Abstract
胰腺癌仍然是其中存活尚未在过去的几十年大大提高了癌症之一。只有确诊患者的7％将生存超过五年。为了理解和模仿胰腺肿瘤的微环境，我们利用胰腺癌的小鼠原位模型，允许肿瘤进展的非侵入性成像的实时性。表达绿色荧光蛋白（PANC-1，GFP）胰腺癌细胞悬浮于基底膜基质，浓度高，（ 例如 ，基质胶HC）与无血清培养基，然后注入通过剖腹胰腺的尾巴。在高浓度基底膜基质中的细胞悬浮液变成凝胶状物质一旦达到室温;因此，当它与胰腺接触，形成在注射部位的密封，防止任何细胞泄漏它胶凝。肿瘤生长和转移到其他器官活监视动物用荧光。它是使用适当的过滤器的GFP的激发和发射的关键。对于原位移植的步骤，在这篇文章中有详细因此，研究人员可以很容易地复制在裸鼠体内的过程。这个协议的主要步骤是制备细胞悬浮液，手术植入，和全身荧光体内成像。此原位模型被设计为调查对原发性和转移性肿瘤新的治疗的功效。
Introduction
胰腺癌诊断与增加的频率相对于其它癌症和是在美国癌症相关死亡的第 4主要原因。从诊断时，患者的90％以上，五年内1,2死亡。目前，手术切除肿瘤是胰腺癌唯一的治疗，但患者不足20％有资格接受手术，主要是因为在诊断时疾病是一个先进的阶段，并已转移3,4。缺乏特异性症状，使胰腺癌的一种无声的疾病;一些症状包括腹痛，背痛，食欲不振，黄疸和恶心的损失;可以很容易地解释为常见的消化系统疾病4。由于这个原因，重要的是开发新的药理学工具在胰腺癌的诊断和治疗，以帮助是重要的。
利用动物模型可以让我们了解pancre生物学ATIC癌症并提供了一个深入了解将这一知识用于人类。胰腺癌的异种移植原位模型是现实的，因为肿瘤起源于5器官生长。在对比异位模型，其中细胞系或肿瘤片段皮下植入，原位建模允许肿瘤微环境和模拟物的肿瘤细胞的相互作用的与其周围6的娱乐。此处所描述的异种移植物模型由人胰腺癌细胞系PANC-1的GFP，这是基因工程化以表达绿色荧光蛋白（GFP）派生的肿瘤。 GFP检测允许用于非侵入性成像和肿瘤生长和转移7的监视。肿瘤发展迅速发生，自发地和非常类似于人类胰腺癌患者8的原 发肿瘤。原位模型提供药物疗效的一个更准确的预测响应于治疗剂，而模拟肿瘤微环境。
如上所述，这种动物模型可让肿瘤生长和转移的实时荧光检测。荧光检测允许相比，发光更直接/实时成像。荧光的发射光是由一较短波长的另一个光的激发的结果;而在发光，该发出的光的化学反应的结果，并且可能不具有强发射9。此外， 在体内荧光成像全身是不损害动物，并允许研究人员来监测肿瘤的生长随时间响应于治疗性治疗。
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Protocol
下面描述的协议的指导和西大学的动物护理和使用委员会的批准下进行。所有的实验都符合所有相关的准则，法规和监管机构执行。
1.细胞培养
- 完全培养基制备
- 使用II类生物安全柜，由无菌加入胎牛血清（FBS）和青霉素链霉素（P / S），以500毫升瓶的RPMI培养基的制备完全培养基。纷飞轻轻混匀。每个补充的终浓度为10％FBS和1％P / S（V / V）。例如，补充500毫升介质56毫升FBS和6ml P / S。
- 放置完全培养基的水浴中在37℃。
- 解冻和细胞传播
- 检索来自液氮PANC-1 GFP细胞。解冻通过温和搅拌小瓶在水浴中在37℃。
注意：解冻应迅速（约2 - 3分钟）。 - 标签T-75烧瓶与（一个）细胞系的名称，（B）通道数，（C）的日期，和（d）研究者的缩写被使用。
- 擦拭用70％乙醇和转移小瓶小瓶到生物安全柜中。
- 以传播的细胞，加9.0毫升完全培养基至15毫升锥形管中。用1.0毫升吸管，小心地转移细胞悬液，9毫升完全培养基挂起。
- 离心在125 xg离心在RT 8分钟。转移锥形小瓶至生物安全柜和吸出上清液，而不会干扰沉淀。
- 轻轻上下吹打悬浮暂停在10ml新鲜的完全培养基的沉淀。
- 计数细胞用血细胞计数器，并在2.1×10 6细胞/烧瓶的密度板他们在T-75烧瓶中。放置烧瓶在培养箱中在37℃和5％的CO 2。
- 用肉眼和显微镜下监视每天的细胞。如果流感标识是需要更新，在无菌条件下吸从烧瓶中的完全生长培养基并丢弃。加入新鲜完全培养基等体积。
- 检索来自液氮PANC-1 GFP细胞。解冻通过温和搅拌小瓶在水浴中在37℃。
- 细胞传播
- 在无菌条件下从烧瓶中删除网上平台。添加5毫升Dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水（DPBS）中冲洗细胞并丢弃。
- 加入3ml的0.25％胰蛋白酶的分离从烧瓶中的细胞。孵育含有在37℃的胰蛋白酶和5％CO 2的5至10分钟的烧瓶中。
- 观察细胞的显微镜（放大10倍）下，并确保他们是圆和脱落。
- 通过加入完全培养基等体积的中和胰蛋白酶和由向下轻轻吹打起来分手团块。
- 使用血球计数细胞，并传送适当的细胞悬浮液体积在1.2.7中提到的细胞密度新瓶中;添加足够的新鲜培养基使终体积为每烧瓶10毫升
- 细胞Suspens离子制备注射
注：由于基底膜基质，浓度高，凝固在室温下，将所有材料冰上。放置在冰箱的所有无菌的枪头和小瓶过夜，并保持在冰上就暂停工作时。- 保持了一瓶RPMI媒体无冰任何添加剂。解冻基底膜基质，浓度高，通过以下制造商的说明。优选地，分装成小小瓶避免多次冻融循环10。
- 从所有培养瓶中吸出介质，并用5毫升的DPBS冲洗。重复上一节中的所有步骤，直至步骤1.3.4。
- 在RT传送内容到15毫升锥形管和离心机在125×g离心8分钟。转移锥形小瓶生物安全柜，并重新暂停用10ml DPBS的沉淀。
- 轻轻吸管悬架上下分手沉淀。算使用血球细胞。
- 离心机再次作为以s概述TEP 1.4.3。吸去上清液，并根据细胞的数量，添加适当的稀释剂，得到3×10 6细胞到50微升的体积。稀释剂将是无血清培养基和高浓度的地下室基质膜的一个1的混合物：1（V / V）的比率。
- 然后振荡悬挂，并保持在冰上在任何时候。该悬浮液现在已准备好用于注射。
- 手术植入
注意：确保所有的手术材料和仪器是无菌的。实践在任何时候无菌技术。- 放置在桌子上的加热垫，并用无菌披盖覆盖。设置麻醉机，并确保所有电源都触手可及。
- 放置在动物的鼻子到麻醉掩模和麻醉设置为1升/分钟的氧气和2.5％的异氟醚。
- 轻轻擦洗用碘动物的侧翼，并用70％乙醇冲洗干净。重复三次。
- 确认动物按捏后肢完全麻醉。如果发现没有反应的动物是完全麻醉，准备手术。然而，如果动物退缩，确保有在蒸发器充分麻醉，并允许动物更多的时间来麻醉下完全去。
- 负载大约200微升细胞悬浮液与一种18G的针头的1.0毫升结核病注射器（预先冷却）。更换一个27克针针，并返回到冰中待用。
- 找到脾脏一般地区（腹部左上腹），并使用镊子捏在该区域上方的皮肤。用手术剪使大约为1.0厘米的切口创建口袋。同样，捏在脾脏顶部的平滑肌和为了访问腹膜腔切穿。
- 轻轻抓住脾的尾端，将其排除体外。胰腺将附在脾脏。传播利用湿式ST胰腺erile棉条并找到胰尾。
- 交付50微升注入胰尾，留针内，持续10秒，慢慢地旋转针头从胰腺。一个成功的植入看起来像没有任何泄漏肤浅的泡沫。
- 返回胰腺和脾脏到腹膜腔。首先附上肌肉，然后分别附上皮肤。使用6-0缝合或钉关闭切口。为了避免在动物疼痛，辖酮洛芬皮下（SC）（5毫克/千克）经24小时。另外，管理丁丙诺啡SC（0.05 - 0.1毫克/千克），超过36小时的时间内，每12小时。
- 从麻醉中恢复的动物，并返回到笼子里。同时监测的痛苦。手术 - 动物必须在（先发制人甚至之前）的时间被提供疼痛缓解。额外的疼痛缓解，必须提供给根据IACCUC协议或由在规定的经历疼痛的动物抚育兽医或指定人员。
- 体内成像
注意：使用装备有暗室和GFP成像适当滤光片的商业成像系统进行图像捕捉。 （： - ;：513 - 557 nm发射495纳米455激发）图像采集，使用CCD照相机和由可互换的激发/发射透镜的光学系统来实现的。亮场图像，而不以1×1像素合并为每个时间点的过滤器被捕获。 GFP的激发利用氙多光谱光源。动物用麻醉机连接到一个气体麻醉歧集成到成像系统的暗室麻醉下保持整个成像过程。- 麻醉动物如1.5.2所述。麻醉掩模是在商业成像系统的暗室的内部，以便在成像过程中，以保持动物麻醉下处理。
- 建立正确的激发和发射滤波器。
- 只用白光获得初始图像开始。保持动物的相同位置在整个成像会议并切换到GFP的过滤器，以采取第二图像。
- 为了达到最佳效果叠加两个图像。分析荧光区域和强度的图像。
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Representative Results
这个方法描述了荧光人胰腺癌细胞的外科原位移植，着眼于制备细胞悬浮液注射，对啮齿类动物适当麻醉，通过剖腹分娩细胞悬浮液，以及使用荧光体内小动物成像的。检测2和3星期之间的绿色荧光信号（GFP信号）植入后的，为研究人员提供视觉提示以确认显影胰腺癌肿瘤（ 图1）的存在。 图1是由一个鼠的三个图像的同PANC-1的GFP荧光的肿瘤。第一种是在白光下（ 图1A）被;第二图像拍摄下的蓝色光的荧光（激发：455 - 495纳米;发射：513 - 557 nm）到图像从PANC-1胰腺肿瘤（ 图1B）射出的绿色荧光;第三个是一个复合前两个和显示鼠标（ 图1C）的主体内的肿瘤的位置。动物不产生肿瘤不显示GFP信号（ 图2）。此外，随着时间的推移的肿瘤进展的代表性图像可以是非侵入性监控，通过记录在不同时间点（ 图3）的GFP信号。 图3示出的GFP信号的几个复合材料随着时间的推移。随着时间的推移，肿瘤大小增加，GFP信号增大。在植入20天后，肿瘤显示为一个小绿点，并在植入后50天，在肿瘤大小增加显著。 图4A示出转移到脾脏，肝脏和胃肠道，可在动物已经经过确认安乐死和器官用于离体荧光成像（ 图4B）中除去。
图2：植入故障，缺一次鼠标的荧光表示，其中肿瘤尚未发展的：与获得的（A）图片是利用蓝光和GFP特定的过滤器获得的白光，没有过滤。（B）图像。A和B（C）的合成图像，请点击此处查看该图的放大版本。
图 3：体内 实时荧光成像，以追踪原发性肿瘤生长。 在不同时间点植入后PANC-1 GFP胰腺癌进展的体内成像。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
我们描述了胰腺癌的原位小鼠模型它表达绿色荧光蛋白，从而允许肿瘤生长的非侵入性监控用整个身体的体内荧光成像（ 图1）。这种技术使我们能够实时监测肿瘤发展（ 图3）;它可以为研究人员研究针对胰腺癌的新试剂的治疗功效的重要工具。这种模式的另一个重要方面是，GFP荧光提供了一种视觉提示指示成功植入和胰腺癌的生长;否则将难以在活的动物来衡量。与临床相符合，这种模式提供了关于转移过程中的见解。它显示了转移到周围器官：脾，肠系膜淋巴结，肝和胃肠道（ 图4）。我们早7周后移植观察转移。 PANC-1转移已经代表orted在10范围- 17周1。在该观察转移的时间可以取决于植入的细胞，注入和可视化技术的数量。在目前的研究中，我们选择了一个绿色荧光细胞系PANC-1的GFP，它是商购的。这里描述的模型重现性好，转移灶可以很容易地可视化，因为他们有明亮的荧光。从建立肿瘤细胞系产生的异种移植物的裸小鼠模型的一个限制是降低了肿瘤的异质性相比，原始人类肿瘤12的可能性;不过该模型是重复性好，易于开发，并按照其在活的动物的进展。此外，异种移植模型小鼠继续在癌症研究中广泛应用。
荧光标记的细胞必须被造粒并重新悬浮在等体积的冰冷基底膜8的混合冰冷的无血清培养基。将细胞悬浮液必须为m在任何时候都aintained冰以防止凝胶或凝固。它装载有18号针头的注射器，以避免裂解细胞是重要的。如果将细胞裂解，将细胞悬浮液变得无用，并且没有肿瘤的生长所达到（ 图2）。立即注射后，允许细胞悬浮液约10秒以固化从注射部位除去针之前。悬浮液的凝固特性允许我们注入细胞而不从注射部位泄漏。电池的泄漏可导致转移作为一个产物，而不是从细胞传播。我们优化使用每50 3×10 6个细胞微升注射PANC-1的GFP细胞系的这种原位移植;其它细胞系注入必须凭经验确定。注射的更高容量达100微升含有500,000个细胞已在文献中报道12。主要优化参数TA肯考虑三个周时植入后内通过绿色荧光原位成功肿瘤生长和阳性的肿瘤成像。
肿瘤的生长和发展不仅受注入，而且所使用的小鼠的年龄的细胞数。我们已经使用无胸腺裸鼠并判定使用6至8周的岁的青年小鼠相比老年小鼠时产生更可再现的结果。由于这些老鼠的年龄，他们开始重新获得一定的免疫力可能导致拒绝人的胰腺细胞。此处所描述的成像技术不限于原位使用;它们也可用于肿瘤的异位注入。必须小心，以避免自体荧光可掩盖肿瘤GFP信号。用于麻醉管的某些塑料可能会产生自体荧光文物。
荧光全身成像使得肿瘤的生长和发展13的快速分析。使用荧光的一个主要优点是跟踪肿瘤无病理组织学检查或免疫组织化学14的传统繁琐的程序的能力。这种模式有明亮的荧光，使图像采集，无需皮瓣或其他操作的。荧光从生物发光的不同之处在于它基于化学反应不产生光;它简单地吸收光并以较低的频率重新发射它。原位异种移植模型提供了宝贵的知识和胰腺肿瘤生物学的理解它可以被翻译成供人类使用的新疗法。
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Disclosures
作者什么都没有透露。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI media 1640 | Caisson Labs | RPL03-500ML | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10437-077 | |
| Penicillin Streptomycin | Thermo Ficher Sci | 15140-122 | |
| Matrigel HC basement membrane, high concentration | Corning | 354248 | |
| SutureVet PGA 6-0 PGA | Henry Schein | 39010 | |
| Alcare or Foamed Antiseptic Handrub | Steris | 639680 | |
| DPBS (Dubelcco's Phosphate-Buffered saline) | Thermo Ficher Sci | 21300025 | |
| TB Syringe 27 G 1/2 | Becton Dickinson | 305620 | |
| Isoflurane | Blutler Schein | 50562 | |
| Ketoprofen | Fort Dodge Animal Health | ||
| Surgical Scissors, 5.5" straight mayo | Henry Schein | 22-1600 | |
| PANC-1 GFP cell line | Anticancer, Inc | ||
| Small Animal Imaging System: iBox Scientia | UVP, LLC. Upland, CA. | Small Animal Imaging System to observe the fluorescent tumor in live animals |
References
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