Fluorescent ortotopisk Mouse Model af kræft i bugspytkirtlen

Abstract

Kræft i bugspytkirtlen er stadig en af ​​de kræftformer, for hvilke overlevelse ikke er forbedret betydeligt i de seneste årtier. Kun 7% af diagnosticerede patienter vil overleve længere end fem år. For at forstå og efterligne mikromiljø pankreatiske tumorer, vi anvendt en murin ortotopisk model af pancreascancer, der tillader ikke-invasiv billeddannelse af tumorprogression i realtid. Bugspytkirtelkræftceller udtrykker grønt fluorescerende protein (PANC-1 GFP) blev suspenderet i basalmembranmatrix, høj koncentration, (f.eks Matrigel HC) med serumfrit medium og derefter sprøjtet ind i halen af bugspytkirtlen via laparotomi. Cellesuspensionen i den høje koncentration basalmembranmatrix bliver en gel-lignende stof, når den når stuetemperatur; derfor er det gelerer, når det kommer i kontakt med bugspytkirtlen, hvilket skaber en tætning på injektionsstedet og forhindrer enhver celle lækage. Tumorvækst og metastase til andre organer overvåges i levendedyr ved anvendelse af fluorescens. Det er afgørende at anvende passende filtre til excitation og emission af GFP. Trinene til ortotopisk implantation er beskrevet i denne artikel, så forskerne kan nemt kopiere proceduren i nøgne mus. De vigtigste trin i denne protokol er udarbejdelse af cellesuspensionen, kirurgisk implantation, og hele kroppen fluorescerende in vivo imaging. Denne ortotopisk model er designet til at undersøge effekten af ​​nye lægemidler på primære og metastatiske tumorer.

Introduction

Kræft i bugspytkirtlen er diagnosticeret med øget hyppighed i forhold til andre kræftformer og er den ^4. hyppigste årsag til kræft-relaterede dødsfald i USA. Fra tidspunktet for diagnosen, over 90% af patienterne dør inden for fem år ^1,2. I øjeblikket kirurgisk tumor fjernelse er den eneste kur mod kræft i bugspytkirtlen, men mindre end 20% af patienterne er berettiget til at blive opereret primært fordi på tidspunktet for diagnosen sygdommen er på et fremskredent stadium og har spredt sig ^3,4. Manglen på specifikke symptomer gør bugspytkirtelkræft en tavs sygdom; nogle af de symptomer er mavesmerter, rygsmerter, tab af appetit, gulsot og kvalme; som let kan fortolkes som fælles fordøjelsesforstyrrelser sygdomme ^4. Af denne grund er det vigtigt at udvikle nye farmakologiske værktøjer til at hjælpe ved diagnose og behandling af pancreascancer.

Brugen af ​​dyremodeller giver os mulighed for at forstå biologi pancreatisk kræft og giver et indblik i at anvende denne viden til mennesker. Xenograft ortotopisk modeller af bugspytkirtelkræft er realistiske, fordi tumorer vokser i organet for oprindelse ^fem. I modsætning til heterotopiske modeller, hvor cellelinier eller tumorfragmenter implanteres subkutant, ortotopisk modellering muliggør genskabelse af tumorens mikromiljø og efterligner interaktionen af tumorceller med sine omgivelser ^6. Den xenograftmodel beskrevet her stammer tumorer fra den humane pancreas cancercellelinie PANC-1 GFP, som er genetisk manipuleret til at udtrykke det grønt fluorescerende protein (GFP). GFP detektion muliggør for en ikke-invasiv billeddannelse og overvågning af tumorvækst og metastase ^7. Tumor udvikling sker hurtigt, spontant, og ligner, at primære tumorer af humane pancreas kræftpatienter ^8. Ortotopisk modeller giver en mere præcis forudsigelse af narkotika effekt som reaktion på terapeutiske midler mensefterligne tumormikromiljøet.

Som nævnt ovenfor er denne dyremodel tillader fluorescerende detektion af tumorvækst og metastase i realtid. Fluorescerende detektion giver mulighed for en mere direkte / live billeddannelse forhold til luminescens. Med fluorescens det udsendte lys er et resultat af en excitation af en anden lys med en kortere bølgelængde; henviser i luminescens, det udsendte lys er et resultat af en kemisk reaktion og har muligvis ikke stærk emission ^9. Desuden hele kroppen in vivo fluorescerende billeddannelse er ikke skadelig for dyret og giver forskerne til at overvåge tumorvækst over tid som reaktion på terapeutiske behandlinger.

Protocol

Den nedenfor beskrevne protokol udføres under vejledning og godkendelse af Western University Animal Care og brug Udvalg. Alle forsøg udføres i overensstemmelse med alle relevante retningslinjer, regulering og reguleringsorganer.

1. Cellekultur

1. Fremstilling af komplet medium
   1. Ved hjælp af en klasse II biologisk sikkerhedsskab, forberede komplet medium ved aseptisk at tilsætte føtalt bovint serum (FBS) og penicillin streptomycin (P / S) til en 500 ml flaske RPMI-medium. Bland forsigtigt ved at slynge. Slutkoncentrationen af ​​hver supplement er 10% FBS og 1% P / S (v / v). For eksempel supplere 500 ml medier med 56 ml FBS og 6 ml P / S.
   2. Placer komplet medium i et vandbad ved 37 ° C.
2. Optøning og formeringsmateriale celler
   1. Hent PANC-1 GFP celler fra flydende nitrogen. Tø hætteglasset ved forsigtig omrøring i et vandbad ved 37 ° C.
      Note:Optøning bør være hurtig (ca. 2 - 3 i min).
   2. Label T-75 kolber, der skal anvendes med (a) cellelinje navn, (b) passage nummer, (c) dato og (d) forskers initialer.
   3. Tør hætteglas med 70% ethanol og hætteglas overførsel til et bio kabinet.
   4. At opformere cellerne, tilsættes 9,0 ml komplet medium til et 15 ml konisk rør. Under anvendelse af en 1,0 ml pipette forsigtigt overføre cellesuspensionen og suspenderer det i 9 ml komplet medium.
   5. Centrifuger ved 125 xg i 8 minutter ved stuetemperatur. Overfør den koniske hætteglas til en biosikkerhed kabinet og aspireres supernatanten uden at forstyrre bundfaldet.
   6. Suspender pellet i 10 ml frisk komplet medium ved forsigtigt at pipettere suspensionen op og ned.
   7. Tæl cellerne med et hæmocytometer og plade dem i T-75 kolber med en tæthed på 2,1 x 10 ⁶ celler / kolbe. Placer kolbe i en inkubator ved 37 ° C og _5% CO2.
   8. Overvåg cellerne dagligt ved øjet og under mikroskopet. Hvis influenzaid er nødvendig fornyelse, aseptisk aspireres det komplette vækstmedium fra kolben og kassér. Tilføj tilsvarende volumen af ​​frisk komplet medium.
3. plantemateriale Celler
   1. Aseptisk fjerne medium fra kolben. Der tilsættes 5 ml Dulbeccos fosfatbuffer saltvand (DPBS) at skylle celler og kassér.
   2. Frigøre cellerne fra kolben ved tilsætning 3 ml 0,25% trypsin. Inkuber kolbe indeholdende trypsin ved 37 ° C og _5% CO2 i 5 til 10 min.
   3. Overhold celler under mikroskop (10X forstørrelse), og sikre, at de er runde og forskubbet.
   4. Neutralisere trypsin ved tilsætning af et lige så stort volumen komplet medium og opbryde klumper ved forsigtigt at pipettere op og ned.
   5. Tæl celler under anvendelse af et hæmocytometer og overføre det passende cellesuspension volumen til nye kolber ved celledensiteten nævnt i 1.2.7; tilføje nok frisk medium så slutvolumenet er 10 ml pr kolbe.
4. Cell Suspension Forberedelse til injektion
   Bemærk: Da basalmembranen matrix, høj koncentration, størkner ved RT, holde alle materialer på is. Læg alle sterile pipettespidser og hætteglas i fryseren natten over, og holde på is, mens du arbejder om suspension.
   1. Hold en flaske RPMI medier uden tilsætningsstoffer på is. Optøs basalmembranmatrix, høj koncentration, ved at følge producentens instruktioner. Fortrinsvis alikvot i mindre hætteglas at undgå gentagne fryse-tø-cykler ^10.
   2. Aspirer medier fra alle kolber, og skyl med 5 ml DPBS. Gentag alle trin på det foregående afsnit op til trin 1.3.4.
   3. Overfør indholdet til en 15 ml konisk rør og centrifugeres ved 125 xg i 8 minutter ved stuetemperatur. Overfør konisk hætteglas til biosikkerhed kabinet og re-suspendere pellet hjælp 10 ml DPBS.
   4. pipette forsigtigt suspensionen op og ned for at bryde op pelleten. Tæl celler under anvendelse af et hæmocytometer.
   5. Der centrifugeres igen som skitseret i sTEP 1.4.3. Aspirer supernatanten og afhængigt af antallet af celler, tilsættes passende fortyndingsmiddel til opnåelse 3 x 10 ⁶ celler i et volumen på 50 pi. Fortyndingsmidlet vil være en blanding af serumfri medier og høj koncentration kælder matrix membran i en 1: 1 (v / v) -forhold.
   6. Vortexes suspensionen blidt og holde på is hele tiden. Suspensionen er nu klar til injektion.
5. kirurgisk implantation
   Bemærk: Sørg for, at alle kirurgiske materialer og instrumenter er sterile. Øv aseptiske teknikker på alle tidspunkter.
   1. Placer en varmepude på bordet og dække med et sterilt afdækningsstykke. Opstil anæstesi maskinen og sikre alle leverancer er inden for rækkevidde.
   2. Placer dyrets snude i anæstesi masken og opsætte anæstesi til 1 l / minut oxygen og 2,5% isofluran.
   3. forsigtigt krat flanken af ​​dyret med iod, og skyl med 70% ethanol. Gentag tre gange.
   4. Bekræftdyr er fuldt bedøvet ved at knibe bagpote. Dyret er fuldt bedøvet og klar til kirurgi, hvis der ikke observeres nogen respons. Men hvis dyret flinches, sikre, der er tilstrækkelig anæstesi i forstøveren og tillade dyret mere tid til at gå helt under anæstesi.
   5. Lægge ca. 200 pi af cellesuspensionen i en 1,0 ml TB sprøjte med en 18 G nål (tidligere afkølet). Udskift nålen med en 27 G nål og vende tilbage til is, indtil klar til brug.
   6. Find det generelle område af milten (øverste venstre kvadrant af maven), og ved hjælp af pincet tag fat i huden på toppen af ​​denne region. Anvendelse af kirurgiske sakse lave et snit på ca. 1,0 cm for at skabe en lomme. Tilsvarende, klemmes den glatte muskel på toppen af ​​milten og skære igennem for at få adgang til bughulen.
   7. Forsigtigt fange den kaudale ende af milten og trække det ud af kroppen. Bugspytkirtlen vil blive knyttet til milten. Spred pancreas ved anvendelse af en våd sterile Q-tip og find halen i bugspytkirtlen.
   8. Lever den 50 pi injektion i halen af ​​bugspytkirtlen, forlader nålen inde i 10 sek og langsomt dreje nålen ud i bugspytkirtlen. En vellykket implantation vil ligne en overfladisk boble uden lækager.
   9. Retur bugspytkirtlen og milten til bughulen. Først omslutte muskel og derefter omslutte huden separat. Brug en 6-0 sutur eller hæfte for at lukke snittet. At undgå smerter i dyret, administrere ketoprofen subkutant (SC) (5 mg / kg) i løbet af 24 timer. Alternativt, administrere buprenorphin sc (0,05 til 0,1 mg / kg) hver 12 timer i løbet af en 36 timers periode.
   10. Gendan dyret fra anæstesi og returnere det til sit bur. Også overvåge for smerter. Dyrene skal være forsynet med smertelindring på tidspunktet for (eller endda før - forebyggende) kirurgi. Yderligere smertelindring skal gives til dyr, der oplever smerte i henhold til IACCUC-protokol eller som foreskrevet af påtendens dyrlæge eller udpeget.
6. In vivo Imaging
   Bemærk: Billedoptagelse udførtes under anvendelse af et kommercielt billeddannelsessystem udstyret med et mørkt kammer og de passende filtre til GFP billeddannelse. Billede Købet blev gennemført ved hjælp af et CCD-kamera og et optisk system bestående af udskiftelige excitation / emission linser (excitation: 455-495 nm, emission: 513-557 nm). Bright felt billeder blev indfanget uden filter på 1 x 1 binning for hvert tidspunkt. Excitation af GFP udnyttede en xenon multispektralt lyskilde. Dyr blev holdt under anæstesi under hele den billeddannende proces ved at forbinde anæstesiapparatet til en gas anæstesi manifold integreret i det mørke kammer i billeddannende system.
   1. Bedøver dyret som skitseret i 1.5.2. En anæstesi maske er i det indre af den kommercielle billeddannende system mørke kammer for at holde dyret under bedøvelse under billeddannelsebehandle.
   2. Opsæt de korrekte excitation og emission filtre.
   3. Begynd ved at opnå en indledende billede ved hjælp af hvidt lys alene. Holde den samme position af dyret under hele imaging session og skifte til GFP filtre til at tage et andet billede.
   4. For de bedste resultater oven begge billeder. Analyser billedet for fluorescerende område og intensitet.

Representative Results

Denne metode beskriver en kirurgisk ortotopisk implantation af fluorescerende humane bugspytkirtelkræftceller med fokus på forberedelsen af cellen suspension til injektion, ordentlig anæstesi for gnavere, levering cellesuspension via laparotomi, og brugen af fluorescerende in vivo lille dyr billeddannelse. Påvisningen af et grønt fluorescenssignal (GFP signal) mellem to og tre uger efter implantation, giver forskere et visuelt signal for at bekræfte tilstedeværelsen af en udvikling bugspytkirtelkræft tumor (figur 1). Figur 1 består af tre billeder af en mus med PANC-1 GFP fluorescerende tumor. Det første er taget under hvidt lys (figur 1A); det andet billede er taget under blå fluorescerende lys (excitation: 455 - 495 nm; emission: 513-557 nm) til at afbilde grøn fluorescens udsendt fra PANC-1 pancreatisk tumor (figur 1B); den tredje er en sammensætning afde to første og viser placeringen af tumoren i kroppen af musen (fig 1C). Dyr, som ikke udvikler tumorer ikke viser GFP signal (figur 2). Endvidere kan repræsentative billeder af tumorprogression over tid være ikke-invasivt overvåget ved at registrere GFP signal på forskellige tidspunkter (figur 3). Figur 3 viser flere kompositter af GFP signaler over tid. Som tiden skrider frem, og tumorstørrelsen stiger, GFP signal øges. Tyve dage efter implantationen, vises tumor som en lille grøn prik, og 50 dage efter implantation, tumorstørrelsen stiger betydeligt. Figur 4A viser metastaser til milten, leveren og mave-tarmkanalen, hvilket kan bekræftes efter at dyret har været aflivet og organerne fjernes til ex vivo fluorescerende billeddannelse (figur 4B).

Figur 1: Fluorescent Imaging of ortotopisk pankreastumor Balb / c nøgen mus blev bedøvet med isofluran og en serie billeder blev opnået under anvendelse af et fluorescerende in vivo imaging system:. (A) Billedet blev opnået med hvidt lys og ingen filter (B). Billede blev opnået ved hjælp af blåt lys og specifikke filtre til GFP. (C) et sammensat billede af a og B. klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2: Implantation fejlfinding, Manglende Fluorescence Repræsentation af en mus i en tid, hvor tumoren endnu ikke havde udviklet:. (A) Billedet blev opnået medhvidt lys og noget filter. (B) billede blev opnået ved hjælp af blåt lys og specifikke filtre til GFP. (C) Et sammensat billede af A og B. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3: In vivo Real Time Fluorescent Imaging til Track Primær tumorvækst. In vivo billeddannelse af PANC-1 GFP bugspytkirtelkræft progression på forskellige tidspunkter efter implantation. Klik her for at se en større version af dette tal.

4:. Bevis for metastaser (A) En mus under anæstesi med metastatiske tumorer; og (B) dets primære tumor og metastaser ex vivo 100 dage efter implantation. Tyk pil viser primær tumor, og tynde pile angiver metastatiske tumorer. Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Vi beskriver en orthotopisk murin model af pancreascancer, der udtrykker GFP, hvilket således tillader ikke-invasiv overvågning af tumorvækst under anvendelse af hele kroppen in vivo fluorescerende billeddannelse (figur 1). Denne teknik gør det muligt at overvåge tumorudvikling i realtid (figur 3); det kan være et vigtigt redskab for forskerne at studere den terapeutiske virkning af nye midler mod kræft i bugspytkirtlen. Et andet vigtigt aspekt af denne model er, at GFP-fluorescens tilvejebringer et visuelt signal indikerer vellykket implantation og vækst af pancreascancer; som ellers ville være vanskeligt at måle med levende dyr. Overensstemmelse med den kliniske omgivelser, denne model giver et indblik på metastase. Det viser metastase til de omgivende organer: milt, mesenteriske lymfeknuder, lever og mave-tarmkanalen (figur 4). Vi observerede metastaser så tidligt som 7 uger efter transplantation. PANC-1 metastaser har været reported i intervallet 10 - 18 uge ^11. Det tidspunkt, hvor der observeres metastase kan afhænge af antallet af implanterede celler, implantation og visualiseringsteknikker. I den aktuelle undersøgelse, valgte vi en grønt fluorescerende cellelinie, PANC-1 GFP, som er kommercielt tilgængelig. Den her beskrevne model er reproducerbar og metastaserne let kan visualiseres, fordi de har lyse fluorescens. En begrænsning af xenograft nude musemodeller fremstillet af etablerede cancercellelinier er muligheden for reduceret tumor heterogenitet i forhold til en original human tumor ^12; alligevel modellen er reproducerbar, let at udvikle og følge dets fremskridt med levende dyr. Desuden xenograft musemodeller fortsat anvendes bredt i kræftforskning.

De fluorescerende mærkede celler skal pelleteres og resuspenderes i iskold serumfrit medium blandet med tilsvarende volumen af iskold basalmembran ^8. Cellesuspensionen skal være maintained på is hele tiden for at forhindre gelering eller størkning. Det er vigtigt at indlæse sprøjter med en 18 gauge nål for at undgå lyse af cellerne. Hvis cellerne lyseres, er cellesuspensionen ubrugelig, og ingen tumorvækst vil blive nået (figur 2). Umiddelbart efter injektion, tillad ca. 10 sek til cellesuspensionen at størkne før fjernelse af nålen fra injektionsstedet. Størkningen egenskaber af suspensionen tilladt os at injicere cellerne uden lækage fra injektionsstedet. Udsivning af celler kan føre til metastase som en artefakt snarere end fra formidling celle. Vi har optimeret denne ortotopisk implantation af PANC-1 GFP cellelinje med 3 x 10 ⁶ celler pr 50 pi injektion; andre cellelinie implantationer skal bestemmes empirisk. Større mængder af injektion op til 100 pi indeholdende 500.000 celler er blevet rapporteret i litteraturen ^12. De vigtigste parametre optimering taken i betragtning lykkedes ortotopisk tumorvækst og positiv tumor billedbehandling via GFP-fluorescens inden for tre uger efter implantation.

Vækst og udvikling tumor er ikke kun påvirkes af antallet af injicerede celler, men også i en alder af anvendte mus. Vi har anvendt athymiske nøgne mus og konstateret, at anvendelse af unge mus i alderen 6 til 8 uger giver mere reproducerbare resultater sammenlignet med ældre mus. Da disse mus alder, begynder de at genvinde en vis immunitet, som kan resultere i afvisning af de humane pancreasceller. De billeddannende teknikker beskrevet her, er ikke begrænset til ortotopisk brug; de kan også anvendes til heterotopisk implantering af tumorer. Der skal udvises forsigtighed for at undgå auto-fluorescens, som kan skjule tumoren GFP-signalet. Visse plastmaterialer anvendes til anæstesi slanger kan producere auto-fluorescerende artefakter.

Fluorescerende hele kroppen imaging muliggør hurtig analyse af tumorvækst og progression ¹³. En stor fordel ved anvendelse af fluorescens er evnen til at spore kræft uden de traditionelle besværlige procedurer for histopatologisk undersøgelse eller immunhistokemi ^14. Denne model har lyse fluorescens og muliggør erhvervelse billede uden brug af hudlapper eller andre manipulationer. Fluorescens afviger fra bioluminescens ved, at den ikke skaber lys baseret på en kemisk reaktion; det simpelthen absorberer lys og reemits det ved en lavere frekvens. Ortotopisk xenograftmodeller give uvurderlig viden om og forståelse af pancreas tumor biologi, som kan oversættes til nye terapier til human brug.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI media 1640	Caisson Labs	RPL03-500ML
Fetal Bovine Serum	Gibco	10437-077
Penicillin Streptomycin	Thermo Ficher Sci	15140-122
Matrigel HC basement membrane, high concentration	Corning	354248
SutureVet PGA 6-0 PGA	Henry Schein	39010
Alcare or Foamed Antiseptic Handrub	Steris	639680
DPBS (Dubelcco's Phosphate-Buffered saline)	Thermo Ficher Sci	21300025
TB Syringe 27 G 1/2	Becton Dickinson	305620
Isoflurane	Blutler Schein	50562
Ketoprofen	Fort Dodge Animal Health
Surgical Scissors, 5.5" straight mayo	Henry Schein	22-1600
PANC-1 GFP cell line	Anticancer, Inc
Small Animal Imaging System: iBox Scientia	UVP, LLC. Upland, CA.		Small Animal Imaging System to observe the fluorescent tumor in live animals