Summary
En procedure til isolering af EOB-DTPA og efterfølgende kompleksdannelse med naturlige Ga (III) og 68 Ga præsenteres heri, samt en grundig analyse af alle forbindelser og undersøgelser om mærkning effektivitet, in vitro stabilitet og n- oktanol / vand fordelingskoefficienten af det radiomærkede kompleks.
Abstract
Vi viser en fremgangsmåde til isolering af EOB-DTPA (3,6,9-triaza-3,6,9-tris (carboxymethyl) -4- (ethoxybenzyl) -undecanedioic syre) fra dens Gd (III) -kompleks og protokoller for forberedelsen af hidtil ukendte ikke-radioaktivt, dvs. naturlige Ga (III) samt radioaktiv 68 Ga-komplekset. Liganden samt Ga (III) komplekset blev karakteriseret ved kernemagnetisk resonans (NMR) spektroskopi, massespektrometri og elementaranalyse. 68 Ga blev opnået ved en standard eluering metode fra en 68 Ge / 68 Ga generator. Eksperimenter at evaluere 68 Ga mærkningseffekt af EOB-DTPA ved pH 3,8-4,0 blev udført. Etableret analyseteknikker radio TLC (tyndtlagskromatografi) og radio HPLC (højtydende væskekromatografi) blev anvendt til at bestemme den radiokemiske renhed af sporstoffet. Som en første undersøgelse af de 68 Ga sporstoffer 'lipofilicitet den n- oktanol / vand distribution koefficient på 68 Ga arter i en pH 7,4 opløsning blev bestemt ved en ekstraktionsmetode. in vitro-stabilitet målinger af sporstoffet i forskellige medier ved fysiologisk pH blev udført, afslører forskellige hastigheder af nedbrydning.
Introduction
Gadoxetic syre, et fælles navn for Gd (III) komplekset af liganden EOB-DTPA 1, er et hyppigt anvendt kontrastmiddel i hepatobiliære magnetisk resonans billeddannelse (MRI). 2,3 grund af sin specifik optagelse af lever hepatocytter og høj procentdel af hepatobiliære udskillelse det muliggør lokalisering af fokale læsioner og hepatiske tumorer. 2-5 visse begrænsninger i MRI teknik (f.eks toksicitet af kontrastmidler, begrænset anvendelighed i patienter med klaustrofobi eller metal implantater) kræver et alternativt diagnostisk værktøj .
Positron emission tomografi (PET) er en molekylær billeddannelse metode, hvor en lille mængde af et radioaktivt stof (sporstof) indgives, hvorpå dets fordeling i kroppen registreres af en PET-scanner. 6 PET er en dynamisk fremgangsmåde, der giver mulighed for høj rumlig og tidsmæssig opløsning på billederne samt kvantificering af resultaterne, uden at skullebehandle de bivirkninger af MRI-kontrastmidler. Den informative værdi af den opnåede metaboliske oplysninger kan øges yderligere ved kombination med anatomiske data modtaget fra andre billeddiagnostiske metoder, som oftest opnås ved hybrid billeddannelse med computertomografi (CT) i PET / CT-scannere.
Den kemiske struktur af et sporstof egnet til PET skal omfatte en radioaktiv isotop, der tjener som positron-emitter. Positroner har en kort levetid, da der næsten øjeblikkeligt tilintetgøre med elektroner af atomet skaller af omgivende væv. Ved udslettelse to 511 keV gamma fotoner med modsat bevægelsesretning udsendes, som registreres af PET-skanneren. 7,8 Til dannelse et sporstof, kan PET nuklider bindes covalent til et molekyle, som det er tilfældet i 2-deoxy- 2- [18F] fluoroglucose (FDG), den mest flittigt brugt PET sporstof. 7. dog kan en nuklid også danner koordinerende bindinger til en eller flere ligander (f.eks, [68 Ga] -DOTATOC 9,10) eller påføres som opløste uorganiske salte (f.eks [18F] natriumfluorid 11). Alt i alt er afgørende struktur sporstof, som det bestemmer sin biofordeling, metabolisme og udskillelse adfærd.
En passende PET nuklid bør kombinere gunstige egenskaber som praktisk positron energi og tilgængelighed samt en halveringstid passende til den påtænkte undersøgelse. Den 68 Ga nuklid er blevet en væsentlig kraft på PET i de seneste to årtier. 12,13 Dette skyldes primært dens tilgængelighed gennem et generatorsystem, der tillader mærkning på stedet uafhængigt af nærheden af en cyklotron. I en generator, moderen nuklid 68 Ge absorberes på en søjle, hvorfra datternuklid 68 Ga elueres og efterfølgende mærket til en passende chelator. 6,14 Siden 68 Ga nuklid eksisterer som en trivalent kation ligesom Gd (III) 10,13, chelaterende EOB-DTPA med 68 Ga stedet vil give et kompleks med den samme samlede negative ladning som gadoxetic syre. Følgelig kan der 68 Ga tracer kombinere en lignende karakteristisk leverspecificitet med egnetheden til PET-billeddannelse. Selvom gadoxetic syre er købt og indgives som dinatriumsalt, i det følgende sammenhæng vil vi henvise til det som Gd [EOB-DTPA] og til den ikke-radioaktive Ga (III) kompleks som Ga [EOB-DTPA], eller 68 Ga [ EOB-DTPA] i tilfælde af den radioaktivt mærkede komponent af hensyn til bekvemmelighed.
For at vurdere deres anvendelighed som sporstoffer til PET, skal undersøges i udstrakt grad i in vitro, in vivo eller ex vivo forsøg første radioaktive metalkomplekser. For at bestemme egnethed til en respektiv medicinsk problem, forskellige tracer egenskaber som biodistribution adfærd og clearance profil, stabilitet, orgel specificitet og celle eller tissue optagelse skal undersøges. På grund af deres ikke-invasiv karakter, er in vitro-bestemmelser ofte udføres før in vivo eksperimenter. Det er almindeligt anerkendt, at DTPA og dets derivater er begrænset egnethed som chelatorer for 68 Ga grundet disse komplekser mangler kinetisk træghed, hvilket resulterer i forholdsvis hurtig nedbrydning, når det administreres in vivo. 14-20 Dette skyldes primært Apo transferrin fungere som en konkurrent for 68 Ga i plasma. Ikke desto mindre er vi undersøgt dette nye sporstof vedrørende dens mulige anvendelse i hepatobiliære billeddannelse, hvor kan tilvejebringes diagnostiske oplysninger inden for få minutter efter injektion 3,4,21-23 derved ikke nødvendigvis kræver langsigtet sporstof stabilitet. Til dette formål isoleres vi EOB-DTPA fra gadoxetic syre og indledningsvis udføres kompleksdannelsen med naturlig Ga (III), der eksisterer som blanding af to stabile isotoper, 69 Ga og 71 68 Ga. Vi brugte etableret metoder og samtidig vurderes deres egnethed til bestemmelse af 68 Galabeling effektiviteten af EOB-DTPA og til at undersøge lipofiliciteten af den nye 68 Ga sporstof og dets stabilitet i forskellige medier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling af EOB-DTPA og Ga [EOB-DTPA]
Forsigtig: Se venligst alle relevante materiale sikkerhedsdatablade (MSDS) af de anvendte organiske opløsningsmidler, syrer og baser før brug. Udfør alle trin i et stinkskab, og brug personlige værnemidler (sikkerhedsbriller, handsker, kittel).
- Isolering af EOB-DTPA fra gadoxetic syre
- Sætte 3 ml 0,25 M gadoxetic syre injicerbar opløsning i en kolbe. Tilføj 500 mg (5,6 mmol) oxalsyre til den omrørte opløsning.
- Efter omrøring i 1 time, filtreres suspensionen gennem en fritte anvendelse af vakuum. Vask restkoncentrationer tre gange med 3 ml vand, hhv.
- Kombiner de vandige filtrater og udstyre løsningen med en pH-elektrode. Tilføj 12 M saltsyre til filtratet, indtil pH er ca. -0.1.
- Fjern opløsningsmidlet i vakuum til opnåelse af en farveløs rest. Opbevar under inert gas.
- remanensen vaskes grundigt (mindst tregange) med ethylacetat for at fjerne overskuddet af oxalsyre. Tør resten under vakuum.
- Resten optages i 2 ml vand ved stuetemperatur, og derefter afkøles opløsningen i et isbad. Uden at fjerne isbadet, tilsæt 0,5 M vandig natriumhydroxidopløsning dråbevis, indtil dannelsen af et farveløst klæbrigt fast stof observeres.
- Fjerne vandet ved dekantering. Vask af de faste to gange med 1 ml koldt vand. Det faste stof tørres i vakuum til opnåelse af første produktfraktion.
- Isolere en anden produktfraktion fra de kombinerede fraktioner af dekanteret vand via søjlekromatografi (silica, methanol / vand 4/1). 24. Fjern opløsningsmidlet i vakuum.
- Hvis det således opnåede faste stof er ikke ren hvid, genopløses det i 1 ml vand, tilsættes 10 ml ethanol, hvorpå 10 ml diethylether til udfældning af produktet. Der filtreres gennem en fritte hjælp reduceret tryk og tør i vakuum.
- Forenebåde faste fraktioner af EOB-DTPA og udføre NMR spektroskopiske, 25 massespektrometrisk 26 og elementært 27 analyser.
- Syntese af Ga [EOB-DTPA]
ADVARSEL: Store solid Ga (III) chlorid under en tør inert atmosfære, da ved kontakt med luft, fugt eller fedt nedbrydning finder sted, hvilket resulterer i korrosive dampe og dannelse af gule, brune eller sorte urenheder.- Der fremstilles en 0,11 M stamopløsning ved at opløse 1,94 g (11,0 mmol) Ga (III) chlorid i 100 ml vand. Fortynd 1 ml 25% vandig ammoniakopløsning med 4 ml vand.
- Opløs 80 mg (0,15 mmol) af EOB-DTPA i en kolbe i 10 ml vand. Om nødvendigt opvarme opløsningsmidlet for at opnå fuldstændig opløsning.
- Tilføj 1,4 ml (0,15 mmol) af Ga (III) chlorid stamopløsning. Udstyr kolben med en omrører og pH-elektrode. Tilføj fortyndet vandig ammoniakopløsning dråbevis indtil pH af opløsningen er ca. 4,1. Der omrøres ved roabout temperatur i 30 minutter.
- Fjern opløsningsmidlet i vakuum. Remanensen anbringes i en kolbe udstyret med en stillhead med en central og parallel side hals. Udstyre den centrale hals med en kølende finger og tuden med en vakuumpumpe outlet
- Varm remanens under reduceret tryk (125 ° C, 0,6 mbar). Periodisk fjerne sublimeret ammoniumchlorid (synlige som hvide belægning af glasoverfladen) fra kølefingeren og stadig hoved, samt fra de øvre dele af kolben med en let fugtig klud. Fortsæt processen, indtil der ikke er nogen synlig dannelse af nye sublimatet.
- At fjerne de endelige spor af ammoniumchlorid restproduktet vaskes tre gange med 0,5 ml varm methanol, henholdsvis. Tør den farveløse remanens i vakuum. Udfør NMR spektroskopiske, 25 Massespektrometrisk 26 og elementært 27 analyser.
2. Generel Mærkning Procedure
ADVARSEL: Alle exmenterne herunder direkte eller indirekte kontakt med radioaktive stoffer skal foretages af kun uddannet personale. Brug venligst passende afskærmning udstyr. Saml radioaktivt affald separat og opbevare og bortskaffe i overensstemmelse med gældende bestemmelser.
- Eluering af generatoren
Bemærk: En 40 mCi 68 Ge / 68 Ga-generator med moderen nuklid bundet som oxid på dodecyl-3,4,5-trihydroxybenzoat silica blev anvendt. Eluering og oprensning kan udføres manuelt eller, som det var tilfældet i denne procedure, som en kombineret automatiseret proces under anvendelse af en peristaltisk pumpe og dispenser enhed.- Fremstille opløsninger af 5,5 M, 1,0 M og 0,05 M saltsyre. Der fremstilles en opløsning af 5,0 M natriumchlorid indeholdende 25 pi 5,5 M saltsyre pr ml. Der fremstilles en pufferopløsning med pH 4,6 ved at kombinere 4,1 g natriumacetat, 1 ml HCl (30%) og 2,5 ml iseddike og fortynding af blandingen med vand til 50 ml.
- Precetingelse PS-H + patron ved skylning det langsomt med 1 ml 1,0 M saltsyre og derefter 5 ml vand.
- Eluere silicakolonne af generatoren med 4 ml 0,05 M HCI. 12 Læg 68 Ga eluatet på PS-H + patron.
- Skyl patronen med 5 ml vand og derefter tørre det med 5 ml luft. Eluering af 68 Ga fra patronen med 1 ml 5,0 M syrnet natriumchloridopløsning. 28
- Mærkning af EOB-DTPA med 68 Ga
- Opløs 1 mg (1,9 pmol) EOB-DTPA i 1 ml vand. Fra denne løsning tage 100 pi (0,19 pmol) og fortyndes dem med 9,9 ml vand til at forberede en 19 uM (10 ug / ml) stamopløsning af EOB-DTPA.
- Fjern 50 pi (svarende til 22-29 MBq) af opløsningen indeholdende 68 Ga og sat ind i et hætteglas. Tilsæt 50 pi (0,5 mg) af en 19 mM stamopløsning af EOB-DTPA og 300 pi of buffer for at hæve pH til 4,0. Ryst kortvarigt og inkuber opløsningen ved stuetemperatur i 5 min. Fjern en portion af 1-5 pi og sat til HPLC eller TLC-analyse.
- Udfør radio HPLC-analyse på en revers fase (RP) C18-søjle 29 Brug følgende mobile fase:. A - vand / trifluoreddikesyre (99,9% / 0,1%), B - acetonitril / trifluoreddikesyre (99,9% / 0,1%), gradient : 06 min 80% A → 0% A (0,5 ml / min), 610 min 0% A (0,5 ml / min).
- Bestem peak intensiteterne af radio HPLC signaler som arealet under kurven. Beregn udbyttet mærkning som den radiokemiske renhed (RCP) af sporstoffet som følger:
RCP = A Ga-EOB-DTPA / (A Ga + A Ga-EOB-DTPA) ∙ 100%
En Ga-EOB-DTPA: arealet under kurven for 68 Ga [EOB-DTPA]
En Ga: areal under kurven for fri 68 Ga
3. Mærkning Effektivitet
- Udfør etikettering som beskriverd i afsnit 2. Brug en konsekvent vifte af start aktivitet af 68 Ga eluat, fx 22-29 MBq (40-140 pi, afhængigt af friskhed af eluatet).
- Tilsæt nødvendige mængde pufferopløsning for at justere pH til 3,8-4,0 (40-190 pi, afhængigt af mængden af 68 Ga eluat). Tilsæt nødvendige mængde ligand stamopløsning (10-70 pi af en 19 mM opløsning).
- Tilføj de nødvendige mængder vand for at justere den samlede mængde af hver mærkning sonde til 1,75 ml. Bland grundigt og lad prøven henstå i 5 minutter ved stuetemperatur. Udfør HPLC-analyse som beskrevet i afsnit 2 at bestemme udbyttet mærkning.
- Udfør procedurer med mængder af ligand mellem 0,1 ug og 0,7 ug i trin på 0,1 mg mærkning. Udfør eksperimenter i tredobbeltbestemmelse for hver ligandkoncentration. Beregn den gennemsnitlige udbytte og standardafvigelse.
4. In vitro Stabilitet
- Generel pROCEDURE og præparater
- Opløs en tablet med phosphatbufret saltvand (PBS) i 200 ml deioniseret vand til fremstilling af en PBS-stamopløsning med en phosphatkoncentration på 10 mM.
- Udfør mærkning af 22-29 MBq 68 Ga med 0,5 ul EOB-DTPA stamopløsning, som beskrevet i afsnit 2. Afhængigt af omfanget af den 68 Ga eluatet, justere mængden af buffer, som beskrevet i afsnit 3. Træk prøver af mærkning, der indeholder 6-12 MBq sporstof til at udføre stabilitet målinger.
- Udfør radio TLC-analyse på 80 mm silicagelplader coatede aluminiumplader anvendelse af 0,1 M vandig natriumcitrat som eluent og analysere pladerne med en TLC radioaktivitet scanner. 30 Bestem intensiteterne af TLC signaler som arealet under kurven. Beregn RCP af sporstoffet som følger:
RCP = A Ga-EOB-DTPA / (A Ga-fri + A Ga-EOB-DTPA + A Ga-kolloid) ∙ 100%
En Ga-EOB-DTPA: areal under kurven for 68 Ga [EOB-DTPA]
En Ga-fri: arealet under kurven for fri 68 Ga
En Ga-kolloid: arealet under kurven for kolloidt 68 Ga - Beregn RCP t / RCP 0 for hver tidspunkt. Plot den således standardiserede RCP vs. tidsforskel da udgangspunktet t = 0 min.
RCP t = RCP af 68 Ga [EOB-DTPA] på tidspunkt t.
RCP 0 = RCP af 68 Ga [EOB-DTPA] ved t = 0 min.
- Stabilitet i phosphatbufret saltvand (A)
- Til 65 pi mærkning opløsning tilsættes 150 pi PBS-stamopløsning og 60 pi natriumhydroxidopløsning (0,1 M) for at øge pH til 7,4. Bland grundigt.
- Fjern en portion på 1-5 pi at udføre TLC-analyse ( »udgangspunkt«). Umiddelbart opbevare opløsningen i en inkubator ved 37 ° C og fjerne alikvoter at udføre TLC-analyse på repræsenterertiv tidspunkter i løbet af 3 timer.
- Stabilitet over for overskud af apo -transferrin i PBS (B)
- Til 120 pi mærkningsløsning tilsættes 50 pi PBS-stamopløsning og 430 pi natriumhydroxidopløsning (0,1 M) for at øge pH til 7,4. Tilsæt 40 pi af en opløsning af apo -transferrin (25 mg / ml). Bland grundigt.
- Fjern en portion på 1-5 pi at udføre TLC-analyse ( »udgangspunkt«). Umiddelbart opbevare opløsningen i en inkubator ved 37 ° C og fjerne alikvoter at udføre TLC-analyse på repræsentative tidspunkter i løbet af 3 timer.
- Stabilitet i humant serum (C)
- Til 500 pi humant serum tilsættes 25 pi mærkningsløsning og 45 pi natriumhydroxidopløsning (0,1 M) for at øge pH til 7,4. Bland grundigt.
- Fjern en portion på 1-5 pi at udføre TLC-analyse ( »udgangspunkt«). Umiddelbart opbevare opløsningen i en INCUbator ved 37 ° C og fjerne alikvoter at udføre TLC-analyse på repræsentative tidspunkter i løbet af 3 timer.
5. Bestemmelse af fordelingskoefficienten logD
- Udfør procedurer til mærkning som beskrevet i afsnit 2. Til 50 pi mærkningsløsning tilsættes 20 pi PBS-stamopløsning og 170 pi natriumhydroxidopløsning (0,1 M) for at øge pH til 7,4.
- Træk 200 pi fra denne løsning, og sætte det ind i en plastik V-hætteglas. Tilsæt 200 pi n- oktanol. Luk hætteglasset og vortex i 2 minutter. Centrifugeres prøven ved 1.600 xg i 5 min.
- Fjern tre eksemplarer af 40 pi fra n-octanol fase og den vandige fase hver og sætte dem i separate V-hætteglas. Pas på ikke at blande lagene.
- Måle aktiviteten af hver prøve i en gamma-brøndtæller i 30 sek. For hver prøve straks gentage målingen to gange og heraf beregne middelværdien aktivitet Ᾱ t t, W1, Ᾱ t, W2 og Ᾱ t, W3 (aktiviteter i vandige prøver) og Ᾱ t, O1, Ᾱ t, O2, Ᾱ t, O3 (aktiviteter i n- oktanol) sammen med den respektive tidspunkt t af deres beslutsomhed.
- Definere tidspunktet for målingen af den sidste prøve som t 0. Bestem og listen AT i min ved at beregne AT = tt 0. Udfør henfald korrektion af Ᾱ t, ved hjælp af følgende formel:
Ᾱ 0 = Ᾱ t · 2 (AT / 68 min). - Beregn Ᾱ 0, W som middelværdien af Ᾱ 0, W1, Ᾱ 0, W2 og Ᾱ 0, W3 samt Ᾱ 0, O som middelværdien af Ᾱ 0, O1, Ᾱ 0, O2 og Ᾱ 0, O3. Beregn logD ved hjælp af følgende formel:
logD = log [(Ᾱ - Udfør hele eksperiment i tre eksemplarer og beregne det gennemsnitlige logD sammen med sin standardafvigelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Liganden EOB-DTPA og det ikke-radioaktive Ga (III) kompleks blev analyseret via 1H og 13C {1H} NMR-spektroskopi, massespektrometri og elementaranalyse. Resultaterne anført i tabel 1 og vist i figur 1-6 verificere renheden af stofferne.
Eluering af 68 Ge / 68 Ga generator gav løsninger på 400-600 MBq 68 Ga. Den beskrevne procedure mærkning resulterer i dannelsen af det ønskede sporstof 68 Ga [EOB-DTPA], angivet som radio HPLC peak udviser en retentionstid på 2,8 min (figur 7). Sammenligning med retentionstiden for Ga [EOB-DTPA] standard i UV-vis-detektor ved 220 nm (2,7 min, figur 8) bekræfter vellykket mærkning. Ukoordineret 68 Ga detekteres som radio top ved 2,1 minutter (figur7). Effektiviteten af EO-BDTPA 68 Ga-mærkning blev undersøgt ved at bestemme mærkningsudbyttet som en funktion af ligandkoncentrationen via HPLC (figur 9). Udbytterne blev bestemt i tre eksemplarer og standardafvigelser blev beregnet.
Afhængigt af pH og koncentrationen af anioner til stede i opløsning, ukoordinerede eller umærkede 68 Ga kan eksistere i forskellige arter, fx, gallater eller uopløselige hydroxid. 31 Den generelle udtrykket "fri 68 Ga" 32 anvendes til alle ikke-mærkede arter i opløsning undtagen hydroxidet, som generelt betegnes som "kolloid 68 Ga". Under de beskrevne analysebetingelser, fri 68 Ga bevæger sig med opløsningsmiddelfronten (Rf = 1,0) på en TLC-plade. Kolloid 68 Ga ikke kan påvises via HPLC, mens på en TLC-plade ser det ud som aktivitetved oprindelsen (Rf = 0). Et repræsentativt kromatogram af en TLC-plade analyseret med et TLC radioaktivitet scanneren er vist i figur 10. Sporstoffet udviser forskellige tilbageholdelse adfærd, afhængigt af om en prøve af mærkning opløsning (pH 3,8-4,0, Rf = 0,3) eller en prøve af fysiologisk pH (Rf = 0,5) blev analyseret.
For at undersøge stabiliteten af sporstoffet, frisk mærket 68 Ga [EOB-DTPA] blev tilsat til prøver af fysiologisk pH, der indeholder fortyndet PBS (phosphatkoncentration 5,5 mM, A), overskud af Apo transferrin (1,6 mg / ml i fortyndet PBS med en phosphatkoncentration på 0,8 mM, B) og humant serum (C), henholdsvis. Med tiden blev den radiokemiske renhed (RCP t) af sporstof i prøverne bestemmes via TLC. Procentdelen af intakt sporstof blev beregnet som forholdet mellem RCP t vedde respektive tidspunkter og RCP 0 ved udgangspunktet (tabel 2). Dette var nødvendigt på grund af de løsninger mærkning indeholdende sporstof af forskellige RCP 0 (93-96%). Den således standardiserede procentdel af intakt sporstof er afbildet som en funktion af tid i figur 11.
Til bestemmelse af logD vandige prøver af sporstof i en fortyndet PBS løsning var forberedt. Prøverne blev blandet med n- oktanol, centrifugeret og efterfølgende portioner blev fjernet for at bestemme koncentrationen af aktivitet i begge faser. Aktivitet værdier og efterfølgende beregning af logD deraf er vist i tabel 3. Middelværdien logD værdi 3,54 ± 0,08.
Figur 1. 1H-NMR-spektret af EOB-DTPA. < / strong> Spektret blev optaget i D2O på 400,1 MHz. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. 13C {1 H} NMR spektrum af EOB-DTPA. Spektret blev optaget i D2O på 100,6 MHz. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. MS af EOB-DTPA (elektrospray ionisering (ESI), methanol, negativ modus).54334fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. 1H-NMR-spektret af Ga [EOB-DTPA]. Spektret blev optaget i D2O på 400,1 MHz. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. 13C {1 H} NMR spektrum af Ga [EOB-DTPA]. Spektret blev optaget i D2O på 100,6 MHz. Klik hende e for et større version af denne figur.
Figur 6. MS af Ga [EOB-DTPA] (ESI, methanol, negativ tilstand), sammen med en detaljeret skildring af isotopen mønster af molekylære top. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7. Repræsentant HPLC kromatogram af en stikprøve på 68 Ga [EOB-DTPA] indeholder i dele ukoordineret 68 Ga, som registreret af radioaktivitet detektor. Ukoordinerede 68 Ga udviser en retentionstid på 2,1 minutter, mens der registreres sporstoffet på 2,8 min .target = "_ blank"> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 8. Repræsentant HPLC kromatogram af standard stof Ga [EOB-DTPA], som påvist i UV-vis kanal ved 220 nm. Retentionstiden for den kolde standard er 2,7 min. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 9. Afbildning af 68 Ga-mærkning effektivitet EOB-DTPA. Udbyttet mærkning som bestemt via HPLC er plottet som en funktion af koncentrationen af EOB-DTPA (22-29 MBq begyndende aktivitet, pH 3,8-40,0, 5 min, RT). Standardafvigelsen er vist ved fejllinjer. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 10. Repræsentant TLC kromatogram afslører forskellige 68 Ga arter. En prøve af 68 Ga [EOB-DTPA] i fortyndet PBS (fosfat koncentration 5,5 mM, pH = 7,4) blev analyseret efter 110 minutters inkubation. Eksemplarisk fordeling af kolloidt 68 Ga (Rf = 0), 68 Ga [EOB-DTPA] (Rf = 0,5) og gratis 68 Ga (Rf = 1,0) på en 70 mm TLC-plade som påvist ved en TLC radioaktivitet scanner er forelagde. Tællinger er forfald rettet. Klik her for at se et størreversion af denne figur.
Figur 11. Stabilitet bestemmelser af 68 Ga [EOB-DTPA] i forskellige medier. Det forfald korrigeret, standardiseret procentdel af intakt sporstof som bestemt via TLC, er afbildet som funktion af tiden. Klik her for at se en større version af dette tal .
Tabel 1. Resultater af NMR spektroskopiske, MS og elementært analyser udført for EOB-DTPA og Ga [EOB-DTPA]. Relative MS topintensiteter er givet i%, overdragelse til toppe er anført i skarpe parenteser. Elemental CHN værdier var beregleret for C 23 H 33 N 3 O 11 · H2O (EOB-DTPA) og (NH4) 0,75 H 1,25 [C 23 H 28 GAN 3 O 11] · 2H 2 O (Ga [EOB-DTPA]).
Tabel 2. Stabilitet bestemmelse af 68 Ga [EOB-DTPA] i forskellige medier. RCP af 68 Ga [EOB-DTPA] i medierne A, B og C blev bestemt via TLC ved givne tidspunkter. Sammensætningen af prøverne gives som procenter i% af sporstof / gratis 68 Ga / kolloid 68 Ga. Procentdelen af intakt sporstof er standardiseret som forholdet mellem RCP t / RCP 0. RCP 0 er den respektive RCP af sporstoffet ved t = 0 min.
. Tabel 3. Bestemmelse af logD Decay korrigerede værdier a 0, X i tre portioner (x = 1, 2, 3) fjernet fra hver fase (W: vandig, O: n-octanol) i en prøve. Alle aktiviteter er angivet i cpm. LogD beregnes som beskrevet i afsnit 5 i protokollen. Eksperimentet blev gentaget to gange.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
EOB-DTPA er tilgængelig via en flertrinssyntese 33, men kan lige så vel isoleres fra tilgængelige kontrastmidler indeholdende gadoxetic syre. Til dette formål kan den centrale Gd (III) ion præcipiteres med et overskud af oxalsyre. Efter fjernelse Gd (III) oxalat og oxalsyre liganden kan isoleres ved udfældning i koldt vand ved pH 1,5. Men for at øge udbyttet søjlekromatografi af filtratet kan udføres i stedet eller som en opfølgende procedure. Begge metoder giver den analytisk rene ligand i totale udbytter på 70% (Figur 1-3, tabel 1).
Vi fandt, at for at isolere Ga [EOB-DTPA] justering af pH med ammoniak opløsning fordelagtig sammenlignet med anvendelsen af natriumhydroxid, idet biproduktet ammoniumchlorid kan fjernes fra den meget hydrofil rest via sublimering. Under ovennævnte betingelser denne proces foregår langsomly. Da ikke-ubetydelige mængder af chlorid var stadig påvises efter fem dage blev den resterende salt udvasket med methanol. Selvom dette arbejde-up procedure resulterer i delvis tab af Ga [EOB-DTPA] blev produktet opnået i analytisk renhed med et samlet udbytte på 46% (Figur 4-6, Tabel 1). Til isolering af både EOB-DTPA og dens Ga (III) kompleks, bør det overvejes at anvende omvendt fase kromatografi som en alternativ metode til oprensning, især da nedbrydning af silicagel er sandsynligt, når der anvendes stærkt polære opløsningsmidler.
Mærkningsprocessen af EOB-DTPA krævede anvendelse af særdeles rent opløsningsmidler, kemikalier og metalfri udstyr for at undgå tilstedeværelsen af konkurrerende metalioner, grundet 68 Ga er til stede i nanomolære mængder (2 MBq 68 Ga i en 1,75 ml prøve lige en nuklid koncentration på 0,14 nM). Mærkning af EOB-DTPA til 68 Ga forekommer ved pH 3,8-4,0 inden fem minUte ved stuetemperatur. Undersøgelser på 68 Ga mærkningseffekt kræver bestemmelse af mærkningsudbyttet samtidig holde reaktionsbetingelserne pH, temperatur og reaktionstid samt udgangsmateriale aktivitet af 68 Ga konstant eller på en forsvarlig interval. For hvert datapunkt (dvs. ligand koncentration) forsøget skal udføres mindst tre gange for at give en rimelig sikkerhed plan, da koncentrationerne af både ligand og 68 Ga er meget lav, og udbyttet mærkning derfor følsom over for selv små afvigelser fra reaktionsbetingelser. For eksempel som de 68 Ga eluat aldre, portioner af stigende volumen skal trækkes tilbage for at tilvejebringe en konstant udgangsaktiviteten, hvilket kræver stigende mængder buffer. Desuden ældning af eluatet resultater i stigende koncentrationer af forfald produkt 68 Zn, som i sig selv kan virke som en konkurrent for 68 Ga, således negativt påvirker labeling effektivitet. 13,34,35 Praktisk kvantitativ mærkning af 22-29 MBq 68 Ga opnås under de ovennævnte betingelser med mængder af EOB-DTPA ≥ 0,7 mg (figur 9), med indholdet af fri 68 Ga ≤ 2% og omkring 5 % af kolloidt 68 Ga stede i prøver.
Mens HPLC gav bedre baseline separation af fri 68 Ga og 68 Ga [EOB-DTPA], er den ikke egnet til at detektere kolloidt 68 Ga. Vi valgte derfor TLC for at bestemme RCP under stabilitetsmålinger, hvor kvantificeringen af transferrin eller proteinbundet 68 Ga var påkrævet. Vi fandt baseline separation accepteres til dette formål (figur 10); imidlertid til brugen af gelpermeationskromatografi eller filtreringsmetoder 15,36 fjerne kolloide fraktioner, efterfulgt af HPLC-analyse, kan betragtes som alternativer. Den 68 Ga-komplekset udviser en stærkere RETention på TLC-plader (R f = 0,3), hvis prøven trækkes direkte fra mærkning løsning i modsætning til prøverne ved fysiologisk pH (R f = 0,5). Vi foreslår denne observation kan forklares ved forskellige protonering stater i komplekset.
In vitro stabilitet bestemmelser af 68 Ga sporstoffer udføres normalt i PBS 15,17 eller alternative puffersystemer efterligner den fysiologiske pH 37, såvel som i opløsninger indeholdende Apo- transferrin 37, som er den vigtigste konkurrent til 68 Ga i blod, eller i human serum 15,17. I vores eksperimenter tilsætning af 0,1 M natriumhydroxidopløsning til PBS var forpligtet til at justere pH af prøverne til 7,4. Vi kunne ikke hævde, at fosfat koncentrationen påvirker nedbrydningshastigheden, da stabilitet eksperimenter i opløsninger af varierende fosfat koncentration (0,8 mM og 5,5 mM (A)) gav ikke-reproduCible resultater. Vi fandt imidlertid, at en opløsning B, der indeholder apo -transferrin (1,6 mg / ml, hvilket er inden for det normale plasma indholdet 38) og 0,8 mM phosphat (humant blod sædvanligvis udviser en phosphat niveau på 0,8-1,5 mM 39,40 ), forårsager nedbrydning med en hastighed svarende til den, observerbare i humant serum (C). I opløsninger AC, efter 185 minutter blev indholdet af kolloidt 68 Ga var steget med ca. 24%, mens indholdet af frit 68 Ga var steget med 11% i opløsning A, 17% i opløsning B og 27% i opløsning C (tabel 2 ). Det faktum, at 68 Ga dannet af tracer nedbrydning er overvejende til stede som fri 68 Ga i modsætning kolloide eller proteinbundet 68 Ga i B og C kan skyldes transferrinmætning eller sammenligneligt langsom transferrin bindende satser.
For at forudsige en sporstoffer vævsfordeling n- oktanol / vand-fordelingskoefficient koefficienter logP eller fordelingskoefficienter logD kan bestemmes som forholdet mellem aktivitet koncentrationer i de to faser. Per definition betyder logD parameter ikke skelne mellem flere arter, der er til stede i et medium, som gør den velegnet til vore forsøg på grund af muligheden for forskellige protonering tilstande af sporstoffet samt dets nedbrydning i den vandige fase. Til bestemmelse logD ved ekstraktion det vandige medium sædvanligvis pufret med PBS for at efterligne blod forhold. 17,43-45 For førnævnte grunde, vi anvendte fortyndede PBS, der udviser en phosphatkoncentration på 0,8 mM og fysiologisk pH. Efter ekstraktion med n-octanol og centrifugering, fjernelse af flere portioner fra den samme fase tillader unøjagtigheder forårsaget af pipettering skal reduceres. På grund af de meget lave koncentrationer aktivitet i n- oktanol man skal være omhyggelig med at undgå krydskontaminering med den vandige fase og for at sikre kvantitativ overførsel til et separat hætteglas. distribution koefficienter bestemt ved denne procedure var reproducerbare, og mens de giver mulighed for et groft skøn af lipofilicitet, en direkte sammenligning til en log P af Gd [EOB-DTPA] er ikke mulig. På grund af den særlige Gd [EOB-DTPA] resulterer ikke primært fra lipofilicitet men hellere vil være nødvendigt at give mere omfattende oplysninger om biofordelingen samt stabilitet in vivo af 68 Ga [EOB sine hepatobiliære uptake yderligere eksperimenter i levende fag eller celler -DTPA]. Alt i alt, en ansøgning som billeddannende agent for perfusion og tidlig hepatobiliære fase er tænkelige.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| primovist | Bayer | - | 0.25 M |
| gallium(III) chloride | Sigma-Aldrich Co. | 450898 | |
| water (deionized) | - | - | tap water deionizing equipment by Auma-Tec GmbH |
| hydrochloric acid 12 M | VWR | 20252.29 | |
| sodium hydroxide | Polskie Odczynniki Chemiczne S.A. | 810925429 | |
| oxalic acid | Sigma-Aldrich Co. | 75688 | |
| ethyl acetate | Brenntag GmbH | 10010447 | |
| silica gel | Merck KGaA | 1.10832.9025 | Geduran Si 60 0.063-0.2 mm |
| TLC silica gel 60 F254 | Merck KGaA | 1.16834.0001 | |
| methanol | VWR | 20903.55 | |
| ethanol | Brenntag GmbH | 10018366 | |
| eiethylether | VWR | 23807.468 | stored over KOH plates |
| ammonia solution (25%) | VWR | 1133.1 | |
| pH electrode | VWR | 662-1657 | |
| stirring and heating unit | Heidolph | 505-20000-00 | |
| pump | Ilmvac GmbH | 322002 | |
| frit | - | custom design | |
| NMR spectrometer | Bruker Coorporation | - | Ultra Shield 400 |
| mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific Inc. | - | |
| elemental analyser | Hekatech GmbH Analysentechnik | - | EuroVector EA 3000 CHNS |
| deuterated water D2O | euriso-top | D214 | 99.90% D |
| Material/Equipment required for labeling procedures | |||
| 68Ge/68Ga generator | ITG Isotope Technologies Garching GmbH | A150 | |
| pump and dispenser system | Scintomics GmbH | - | Variosystem |
| hydrochloric acid 30% (suprapur) | Merck KGaA | 1.00318.1000 | |
| water (ultrapur) | Merck KGaA | 1.01262.1000 | |
| sodium chloride (suprapur) | Merck KGaA | 1.06406.0500 | |
| sodium acetate (suprapur) | Merck KGaA | 1.06264.0050 | |
| glacial acetic acid (suprapur) | Merck KGaA | 1.00066.0250 | |
| sodium citrate dihydrate | VEB Laborchemie Apolda | 10782 | >98.5% |
| PS-H+ Cartridge (S) | Macherey-Nagel | 731867 | Chromafix |
| apo-Transferrin | Sigma-Aldrich Co. | T2036 | |
| PBS buffer (tablets) | Sigma-Aldrich Co. | 79382 | |
| human serum | Sigma-Aldrich Co. | H4522 | from human male AB plasma |
| flasks, columns, etc. | custom design | ||
| pH electrode | Knick Elektronische Messgeräte GmbH & Co. KG | 765-Set | |
| binary pump (HPLC) | Hewlett-Packard | G1312A (HP 1100) | |
| UV Vis detector (HPLC) | Hewlett-Packard | G1315A (HP 1100) | |
| radioactive detector (HPLC) | EGRC Berthold | ||
| HPLC C-18-PFP column | Advanced Chromatography Technologies Ltd. | ACE-1110-1503/A100528 | |
| HPLC glass vials | GTG Glastechnik Graefenroda GmbH | 8004-HP-H/i3µ | |
| pipette | Eppendorf | - | |
| plastic vials | Sarstedt AG & Co. | 6542.007 | |
| plastic vials | Greiner Bio-One International GmbH | 717201 | |
| activimeter | MED Nuklear-Medizintechnik Dresden GmbH | - | Isomed 2010 |
| tweezers | custom design | ||
| incubator | Heraeus Instruments GmbH | 51008815 | |
| vortex mixer | Fisons | - | Whirlimixer |
| centrifuge | Heraeus Instruments GmbH | 75003360 | |
| gamma well counter | MED Nuklear-Medizintechnik Dresden GmbH | - | Isomed 2100 |
| water for chromatography | Merck KGaA | 1.15333.2500 | |
| acetonitrile for chromatography | Merck KGaA | 1.00030.2500 | |
| trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | 91707 | |
| TLC radioactivity scanner | raytest Isotopenmessgeräte GmbH | B00003875 | equipped with beta plastic detector |
References
- Weinmann, H. J., et al. A new lipophilic gadolinium chelate as a tissue-specific contrast medium for MRI. Magn. Reson. Med. 22, 233-237 (1991).
- Stroszczynski, C., et al. Aktueller Stand der MRT-Diagnostik mit leberspezifischen Kontrastmitteln. Radiologe. 44, 1185 (2004).
- Van Beers, B. E., Pastor, C. M., Hussain, H. K. Primovist, Eovist - what to expect. J. Hepatol. 57, 421-429 (2012).
- Zech, C. J., Herrmann, K. A., Reiser, M. F., Schoenberg, S. O. MR Imaging in Patients with Suspected Liver Metastases: Value of Liver-specific Contrast Agent Gd-EOB-DTPA. Magn. Reson. Med. Sci. 6, 43-52 (2007).
- Leonhardt, M., et al. Hepatic Uptake of the Magnetic Resonance Imaging Contrast Agent Gd-EOB-DTPA: Role of Human Organic Anion Transporters. Drug Metab. Dispos. 38, 1024-1028 (2010).
- Wadas, T. J., Wong, E. H., Weisman, G. R., Anderson, C. Coordinating Radiometals of Copper, Gallium, Indium, Yttrium, and Zirconium for PET and SPECT Imaging of Disease. J. Chem. Rev. 110, 2858-2902 (2010).
- Ametamey, S. M., Honer, M., Schubiger, P. A. Molecular Imaging with PET. Chem. Rev. 108, 1501-1516 (2008).
- Cutler, C. S., Hennkens, H. M., Sisay, N., Huclier-Markai, S., Jurisson, S. S. Radiometals for Combined Imaging and Therapy. Chem. Rev. 113, 858-883 (2013).
- Henze, M., et al. PET Imaging of Somatostatin Receptors Using [68GA]DOTA-D-Phe1-Tyr3-Octreotide: First Results in Patients with Meningiomas. J. Nucl. Med. 42, 1053-1056 (2001).
- Hofmann, M., et al. Biokinetics and imaging with the somatostatin receptor PET radioligand 68Ga-DOTATOC: preliminary data. Eur. J. Nucl. Med. 28, 1751-1757 (2001).
- Blau, M., Nagler, W., Bender, M. A. Fluorine-18: a new isotope for bone scanning. J. Nucl. Med. 3, 332-334 (1962).
- Green, M. A., Welch, M. J. Gallium Radiopharmaceutical Chemistry. Int. J. Radiat. Appl. Instrum. B. 16, 435-448 (1989).
- Rösch, F. Past, present and future of 68Ge/68Ga generators. Appl. Radiat. Isot. 76, 24-30 (2013).
- Liu, S. The role of coordination chemistry in the development of target-specific radiopharmaceuticals. Chem. Soc. Rev. 33, 445-461 (2004).
- Haubner, R., et al. Development of (68)Ga-labelled DTPA galactosyl human serum albumin for liver function imaging. Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging. 40 (68), 1245-1255 (2013).
- Yang, W., Zhang, X., Liu, Y. Asialoglycoprotein Receptor-Targeted Radiopharmaceuticals for Measurement of Liver Function. Curr. Med. Chem. 21, 4-23 (2014).
- Chauhan, K., et al. 68Ga based probe for Alzheimer's disease: synthesis and preclinical evaluation of homodimeric chalcone in β-amyloid imaging. Org. Biomol. Chem. 12, 7328-7337 (2014).
- Chakravarty, R., Chakraborty, S., Dash, A., Pillai, M. R. A. Detailed evaluation on the effect of metal ion impurities on complexation of generator eluted 68Ga with different bifunctional chelators. Nucl. Med. Biol. 40, 197-205 (2013).
- Clevette, D. J., Orvig, C. Comparison of ligands of differing denticity and basicity for the in vivo chelation of aluminum and gallium. Polyhedron. 9, 151-161 (1990).
- Prinsen, K., et al. Development and evaluation of a 68Ga labeled pamoic acid derivative for in vivo visualization of necrosis using positron emission tomography. Bioorg. Med. Chem. 18, 5274-5281 (2010).
- Vogl, T. J., et al. Liver tumors: comparison of MR imaging with Gd-EOB-DTPA and Gd-DTPA. Radiology. 200, 59-67 (1996).
- Reimer, P., et al. Phase II clinical evaluation of Gd-EOB-DTPA: dose, safety aspects, and pulse sequence. Radiology. , 177-183 (1996).
- Ba-Ssalamah, A., et al. MRT der Leber. Radiologe. 44, 1170-1184 (2004).
- Scott, R. P. W. Journal of Chromatography Library. 22A, Elsevier Scientific Publishing Co. A137-A160 (1983).
- Reichenbaecher, M., Popp, J. Strukturanalytik organischer und anorganischer Verbindungen. , 1st, B. G. Teubner Verlag. Wiesbaden. (2007).
- Gross, J. H. Mass Spectrometry: A Textbook. , Springer. (2004).
- Ma, T. S., Rittner, R. C. Modern Organic Elemental Analysis. , Marcel Dekker, Inc. (1979).
- Mueller, D., et al. Simplified NaCl Based 68Ga Concentration and Labeling Procedure for Rapid Synthesis of 68Ga Radiopharmaceuticals in High Radiochemical Purity. Bioconjugate Chem. 23, 1712-1717 (2012).
- Roberts, T. R. Radio-column chromatography. Journal of Chromatography Library. 14, 103-132 (1978).
- Roberts, T. R. Radio-thin-layer chromatography. Journal of Chromatography Library. 14, 45-83 (1978).
- Green, M. A., Welch, M. J. Gallium radiopharmaceutical chemistry. Nucl. Med. Biol. 16, 435-448 (1989).
- Notni, J., Plutnar, J., Wester, H. J. Bone-seeking TRAP conjugates: surprising observations and their implications on the development of gallium-68-labeled bisphosphonates. EJNMMI Res. 2, 13 (2012).
- Schmitt-Willich, H., et al. Synthesis and Physicochemical Characterization of a New Gadolinium Chelate: The Liver-Specific Magnetic Resonance Imaging Contrast Agent Gd-EOB-DTPA. Inorg. Chem. 38, 1134-1144 (1999).
- 68Ga generator for positron emission tomography. Zhernosekov, K., Nikula, T. , DE102010037964B3 (2012).
- Simecek, J., Hermann, P., Wester, H. J., Notni, J. How is 68Ga Labeling of Macrocyclic Chelators Influenced by Metal Ion Contaminants in 68Ge/68Ga Generator Eluates? ChemMedChem. 8, 95-103 (2013).
- Baur, B., et al. Synthesis, Radiolabelling and In Vitro Characterization of the Gallium-68-, Yttrium-90- and Lutetium-177-Labelled PSMA Ligand, CHX-A''-DTPA-DUPA-Pep. Pharmaceuticals (Basel). 7, 517-529 (2014).
- Boros, E., et al. RGD conjugates of the H2dedpa scaffold: synthesis, labeling and imaging with 68Ga. Nucl. Med. Biol. 39, 785-794 (2012).
- Beck, W. S. Hematology. , 5th, MIT press. Cambridge, Massachusetts. (1998).
- Patel, V., Morrissey, J. Practical and Professional Clinical Skills. , 1, Oxford University Press Inc. New York. (2001).
- Bartke, A., Constanti, A. Basic Endocrinology. , 1, CRC Press. (1998).
- Bernstein, L. R. Mechanisms of Therapeutic Activity for Gallium. Pharmacol. Rev. 50, 665-682 (1998).
- Clausen, J., Edeling, C. J., Fogh, J. 67Ga Binding to Human Serum Proteins and Tumor Components. Cancer Res. 34, 1931-1937 (1974).
- Dumont, R. A., et al. Novel 64Cu- and 68Ga-Labeled RGD conjugates show improved PET imaging of αvβ3 integrin expression and facile radiosynthesis [Erratum to document cited in CA156:116856. J. Nucl. Med. 52, 1498 (2011).
- Pohle, K., et al. 68Ga-NODAGA-RGD is a suitable substitute for 18F-Galacto-RGD and can be produced with high specific activity in a cGMP/GRP compliant automated process. Nucl. Med. Biol. 39, 777-784 (2012).
- Notni, J., Pohle, K., Wester, H. J. Be spoilt for choice with radiolabelled RGD peptides: Preclinical evaluation of 68 Ga-TRAP(RGD)3. Nucl. Med. Biol. 40, 33-41 (2013).
