Summary
Ett förfarande för isolering av EOB-DTPA och efterföljande komplex med naturliga Ga (III) och 68 Ga presenteras häri, liksom en grundlig analys av alla föreningar och utredningar på effektivitet märkning in vitro stabilitet och oktanol / vatten fördelningskoefficienten för det radiomärkta komplexet.
Abstract
Vi visar en metod för isoleringen av EOB-DTPA (3,6,9-triaza-3,6,9-tris (karboximetyl) -4- (etoxibensyl) -undecanedioic syra) från dess Gd (III) -komplexet och protokoll för utarbetandet av nya icke-radioaktiv, dvs naturliga Ga (III) samt radioaktivt 68 Ga komplex. Liganden samt den Ga (III) komplex karakteriserades genom kärnmagnetisk resonans (NMR) spektroskopi, masspektrometri och elementaranalys. 68 Ga erhölls genom ett standard elueringsmetod från en 68 Ge / 68 Ga generator. Experiment för att utvärdera effektiviteten 68 Ga-märkning av EOB-DTPA vid pH 3,8-4,0 utfördes. Etablerade analystekniker radio TLC (tunnskiktskromatografi) och radio HPLC (högupplösande vätskekromatografi) användes för att bestämma den radiokemiska renheten av spårämnet. Som en första undersökning av 68 Ga spår "lipofilicitet den oktanol / vatten distribution koefficient 68 Ga arter som förekommer i en pH 7,4 lösning bestämdes genom en extraktionsmetod. In vitro-mätningar stabilitets av spårämnet i olika media vid fysiologiskt pH utfördes, avslöjar olika hastigheter av nedbrytning.
Introduction
Gadoxetic syra, ett gemensamt namn för Gd (III) komplex av liganden EOB-DTPA en, är ett ofta använt kontrastmedel i hepatobiliär magnetisk resonanstomografi (MRT). 2,3 På grund av sin specifika upptag av lever hepatocyter och hög andel av hepatobiliär utsöndring den möjliggör lokalisering av fokala lesioner och levertumörer. 2-5 vissa begränsningar av MRI-tekniken (t.ex. toxicitet av kontrastmedel, begränsad användbarhet i patienter med klaustrofobi eller metallimplantat) kräver ett alternativt diagnostiskt verktyg .
Positronemissionstomografi (PET) är en molekylär avbildningsmetod, vari en liten mängd av ett radioaktivt ämne (spårämne) administreras, vid vilket dess fördelning i kroppen registreras av en PET-kamera. 6 PET är en dynamisk metod som möjliggör för hög rumslig och tidsmässig upplösning av bilder samt kvantifiering av resultaten, utan att behövahantera de biverkningar av MRI-kontrastmedel. Informationsvärdet av den erhållna metabolisk information kan ökas ytterligare genom kombination med anatomiska data som tas emot från andra avbildningsmetoder, som oftast uppnås genom hybrid avbildning med datortomografi (CT) i PET / CT scanners.
Den kemiska strukturen för ett spårämne som lämpar sig för PET måste innehålla en radioaktiv isotop som tjänar som positronemitter. Positroner har en kort livslängd, eftersom de nästan omedelbart förinta med elektroner av atomen skal av omgivande vävnad. Genom förintelse två 511 keV gammafotoner med motsatt rörelseriktning avges, som registreras av PET-kamera. 7,8 För att bilda ett spårämne, kan PET-nuklider bindas kovalent till en molekyl, såsom är fallet i två-deoxi- 2- [18 F] fluoroglucose (FDG), den mest använda PET spårämne. 7 kan emellertid en nuklid också bilda koordinationsbindningar till en eller flera ligander (t.ex.[68 Ga] -DOTATOC 9,10) eller appliceras som lösta oorganiska salter (t.ex. [18 F] natriumfluorid 11). Sammantaget är strukturen av spårämnet avgörande eftersom den avgör dess biodistribution, metabolism och utsöndring beteende.
En lämplig PET nuklid bör kombinera goda egenskaper som bekvämt positron energi och tillgänglighet samt en halveringstid lämpligt för avsedd utredning. 68 Ga nuklid har blivit en viktig kraft inom PET under de senaste två decennierna. 12,13 Detta beror främst på grund av dess tillgänglighet genom ett generatorsystem, som gör det möjligt för märkning på plats oberoende av närheten av en cyklotron. I en generator, modern nukliden 68 Ge absorberas på en kolumn från vilken dotternuklid 68 Ga elueras och därefter märkt med en lämplig kelator. 6,14 Sedan 68 Ga nuklid existerar som en trivalent katjon precis som Gd (III) 10,13, kelaterande EOB-DTPA med 68 Ga i stället skulle ge ett komplex med samma totala negativa laddningen som gadoxetic syra. Följaktligen kan det 68 Ga spår kombinera en liknande egenskap lever specificitet med lämplighet för PET avbildning. Även gadoxetic syra köps och administreras som dinatriumsalt, i följande sammanhang kommer vi att hänvisa till det som Gd [EOB-DTPA] och icke-radioaktiv Ga (III) komplex som Ga [EOB-DTPA], eller 68 Ga [ EOB-DTPA] i fallet med radiomärkt komponent för enkelhetens skull.
För att utvärdera deras användbarhet som spårämnen för PET, radioaktiva metallkomplex måste undersökas i stor utsträckning i in vitro, in vivo eller ex vivo experiment först. För att bestämma lämpligheten för en respektive medicinskt problem, olika spår egenskaper som biodistributionen beteende och clearance profil, stabilitet, organspecificitet och cell eller tissue upptag måste undersökas. På grund av deras icke-invasiv karaktär, in vitro bestämningar ofta utförs före in vivo experiment. Det är allmänt känt att DTPA och dess derivat är begränsad lämplighet som kelatorer för 68 Ga på grund av dessa komplex som saknar kinetisk tröghet, vilket resulterar i förhållandevis snabb nedbrytning när de administreras in vivo. 14-20 Detta är i första hand orsakas av apo transferrin fungerar som en konkurrent till 68 Ga i plasma. Ändå undersökte vi den nya spårämne om dess möjliga tillämpning i hepatobiliär avbildning, där diagnostisk information kan lämnas inom några minuter efter injektion 3,4,21-23, därmed inte nödvändigtvis kräver långsiktig spårstabilitet. För detta ändamål isolerades vi EOB-DTPA från gadoxetic syra och inledningsvis göras komplexbildningen med naturlig Ga (III), som existerar som blandning av två stabila isotoper, 69 Ga och 71 68 Ga. Vi använde etablerade metoder och samtidigt utvärdera deras lämplighet för att bestämma 68 Galabeling effektivitet EOB-DTPA och undersöka lipofilicitet av den nya 68 Ga spårämne och dess stabilitet i olika medier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Framställning av EOB-DTPA och Ga [EOB-DTPA]
Varning: Kontakta alla relevanta säkerhetsdatablad (SDB) för de använda organiska lösningsmedel, syror och baser före användning. Utför alla steg i ett dragskåp och använda personlig skyddsutrustning (skyddsglasögon, handskar, skyddsrock).
- Isolering av EOB-DTPA från gadoxetic syra
- Sätta 3 ml 0,25 M gadoxetic syra injicerbar lösning i en kolv. Tillsätt 500 mg (5,6 mmol) oxalsyra till den omrörda lösningen.
- Efter omröring under 1 timme, filtrera suspensionen genom en fritta med användning av reducerat tryck. Skölj återstoden tre gånger med 3 ml vatten, respektive.
- Kombinera de vattenhaltiga filtraten och utrusta lösningen med en pH-elektrod. Lägg 12 M saltsyra till filtratet tills pH är ca -0,1.
- Avlägsna lösningsmedlet i vakuum för att ge en färglös rest. Lagra under inert gas.
- Skölj återstoden ordentligt (minst tregånger) med etylacetat för att avlägsna överskottet av oxalsyra. Torka återstoden i vakuum.
- Lös åter upp återstoden i 2 ml vatten vid rumstemperatur och sedan kyla lösningen i ett isbad. Utan att ta bort isbadet, tillsätt 0,5 M vattenlösning av natriumhydroxid droppvis tills bildningen av en färglös klibbig fast substans observeras.
- Avlägsna vattnet genom dekantering. Tvätta de fasta ytterligare två gånger med 1 ml kallt vatten. Torka den fasta substansen i vakuum för att ge den första produktfraktionen.
- Isolera en andra produktfraktion från de kombinerade fraktionerna av dekanterat vatten via kolonnkromatografi (silika, metanol / vatten 4/1). 24 Avlägsna lösningsmedlet i vakuum.
- Om den så erhållna fasta substansen inte är rent vit, återupplösa den i 1 ml vatten, tillsätt 10 ml etanol och därefter 10 ml dietyleter för att fälla ut produkten. Filtrera genom en fritta med hjälp av reducerat tryck och torka i vakuum.
- Kombinerabåde fasta fraktioner av EOB-DTPA och utföra NMR spektroskopiska, 25 masspektrometrisk 26 och elementar 27 analyser.
- Syntes av Ga [EOB-DTPA]
VARNING: Store fast Ga (III) klorid under en torr inert atmosfär, eftersom vid kontakt med luft, fukt eller fett nedbrytning sker, vilket resulterar i korrosiva rökgaser och bildning av gula, bruna eller svarta föroreningar.- Bered en 0,11 M förrådslösning genom att lösa 1,94 g (11,0 mmol) Ga (III) klorid i 100 ml vatten. Späd 1 ml av 25% vattenhaltig ammoniaklösning med 4 ml vatten.
- Lös upp 80 mg (0,15 mmol) av EOB-DTPA i en kolv i 10 ml vatten. Om nödvändigt, upphetta lösningsmedlet för att uppnå fullständig upplösning.
- Lägga 1,4 ml (0,15 mmol) av Ga (III) klorid stamlösning. Utrusta kolven med en omrörare och pH-elektrod. Lägga utspädd vattenhaltig ammoniaklösning droppvis tills lösningens pH är cirka 4,1. Rör om vid roabout temperatur under 30 min.
- Avlägsna lösningsmedlet i vakuum. Placera återstoden i en kolv, utrustad med en stillhead med en central och parallell sidohalsen. Utrusta den centrala halsen med en kyl-finger och sidohalsen med en vakuumpump utlopp
- Upphetta återstoden under reducerat tryck (125 ° C, 0,6 mbar). Periodiskt avlägsna Sublimerad ammoniumklorid (synliga som vit beläggning av glasytan) från kylan fingret och fortfarande huvud, samt från de övre delarna av kolven med en något våt trasa. Fortsätt tills det inte finns någon synlig bildandet av nya sublimatet.
- För att avlägsna slutliga spår av ammoniumklorid tvätta återstoden tre gånger med 0,5 ml varm metanol, respektive. Torka den färglösa återstoden i vakuum. Utför NMR spektroskopiska, 25 masspektrometrisk 26 och elementar 27 analyser.
2. Allmänt Märkning ordningen
VARNING: Alla experiments inklusive direkt eller indirekt kontakt med radioaktiva ämnen måste utföras av endast utbildad personal. Använd lämplig avskärmning utrustning. Samla alla radioaktivt avfall separat och lagra och kassera i enlighet med gällande föreskrifter.
- Eluering av generatorn
Obs: En 40 mCi 68 Ge / 68 Ga generator med moder nuklid bunden som oxid på dodecyl-3,4,5-trihydroxybenzoate kiseldioxid användes. Eluering och rening kan utföras manuellt eller, såsom var fallet i detta förfarande, som en kombinerad automatiserad process med användning av en peristaltisk pump och dispenserenheten.- Bered lösningar av 5,5 M, 1,0 M och 0,05 M saltsyra. Bered en lösning av 5,0 M natriumklorid innehållande 25 | il av 5,5 M klorvätesyra per ml. Bered en buffertlösning med pH 4,6 genom att kombinera 4,1 g natriumacetat, 1 ml HCl (30%) och 2,5 ml isättika och utspädning av blandningen med vatten till 50 ml.
- Precondition PS-H + patronen genom att spola den långsamt med 1 ml 1,0 M saltsyra och därefter 5 ml vatten.
- Eluera kiseldioxidkolonn av generatorn med 4 ml 0,05 M HCl. 12 Ladda 68 Ga eluatet på PS-H + patron.
- Spola patronen med 5 ml vatten och därefter torka den med 5 ml luft. Eluera 68 Ga från patronen med 1 ml 5,0 M syrad natriumkloridlösning. 28
- Märkning av EOB-DTPA med 68 Ga
- Upplös 1 mg (1,9 | imol) av EOB-DTPA i 1 ml vatten. Från denna lösning ta 100 | il (0,19 | imol) och späda ut dem med 9,9 ml vatten för att framställa en 19 ^ M (10 | j, g / ml) stamlösning av EOB-DTPA.
- Ta bort 50 | il (motsvarande 22-29 MBq) av lösningen innehållande 68 Ga och placerades i en flaska. Tillsätt 50 pl (0,5 mikrogram) av en 19 mM stamlösning av EOB-DTPA och 300 pl of buffert för att höja pH till 4,0. Skaka om hastigt och inkubera lösningen vid rumstemperatur under 5 min. Ta bort en delmängd av 1-5 pl och sätta HPLC eller TLC-analys.
- Utföra radio HPLC-analys på en omvänd fas (RP) C18-kolonn 29 Använd följande mobilfas:. A - vatten / trifluorättiksyra (99,9% / 0,1%), B - acetonitril / trifluorättiksyra (99,9% / 0,1%), gradient : 06 min 80% A → 0% A (0,5 ml / min), 610 min 0% A (0,5 ml / min).
- Bestäm toppintensiteterna hos radio HPLC signaler area under kurvan. Beräkna märknings utbyte som radiokemiska renheten (RCP) av spårämnet på följande sätt:
RCP = A Ga-EOB-DTPA / (A Ga + A Ga-EOB-DTPA) ∙ 100%
En Ga-EOB-DTPA: area under kurvan för 68 Ga [EOB-DTPA]
En Ga: area under kurvan för fri 68 Ga
3. Märkning Effektivitet
- Utför märkningsförfaranden som beskrivsd § 2. Använd en konsekvent utbud av start aktivitet av 68 Ga eluat, t ex 22-29 MBq (40-140 pl, beroende på färskhet eluatet).
- Tillsätt erforderlig mängd buffertlösning för att justera pH till 3,8-4,0 (40-190 pl, beroende på volymen av 68 Ga eluat). Tillsätt erforderlig mängd ligand-stamlösning (10-70 | j, l av en 19 mM lösning).
- Lägga de erforderliga mängderna av vatten för att justera den totala volymen för varje märknings sond till 1,75 ml. Blanda väl och låt provet stå i 5 min vid rumstemperatur. Utför HPLC-analys som beskrivs i avsnitt 2 för att bestämma utbytet märkning.
- Utför märkningsförfaranden med mängder av ligand mellan 0,1 ng och 0,7 mikrogram i steg om 0,1 mikrogram. Utföra experiment i triplikat för varje ligandkoncentration. Beräkna medelvärdet avkastning och standardavvikelse.
4. In vitro-stabilitet
- Allmänt pÖRFARANDE och preparat
- Lös upp en tablett av fosfatbuffrad saltlösning (PBS) i 200 ml avjoniserat vatten för att framställa en PBS förrådslösning med en fosfatkoncentration av 10 mM.
- Utför märkning av 22-29 MBq 68 Ga med 0,5 pl EOB-DTPA stamlösning, som beskrivs i avsnitt 2. Beroende på volymen av 68 Ga eluatet, justera mängden buffert, som beskrivs i avsnitt 3. Dra prover av märkning lösning innehållande 6-12 MBq spår att utföra mätningar stabilitet.
- Utföra radio TLC-analys på 80 mm silikagelplattor belagda aluminiumplåtar med användning av 0,1 M vattenlösning av natriumcitrat som elueringsmedel och analysera av plattorna med en TLC-radioaktivitetsscanner. 30 Bestäm intensiteterna för TLC-signaler som area under kurvan. Beräkna RCP av spårämnet på följande sätt:
RCP = A Ga-EOB-DTPA / (A Ga-fri + A Ga-EOB-DTPA + A Ga-kolloidalt) ∙ 100%
En Ga-EOB-DTPA: area under kurvan för 68 Ga [EOB-DTPA]
En Ga-fri: area under kurvan för fri 68 Ga
En Ga-kolloidalt: area under kurvan av kolloidalt 68 Ga - Beräkna RCP t / RCP 0 för varje tidpunkt. Rita alltså standardiserade RCP kontra skillnad gången sedan startpunkten t = 0 min.
RCP t = RCP av 68 Ga [EOB-DTPA] vid tidpunkten t.
RCP 0 = RCP av 68 Ga [EOB-DTPA] vid t = 0 min.
- Stabilitet i fosfatbuffrad saltlösning (A)
- Till 65 | il av märkning lösning tillsätts 150 ul PBS stamlösning och 60 | il natriumhydroxidlösning (0,1 M) för att höja pH till 7,4. Blanda omsorgsfullt.
- Ta bort en delmängd av 1-5 pl att utföra TLC-analys ( "utgångspunkt"). Omedelbart lagra lösningen i en inkubator vid 37 ° C och avlägsna alikvoter att utföra TLC-analys på representerativt tidpunkter under 3 h.
- Stabilitet mot överskott av apo -transferrin i PBS (B)
- Till 120 ul av märkning lösning tillsätt 50 | il av PBS förrådslösning och 430 | il natriumhydroxidlösning (0,1 M) för att höja pH till 7,4. Tillsätt 40 | il av en lösning av apo -transferrin (25 mg / ml). Blanda omsorgsfullt.
- Ta bort en delmängd av 1-5 pl att utföra TLC-analys ( "utgångspunkt"). Omedelbart lagra lösningen i en inkubator vid 37 ° C och avlägsna alikvoter för att utföra TLC-analys vid representativa tidpunkter under 3 h.
- Stabilitet i humant serum (C)
- Till 500 | il av humanserum tillsätt 25 | il av märkningslösning och 45 | il natriumhydroxidlösning (0,1 M) för att höja pH till 7,4. Blanda omsorgsfullt.
- Ta bort en delmängd av 1-5 pl att utföra TLC-analys ( "utgångspunkt"). Omedelbart lagra lösningen i en incubator vid 37 ° C och avlägsna alikvoter för att utföra TLC-analys vid representativa tidpunkter under 3 h.
5. Prövning av fördelningskoefficienten logd
- Utför märkningsförfaranden som beskrivs i avsnitt 2. 50 pl märkning lösning tillsätt 20 pl PBS stamlösning och 170 | il natriumhydroxidlösning (0,1 M) för att höja pH-värdet till 7,4.
- Uttag 200 l från denna lösning och lägg den i en plast V-flaskan. Tillsätt 200 pl oktanol. Stäng flaskan och skaka i 2 min. sedan centrifugera provet vid 1600 xg under 5 min.
- Ta bort triplikat av 40 pl från n -octanol fasen och vattenfasen var och sätta dem i separata V-flaskor. Var noga med att inte blanda ihop lagren.
- Mäta aktiviteten av varje prov i en gamma väl räknare för 30 sek. För varje prov omedelbart upprepa mätningen två gånger och därav beräkna medelvärdet aktivitet Ᾱ t t, W1, Ᾱ t, W2 och Ᾱ t, W3 (aktiviteter i vattenprover) och Ᾱ t, O1, Ᾱ t, O2, Ᾱ t, O3 (aktiviteter i oktanol) tillsammans med respektive tidpunkten t av deras beslutsamhet.
- Ange tidpunkten för mätningen av det sista provet som t 0. Bestäm och lista At i min genom att beräkna At = tt 0. Utför förfall korrigering av Ᾱ t, med hjälp av följande formel:
Ᾱ 0 = Ᾱ t · 2 (At / 68 min). - Beräkna Ᾱ 0, W som medelvärdet av Ᾱ 0, W1, Ᾱ 0, W2 och Ᾱ 0, W3 samt Ᾱ 0, O som medelvärdet av Ᾱ 0, O1, Ᾱ 0, O2 och Ᾱ 0, O3. Beräkna logD hjälp av följande formel:
logD = log [(Ᾱ - Utför hela experimentet i tre exemplar och beräkna medelvärdet logD tillsammans med dess standardavvikelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Liganden EOB-DTPA och den icke radioaktiva Ga (III) komplex analyserades via ett H och 13 C {1 H} NMR-spektroskopi, masspektrometri och elementaranalys. De resultat som räknas upp i tabell 1 och som avbildas i figurerna 1-6 kontrollera renheten av substanserna.
Eluering av 68 Ge / 68 Ga generator gav lösningar av 400-600 MBq 68 Ga. De beskrivna märkningsförfarande resulterar i bildning av den önskade spårämne 68 Ga [EOB-DTPA], angiven som radio HPLC-topp som uppvisar en retentionstid av 2,8 min (figur 7). Jämförelse med retentionstiden för den Ga [EOB-DTPA] standarden i UV-vis detektor vid 220 nm (2,7 min, Figur 8) bekräftar framgångsrik märkning. Okoordinerade 68 Ga detekteras som radiotopp vid 2,1 min (Figur7). Effektiviteten i EO-BDTPA 68 Ga-märkning undersöktes genom bestämning av märkningen utbyte som en funktion av ligandkoncentrationen via HPLC (figur 9). Utbytena bestämdes i tre exemplar och standardavvikelser beräknades.
Beroende på pH och koncentrationen av anjoner som är närvarande i lösningen, okoordinerad eller icke-märkta 68 Ga kan existera i olika arter, t.ex., gallater eller olöslig hydroxid. 31 Den allmänna termen "fri 68 Ga" 32 används för alla icke-märkt arter i lösning förutom hydroxid, som vanligen kallas "kolloidalt 68 Ga". Under de villkor som beskrivs analys, gratis 68 Ga rör sig med lösningsmedelsfronten (Rf = 1,0) på en TLC-platta. Kolloidalt 68 Ga kan inte upptäckas via HPLC, medan på en TLC-platta verkar det som aktiviteti origo (Rf = 0). Ett representativt kromatogram av en TLC-platta analyserades med TLC radioaktivitet skanner visas i figur 10. Spårämnet uppvisar olika retentionsegenskaper, beroende på om ett prov av märkning lösning (pH 3,8 till 4,0, Rf = 0,3) eller ett prov av fysiologisk pH (Rf = 0,5) analyserades.
Att undersöka stabiliteten av spårämnet, nyligen märkt 68 Ga [EOB-DTPA] sattes till prover av fysiologiskt pH, innehållande utspädda PBS (fosfatkoncentration 5,5 mM, A), överskott av apo-transferrin (1,6 mg / ml i utspädd PBS med en fosfatkoncentration av 0,8 mM, B) och humant serum (C), respektive. Med tiden blev den radiokemiska renheten (RCP t) av spårämne i proven bestäms via TLC. Den procentuella andelen av intakta spårämne beräknades som förhållandet mellan RCP t vidrespektive tidpunkter och RCP 0 vid startpunkten (tabell 2). Detta var nödvändigt på grund av märkningslösningar innehållande spårämne för olika RCP 0 (93-96%). Den sålunda standardiserade procent av intakt spår avbildas som en funktion av tiden i figur 11.
För bestämningen av logd vattenprover av spårämne i en utspädd PBS-lösning var förberedda. Proverna blandades med oktanol, centrifugerades och därefter alikvoter avlägsnades för att bestämma aktivitetskoncentrationen i båda faserna. Aktivitetsvärden och efterföljande beräkning av logD därav visas i tabell 3. Medelvärdet logD värdet är 3,54 ± 0,08.
Figur 1. 1 H-NMR-spektrum av EOB-DTPA. < / strong> Spektrumet registrerades i D2O vid 400,1 MHz. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. 13 C {1 H} NMR spektrum av EOB-DTPA. Spektrumet registrerades i D2O vid 100,6 MHz. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. MS av EOB-DTPA (elektro (ESI), metanol, negativt tillstånd).54334fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. 1 H-NMR-spektrum av Ga [EOB-DTPA]. Spektrumet registrerades i D2O vid 400,1 MHz. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. 13 C {1 H} NMR spektrum av Ga [EOB-DTPA]. Spektrumet registrerades i D2O vid 100,6 MHz. Klicka henne e för att se en större version av denna siffra.
Figur 6. MS Ga [EOB-DTPA] (ESI, metanol, negativt tillstånd), tillsammans med en detaljerad skildring av isotopen mönster av molekyltoppen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7. Representativa HPLC-kromatogram av ett urval av 68 Ga [EOB-DTPA] innehållande delar okoordinerade 68 Ga, som registrerats av radioaktivitetsdetektor. Icke samordnade 68 Ga uppvisar en uppehållstid av 2,1 minuter, medan spår detekteras vid 2,8 min .target = "_ blank"> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 8. Representativa HPLC-kromatogram av standardsubstansen Ga [EOB-DTPA], som detekteras i UV-vis kanal vid 220 nm. Retentionstiden för den kalla standarden är 2,7 minuter. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 9. Visning av 68 Ga-märkning effektivitet EOB-DTPA. Märkningen utbyte som bestämts via HPLC plottas som en funktion av koncentrationen av EOB-DTPA (22-29 MBq start aktivitet, pH 3,8-40,0, 5 min, RT). Standardavvikelsen skildras av felstaplar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 10. Representativa TLC kromatogram avslöjar olika 68 Ga arter. Ett prov av 68 Ga [EOB-DTPA] i utspädd PBS (fosfatkoncentrationen 5,5 mM, pH = 7,4) analyserades efter 110 minuters inkubation. Exemplarisk fördelning av kolloidalt 68 Ga (Rf = 0), 68 Ga [EOB-DTPA] (Rf = 0,5) och fri 68 Ga (Rf = 1,0) på en 70 mm TLC-platta som detekteras av en TLC radioaktivitet scanner är presenteras. Räknar är förfall korrigeras. Klicka här för att se en störreversion av denna siffra.
Figur 11. Stabilitet bestämningar av 68 Ga [EOB-DTPA] i olika medier. Förfallet korrigerade, standardiserad procent av intakt spår bestämd via TLC, avbildas som en funktion av tiden. Klicka här för att se en större version av denna siffra .
Tabell 1. Resultat av NMR spektroskopiska, MS och elementaranalyser utförs för EOB-DTPA och Ga [EOB-DTPA]. Är relativa MS toppnivåer anges i%, överlåtelse till toppar ges inom hakparenteser. Elemental CHN-värdena var beräk-nas för C 23 H 33 N 3 O 11 · H2O (EOB-DTPA) och (NH 4) 0,75 H 1,25 [C 23 H 28 GaN 3 O 11] · 2H 2 O (Ga [EOB-DTPA]).
Tabell 2. Stabilitet bestämning av 68 Ga [EOB-DTPA] i olika medier. RCP av 68 Ga [EOB-DTPA] i medium A, B och C bestämdes via TLC vid givna tidpunkter. Sammansättningen av proven ges i procent i% av spårämne / gratis 68 Ga / kolloidalt 68 Ga. Procentandelen intakta spår standardiseras förhållandet mellan RCP t / RCP 0. RCP 0 är den respektive RCP av spårämnet vid t = 0 min.
. Tabell 3. Bestämning av logD Decay korrigerade värdena a 0, X i tre alikvoter (x = 1, 2, 3) avlägsnas från varje fas (W: vattenhaltig, O: n -octanol) av ett prov. All verksamhet ges i cpm. Logd beräknas som beskrivs i avsnitt 5 i protokollet. Experimentet upprepades två gånger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
EOB-DTPA är tillgänglig genom en flerstegssyntes 33 men kan lika gärna vara isolerad från tillgängliga kontrastmedel som innehåller gadoxetic syra. För detta ändamål kan den centrala Gd (III) jon utfällas med ett överskott av oxalsyra. Efter avlägsnande Gd (III) oxalat och oxalsyra liganden kan isoleras genom utfällning i kallt vatten vid pH 1,5. Men för att förbättra avkastningen kolonnkromatografi av filtratet kan utföras i stället eller som ett uppföljningsförfarande. Antingen metod ger den analytiskt rena liganden i totala utbyten av 70% (figur 1-3, Tabell 1).
Vi fann att i syfte att isolera Ga [EOB-DTPA] justering av pH med ammoniaklösning är fördelaktig jämfört med användningen av natriumhydroxid, eftersom biprodukten ammoniumklorid kan avlägsnas från den mycket hydrofil rest via sublimering. Under ovannämnda villkor denna process sker långsamtly. Eftersom icke försumbara mängder klorid var fortfarande detekterbar efter fem dagar, var den kvarvarande salt tvättas med metanol. Även om denna upparbetnings procedur resulterar i partiell förlust av Ga [EOB-DTPA], erhölls produkten i analytisk renhet med ett totalt utbyte av 46% (figur 4-6, Tabell 1). För isolering av både EOB-DTPA och dess Ga (III) komplex, bör användningen av omvänd faskromatografi betraktas som ett alternativt förfarande för rening, i synnerhet eftersom sönderdelning av silikagel är troligt när man använder höggradigt polära lösningsmedel.
Märkningen process för EOB-DTPA krävde användning av mycket rent lösningsmedel, kemikalier och metallfria utrustning för att undvika förekomst av konkurrerande metalljoner, på grund av 68 Ga är närvarande i nanomolära mängder (2 MBq 68 Ga i en 1,75 ml prov lika med en nuklid koncentration av 0,14 nM). Märkning av EOB-DTPA till 68 Ga inträffar vid pH 3,8 till 4,0 inom fem minuternuter vid rumstemperatur. Undersökningar på 68 effektivitet Ga-märkning kräver bestämning av utbytet märkning samtidigt som reaktionsbetingelserna pH, temperatur och reaktionstiden samt start aktivitet 68 Ga konstant eller i ett försvarbart intervall. För varje datapunkt (dvs, ligandkoncentration) försöket bör utföras åtminstone tre gånger för att ge en rimlig säkerhetsnivå, eftersom koncentrationerna av både ligand och 68 Ga är mycket låg och utbytet märkning därför känsliga för även små avvikelser i reaktionsbetingelser. Till exempel, eftersom de 68 Ga eluatet åldrar, alikvoter av volymökning måste dras tillbaka för att ge en konstant utgångs aktivitet, vilket kräver ökade volymer buffert. Dessutom, åldrande av eluatet resultat i ökande koncentrationer av sönderfallsprodukt 68 Zn, som i sin tur skulle kunna fungera som en konkurrent för 68 Ga, vilket negativt påverkar labeling effektivitet. 13,34,35 Praktiskt taget kvantitativ märkning av 22-29 MBq 68 Ga uppnås under ovan nämnda villkor med mängder av EOB-DTPA ≥ 0,7 mikrogram (Figur 9), med innehållet i fri 68 Ga ≤ 2% och ca 5 % av kolloidalt 68 Ga närvarande i prover.
Medan HPLC gav överlägsen baslinjen separation av fri 68 Ga och 68 Ga [EOB-DTPA], är det inte lämpligt att detektera kolloidalt 68 Ga. Vi valde därför TLC för att bestämma RCP under mätningar stabilitet, varvid kvantifiering av transferrin eller proteinbundet 68 Ga krävdes. Vi fann baslinjeseparation godtagbara för detta ändamål (Figur 10); dock till användning av storleksuteslutningskromatografi eller filtreringsmetoder 15,36 avlägsna kolloidala fraktioner, följt av HPLC-analys, kan betraktas som alternativ. Den 68 Ga-komplexet uppvisar en starkare retention på TLC-plattor (Rf = 0,3) om provet uttages direkt från märkningslösningen i motsats till proverna vid fysiologiskt pH (Rf = 0,5). Vi föreslår denna observation skulle kunna förklaras av olika prototillstånd av komplexet.
In vitro stabilitetsbestämningar av 68 Ga spår utförs vanligen i PBS 15,17 eller alternativa buffertsystem som härmar det fysiologiska pH 37, liksom i lösningar innehållande apo transferrin 37, vilket är den främsta konkurrenten till 68 Ga i blod, eller i humant serum 15,17. I våra experiment tillsats av 0,1 M natriumhydroxidlösning till PBS krävdes för att justera pH i proverna till 7,4. Vi kunde inte påstå, att fosfatkoncentrationen påverkar hastigheten för nedbrytning, eftersom stabilitetsexperiment i lösningar med varierande fosfatkoncentration (0,8 mM och 5,5 mM (A)) gav icke-reproducible resultat. Vi fann emellertid att en lösning B innehållande apo -transferrin (1,6 mg / ml, vilket är inom räckhåll för normal plasma innehållet 38) och 0,8 mM fosfat (blod uppvisar vanligtvis en fosfatnivå 0,8-1,5 mM 39,40 ), orsakar sönderdelning vid en hastighet jämförbar med den som observeras i humant serum (C). I lösningar AC, efter 185 minuter innehållet av kolloidalt 68 Ga hade ökat med ca 24%, medan halten fri 68 Ga hade ökat med 11% i lösning A, 17% i lösning B och 27% i lösning C (Tabell 2 ). Det faktum att 68 Ga bildas av spår nedbrytning är övervägande närvarande som fri 68 Ga i motsats till kolloidalt eller proteinbundet 68 Ga i B och C kan bero på transferrinmättnad eller jämförelsevis långsam transferrin bindande priser.
För att förutsäga en distributionsspårvävnads oktanol / vatten fördelnings-koefficienter logP eller fördelningskoefficienter logd kan bestämmas som förhållandet mellan aktivitetskoncentrationer i de två faserna. Per definition, inte logD parametern inte skilja mellan olika arter som förekommer i ett medium, vilket gör den lämplig för våra experiment på grund av möjligheten av olika prototillstånd spårämnet liksom dess nedbrytning i vattenfasen. Att bestämma logD genom extraktion det vattenhaltiga mediet är vanligtvis buffrad med PBS för att efterlikna blodförhållanden. 17,43-45 För ovannämnda skäl som vi använde utspädda PBS, som uppvisar en fosfatkoncentration av 0,8 mM och fysiologiskt pH. Efter extraktion med n -octanol och centrifugering, avlägsnande av flera alikvoter från samma fas möjliggör felaktigheter orsakade av pipettering skall reduceras. På grund av den mycket låga aktivitetskoncentrationer i oktanol man bör vara noga med att undvika korskontaminering med vattenfasen och för att säkerställa kvantitativ överföring till en separat flaska. distribution koefficienter som bestämts genom denna procedur var reproducerbar, och medan de tillåter en grov uppskattning av lipofilicitet, går det inte att direkt jämförelse med ett logP av Gd [EOB-DTPA]. På grund av den särskilda karaktären hos Gd [EOB-DTPA] följd inte främst från lipofilicitet utan dess hepatobiliär upptags ytterligare experiment i levande individer eller celler skulle vara nödvändigt att ge mer omfattande information om biodistribution samt stabiliteten in vivo av 68 Ga [EOB -DTPA]. Sammantaget är ett program som avbildande medel för perfusion och tidig hepatobiliär fas tänkbara.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| primovist | Bayer | - | 0.25 M |
| gallium(III) chloride | Sigma-Aldrich Co. | 450898 | |
| water (deionized) | - | - | tap water deionizing equipment by Auma-Tec GmbH |
| hydrochloric acid 12 M | VWR | 20252.29 | |
| sodium hydroxide | Polskie Odczynniki Chemiczne S.A. | 810925429 | |
| oxalic acid | Sigma-Aldrich Co. | 75688 | |
| ethyl acetate | Brenntag GmbH | 10010447 | |
| silica gel | Merck KGaA | 1.10832.9025 | Geduran Si 60 0.063-0.2 mm |
| TLC silica gel 60 F254 | Merck KGaA | 1.16834.0001 | |
| methanol | VWR | 20903.55 | |
| ethanol | Brenntag GmbH | 10018366 | |
| eiethylether | VWR | 23807.468 | stored over KOH plates |
| ammonia solution (25%) | VWR | 1133.1 | |
| pH electrode | VWR | 662-1657 | |
| stirring and heating unit | Heidolph | 505-20000-00 | |
| pump | Ilmvac GmbH | 322002 | |
| frit | - | custom design | |
| NMR spectrometer | Bruker Coorporation | - | Ultra Shield 400 |
| mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific Inc. | - | |
| elemental analyser | Hekatech GmbH Analysentechnik | - | EuroVector EA 3000 CHNS |
| deuterated water D2O | euriso-top | D214 | 99.90% D |
| Material/Equipment required for labeling procedures | |||
| 68Ge/68Ga generator | ITG Isotope Technologies Garching GmbH | A150 | |
| pump and dispenser system | Scintomics GmbH | - | Variosystem |
| hydrochloric acid 30% (suprapur) | Merck KGaA | 1.00318.1000 | |
| water (ultrapur) | Merck KGaA | 1.01262.1000 | |
| sodium chloride (suprapur) | Merck KGaA | 1.06406.0500 | |
| sodium acetate (suprapur) | Merck KGaA | 1.06264.0050 | |
| glacial acetic acid (suprapur) | Merck KGaA | 1.00066.0250 | |
| sodium citrate dihydrate | VEB Laborchemie Apolda | 10782 | >98.5% |
| PS-H+ Cartridge (S) | Macherey-Nagel | 731867 | Chromafix |
| apo-Transferrin | Sigma-Aldrich Co. | T2036 | |
| PBS buffer (tablets) | Sigma-Aldrich Co. | 79382 | |
| human serum | Sigma-Aldrich Co. | H4522 | from human male AB plasma |
| flasks, columns, etc. | custom design | ||
| pH electrode | Knick Elektronische Messgeräte GmbH & Co. KG | 765-Set | |
| binary pump (HPLC) | Hewlett-Packard | G1312A (HP 1100) | |
| UV Vis detector (HPLC) | Hewlett-Packard | G1315A (HP 1100) | |
| radioactive detector (HPLC) | EGRC Berthold | ||
| HPLC C-18-PFP column | Advanced Chromatography Technologies Ltd. | ACE-1110-1503/A100528 | |
| HPLC glass vials | GTG Glastechnik Graefenroda GmbH | 8004-HP-H/i3µ | |
| pipette | Eppendorf | - | |
| plastic vials | Sarstedt AG & Co. | 6542.007 | |
| plastic vials | Greiner Bio-One International GmbH | 717201 | |
| activimeter | MED Nuklear-Medizintechnik Dresden GmbH | - | Isomed 2010 |
| tweezers | custom design | ||
| incubator | Heraeus Instruments GmbH | 51008815 | |
| vortex mixer | Fisons | - | Whirlimixer |
| centrifuge | Heraeus Instruments GmbH | 75003360 | |
| gamma well counter | MED Nuklear-Medizintechnik Dresden GmbH | - | Isomed 2100 |
| water for chromatography | Merck KGaA | 1.15333.2500 | |
| acetonitrile for chromatography | Merck KGaA | 1.00030.2500 | |
| trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | 91707 | |
| TLC radioactivity scanner | raytest Isotopenmessgeräte GmbH | B00003875 | equipped with beta plastic detector |
References
- Weinmann, H. J., et al. A new lipophilic gadolinium chelate as a tissue-specific contrast medium for MRI. Magn. Reson. Med. 22, 233-237 (1991).
- Stroszczynski, C., et al. Aktueller Stand der MRT-Diagnostik mit leberspezifischen Kontrastmitteln. Radiologe. 44, 1185 (2004).
- Van Beers, B. E., Pastor, C. M., Hussain, H. K. Primovist, Eovist - what to expect. J. Hepatol. 57, 421-429 (2012).
- Zech, C. J., Herrmann, K. A., Reiser, M. F., Schoenberg, S. O. MR Imaging in Patients with Suspected Liver Metastases: Value of Liver-specific Contrast Agent Gd-EOB-DTPA. Magn. Reson. Med. Sci. 6, 43-52 (2007).
- Leonhardt, M., et al. Hepatic Uptake of the Magnetic Resonance Imaging Contrast Agent Gd-EOB-DTPA: Role of Human Organic Anion Transporters. Drug Metab. Dispos. 38, 1024-1028 (2010).
- Wadas, T. J., Wong, E. H., Weisman, G. R., Anderson, C. Coordinating Radiometals of Copper, Gallium, Indium, Yttrium, and Zirconium for PET and SPECT Imaging of Disease. J. Chem. Rev. 110, 2858-2902 (2010).
- Ametamey, S. M., Honer, M., Schubiger, P. A. Molecular Imaging with PET. Chem. Rev. 108, 1501-1516 (2008).
- Cutler, C. S., Hennkens, H. M., Sisay, N., Huclier-Markai, S., Jurisson, S. S. Radiometals for Combined Imaging and Therapy. Chem. Rev. 113, 858-883 (2013).
- Henze, M., et al. PET Imaging of Somatostatin Receptors Using [68GA]DOTA-D-Phe1-Tyr3-Octreotide: First Results in Patients with Meningiomas. J. Nucl. Med. 42, 1053-1056 (2001).
- Hofmann, M., et al. Biokinetics and imaging with the somatostatin receptor PET radioligand 68Ga-DOTATOC: preliminary data. Eur. J. Nucl. Med. 28, 1751-1757 (2001).
- Blau, M., Nagler, W., Bender, M. A. Fluorine-18: a new isotope for bone scanning. J. Nucl. Med. 3, 332-334 (1962).
- Green, M. A., Welch, M. J. Gallium Radiopharmaceutical Chemistry. Int. J. Radiat. Appl. Instrum. B. 16, 435-448 (1989).
- Rösch, F. Past, present and future of 68Ge/68Ga generators. Appl. Radiat. Isot. 76, 24-30 (2013).
- Liu, S. The role of coordination chemistry in the development of target-specific radiopharmaceuticals. Chem. Soc. Rev. 33, 445-461 (2004).
- Haubner, R., et al. Development of (68)Ga-labelled DTPA galactosyl human serum albumin for liver function imaging. Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging. 40 (68), 1245-1255 (2013).
- Yang, W., Zhang, X., Liu, Y. Asialoglycoprotein Receptor-Targeted Radiopharmaceuticals for Measurement of Liver Function. Curr. Med. Chem. 21, 4-23 (2014).
- Chauhan, K., et al. 68Ga based probe for Alzheimer's disease: synthesis and preclinical evaluation of homodimeric chalcone in β-amyloid imaging. Org. Biomol. Chem. 12, 7328-7337 (2014).
- Chakravarty, R., Chakraborty, S., Dash, A., Pillai, M. R. A. Detailed evaluation on the effect of metal ion impurities on complexation of generator eluted 68Ga with different bifunctional chelators. Nucl. Med. Biol. 40, 197-205 (2013).
- Clevette, D. J., Orvig, C. Comparison of ligands of differing denticity and basicity for the in vivo chelation of aluminum and gallium. Polyhedron. 9, 151-161 (1990).
- Prinsen, K., et al. Development and evaluation of a 68Ga labeled pamoic acid derivative for in vivo visualization of necrosis using positron emission tomography. Bioorg. Med. Chem. 18, 5274-5281 (2010).
- Vogl, T. J., et al. Liver tumors: comparison of MR imaging with Gd-EOB-DTPA and Gd-DTPA. Radiology. 200, 59-67 (1996).
- Reimer, P., et al. Phase II clinical evaluation of Gd-EOB-DTPA: dose, safety aspects, and pulse sequence. Radiology. , 177-183 (1996).
- Ba-Ssalamah, A., et al. MRT der Leber. Radiologe. 44, 1170-1184 (2004).
- Scott, R. P. W. Journal of Chromatography Library. 22A, Elsevier Scientific Publishing Co. A137-A160 (1983).
- Reichenbaecher, M., Popp, J. Strukturanalytik organischer und anorganischer Verbindungen. , 1st, B. G. Teubner Verlag. Wiesbaden. (2007).
- Gross, J. H. Mass Spectrometry: A Textbook. , Springer. (2004).
- Ma, T. S., Rittner, R. C. Modern Organic Elemental Analysis. , Marcel Dekker, Inc. (1979).
- Mueller, D., et al. Simplified NaCl Based 68Ga Concentration and Labeling Procedure for Rapid Synthesis of 68Ga Radiopharmaceuticals in High Radiochemical Purity. Bioconjugate Chem. 23, 1712-1717 (2012).
- Roberts, T. R. Radio-column chromatography. Journal of Chromatography Library. 14, 103-132 (1978).
- Roberts, T. R. Radio-thin-layer chromatography. Journal of Chromatography Library. 14, 45-83 (1978).
- Green, M. A., Welch, M. J. Gallium radiopharmaceutical chemistry. Nucl. Med. Biol. 16, 435-448 (1989).
- Notni, J., Plutnar, J., Wester, H. J. Bone-seeking TRAP conjugates: surprising observations and their implications on the development of gallium-68-labeled bisphosphonates. EJNMMI Res. 2, 13 (2012).
- Schmitt-Willich, H., et al. Synthesis and Physicochemical Characterization of a New Gadolinium Chelate: The Liver-Specific Magnetic Resonance Imaging Contrast Agent Gd-EOB-DTPA. Inorg. Chem. 38, 1134-1144 (1999).
- 68Ga generator for positron emission tomography. Zhernosekov, K., Nikula, T. , DE102010037964B3 (2012).
- Simecek, J., Hermann, P., Wester, H. J., Notni, J. How is 68Ga Labeling of Macrocyclic Chelators Influenced by Metal Ion Contaminants in 68Ge/68Ga Generator Eluates? ChemMedChem. 8, 95-103 (2013).
- Baur, B., et al. Synthesis, Radiolabelling and In Vitro Characterization of the Gallium-68-, Yttrium-90- and Lutetium-177-Labelled PSMA Ligand, CHX-A''-DTPA-DUPA-Pep. Pharmaceuticals (Basel). 7, 517-529 (2014).
- Boros, E., et al. RGD conjugates of the H2dedpa scaffold: synthesis, labeling and imaging with 68Ga. Nucl. Med. Biol. 39, 785-794 (2012).
- Beck, W. S. Hematology. , 5th, MIT press. Cambridge, Massachusetts. (1998).
- Patel, V., Morrissey, J. Practical and Professional Clinical Skills. , 1, Oxford University Press Inc. New York. (2001).
- Bartke, A., Constanti, A. Basic Endocrinology. , 1, CRC Press. (1998).
- Bernstein, L. R. Mechanisms of Therapeutic Activity for Gallium. Pharmacol. Rev. 50, 665-682 (1998).
- Clausen, J., Edeling, C. J., Fogh, J. 67Ga Binding to Human Serum Proteins and Tumor Components. Cancer Res. 34, 1931-1937 (1974).
- Dumont, R. A., et al. Novel 64Cu- and 68Ga-Labeled RGD conjugates show improved PET imaging of αvβ3 integrin expression and facile radiosynthesis [Erratum to document cited in CA156:116856. J. Nucl. Med. 52, 1498 (2011).
- Pohle, K., et al. 68Ga-NODAGA-RGD is a suitable substitute for 18F-Galacto-RGD and can be produced with high specific activity in a cGMP/GRP compliant automated process. Nucl. Med. Biol. 39, 777-784 (2012).
- Notni, J., Pohle, K., Wester, H. J. Be spoilt for choice with radiolabelled RGD peptides: Preclinical evaluation of 68 Ga-TRAP(RGD)3. Nucl. Med. Biol. 40, 33-41 (2013).
