSA-oppløsning og 2 ul andre antistoff for å fremstille en 1: 100 (sekundært antistoff: 0,1% BSA) sekundært antistoff oppløsning.
      2. Forbered en 0,1% stamløsning av rhodamine eller fluorescein-merket phalloidin (å farge de cellulære aktin filamenter) i 0,1% BSA løsning.
      3. Pipetter 25 mL av hver løsning i et rør og bland well.
    11. Pipetter 50 ul av det sekundære antistoff stamløsning på stillaset. Dekk stillaset med parafin film, vikle fatet med aluminiumsfolie og oppbevar ved romtemperatur i 2 timer.
    12. Vask 3x med 2 ml PBS.
    13. Pipetter 200 ul 0,2% 4'-6-diamidino-2-fenylindol (DAPI, en kjerne stain) løsning på stillaset og holde ved RT i 2-3 min. Dekk plate med aluminiumsfolie.
    14. Vask 2x med 2 ml PBS.
    15. Ved hjelp av en dropper, plassere en dråpe monterings media på underlaget.
    16. Legg forsiktig stillaset på en glassplate og bilde ved hjelp CLSM 47.
  3. Vurdere genuttrykk ved real-time PCR (qPCR). Bruk standard sett for revers transkriptase PCR (RT-PCR) 53 og qPCR 54 i henhold til produsentens anvisninger. Ekstrahere RNA fra celler som beskrevet nedenfor.
    1. Plasser stillaset (fra trinn 3,7) i et 1,5 ml mikrosentrifugerør.
    2. Pipetter 200 ul kloroform i hvert mikrosentrifugerør og riste røret kraftig i hånden i 15-20 sekunder. Holde rørene ved RT i ~ 3 minutter til fasene separeres.
    3. Sentrifuger prøven ved 13 000 xg, 4 ° C i 15 minutter og fjerne rørene forsiktig slik at fasene ikke blander.
    4. Pipette nøye 500-600 pl av den øvre vandige fase fra det første røret inn i en andre mikrosentrifugerør.
    5. Legge til et tilsvarende volum (500-600 pl) av isopropanol til denne andre rør.
    6. Snu røret 3-5 ganger og la røret stå ved RT i 10 min.
    7. Sentrifuger prøven ved 13 000 xg, 4 ° C i 15 min.
      1. Hvis en pellet er ikke synlig på bunnen av røret, sentrifuger på nytt i 5 min.
        Merk: Hvis det er fortsatt ingen synlig pellet, kan mengden av RNA være utilstrekkelig.
    8. Jegnvert rør med lokket åpent til kast supernatant og pipette i 1 ml 70% etanol fortynnet i DEPC vann inn i røret.
    9. Svakt vortex røret slik pellet løsner fra veggen av røret, og deretter la røret lufttørke.
    10. Tilsett 50 ul DPEC vann for å resuspendere pelleten.
    11. Hold pipettering inntil pellet oppløses.
    12. Hold i 10 minutter ved 55 ° C for å denaturere dobbelt-trådet RNA inn i enkelt-trådet RNA.
    13. Lett tromme fingre på røret bunnen og deretter sentrifuger-rør en kort stund (7500 xg, 4 min, 4 ° C).
    14. Hold rørene i isen før du utfører revers transkriptase 55 og real-time PCR som beskrevet i 56.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De representative resultater for den strukturelle karakterisering av ICC stillas og sammenligning av hver ICC stillas tilstand effekt ved dyrking hepatocytter er vist og forklart nedenfor. ICC stillasBetingelsene anvendt i disse resultatene er collagen belegg på 0 ug / ml (Bart), 20 ug / ml (Kollagen 20), 200 ug / ml (Kollagen 200) og 400 ug / ml (Kollagen 400) og den innledende Huh-7.5 celle seeding nummer er 1x10 6.

Karakterisering av ICC pore sammenkoblinger og stillas topologi.

SEM avbildning, etter fiksering og frysetørking av ICC stillas, ble først brukt til å bestemme hvorvidt ble dannet riktige sammenkoblinger mellom ICC porer og for å se effekten av konjugering av varierte kollagenkonsentrasjon på stillaset topologi. Kvantitativ analyse av de to-ddimensjonell nakne ICC SEM bilder (figur 3A) ved hjelp ImageJ programvare, viste en gjennomsnittlig porediameter på 102,3 ± 9,3 um og en gjennomsnittlig sammenkopling diameter på 38,6 ± 4,3 um (figur 3B, C). Denne forbindelse mellom porene spiller en betydelig rolle i riktig diffusjon av næringsstoffer til cellene, samt celle-celle-interaksjon i hele stillaset. Belegget av kollagen resulterte i en fiberduk nettverk som ble mer definert ved høyere konsentrasjoner av kollagen konjugasjon (figur 4A). Confocal bilder avslører også lag av kollagen på hulrom overflater og høyere overflatedekningsområde med økninger i kollagen konsentrasjon (figur 4B).

Effekt av ICC plattformforholdene på Huh-7,5 cellenes levedyktighet og funksjon.

Huh-7.5 celler ble utsatt for den fluorescerende Levende / Døde flekkening assay (4 uM calcein AM og 8 pM EthD-1) og avbildes ved bruk av CLSM, som vist i figur 5. Celler sås i bart, ikke-klebende ICC stillasene hadde en tendens til å aggregere i midten av pore og celle-celle-sammenkopling mellom porene ble sett i senere tid (dager 7 og 10). Tilstedeværelsen av en kollagen belegg på ICC stillasene lov celler til å følge stillaset overflaten samt et inter-pore celle-celle interaksjon så tidlig som dag 1. Celleviabilitet, merket med det grønne flekken, økt med tiden og var generelt høyere i kollagen-belagte stillaser, som antydet med høyere grønn fluorescens. Figur 6 viser de kvantitative MSR resultater for videre undersøkelser av effekten av ICC 3D-strukturen og proteinkonsentrasjon på cellenes levedyktighet. En kolorimetrisk cellelevedyktighet analyse ble utført på celler dyrket i ICC stilla forhold så vel som på en 2D-polystyren kulturplate og absorbans-data (målt ved 450 nm) ble normalisert til tHan kontroll (dag 1). Celler dyrket på 2D-platene holdes cellenes levedyktighet, men ingen økning i celleformering ble observert. 3D bart ICC stillas sterkt forbedret celleproliferasjon sammenlignet med 2D-tilstand, noe som indikerer viktigheten av 3D-matrisen. Med tillegg av kollagen belegg, øket celleproliferasjon med tiden ved alle konsentrasjoner kollagen og den maksimale spredning ble funnet i 200 ug / ml belagt ICC stillaset på dag 14. Dette bekrefter kvalitative observasjoner i figur 5.

Hepatocytt funksjon ble målt ved å overvåke endringer i albumin sekresjon såvel genekspresjonen profilen til tre adhesjonsproteiner i de forskjellige ICC stilla forhold. Figur 7 viser den positive korrelasjon mellom serum albumin sekrert, som kvantifisert ved albumin ELISA, og den kollagen-konsentrasjonen konjugert til stillaset. På dag 14 Huh-7.5 celler dyrket i400 mikrogram / ml belagt ICC stillaser skilles mer enn tre ganger så mye albumin som de dyrket i den nakne stillaset. Resultater for genuttrykk profiler av E-cadherin, N-cadherin og inte ß1 proteiner i de ulike ICC stillasforhold vises i Figur 8. Frekvensen av E-cadherin mRNA-ekspresjon i 400 ug / ml belagt ICC stillasene økt med mer enn 4 folder i forhold til de andre beleggs forhold (Figur 8A). Den ganger endring i N-cadherin-genekspresjon var større i de høyere konsentrasjoner av kollagen belegg. Men inte β1 genuttrykk oppholdt seg relativt konstant eller gått ned i alle ICC stillas vilkår unntatt 200 mikrogram / ml belagt ICC stillaser.

Figur 32
Figur 2. Bøyning av kollagen til PEGDA stillaset via NHS kjemi. Bioaktive stillasene bruke PEG-NHS som har en amin-reaktiv succinimidyl (NHS) ester som reagerer på amingruppen i kollagen slik at konjugering til stillaset. PEG, poly (etylenglykol); NHS, N-hydroksysuccinimid; UV, ultrafiolett. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3. Analyse av størrelsen på ICC hulrom og sammenkoplinger. (A) SEM mikrografer av ICC stillaset (skala bar = 100 pm) ble analysert ved bruk av ImageJ programvare og kvantitativt representert som histogrammer av (B), porediameter og (C) samtrafikk diameter. Dette tallet har blitt endret og brukes med tillatelse fra Wiley 47."Https://www.jove.com/files/ftp_upload/54331/54331fig3large.jpg" target = "_ blank"> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4. Innflytelse av kollagen belegg på ICC stillaset topologi. (A) SEM bilder og (B) konfokale bilder ble tatt for å evaluere kvalitativt overflaten topologien av stillas belagt med 20 ug / ml 200 ug / ml og 400 ug / ml av kollagen. Røde bokser omgir hulrommet vist i høyere forstørrelse bildene nedenfor. Skala barer er (A) 5 um, (B) 200 um og 100 um (høyere forstørrelse). Dette tallet har blitt endret og brukes med tillatelse fra Wiley 47. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.


Figur 5. Effekt av ICC plattform forholdene på celle levedyktighet og morfologi ved hjelp av kvalitative Levende / Døde analysen. Confocal bilder av Live / Dead-farget Huh-7.5 celler seeded i ICC stillaser med ulike kollagen konsentrasjons belegg (0, 20, 200, og 400 ug / ml) ble tatt 1, 4, 7 og 10 dager etter såing. Grønn flekk (calcein) indikerer levende celler og rød flekk (Ethidium homodimer-1) indikerer celledød. Skala barer indikerer 200 mikrometer. [Dette tallet har blitt endret og brukes med tillatelse fra Wiley 47] Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 6
Figur 6. Effektav plattformtype og ICC plattform forholdene på celle levedyktighet ved hjelp av en kvantitativ kolo celleviabilitet analysen. Huh-7.5 celler seeded på en 2D polystyren kultur plate og i ICC stillaser med ulike kollagen konsentrasjons belegg (0, 20, 200 og 400 mikrogram / ​​ml ) ble underkastet kolorimetrisk assay MSR levedyktighet 1, 4, 7, 10 og 14 dager etter såing. Absorbans ble målt ved 450 nm og dataene ble normalisert for å Dag 1 absorbansverdier. (n = 3, gjennomsnitt ± SD, ***: p <0,001 sammenlignet med MSR løsning absorbans lesing for dag 1 i hver gruppe.) [Dette tallet har blitt endret og brukes med tillatelse fra Wiley 47] Klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

Figur 7
Figur 7. Effekt av ICC platform tilstand på Huh-7,5-funksjon ved hjelp av utskilt albuminkonsentrasjon ELISA-analyse. Albumin ELISA ble anvendt for å kvantifisere serumalbumin sekresjon i media samlet inn fra celle-laden ICC stillasene med ulike kollagen konsentrasjons belegg (0, 20, 200 og 400 mikrogram / ml) på dag 1, 4, 7, 10 og 14 etter seeding. Hvert datapunkt representerer et gjennomsnitt av 3 prøver, og er normalisert til antall celler funnet ved å bruke den kolorimetriske MSR celleviabilitet analysen og den opprettede standard kurve (n = 3, middelverdi ± SA). [Dette tallet har blitt endret og brukes med tillatelse fra Wiley 47] Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 8
Figur 8. Effekt av ICC plattform tilstand på Huh-7.5funksjon ved hjelp av genekspresjon analyse. Sanntids kvantitativ PCR ble brukt for å profilere genekspresjon av celler dyrket i ICC stillaser med forskjellig kollagen konsentrasjons belegg (0, 20, 200, og 400 ug / ml) på dag 1, 4 og 7 etter seeding. Tre koblings proteiner ble valgt, nemlig (A) E-cadherin, (B) N-cadherin, og (C) Inte Beta 1. mRNA-ekspresjonsnivåer ble normalisert av GAPDH. (n = 3, gjennomsnitt ± SD *:. P <0,05 **:.. P <0,01 sammenlignet med genekspresjon av dag 1 hver gruppe) [Dette tallet har blitt endret og brukes med tillatelse fra Wiley 47] Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Tissue engineering stillasene er raskt utvikler seg til å gi alle de fysiske og biokjemiske signaler nødvendig for å regenerere, vedlikeholde eller reparere vev for anvendelse av orgel erstatning, studere sykdom, å utvikle medikamenter, og mange andre 57. I leveren tissue engineering, primære humane hepatocytter raskt miste sine metabolske funksjoner gang isolert fra kroppen, og skaper et stort behov for ingeniører stillaser og utviklingsplattformer for å opprettholde leverfunksjon. Den nåværende in vitro hepatocytter kultur plattformer har benyttet ulike biomaterialer. Forskningen på dette området har vært sentrert på å etterligne ulike funksjonene i in vivo levermikromiljø, for eksempel ECM protein konfigurasjon 58,59, co-kultur 60,61, og micropatterning 62. Imidlertid har det vært en mangel på stillas med kontrollert porøsitet og høy romlig organisasjon. I denne forbindelse er beskrevet ICC cellekultur Platform, med sine isotrope egenskaper og høy organisasjon, løser dette tomrommet. Vi viser ICC PEGDA stillaset er en egnet plattform for dyrking hepatokarsinom celler, en modell celletype for hepatocytter, og at ytterligere kollagen belegg forbedrer celle atferd 47.

I praksis kan hulrommet størrelsen på ICC stillaset være innstilt ved størrelsen av PS mikrokuler. I tillegg kan det sammenbundne størrelsen av stillaset styres ved tid og temperatur til å feste prosess; høyere annealing temperatur eller lengre annealing tid fører til større diametre samtrafikk. Derfor bør disse parametrene velges nøye som større diameter samtrafikk vil kompromittere den mekaniske stabiliteten av stillaset. I dette arbeidet ble PS-kuler med en diameter på 140 um som er valgt for hepatocytt cellekultur for å begrense størrelsen av de resulterende hepatospheres i nakne ICC stillasene for å hindre nekrose av cellen i midten av hanpatocyte sfæroide. 63 Som vist på representative resultater, 3D-arkitekturen i ICC stillaset tillater høyere Huh-7,5 celleproliferasjon sammenlignet med 2D polystyren plate cellekultur. Resultatene tyder på at de innbyrdes forbundne ensartede hulrom i ICC stillaset tillate effektiv celle-celle-interaksjon og krysstale mellom hulrommene.

Konsentrasjonen av kollagen type I belegning berørte cellemorfologi, levedyktighet og funksjon. Kollagen type I er et viktig ECM protein som finnes i Space of Disse, et område som grenser til hepatocytter 64. Klebende, nakne PEGDA ICC stillaser fremmet hepatocytter spheroid formasjon mens, en kollagen belegg gjengis stillaset bioaktive og Huh-7.5 celler levd opp til overflaten av stillaset, utnytte det store arealet til stede. Den ECM protein-belagte ICC stillasene forbedret både celle-celle-interaksjon, samt celle-ECM interaksjon, som antydet med oppregulert E-cadherin, N-cadheRin og integrin ß1 genekspresjon, som spiller en rolle i regulering av celle-adferd. Kollagen type I konsentrasjoner på 200 ug / ml og 400 ug / ml var passende for Huh-7,5 kultur, forbedre både celleformering og albumin sekresjon.

Den største begrensningen som utgjøres av ICC fabrikasjon er kontroll over PS sfære justering og nummer når du gjør de rister. Rask fordampning av etanol under lasting kulene inn i støpeformene kan føre til forskjellige kuletettheter, noe som resulterer i et annet antall lag av kuler i gitre. Imidlertid har bruken av mindre flyktige oppløsning som vann har også ulemper. Det fører til mindre organisert CCs i flytende monteringssystemet 65, og det er en stor mulighet for en meget krum stillaset overflaten på grunn av meniskdannelse. En annen begrensning er riktig justering av kuler i formene for å sikre størst mulig effektivitet av sammenhengene. Risting (trinn 1.1.5 og 1.1.6) er derfor critical til ICC fabrikasjon teknikk. Hvis en god ordning ikke er observert ved mikroskopi, gjenta trinn 1.1.6.

Totalt sett ICC PEGDA stillaset, med sin enkle fabrikasjon protokollen, kan brukes praktisk som en plattform for 3D cellekultur applikasjoner. Bioaktive av den nakne stillas med proteiner ytterligere forbedrer sin funksjonelle egenskaper 14. I dette manuskriptet, skreddersydd vi fabrikasjon protokollen til og valgte cellen vurderings analyser for leveren tissue engineering søknad. Imidlertid kan en rekke celletyper dyrkes innenfor dette unike stillas og hver celletype kan kreve endring av visse parametre. Også lag av kompleksitet i form av flere ECM proteintyper, co-kulturen, og dynamisk kultur ved hjelp av en bioreaktor kan alle bli tilsatt for å forbedre celleytelse ytterligere. Denne plattformen har potensial til å hjelpe til regenerering av vev og narkotika utvikling, for å studere leversykdommer, og som skal brukes for transplantasjon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Forfatterne ønsker å erkjenne støtte fra National Research Foundation Fellowship (NRF -NRFF2011-01) og konkurransedyktig forskning Programme (NRF-CRP10-2012-07).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 ml PCR tube Axygen Scientific PCR-02D-C Boil-proof
Gorilla Glue Gorilla Glue, Inc. Depends on vendor. This was purchased from a local store.
Glass slides VWR 631-1575 Dimensions: 24×60 mm2
Polystyrene spheres Fisher Scientific TSS#4314A Diameter = 140 µm; 3x104 particles per milliliter and 1.4% size distribution
Ethanol Merck 1.00983.1011 absolute for analysis EMSURE; Dilute to 70% with Milli-Q water
Ultrasonic Bath Elma S10H Equiment
Furnace Nabertherm N7/H Equipment
200 µl pipette tip Axygen Scientific T-210-Y-R-S
Rocking shaker VWR 444-0142
Polyethylene Glycol (PEG) Merck 1.09727.0100 Mw= 4 kDa; acrylation of PEG monomers and purification of the resulting precipitate produces a PEGDA macromer with Mw = 4.6 kDa
Centrifuge Beckman Coulter 392932 Equipment
Acrylate-Poly(Ethylene Glycol) - Succinimidyl Valerate Laysan Bio ACRL-PEG-SVA-3400-1g Mw = 3.4 kDa
2-hydroxy-4'-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone Sigma Aldrich 410896
Vortex VWR 58816-123 Equipment
Microcentrifuge Eppendorf 5404 000.413
Paraffin Film Parafilm M  #PM996 Kept at 9" with allows intensity of 10.84 mW/cm2
Bluewave 200 UV spotlight Blaze Technology  120008, 122300
Tetrahydrofuran (THF) Merck 107025
Orbital shaker Heidolph 543-123120-00-5
Collagen Type I Sigma Aldrich C3867-1VL From rat. 1x, w/o CaCl2 & MgCl2; pH = 7.2
Phosphate Buffered Saline (PBS) Gibco 20012-027 16% W/V AQ. 10 x 10 ml
Paraformaldehyde VWR 43368.9M Equipment
Freezone 4.5 freeze drier Labconco 7750020 Equipment
Sputter coater Jeol Ltd. JFC-1600 Equipment
Scanning Electron Microscope Jeol Ltd. JSM 5310
Anti-mouse primary antibodies against Collagen type I Abcam ab6308
Anti-mouse secondary antibody conjugated with Alexa Fluor 488 Life Technologies A21121
Plate, Tissue Culture 24 Well, Flat Bottom (Nunclon)  Bio-Rev PTE LTD 3820-024
Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM)
2.5 g/L Glucose w/ L-Gln		 Lonza 12-604F
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco A15-151
Penicillin-Streptomycin (P/S) Life Tchnologies 15140-122 E
100 mm Corning non-treated culture dishes Sigma Aldrich CLS430591
0.25% Trypsin-EDTA Gibco 25200-056 Equipment; 37 °C, 5% Humidity
Forma Steri-Cycle CO2 Incubators Thermofisher Scientific 371
Hausser Bright-Line Phase Hemacytometer Thermofisher Scientific 02-671-6
Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit for mammalian cells Life Technologies L3224 
CCK-8 Assay Dojindo Laboratories CK04-11 Monosodium-salt reagent (MSR)
Infinite 200 PRO microplate reader  Tecan
Albumin Human ELISA kit Abcam ab108788
Triton X-100 Bio-Rad #1610407
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A2153-50G
Anti-mouse primary antibodies (against CYP3A4, albumin) Santa Cruz Biotechnology sc-53850; sc-271605
DAPI Life Technologies D3571
Alexa Fluor 555 labeled Phalloidin Life Technologies A34055
Trizol Life Technologies 15596-026
Chloroform VWR 22706.326
Isopropanol Fisher Scientific 67-63-0
DPEC water Thermofisher Scientific AM9916
Nanodrop 2000c Spectrophotometer Thermofisher Scientific ND-2000
iScript Reverse Transcription Supermix  Bio-Rad Laboratories 1708840
SYBR select Master Mix for CFX Life Technology 4472937
Primers (to be chosen)
CFX96 Real-Time System, C-1000 Touch Thermal Cycler Bio Rad Laboratories SOFT-CFX-31-PATCH 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yamada, M., et al. Controlled formation of heterotypic hepatic micro-organoids in anisotropic hydrogel microfibers for long-term preservation of liver-specific functions. Biomaterials. 33 (33), 8304-8315 (2012).
  2. Abboud, G., Kaplowitz, N. Drug-induced liver injury. Drug Safety. 30 (4), 277-294 (2007).
  3. Cho, N. J., et al. Viral infection of human progenitor and liver-derived cells encapsulated in three-dimensional PEG-based hydrogel. Biomed Mater. 4 (1), (2009).
  4. Revzin, A., et al. Designing a hepatocellular microenvironment with protein microarraying and poly (ethylene glycol) photolithography. Langmuir. 20 (8), 2999-3005 (2004).
  5. Sato, A., Kadokura, K., Uchida, H., Tsukada, K. An in vitro hepatic zonation model with a continuous oxygen gradient in a microdevice. Biochem Bioph Res Com. 453 (4), 767-771 (2014).
  6. Domansky, K., et al. Perfused multiwell plate for 3D liver tissue engineering. Lab Chip. 10 (1), 51-58 (2010).
  7. Hegde, M., et al. Dynamic interplay of flow and collagen stabilizes primary hepatocytes culture in a microfluidic platform. Lab Chip. 14 (12), 2033-2039 (2014).
  8. Flaim, C. J., Chien, S., Bhatia, S. N. An extracellular matrix microarray for probing cellular differentiation. Nat methods. 2 (2), 119-125 (2005).
  9. Underhill, G. H., Chen, A. A., Albrecht, D. R., Bhatia, S. N. Assessment of hepatocellular function within PEG hydrogels. Biomaterials. 28 (2), 256-270 (2007).
  10. Dunn, J., Tompkins, R. G., Yarmush, M. L. Hepatocytes in collagen sandwich: evidence for transcriptional and translational regulation. J cell biol. 116 (4), 1043-1053 (1992).
  11. Dunn, J. C., Tompkins, R. G., Yarmush, M. L. Long-term in vitro function of adult hepatocytes in a collagen sandwich configuration. Biotechnol progr. 7 (3), 237-245 (1991).
  12. Ling, Y., et al. A cell-laden microfluidic hydrogel. Lab Chip. 7 (6), 756-762 (2007).
  13. Kim, M., Lee, J. Y., Jones, C. N., Revzin, A., Tae, G. Heparin-based hydrogel as a matrix for encapsulation and cultivation of primary hepatocytes. Biomaterials. 31 (13), 3596-3603 (2010).
  14. Kotov, N. A., et al. Inverted Colloidal Crystals as Three-Dimensional Cell Scaffolds. Langmuir. 20 (19), 7887-7892 (2004).
  15. Shanbhag, S., Woo Lee, J., Kotov, N. Diffusion in three-dimensionally ordered scaffolds with inverted colloidal crystal geometry. Biomaterials. 26 (27), 5581-5585 (2005).
  16. Lee, Y. H., Huang, J. R., Wang, Y. K., Lin, K. H. Three-dimensional fibroblast morphology on compliant substrates of controlled negative curvature. Integr Biol. 5, 1447-1455 (2013).
  17. da Silva, J., Lautenschlager, F., Kuo, C. H. R., Guck, J., Sivaniah, E. 3D inverted colloidal crystals in realistic cell migration assays for drug screening applications. Integr Biol. 3, 1202-1206 (2011).
  18. da Silva, J., Lautenschlager, F., Sivaniah, E., Guck, J. R. The cavity-to-cavity migration of leukaemic cells through 3D honey-combed hydrogels with adjustable internal dimension and stiffness. Biomaterials. 31, 2201-2208 (2010).
  19. Lee, J., Lilly, G. D., Doty, R. C., Podsiadlo, P., Kotov, N. A. In vitro toxicity testing of nanoparticles in 3D cell culture. Small. 5, 1213-1221 (2009).
  20. Lee, J., Kotov, N. A. Notch ligand presenting acellular 3D microenvironments for ex vivo human hematopoietic stem-cell culture made by layer-by-layer assembly. Small. 5, 1008-1013 (2009).
  21. Liu, Y., et al. Rapid aqueous photo-polymerization route to polymer and polymer-composite hydrogel 3D inverted colloidal crystal scaffolds. J Biomed Mater Res. Part A. 83, 1-9 (2007).
  22. Ma, P. X., Choi, J. W. Biodegradable polymer scaffolds with well-defined interconnected spherical pore network. Tissue Eng. 7, 23-33 (2001).
  23. Cuddihy, M. J., Kotov, N. A. Poly (lactic-co-glycolic acid) bone scaffolds with inverted colloidal crystal geometry. Tissue Eng Part A. 14, 1639-1649 (2008).
  24. Choi, S. W., Zhang, Y., Xia, Y. Three-dimensional scaffolds for tissue engineering: the importance of uniformity in pore size and structure. Langmuir. 26, 19001-19006 (2010).
  25. Choi, S. W., Zhang, Y., Thomopoulos, S., Xia, Y. In vitro mineralization by preosteoblasts in poly(DL-lactide-co-glycolide) inverse opal scaffolds reinforced with hydroxyapatite nanoparticles. Langmuir. 26, 12126-12131 (2010).
  26. Choi, S. W., Zhang, Y., Macewan, M. R., Xia, Y. Neovascularization in biodegradable inverse opal scaffolds with uniform and precisely controlled pore sizes. Adv Healthc Mater. 2, 145-154 (2013).
  27. Zhang, Y., Choi, S. W., Xia, Y. Modifying the Pores of an Inverse Opal Scaffold With Chitosan Microstructures for Truly Three-Dimensional Cell Culture. Macromol Rapid Commun. 33, 296-301 (2012).
  28. Cai, X., et al. Investigation of neovascularization in three-dimensional porous scaffolds in vivo by a combination of multiscale photoacoustic microscopy and optical coherence tomography. Tissue Eng. Part C, Meth. 19, 196-204 (2013).
  29. Zhang, Y. S., Yao, J., Wang, L. V., Xia, Y. Fabrication of Cell Patches Using Biodegradable Scaffolds with a Hexagonal Array of Interconnected Pores (SHAIPs). Polymer. 55, 445-452 (2014).
  30. Zhang, Y. S., Regan, K. P., Xia, Y. Controlling the Pore Sizes and Related Properties of Inverse Opal Scaffolds for Tissue Engineering Applications. Macromol Rapid Commun. 34, 485-491 (2013).
  31. Stachowiak, A. N., Bershteyn, A., Tzatzalos, E., Irvine, D. J. Bioactive Hydrogels with an Ordered Cellular Structure Combine Interconnected Macroporosity and Robust Mechanical Properties. Adv Mater. 17, 399-403 (2005).
  32. Stachowiak, A. N., Irvine, D. J. Inverse opal hydrogel-collagen composite scaffolds as a supportive microenvironment for immune cell migration. J Biomed Mater Res. Part A. 85, 815-828 (2008).
  33. Liu, Y., Wang, S. 3D inverted opal hydrogel scaffolds with oxygen sensing capability. Colloids and surfaces. B, Biointerfaces. 58, 8-13 (2007).
  34. Bryant, S. J., Cuy, J. L., Hauch, K. D., Ratner, B. D. Photo-patterning of porous hydrogels for tissue engineering. Biomaterials. 28, 2978-2986 (2007).
  35. Bhrany, A. D., Irvin, C. A., Fujitani, K., Liu, Z., Ratner, B. D. Evaluation of a sphere-templated polymeric scaffold as a subcutaneous implant. JAMA facial plastic surgery. 15, 29-33 (2013).
  36. Kuo, Y. C., Chiu, K. H. Inverted colloidal crystal scaffolds with laminin-derived peptides for neuronal differentiation of bone marrow stromal cells. Biomaterials. 32 (3), 819-831 (2011).
  37. Yang, J. T., Kuo, Y. C., Chiu, K. H. Peptide-modified inverted colloidal crystal scaffolds with bone marrow stromal cells in the treatment for spinal cord injury. Colloids Surf. B, Biointerfaces. 84, 198-205 (2011).
  38. Kuo, Y. C., Tsai, Y. T. Inverted colloidal crystal scaffolds for uniform cartilage regeneration. Biomacromolecules. 11, 731-739 (2010).
  39. Choi, S. W., Xie, J., Xia, Y. Chitosan-Based Inverse Opals: Three-Dimensional Scaffolds with Uniform Pore Structures for Cell Culture. Adv Mater. 21, 2997-3001 (2009).
  40. Long, T. J., Sprenger, C. C., Plymate, S. R., Ratner, B. D. Prostate cancer xenografts engineered from 3D precision-porous poly(2-hydroxyethyl methacrylate) hydrogels as models for tumorigenesis and dormancy escape. Biomaterials. 35, 8164-8174 (2014).
  41. Kuo, Y. C., Tsai, Y. T. Inverted colloidal crystal scaffolds for uniform cartilage regeneration. Biomacromolecules. 11, 731-739 (2010).
  42. Kuo, Y. C., Chiu, K. H. Inverted colloidal crystal scaffolds with laminin-derived peptides for neuronal differentiation of bone marrow stromal cells. Biomaterials. 32, 819-831 (2011).
  43. Lee, J., Cuddihy, M. J., Cater, G. M., Kotov, N. A. Engineering liver tissue spheroids with inverted colloidal crystal scaffolds. Biomaterials. 30 (27), 4687-4694 (2009).
  44. Galperin, A., et al. Integrated bi-layered scaffold for osteochondral tissue engineering. Adv Healthc Mater. 2, 872-883 (2013).
  45. Waters, D. J., et al. Morphology of Photopolymerized End-linked Poly(ethylene glycol) Hydrogels by Small Angle X-ray Scattering. Macromolecules. 43 (16), 6861-6870 (2010).
  46. Elbert, D. L., Hubbell, J. A. Conjugate addition reactions combined with free-radical cross-linking for the design of materials for tissue engineering. Biomacromolecules. 2 (2), 430-441 (2001).
  47. Kim, M. H., et al. Biofunctionalized Hydrogel Microscaffolds Promote Three-Dimensional Hepatic Sheet Morphology. Macromol Biosci. , (2015).
  48. Ferreira, T., Rasband, W. ImageJ User Guide. , http://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146-30.html#toc-Subsection-30.1 (2012).
  49. JoVE Science Education Database. General Laboratory Techniques. Introduction to Fluorescence Microscopy. , JoVE. Cambridge, MA. (2015).
  50. Tominaga, H., et al. A water-soluble tetrazolium salt useful for colorimetric cell viability assay. Anal Commun. 36 (2), 47-50 (1999).
  51. JoVE Science Education Database. General Laboratory Techniques. Introduction to the Microplate Reader. , JoVE. Cambridge, MA. (2015).
  52. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The ELISA Method. , JoVE. Cambridge, MA. (2015).
  53. Nolan, T., Hands, R. E., Bustin, S. A. Quantification of mRNA using real-time RT-PCR. Nat Protoc. 1, 1559-1582 (2006).
  54. JoVE Science Education Database. Essentials of Environmental Microbiology. RNA Analysis of Environmental Samples Using RT-PCR. , JoVE. Cambridge, MA. (2016).
  55. JoVE Science Education. Essentials of Environmental Microbiology. , JoVE. (2015).
  56. Jeong, S., et al. The evolution of gene regulation underlies a morphological difference between two Drosophila sister species. Cell. 132 (5), 783-793 (2008).
  57. Griffith, L. G., Naughton, G. Tissue engineering--current challenges and expanding opportunities. Science. 295 (5557), 1009-1014 (2002).
  58. Hegde, M., et al. Dynamic Interplay of Flow and Collagen Stabilizes Primary Hepatocytes Culture in a Microfluidic Platform. Lab Chip. 14, 2033-2039 (2014).
  59. Kim, Y., Lasher, C. D., Milford, L. M., Murali, T., Rajagopalan, P. A comparative study of genome-wide transcriptional profiles of primary hepatocytes in collagen sandwich and monolayer cultures. Tissue Eng Pt C. 16 (6), 1449-1460 (2010).
  60. Baimakhanov, Z., et al. Efficacy of multi-layered hepatocyte sheet transplantation for radiation-induced liver damage and partial hepatectomy in a rat model. Cell Transplant. , (2015).
  61. Li, C. Y., et al. Micropatterned Cell-Cell Interactions Enable Functional Encapsulation of Primary Hepatocytes in Hydrogel Microtissues. Tissue Eng Pt A. 20 (15-16), 2200-2212 (2014).
  62. Shlomai, A., et al. Modeling host interactions with hepatitis B virus using primary and induced pluripotent stem cell-derived hepatocellular systems. P Natl A Sci USA. 111 (33), 12193-12198 (2014).
  63. Curcio, E., et al. Mass transfer and metabolic reactions in hepatocyte spheroids cultured in rotating wall gas-permeable membrane system. Biomaterials. 28, 5487-5497 (2007).
  64. Martinez-Hernandez, A., Amenta, P. The hepatic extracellular matrix. Vichows Archiv A Pathol Anat. 423, 1-11 (1993).
  65. Liu, Y., Wang, S., Lee, J. W., Kotov, N. A. A Floating Self-Assembly Route to Colloidal Crystal Templates for 3D Cell Scaffolds. Chem Mater. 17 (20), 4918-4924 (2005).

Tags

Bioteknologi Liver tissue engineering poly (etylenglykol) hydrogel invertert kolloidalt krystall hepatocytter cellekultur biofunctionalization
Fabrikasjon av invertert Kolloidalt Crystal Poly (etylenglykol) Stillas: En Tredimensjonal Cell Culture plattform for Liver Tissue Engineering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shirahama, H., Kumar, S. K., Jeon,… More

Shirahama, H., Kumar, S. K., Jeon, W. Y., Kim, M. H., Lee, J. H., Ng, S. S., Tabaei, S. R., Cho, N. J. Fabrication of Inverted Colloidal Crystal Poly(ethylene glycol) Scaffold: A Three-dimensional Cell Culture Platform for Liver Tissue Engineering. J. Vis. Exp. (114), e54331, doi:10.3791/54331 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter