Introduction
חומרים נקבוביים לשחק תפקיד מרכזי יישומים מעשיים כגון קטליזה כרומטוגרפיה 1. על ידי הוספת קבוצות משטח והתאמת מאפייני גודל משטח הנקבוביות, החומרים ניתן להתאים את היישום הרצוי 2,3. הפונקציונליות של חומר נקבובי תלוי באופן מכריע על המאפיינים דיפוזיה של מולקולות אורח בתוך הנקבוביות. חומרים נקבוביים, הבחנה צריכה להיעשות בין המיקרו D הדיפוזיה translational המיקרוסקופי, אשר מתאר דיפוזיה בסולם אורך מולקולרי מחד ואת המאקרו D הדיפוזיה translational מקרוסקופית מצד השני, אשר מושפע דיפוזיה דרך הנקבוביות מרובות, גבולות תבואה, tortuosity ו הומגניות של החומר.
ישנן מספר שיטות תהודה המגנטית זמינות ללמוד דיפוזיה, כל מתאים חלקבקנה מידה אורך icular. על הסקאלה המילימטר, תהודה מגנטית גרעינית (NMR) הדמיה 4 ו תהודה מגנטית אלקטרוני (EPR) הדמיה (כפי שהוצג בפרוטוקול זה) יכול לשמש. הקשקשים קטנים הופכים נגישים על ידי השימוש הדרגתי שדה פעם ב NMR וכן ניסויי EPR 5,6. על בקנה מידה ננומטרי, ספקטרוסקופיה EPR יכול להיות בשימוש על ידי התבוננות שינויים של אינטראקציה החליפין הייזנברג בין בדיקות ספין 7,8. מחקרים של דיפוזיה translational באמצעות מגוון הדמיה EPR מ זרז תעשייתי תומך, למשל, תחמוצת 9 אלומיניום, כדי איזוטרופי נוזלים 10,11, מערכות שחרור התרופה עשוי ג'ל פולימר 12 - 14 ודגם ממברנות 15.
פרוטוקול זה מציג בגישה באתרו באמצעות הדמיה EPR לפקח דיפוזיה translational מקרוסקופית של בדיקות ספין גלילי, בתווך נקבובי. זה מודגם על מערכת מארחת-אורח המורכב הדואר ספין nitroxide חללית 3- (2-Iodoacetamido) -2,2,5,5-tetramethyl-1-pyrrolidinyloxy (IPSL) כאורח בתוך organosilica mesoporous התקופתי (PMO) airgel UKON1-GEL כמארח ואתנול כמו מֵמֵס. פרוטוקול זה בהצלחה כבר בשימוש 16 בעבר להשוות מאקרו D כפי שנקבע עם הדמיה EPR עם מיקרו D עבור החומרים מארח UKON1-GEL וסיליקה-GEL ו IPSL מינים אירוח טריס (8-carboxy-2,2,6,6-perdeutero-tetramethyl-benzo [1,2-D : 4,5-D '] bis (1,3) dithiole מתיל) (Trityl), ראה איור 1.
בשיטות אחרות המבוססות על הגל רציף (CW) EPR הדמיה 17, דיפוזיה מתרחשת מחוץ ספקטרומטר. לעומת זאת, השיטה המוצגת כאן משתמשת בגישה באתרו. סדרת תמונות של 1D ρ הפצת צפיפות ספין 1D (t, γ) היאנרשם על פני תקופה של מספר שעות. במהלך תקופה זו, תמונת מצב אחד הוא נלקח אחרת ומספקת דפוס דיפוזיה בזמן אמת עם רזולוצית זמן של כ 5 דקות.
UKON1-GEL וסיליקה-GEL כבר מסונתזים דוגמיות בקוטר פנימי של 3 מ"מ כמתואר בספרות. 16,18,19 סינתזת UKON1-GEL וסיליקה-GEL מובילה בהתכווצות המדגמת. הדגימות ממוקמות בתוך צינור לכווץ למנוע מולקולות אורחים נעו בין airgel לבין הקיר של הצינור המדגם. צעד נוסף זה אינו הכרחי עבור דגימות שניתן מסונתז ישירות בצינור מדגם מבלי לשנות את הגודל שלהם. קריסת דגימות airgel כאשר הם מתייבשים, ולכן הם חייבים להיות שקועים בתוך ממס בכל העת. הטמפרטורה מה שצריך עבור צינורות החום להתכווץ היא גבוהה יותר מאשר נקודת הרתיחה של אתנול בלחץ הסביבה. לכן הפרוטוקול מתאר את השימוש בסיר לחץ להעלות את נקודת רתיחה של אתנול.
הפרוטוקול מכסה את הכנת המדגם של-GEL UKON1 המסונתז מראש לצורך ניסוי הדמית EPR ואת ההגדרות ספקטרומטר המשמשות לניטור דיפוזיה של חללית ספין IPSL. לניתוח נתונים, תוכנות שנכתבו מקומית מסופקות והשימוש בו מתואר. הנתונים הגולמיים מן ספקטרומטר ניתן לטעון ישירות. התוכנה מחשבת את הפריסה המרחבית 1D ספין צפיפות ρ 1D (t, γ) ולוקחת בחשבון את פרופיל רגישות מהוד. המשתמש יכול לבחור אזור של airgel וחלון זמן, שעליו הדיפוזיה הוא שיקבע. התוכנה ואז קובעת את תנאי הגבול של משוואת הדיפוזיה מבוסס על כי הבחירה פותר את משוואת הדיפוזיה. הוא תומך הולם מרובע לפחות כדי למצוא את הערך של מאקרו D שבו הפתרון המספרי המתאים ביותר את נתוני הניסוי.
תחת = "jove_content"> הפרוטוקול ניתן להשתמש בהתאמות לחומרי אורח ומארח שונים כל עוד שטח החתך של המדגם אינו משתנה לאורך כל המדגם, כלומר ρ 1D (t, γ) מעניק גישה ישירה אל הריכוז אינו מושפע משינוי חתך מדגם. טווח הערכים נגישים עבור מאקרו D ההערכה היא 16 בין 10 -12 מ '2 / sec ו -7 · 10 -9 מ' 2 / sec.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
זהירות: יש להתייעץ כל גיליונות נתוני בטיחות חומרים רלוונטיים (MSDS) לפני השימוש. אתנול הוא מזיק אם נבלע או נשאף וזה דליק.
1. לייעל את פרמטרי EPR גל (CW) הרציפים
- כן 40 μl של IPSL באתנול (pa) בריכוז של 1 מ"מ.
- קח בקר פיפטה ולמלא נימי עם פתרון IPSL לגובה מילוי של 2 ס"מ. משוך את הפתרון 1 סנטימטר יותר אל תוך הנימים כך שיש פער אוויר מתחת הפתרון. חותם את הנימים בשני הקצוות עם צינור נימי איטום מתחם. פער האוויר מונע דיפוזיה של רכיבים של מתחם האיטום לתוך המדגם.
- עוטפים שתי רצועות polytetrafluoroethylene (PTFE) קלטת של כ אורך 5 ס"מ מסביב נימי במרחק של 1 ס"מ מהקצה העליון והתחתון של נימי.
- שים את הנימים לתוך צינור מדגם EPR (4 מ"מ קוטר פנימי). ודא כי קלטת PTFE שומרת על הנימיםקבוע בציר במרכז הצינור המדגם. דחוף את הנימים עד לתחתית של התחתית המדגמת.
- שים את המדגם לתוך המהוד ומרכזת את פתרון התווית ספין בתוך המהוד.
- כוון את ספקטרומטר עבור צימוד קריטי על ידי ביצוע ההוראות ספקטרומטר.
- הגדרות ספקטרומטר ראשוניות
- השתמש תדירות במיקרוגל כדי להגדיר את B במרכז השדה באמצעות הנוסחה
כאשר g ≈ 2.003 הוא הערכה גסה עבור הגורם גרם של הרדיקל מזווג בתווית ספין nitroxide, h הוא קבוע פלאנק ו מיקרון B הוא מגנטון בוהר. - הגדרת ניסוי חדש "field_sweep" עם השדה המגנטי כמו abscissa ואת עוצמת האות כמו לתאם. השתמש בפרמטרים הבאים: centerfield כפי שחושבו בשלב הקודם, רוחב לטאטא: 400 G, modulatiעל משרעת: 0.8 G, אפנון תדר: 100 kHz, הנחתת מיקרוגל: 30 dB, מספר נקודות: 2,048, מספר סריקות: 1, זמן סריקה: 80 שניות, זמן קבוע: 50 msec.
- הפעל את מצב סריקת ההתקנה. עבור קבוע זמן סריקה להגדרות, בחר את הערך הנמוך ביותר כי הצעות ספקטרומטר. התאם את רווח המקלט לערך שבו האות המוצג ממלא 80% של הטווח העוצם המוצג, כך שגם עם רעש טעם נתונים יש בעצימות גבוהות יותר מ -80% של המקסימום. לבטל את סריקת התקנה לאחר מכן.
- לחץ על כפתור "הפעל".
- קראו את ערך השדה של המעבר אפס של השיא המרכזי מן הספקטרום המתקבל. הגדר את מרכז השדה לערך זה.
- קח את כלי הקו האופקי ולמדוד את רוחב הספקטרום מהנקודה שבה השיא השמאלי ביותר מתחיל להתעלות מעל הרמה הבסיסית עד לנקודה שבה חוזר השיא הימני ביותר לרמת הבסיס.
- הגדר את רוחב לטאטא בשילוש רוחב הספקטרום.
- השתמש תדירות במיקרוגל כדי להגדיר את B במרכז השדה באמצעות הנוסחה
- לחשב מחדש את הפרמטרים ספקטרומטר
- לחשב את הזמן לטאטא: מהירות רוחב לטאטא / לטאטא. השתמש מהירות לטאטא 5 G / sec.
- חשב את המספר המינימלי של נקודות נתונים: 10 * רוחב לטאטא רוחב / קו.
- חשב את זמן ההמרה: זמן לטאטא / מספר נקודות הנתונים.
- חשב את קבוע הזמן: 0.1 * רוחב קו * סריקה בזמן / לטאטא רוחב.
- מדוד Curve רווי כדי לקבוע את כוח מיקרוגל אופטימום
- הגדר את הנחתת המיקרוגל עד 10 dB ולהתאים את רווח המקלט כמתואר בשלב 1.7.3.
- הגדר את הנחתת המיקרוגל ל -50 dB ולהקליט קשת. אם יחס אות לרעש הוא פחות מ -5: 1, להגדיל את מספר סריקות. חזור על שלב זה עד יחס אות לרעש הוא 5: 1 או יותר.
- צור "רוויה" ניסוי חדש באמצעות השדה המגנטי 1 abscissa, כוח המיקרוגל כמו abscissa 2 ואת עוצמת האות כמו לתאם. העתק את כל ההגדרות הe "field_sweep" הניסוי משלב 1.9.2. עבור 2 abscissa, להגדיר את ערך תחילת הנחתת המיקרוגל עד 10 dB, ערך התוספת ל -1 dB ומספר נקודות ל -41 כדי לכסות טווח שנע בין 10 dB ל -50 dB. הפעל את הניסוי.
- צור גיליון אלקטרוני עבור עקומת הרוויה. הכנס הנחתת מיקרוגל dB לתוך הטור הראשון.
- לחשב את השורש הריבועי של כוח מיקרוגל au בעמודה השנייה עם הנוסחה
כאשר x הוא הנחתת מיקרוגל dB מהעמודה הראשונה. - השתמש בתוכנת ספקטרומטר למדידה לפיםגה עוצמת הקו ספקטרלי המרכזי עבור כל הנחתת מיקרוגל בניסוי. כתוב בעוצמה לתוך הטור השלישי בגיליון האלקטרוני.
- מגרש את השורש הריבועי של כוח המיקרוגל נגד השיא עוצם שיא (עמודת 3 נגד טור 2) כדי לקבל את עקומת הרוויה. incluדה המקור (0,0) בעלילה.
- זהה את המשטר ליניארית של עקומת הרוויה. כוחה המיקרוגל האופטימלי הוא כוח המיקרוגל הגבוה ביותר הוא עדיין במשטר ליניארי. השתמש בהגדרת ההנחתה המקבילה לכל ניסויים נוספים.
2. לקבוע את עוצמת צבע השדה המגנטי ואת רזולוציית זמן
- צור ניסוי חדש בתוכנה ספקטרומטר עם השדה המגנטי כמו abscissa 1 ואת עוצמת האות כמו לתאם. אפשר בקרות סליל שיפוע.
- העתק את כל ההגדרות ספקטרומטר מהניסוי הקודם כפי שנקבע 1.8 ו 1.9.8.
- הגדר את כוח שיפוע השדה המגנטי ל -170 G / ס"מ לכיוון ציר מדגם מצביע כלפי מעלה.
- חשבתי את SW הרוחב לטאטא = SW 0 + FOV · G, שבו SW 0 הוא הרוחב לטאטא שנקבע 1.8.4 בהעדר שיפוע שדה מגנטי,FOV שדה הראייה (2.5 ס"מ) ו- G הוא הוא כוח שיפוע השדה המגנטי.
- חשבתי את גודל פיקסל המוערך = קו הרוחב / G, באמצעות רוחב הקו של הספקטרום שנרשם 1.9.3 בהעדר שיפוע שדה מגנטי.
- חשב את לטאטא זמן = SW / מהירות לטאטא. השתמש באותו מהירות לטאטא כמו 1.8.1.
- חשבתי את המספר המינימאלי של נקודות נתונים הנדרש על פי הערך הגבוה של
אני. N 1 = 10 * רוחב לטאטא / קו רוחב
ii. N 2 = 10 * שדה הראייה / (G * גודל פיקסל). - חשב את זמן ההמרה: זמן לטאטא / מספר נקודות הנתונים.
- חשב את קבוע הזמן: 0.1 * רוחב קו * זמן הסריקה / רוחב לטאטא או נמוך.
- הגדר את הפרמטרים מחושבים ב 2.3 דרך 2.9 ולחץ על כפתור "הפעל".
- מדדו את רמת הרעש של קו הבסיס וכן לפיםגה עוצמתשל הקו המרכזי עם כלי הקו האנכי. חשב את יחס האות לרעש.
- אם יחס אות לרעש הוא פחות מ -5: 1, להכפיל את מספר סריקות בלוח "סריקה" של הפרמטרים ספקטרומטר וחזור על שלבים 2.1.3 דרך 2.11.
3. להכין את המדגם
זהירות: יש להרכיב משקפי בטיחות.
הערה: שמור את airgel שקוע לחלוטין בתוך ממס בכל עת. ראה איור 2 עבור תצלום סכימטי.
- למלא צלחת פטרי בקוטר 10 ס"מ עם אתנול (pa) עד לגובה של 5 מ"מ.
- שים את airgel לתוך צלחת פטרי לחתוך חתיכה גלילי 5 מ"מ עד 1 ס"מ אורך.
- כן פיסת צינורות חום להתכווץ כי הוא בערך 1 סנטימטר יותר מאשר גליל airgel.
- השתמש חותך צינורות זכוכית לשבור צינור מדגם של קוטר פנימי 2 מ"מ ליצור שתי חתיכות באורך 4 ס"מ. שני החלקים צריכים להיות שני קצוות פתוחים.
- הכנס אחת היצירות צינור מדגם 5 מ"מ עמוק לתוך קצה אחד של הצינור החום להתכווץ. בעזרת אקדח חום בזהירות לחמם לקצה הזה של צינורות החום להתכווץ בלי רתיעה שאר הצינורות. צינורות החום להתכווץ צריך להיות קבוע עכשיו על שפופרת זכוכית.
- להטביע את השילוב הזה של שפופרת זכוכית צינורות חום להתכווץ בצלחת פטרי של airgel. בזהירות לדחוף את פיסת airgel משלב 3.2 לתוך הסוף הפתוח של הצינור החום להתכווץ.
- ממלאים מבחנה עם אתנול (pa) עד לגובה של 7 ס"מ. מעבירים את המדגם מצלחת פטרי לתוך מבחנה. תוך כדי כך, ודא כי את הקצה הפתוח של הצינור החום להתכווץ מכוון לחלק העליון. ודא כי airgel הוא שקוע לחלוטין באתנול.
- הכנס את פיסת 4 ס"מ השני שלצינור דגימה משלב 3.4 לתוך הסוף הפתוח של הצינור החום להתכווץ. אין להפעיל כוח, כוח המשיכה אמורה להיות מספיק כדי לסגור את הפערים בין airgel ואת חתיכות צינור דגימה. שים את המבחנה עם המדגם לתוך מבחנה.
- ממלאים סיר לחץ עם לפחות אתנול 500 מ"ל ולהוסיף בר ומערבבים.
- שים את המבחנה המכילה מדגם על תחתית בתוך סיר הלחץ.
זהירות: בצע את הצעד הבא תחת במנדף ולהמשיך ללבוש משקפי מגן. - מבשלים ומערבבים דגימות ב הגדרה הלחץ של 1 בר מעל ללחץ הסביבה על בוחש מגנטי. הטמפרטורה חייבת להגיע לפחות C ° 90. תן לזה להתקרר בהקדם הלחץ הוא הגיע ואת אדי אתנול משחרר שסתום לחץ. אם צינורות החום להתכווץ לא להתכווץ, חזור על שלב זה.
הערה: מייד לנקות את סיר לחץ עם מים כדי למזער את ההשפעה של אתנול על השסתומים החותמים. בשלב זה, המדגם המוכן ניתן לאחסן אתנול עבור seveחודשי RAL.
4. מכינים את ספקטרומטר
- צור ניסוי 2d באמצעות השדה המגנטי כמו abscissa 1, הפעם כמו abscissa 2 ו עוצמת אות כמו לתאם, כך לטאטא שדה מגנטי נרשמת עבור כל צעד זמן. אפשר בקרות סליל שיפוע.
- הגדר את זמן ההשהיה בין המדידות לאפס. הגדר את הפרמטרים האחרים כפי שנקבע סט סעיף 2. את מספר הנקודות עבור ציר הזמן 20 שעות / זמן לטאטא. הגדר את גשר המיקרוגל לבצע כוונון עדין אחרי כל סריקה פרוסה.
- בצע את השלבים בסעיף 1.7 כדי לכוון את ספקטרומטר כדי המהוד הריק.
5. מכינים את המדגם למדידה
הערה: פעם יחידת השלבים הקריטיים של פרוטוקול זה הם 5.3 דרך 6.2, המהווה מההתחלה של התהליך דיפוזיה בתוספת התווית הספין עד למועד רכישת הנתונים ב ספקטרומטר מתחילה. בצע את הפעולות הבאות ללא החדרהכל עיכובים.
- לשים את האצבע על החלק העליון של מדגם מתוך סעיף 3 כדי לשמור על פתרון אתנול לזרום החוצה על הקרקעית. ואז להשתמש במזרק כדי להסיר חלק אתנול מ -5 המ"מ התחתון של צינור המדגם הנמוך ולאטום סוף כי עם תרכובת איטום צינור. ודא שיש בועת אוויר של 2 מ"מ גובה מעל מתחם האיטום.
- הסר את כל אתנול מצינור המדגם מעל airgel למעט 3 מ"מ מעל airgel בעזרת פיפטה נימי פסטר.
- להזריק 20 μl של פתרון התווית ספין באתנול על גבי airgel. ודא שלא ליצור בועת אוויר על גבי airgel. סמן את השעה הנוכחית כמו התחלה של תהליך דיפוזיה.
- מניחים את המדגם בתוך שפופרת מדגם עם קוטר פנימי 4 מ"מ. השתמש קלטת PTFE כדי למרכז את המדגם.
- השתמש בטוש לציון צינור המדגם החיצוני בדיוק בעמדה של 68 מ"מ מעל הקצה העליון של airgel. זה עוזר מרכוז המדגם כהלכה מהוד ומניח את גזן של המהוד 1 מ"מ מתחת לקצה העליון של airgel.
6. בצעו את הניסוי דיפוזיה
- הנח את הדוגמה מהוד כך סימון מ -5.5 מיישרת עם החלק העליון של בעל PTFE של מהוד ולכוון את ספקטרומטר עבור צימוד קריטי כמו מתואר במדריך ההפעלה של ספקטרומטר.
- השתמש במצב התקנת הסריקה כדי לקבוע את רווח המקלט כמתואר 1.7.3 בעוד סלילי השיפוע עדיין כבויים.
- הפעל את הניסוי כי הוגדר בסעיף 4. רשמו את השעה הנוכחית. כך או לחכות 20 שעות כדי שהניסוי לסיים או להפסיק את הניסוי כאשר האות הרשומה אינה המשתנים לאורך של 4 שעות או יותר. שמור את התוצאה.
7. לבצע ניסויים נוספים חסרים עבור ניתוח נתונים
הערה: לבצע את הניסויים 7.1 ו -7.2 עם המדגם אותו מיד לאחר הניסוי דיפוזיה ללא מווינג המדגם.
- רשום את נקודת הפונקציה המורחת עבור Deconvolution
- Switch to הניסוי "שדה לטאטא" משלב 1.7.2. העתק את כל ההגדרות מהניסוי בשלב 6.
- קלט ספקטרום ולמדוד את יחס האות לרעש. אם הוא פחות מ -20: 1, להגדיל את מספר סריקות וחזור על שלב זה. אחרת להציל את הספקטרום.
- לבצע ניסוי הדמיה 2d
- צור ניסוי חדש על ספקטרומטר עם השדה המגנטי כמו 1 abscissa, זווית השיפוע השדה המגנטי כמו abscissa 2 ואת עוצמת האות כמו לתאם. העתק את הפרמטרים משלב 6. הגדר את המטוס הדמיה למישור YZ, המהווה את המטוס כולל לכיוון B שדה מגנטי סטטי 0 ואת ציר מדגם.
- הגדר את מספר זוויות N של בכיוון שיפוע גודל פיקסל N = FOV / רצוי ומעלה.
- התחל את המדידה ולשמור את התוצאה.
- ה חזורדואר צעדים 7.1 ולשמור את התוצאה.
- מדוד את פרופיל רגישות מהוד
- כן אחר מדגם של חללית ספין בתמיסה ידי חזרה על שלבי 1.1 עד 1.5, אבל הפעם להוסיף 4 סנטימטר של הפתרון לתוך הנימים במקום 2 סנטימטר.
- בצע את השלבים בסעיף 2 להקליט ספקטרום של המדגם עם שיפוע שדה מגנטי בכיוון של ציר המדגם. עבור שלב 2.3, השתמש בשדה הראייה של 3 ס"מ. שמור את התוצאה.
- חזור על המדידה בהעדר שיפוע השדה המגנטי ולשמור את התוצאה.
ניתוח 8. נתונים
- משחזר את ניסוי הדמית 2d
- טען את ניסוי הדמית 2d מ 7.2.3 לתוך חלון התצוגה הראשי של התוכנה ספקטרומטר.
- טען את ניסוי 7.2.4 לתוך viewport המשנית של התוכנה ספקטרומטר.
- עבור אל עיבוד> טרנספורמציות> Deconvolution, בחר Slice: כל ולחץלהחיל לבצע deconvolution.
- שמור את הנתונים deconvolved לדיסק.
- השתמש בתוכנת שחזור תמונה בחופשיות הזמינה 20 עם הפקודה הבאה: לשחזר --input result_from_8_1_4.DSC --output reconstructed_image.DSC --steps 100 --size 256
- טען את התוצאה מ 8.1.5 לתוך התוכנה ספקטרומטר לעיון מאוחר יותר.
- נתח את ניסוי דיפוזיה הקלטות
- הפעל את תוכנת ניתוח נתונים עבור לכרטיסייה "Load" של התוכנה שמוצג באיור 3. טען את הניסוי דיפוזיה משלב 6.3 תחת "ניסוי דיפוזיה". טען את הפונקציה להפיץ את הצבע המקביל משלב 7.1.2 תחת "ניסוי דיפוזיה w / o צבע". טען את התוצאה משלבת 7.3.2 תחת "ניסוי פרופיל מהוד" והתוצאה משלב 7.3.3 תחת "exp פרופיל המהוד w / o צבע".
- עבור לכרטיסייה הרגישה מהוד שמוצגת באיור 4
- עבור לכרטיסיית פרופיל צפיפות ספין 1D שמוצגת באיור 5 כדי deconvolve כל לטאטא שדה שנרשם 6.2 באמצעות הניסוי מ -7.1 כפונקציה להפיץ את הצבע. להקטין את ערך כוח הרעש עד התוצאה היא רועשת, ואז להעלות אותו עד הרעש פשוט נעלם.
- עבור לכרטיסיית אזור החיתוך שמוצגת באיור 6. בחר אזור של המפה החומה דיפוזיה שנמצאה לחלוטין פנימי של airgel והיכן חללית ספין היא פשוט עומדת להיכנס מלמעלה על הצעד לראשונה של אזור זה. בכל מקרה של ספק, לטעון את התמונה המשוחזרת 8.1.6 בתוכנת ספקטרומטר כדי לזהות את המיקום המדויק של airgel.
- הגדלת השטח משלב 8.2 בכיוון מטה של המדגם כך אין בעיה ספיןדואר מגיע לגבול התחתון של האזור בתוך זמן הניסוי. ראה איור 6 לעיון.
- עבור לכרטיסייה זרם שמוצג באיור 7 ובכושר העיתונות. בחלונית הימנית מראה את אינטגרלית באזור הקצוץ מ 8.2.5 לאורך ציר העמדה.
- ודא כי העקומה המוצגת הפנל באמצע מתחילה באפס ומייד מתחילה לעלות. אם זה לא המקרה, לחזור 8.2.5.
- ודא שק אדום המוצגים בלוח באמצע כדלקמן נקודות הנתונים השחורות.
- לדמות את ריכוז ספין 1D לאורך הזמן התאים את מקדם דיפוזיה
- עבור לכרטיסייה מקדם הדיפוזיה ובכושר העיתונות.
- חכה תוצאות החישוב.
- ודא כי נתוני הניסוי מוצגים בפינה השמאלית תואמים את הנתונים המספריים יוצגו בפינה הימנית.
- קרא את הערך של מאקרו D מקדם הדיפוזיה מקרוסקופית translational כי הוא displayed על המסך.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
תצלום סכימטי של airgel בתוך הצינור מתכווץ מוצג 2a דמויות 2b. התמונה EPR 2d ב איור 2 ג מראה בבירור את הקצה העליון של airgel. עוצמת 1D ρ בתוך הצינור מדגם מעל airgel נמוכה למרות הריכוז של חללית הספין הוא לפחות גבוה ככל בתוך airgel. עם זאת, את העומק מדגם בניצב למישור התמונה קטן בהרבה בשל הקוטר הפנימי הקטן של הצינור המדגם. ראוי לציין, כי תמונת EPR גם מראה שום בועות אוויר בצינור המדגם ואת airgel לא נראה לי שום בקיעים הציגו במהלך ההתכווצות של הצינור מתכווץ.
8a איור מראה מפת חום דיפוזיה של Trityl ב UKON1-GEL. איור 8C מראה את אותם נתונים עבור IPSL ב UKON1-GEL. 8b Figuress 8 ד להראות הפתרונות נומרית משוואות דיפוזיה התואמים את נתוני הניסוי מ (א) ו- (ג), בהתאמה. כל פרוסה האנכית של המפה החומה מראה את פרופיל הריכוז של חללית הספין בנקודה קבועה בזמן. בתחילת הניסוי חלליות הספין מרוכזות בחלק העליון של המדגם. כתוצאה מגדילה הזמן, הם להפיץ דרך המדגם בעוד בדיקות ספין חדש להיכנס מלמעלה. המפות החומות להראות איכותי כי דיפוזיה translational מקרוסקופית של Trityl היא איטית באופן משמעותי מאשר דיפוזיה translational מקרוסקופית של IPSL. זה צפוי מאז Trityl הוא גדול יותר מאשר IPSL והמערכת הנקבובית ממס זהה.
מקדמי דיפוזיה translational מקרוסקופית עבור Trityl ו IPSL ב UKON1-GEL וסיליקה-GEL מוצגים באיור 9. לשם השוואה, איור 9 גםמציג את מקדם הדיפוזיה translational המיקרוסקופי עבור IPSL באתנול על 2.1 · 10 -10 מ '2 / sec, אשר כבר נגזר על ידי התאמת צורת קו ספקטרלי משלב 7.1.2 באמצעות תוכנה 21 כדי לקבוע את זמן מתאם הסיבוב כמתואר קודם סעיף 16. הניתוח הכמותי של מאקרו D תערוכות דיפוזיה איטית יותר עבור מולקולת Trityl הגדולה יותר לעומת IPSL. השוואה בין UKON1-GEL וסיליקה-GEL מראה ערכים דומים מאוד עבור מאקרו D. זה היה צפוי, שכן המבנה הנקבובי של aerogels דומה ואת האינטראקציה בין חלליות הספין וקבוצות משטח נוכח UKON1-GEL אינה חזקה מספיק כדי להשפיע באופן משמעותי מאקרו D. הוספת גליצרול הממס מגבירה את הצמיגות ומראה ירידה נוספת של מקדם הדיפוזיה עבור Trityl. הניסויים עבור Trityl ב UKON1-GEL וסיליקה-GEL יש בeen חזר עם דגימות מאותו יצווה. הברים שגיאה להראות את סטיית התקן של מאקרו D.
איור 1:. נוסחות מבניות של בדיקות ספין הנוסחא המבנית של (א) Trityl ספין בדיקה ו- (ב) בדיקת IPSL. הודפס מחדש באישור האגודה האמריקנית לכימיה 16. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2:. לדגום את האוכל (א) צילום, (ב) ציור סכמטי ו- (ג) תמונה צפיפות 2d ספין 29 שעות לאחר הזרקת הבדיקות דואר ספין על גבי airgel. הודפס מחדש באישור האגודה האמריקנית לכימיה 16. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3:. תוכנת צילום מסך של טעינת נתוני האיור מציג את מסך הטעינה של התוכנה המשמשת לניתוח נתונים (שלב 8.2.1). טען את הנתונים הבאים משמאל לימין: נתונים גולמיים מניסוי דיפוזיה (שלב 6), פונקציה להפיץ את הצבע מתאים (שלב 7.1), לטאטא שדה לציון נימים מלאים חללית ספין בנוכחות שיפוע שדה מגנטי לאורך ציר המדגם (7.3.2) והפונקציה להפיץ את הצבע המתאים (שלב 7.3.3). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4:. קביעת פרופיל רגישות מהוד האיור מציג את המסך הרגיש המהוד של התוכנה המשמשת לניתוח נתונים (שלב 8.2.2). משמאל, הוא מציג את לטאטא השדה לציון נימים מלאי חללית הספין רשמה בנוכחות שיפוע שדה מגנטי לאורך ציר המדגם (7.3.2) ובאמצע זה מראה את הפונקציה להפיץ את הצבע המתאים (שלב 7.3. 3). מימין פרופיל רגישות המהוד לאורך ציר המדגם מוצג כפי שנקבע על ידי deconvolution באמצעות deconvreg פונקצית Matlab עם פרמטר כוח הרעש המצוין. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
together.within-page = "1"> 
איור 5:. נתונים מחקריים על צפיפות ספין 1D בתוך המדגם האיור מציג את מסך פרופיל ספין צפיפות 1D של התוכנה המשמשת לניתוח נתונים (שלב 8.2.3). משמאל, הוא מציג את העוצמות מניסוי דיפוזיה (שלב 6) ביחידות כלשהן. כל קו אנכי מתאים לנקודת הזמן הוא קונבולוציה של צורת קו ספקטרלי של החללית ספין Trityl ופרופיל צפיפות ספין 1D, משוקלל על פי פרופיל הרגישות מהוד. כיוון השיפוע הוא לאורך ציר המדגם מלמטה למעלה, כדי שנקודות נמוכות בחלל לתת אות ב שדה מגנטי גבוה ולהיפך. הקו הצהוב נוצר על ידי העליון של המדגם, שבו הצינור המדגם נוגע airgel ואת הקוטר של פתרון בדיקת ספין קופץ הקוטר הפנימי של הצינור מדגם לקוטר הגדול של airgel. הקו הכחולהנוצר על ידי אלה בדיקות הספין אשר קדמו קליעה לתוך airgel עקב דיפוזיה. הלוח המרכזי מציג את צורת קו ספקטרלי של חלליות ספין המשמש deconvolution. הפנל הימני מראה את הצבע מקודד פרופיל רגישות ספין 1D לאורך ציר המדגם לאורך זמן, כפי שנקבע על ידי deconvolution באמצעות deconvreg פונקצית Matlab עם פרמטר כוח הרעש המצוין עבור כל נקודת הזמן. ציר השדה המגנטי שהומר על מיקום המרחבי ציר באמצעות כוח שיפוע השדה המגנטי, שבו ערכים חיוביים מתאימים העליון של מדגם הערכים שליליים מתאימים התחתון של המדגם. חלקו העליון של airgel ניתן לראות כקו אופקי בסביבות 3.5 מ"מ. מתחת לזה קו, ההתפשטות של בדיקות ספין דרך airgel ניתן לראות רחבה של האזור הצהוב בכיוון האנכי עם עליית זמן. אנא לחץכאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 6: חיתוך צפיפות ספין 1D לאזור של עניין האיור מציג את הצעד אזור החיתוך של התוכנה המשמשת לניתוח נתונים (שלב 8.2.4).. הוא מציג את צפיפות ספין 1D משלב 8.2.3 בצד שמאל. נתוני לקוחים ישירות בחלונית השמאלית של איור 5 והיא מוגבלת לאזור שבו פרופיל רגישות מההוד גדול מ -10 אחוזים של הערך המקסימאלי שלה. הצד הימני מציג את אותם נתונים, אבל קצוץ לאזור שהמשתמש שנבחר. מקדם דיפוזיה ייקבע מאותו התחום היחיד. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 8:. צפיפות ספין 1D לאורך הזמן נמדד בניסוי ρ 1D (t, y) ביחידות שרירותיות UKON1-GEL עבור (א) Trityl ו- (ג) פתרונות IPSL ופתרונות מספריים של משוואת הדיפוזיה ב (ב), (ד ), בהתאמה. הודפס מחדש באישור האגודה האמריקנית לכימיה 16./54335/54335fig8large.jpg "Target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 9:. שהושגו מקדמי דיפוזיה לשם ניסוי שהושגו מאקרו D מקדמי דיפוזיה translational מקרוסקופית. סטיית התקן של מדידות כמה באמצעות דגימות בודדות מאותה אצווה מוצג. המאקרו D מקדם הדיפוזיה translational המיקרוסקופי של IPSL מותווה כקו מקווקו להשוואה עם הערכה של אי הוודאות של קביעת זמן מתאם הסיבוב בסימולציות רפאים, הצביע קווים מקווקווים כמו 16. הודפס מחדש באישור של האגודה האמריקאית לכימיה 16. PleASE לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הפרוטוקול מאפשר ניטור של דיפוזיה של מולקולות אורח פאראמגנטיים. גישה הדמיה 1D נבחרה משום שהיא מאפשרת על מנת להגיע לפתרון זמן גבוה לעומת הדמיה 2D או 3D. גישת 1D דורשת שטח חתך קבוע של המדגם בגלל האינטנסיביות של תמונת 1D השיגה תלויה לא רק הריכוז אלא גם על אזור החתך של המדגם. השיטה גם דורשת כי ספקטרום EPR של חלליות הספין בתוך הדגימות לשנות רק בעוצמת אבל לא בכושר. אחרת עוד זמן רב הדמיה ספקטרלית-מרחבית חייב לשמש, אשר נמצא מחוץ להיקף של פרוטוקול זה. השיטה היא מוגבלת גם למערכות שבהן מאקרו D נמצא בין 10 -12 מ '2 / sec ו -7 · 10 -9 מ' 2 / sec אם המדגם הוא ציין בשטח שבין 1 מ"מ ו 1 ס"מ אורך ו פני תקופות זמן בין 1 שעה ו 72 שעות 16.
אlthough UKON1-GEL וסיליקה-GEL היה מסונתז בתוך שפופרת מדגם, החוזה דגימות תוך כדי התהליך. זה יוצר פער בין airgel לבין הקיר של הצינור המדגם, האוסר גישת הדמית 1D לפקח על דיפוזיה. סיבוך זה נפתר על ידי צבת airgel בתוך צינור מתכווץ בחום. דוגמאות שאינם כוללים פער בין airgel ואת צינור המדגם ניתן למדוד ישירות. ניסוי הדמית 2d משמש ניסוי ביקורת לבדוק בדיקת ספין כי הוא מחוץ הצינור התכווץ בחום עקב דליפה. תמונת 2D ניתן לשחזר עם אלגוריתם ההקרנה הסתנן כי מיושם התוכנה ספקטרומטר. בפרוטוקול זה אולם שימוש אלגוריתם איטרטיבי 20, כי הוא חזק יותר בתנאים רועשים, הוא הציע.
בעבודות קודמות 10-15,17 המשתמשות הדמיה EPR ללמוד דיפוזיה, את המצב ההתחלתי של הניסוי שהוכן בקפידהבתחילה כולל כמות מסוימת של בדיקות ספין קטן בשטח ככל האפשר ועם מדגם מבודד לחלוטין. לקבלת השיטה המתוארת פרוטוקול זה, החלוקה הראשונית של בדיקות ספין אינה קריטית, כל עוד יש חלק מהמדגם כי בתחילה אינו מכיל בדיקות ספין. הסכום של בדיקות ספין שנכנס החלק הנצפה של המדגם נקבע ישירות ממדידת נתוני דיפוזיה. תוכנת ניתוח נתונים מיישמת את השיטה מתוארת בעבודה קודמת 16. בעוד התוכנה ספקטרומטר כולל את כל הפונקציות הדרושות כדי לבצע את הצעדים עיבוד מקדים ב 8.2, צעדים אלה נכללו תוכנת ניתוח הנתונים שסופקו. זה עושה את זה קל יותר לשנות ולהשוות את הבחירה של פרמטרים.
כאשר התאמת הפרוטוקול למערכות דגימה שונות וציוד, פרמטרים ספקטרוסקופיות כגון מהירות סריקה, משרעת אפנון, אפנון frequency וצורך כוח במיקרוגל כדי להיות מותאם על פי ההוראות של ספקטרומטר, וגם את כוח השיפוע ותקופת הזמן שבו על דיפוזיה הוא ציין שיש צורך לבחון מחדש. משך הזמן שבו דיפוזיה הוא ציין בשלב 6.3 תלוי מאקרו D. הניסוי ניתן לעצור כאשר לא חל שינוי משמעותי של פרופיל ריכוז 1D מתרחש. ניתן לראות זאת גם את הנתונים הגולמיים לפני deconvolution.
ישנן כמה נקודות קריטיות שיש לנקוט בעת ביצוע השלבים של פרוטוקול זה. Aerogels מסוים בשימוש קריסת בפרוטוקול זה ולהתכווץ באופן בלתי הפיך כאשר הם מתייבשים, ולכן הוא חיוני כדי לשמור על aerogels שקוע ממס בכל עת. הסיבה בסיר הלחץ מתמלא ממס נוסף ובר ומערבבים ב 3.8 היא ליצור לחץ האדים במהירות לפני ממס ברחבי airgel מתאדה. כאשר aerogels להתייבש הם להפחית באופן משמעותי דחייבים להיות מוכן iameter ואורך ומוצא מדגם טרי. מתחם איטום צינור נימים יכול לגרום אות EPR אם הוא נמצא בקשר ישיר עם הממס מתמוסס לתוך המהוד. בועת האוויר בין מתחם האיטום הממס בשלב 5.1 יוצרת מחסום כדי למנוע זאת.
בהתאם הממס ואת הגיאומטריה של המדגם זה יכול להיות קשה להשיג צימוד קריטי במהלך שלב כוונון ספקטרומטר. במקרה זה, לסובב את המדגם ולנסות שוב, או לקחת את הדגימה החוצה ולוודא כי airgel ואת הנימים המכילים הממס מרוכזים.
במהלך ניתוח נתונים בשלב 8.2.8, הזרם נקבע באופן ניסיוני של התווית הספין יכול לסטות לנכון. אם זה המקרה ואת יחס אות לרעש של נתונים deconvolved אינה מספיקה, שוב צעדים 8.2.2 ו 8.2.3 ולהגדיל את פרמטר הכוח רעש להפחית את כמות הרעש במחיר של מרחביתרזולוציה. אם יחס אות לרעש הוא לא הבעיה, שוב צעדים 8.2.4 דרך 8.2.8 לבחור שוב לאזור שממנו מאקרו D מחושב לוודא כי נתוני הניסוי כמו גם את ההתאמה בחלונית במרכז הכרטיסייה זרם בדיקה ספין הוא קו דרך הראשית, כפי שמוצג באיור 7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים אין לי מה לחשוף.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| X-Band spectrometer | Bruker | E580 | |
| Spectrometer software | Bruker | Xepr 2.6b.108 | |
| gradient coil system | Bruker | E540 GCX2 | |
| imaging resonator | Bruker | TMHS 1007 | |
| micro-classic pipette controller | Brand | 25900 | |
| microcapillary ringcaps 50 µl | Hirschmann | 9600150 | inner diameter 0.5 mm |
| EPR sample tube 2 mm inner diameter | Bruker | ER 221TUB/2 | |
| EPR sample tube 4 mm inner diameter | Bruker | ER 221TUB/4 | |
| heat-shrink tubing DERAY-IB | DSG-Canusa | 2210048952 | 4.8 mm/2.4 mm, 2:1, 95 °C - 200 °C |
| heat gun | Bosch | PHG 600-3 | |
| PTFE band | VWR | 332362S | width 12 mm |
| test tube | length 16 cm, diameter 1.5 cm | ||
| beaker | 250 ml, height 9 cm, diameter 7 cm | ||
| capillary tube sealing | Fisher Scientific | 02-678 | |
| pressure cooker, 3 L with trivet | Beem | Vital-X-Press V2, F1000675 | |
| magnetic stirrer with heating element | |||
| ethanol (p.a.) | |||
| ethanol (techn.) | |||
| syringe | Hamilton | 1705 | 0.05 ml, custom length: 20 cm |
| Pasteur capillary pipette | length 23 cm | ||
| data analysis software | homemade | Available for download at http://www.uni-konstanz.de/drescher/software. Requires Matlab. | |
| UKON1-GEL | kindly provided by Prof. Sebastian Polarz, Martin Wessig and Andreas Schachtschneider | See references 16, 18, 19 for the synthesis |
References
- Schüth, F., Sing, K. S. W., Weitkamp, J. Handbook of Porous Solids. , Wiley-VCH Verlag GmbH. Weinheim, Germany. (2002).
- Hoffmann, F., Cornelius, M., Morell, J., Fröba, M. Silica-Based Mesoporous Organic-Inorganic Hybrid Materials. Angew. Chem. Int. Edit. 45 (20), 3216-3251 (2006).
- Sanchez, C., Boissière, C., Grosso, D., Laberty, C., Nicole, L. Design, Synthesis, and Properties of Inorganic and Hybrid Thin Films Having Periodically Organized Nanoporosity. Chem. of Mat. 20 (3), 682-737 (2008).
- Le Bihan, D., Johansen-Berg, H. Diffusion MRI at 25: Exploring brain tissue structure and function. NeuroImage. 61 (2), 324-341 (2012).
- Pregosin, P. S., Kumar, P. G. A., Fernández, I. Pulsed Gradient Spin−Echo (PGSE) Diffusion and 1H,19F Heteronuclear Overhauser Spectroscopy (HOESY) NMR Methods in Inorganic and Organometallic Chemistry: Something Old and Something New. Chem. Rev. 105 (8), 2977-2998 (2005).
- Talmon, Y., et al. Molecular diffusion in porous media by PGS ESR. Phys. Chem. Chem. Phys. 12 (23), 5998-6007 (2010).
- Okazaki, M., Seelan, S., Toriyama, K. Condensation process of alcohol molecules on mesoporous silica MCM-41 and SBA-15 and fumed silica: a spin-probe ESR study. Appl. Magn. Reson. 35 (3), 363-378 (2009).
- Wessig, M., Spitzbarth, M., Drescher, M., Winter, R., Polarz, S. Multiple scale investigation of molecular diffusion inside functionalized porous hosts using a combination of magnetic resonance methods. Phys. Chem. Chem. Phys. 17 (24), 15976-15988 (2015).
- Yakimchenko, O. E., Degtyarev, E. N., Parmon, V. N., Lebedev, Y. S. Diffusion in Porous Catalyst Grains as Studied by EPR Imaging. J. Phys. Chem. 99 (7), 2038-2041 (1995).
- Cleary, D. A., Shin, Y. K., Schneider, D. J., Freed, J. H. Rapid determination of translational diffusion coefficients using ESR imaging. J. Magn. Reson. 79 (3), 474-492 (1988).
- Hornak, J. P., Moscicki, J. K., Schneider, D. J., Freed, J. H. Diffusion coefficients in anisotropic fluids by ESR imaging of concentration profiles. J. Chem. Phys. 84 (6), 3387-3395 (1986).
- Berliner, L. J., Fujii, H. EPR imaging of diffusional processes in biologically relevant polymers. J. Magn. Reson. 69 (1), 68-72 (1986).
- Degtyarev, Y. N., Schlick, S. Diffusion Coefficients of Small Molecules as Guests in Various Phases of Pluronic L64 Measured by One-Dimensional Electron Spin Resonance Imaging. Langmuir. 15 (15), 5040-5047 (1999).
- Marek, A., Labský, J., Koňák, Č, Pilař, J., Schlick, S. Translational Diffusion of Paramagnetic Tracers in HEMA Gels and in Concentrated Solutions of PolyHEMA by 1D Electron Spin Resonance Imaging. Macromolecules. 35 (14), 5517-5528 (2002).
- Shin, Y. K., Ewert, U., Budil, D. E., Freed, J. H. Microscopic versus macroscopic diffusion in model membranes by electron spin resonance spectral-spatial imaging. Biophys. J. 59 (4), 950-957 (1991).
- Spitzbarth, M., et al. Simultaneous Monitoring of Macroscopic and Microscopic Diffusion of Guest Molecules in Silica and Organosilica Aerogels by Spatially and Time-Resolved Electron Paramagnetic Resonance Spectroscopy. J. Phys. Chem. C. 119 (30), 17474-17479 (2015).
- Kruczala, K., Schlick, S. Measuring Diffusion Coefficients of Nitroxide Radicals in Heterophasic Propylene−Ethylene Copolymers by Electron Spin Resonance Imaging. Macromolecules. 44 (2), 325-333 (2011).
- Wessig, M., Drescher, M., Polarz, S. Probing Functional Group Specific Surface Interactions in Porous Solids Using ESR Spectroscopy as a Sensitive and Quantitative Tool. The J. Phys. Chem. C. 117 (6), 2805-2816 (2013).
- Kuschel, A., Polarz, S. Organosilica Materials with Bridging Phenyl Derivatives Incorporated into the Surfaces of Mesoporous Solids. Adv. Funct. Mater. 18 (8), 1272-1280 (2008).
- Spitzbarth, M., Drescher, M. Simultaneous iterative reconstruction technique software for spectral-spatial EPR imaging. J. Magn. Reson. 257, 79-88 (2015).
- Stoll, S., Schweiger, A. EasySpin, a comprehensive software package for spectral simulation and analysis in EPR. J. Magn. Reson. 178 (1), 42-55 (2006).
