Abstract
Le cancer du pancréas reste l'un des cancers pour lesquels la survie n'a pas sensiblement améliorées au cours des dernières décennies. Seulement 7% des patients diagnostiqués va survivre plus de cinq ans. Afin de comprendre et imiter le microenvironnement des tumeurs pancréatiques, nous avons utilisé un modèle murin orthotopique du cancer du pancréas qui permet l'imagerie non-invasive de la progression tumorale en temps réel. Les cellules cancéreuses pancréatiques exprimant la protéine fluorescente verte (GFP PANC-1) ont été suspendues en sous - sol matrice de la membrane, une concentration élevée, (par exemple, Matrigel HC) avec des milieux sans sérum, puis injectées dans la queue du pancréas par laparotomie. La suspension de cellules dans la matrice de membrane basale à haute concentration devient une substance analogue à un gel une fois qu'il atteint la température ambiante; Par conséquent, il se gélifie quand il entre en contact avec le pancréas, ce qui crée un joint d'étanchéité au niveau du site d'injection et d'empêcher toute fuite de la cellule. La croissance des tumeurs et des métastases dans d'autres organes sont surveillés en temps réelles animaux en utilisant la fluorescence. Il est essentiel d'utiliser les filtres appropriés pour l'excitation et l'émission de la GFP. Les étapes de l'implantation orthotopique sont détaillées dans cet article afin que les chercheurs peuvent facilement répliquer la procédure chez la souris nude. Les principales étapes de ce protocole sont la préparation de la suspension cellulaire, l' implantation chirurgicale, et toute fluorescente du corps dans l' imagerie in vivo. Ce modèle orthotopique est conçu pour évaluer l'efficacité de nouveaux traitements sur les tumeurs primaires et métastatiques.
Introduction
Le cancer du pancréas est diagnostiqué avec une fréquence accrue par rapport à d' autres cancers et est le 4 e principale cause de décès liés au cancer aux Etats-Unis. A partir du moment du diagnostic, plus de 90% des patients meurent dans les cinq ans 1,2. Actuellement, l' ablation chirurgicale de la tumeur est le seul remède pour le cancer du pancréas, mais moins de 20% des patients sont admissibles à subir une intervention chirurgicale principalement parce que , au moment du diagnostic de la maladie est à un stade avancé et a métastasé 3,4. L'absence de symptômes spécifiques rend le cancer du pancréas une maladie silencieuse; certains des symptômes comprennent des douleurs abdominales, maux de dos, perte d'appétit, la jaunisse et des nausées; qui peut être facilement interprété comme maladies digestives communes 4. Pour cette raison, il est important de développer de nouveaux outils pharmacologiques pour faciliter le diagnostic et le traitement du cancer du pancréas.
L'utilisation de modèles animaux nous permet de comprendre la biologie de pancrecancer atique et donne un aperçu de l'application de ces connaissances à l'homme. Des modèles de xénogreffes orthotopiques du cancer du pancréas sont réalistes, parce que les tumeurs se développent dans l'organe 5 d'origine. Contrairement aux modèles hétérotopiques où des lignées cellulaires ou des fragments de tumeur sont implantés par voie sous- cutanée, la modélisation orthotopique permet la reconstitution du microenvironnement tumoral et imite l'interaction des cellules tumorales avec son environnement 6. Le modèle de xénogreffe de tumeurs décrit ici dérive de la lignée cellulaire pancréatique cancéreuses humaines PANC-1 GFP, qui est génétiquement modifiée pour exprimer la protéine fluorescente verte (GFP). La détection de la GFP permet une imagerie et de suivi de la croissance tumorale et les métastases 7 non invasive. Le développement de la tumeur se produit rapidement, spontanément, et ressemble étroitement à celui des tumeurs primaires de patients atteints de cancer du pancréas humains 8. modèles orthotopiques fournissent une prédiction plus précise de l'efficacité des médicaments en réponse à des agents thérapeutiques, tout enmimant le microenvironnement tumoral.
Comme il est mentionné ci-dessus, ce modèle animal permet la détection par fluorescence de la croissance tumorale et les métastases en temps réel. détection fluorescente permet une imagerie plus direct / live par rapport à luminescence. Avec la fluorescence de la lumière émise est le résultat d'une excitation par une lumière d'une longueur d'onde plus courte; tandis que la luminescence, la lumière émise est le résultat d'une réaction chimique et peut ne pas avoir une forte émission 9. Par ailleurs, le corps entier dans l' imagerie par fluorescence in vivo ne nuise pas à l'animal et permet aux chercheurs de surveiller la croissance de la tumeur au fil du temps en réponse à des traitements thérapeutiques.
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Protocol
Le protocole décrit ci-dessous est exécuté sous la direction et l'approbation du Comité des soins et de l'utilisation des animaux de l'Université Western. Toutes les expériences sont réalisées en conformité avec toutes les directives pertinentes, la réglementation et les organismes de réglementation.
1. Culture cellulaire
- Préparation de Milieu Complet
- L'utilisation d'une enceinte de sécurité biologique de classe II, préparer un milieu complet en ajoutant aseptiquement sérum fœtal bovin (FBS) et de la pénicilline streptomycine (P / S) à une bouteille de milieu RPMI 500 ml. Mélanger doucement par tourbillonnement. La concentration finale de chaque supplément est de 10% de FBS et 1% P / S (v / v). Par exemple, compléter 500 ml de milieu avec 56 ml de FBS et 6 ml P / S.
- Placez un milieu complet dans un bain d'eau à 37 ° C.
- Dégel et cellules de multiplication
- Récupérer les cellules PANC-1 GFP de l'azote liquide. Décongeler le flacon par agitation douce dans un bain d'eau à 37 ° C.
Remarque:Dégel doit être rapide (environ 2 - 3 min). - Étiquette T-75 flacons à utiliser avec (a) le nom de lignée cellulaire, (b) le numéro de passage, (c) la date et ses initiales (d) chercheur.
- Essuyez le flacon avec 70% d'éthanol et le transfert du flacon à une enceinte de sécurité biologique.
- Pour propager les cellules, ajouter 9,0 ml de milieu complet dans un tube de 15 ml conique. 1,0 ml à l'aide d'une pipette, transférer soigneusement la suspension de cellules et mettre en suspension dans 9 ml de milieu complet.
- Centrifuger à 125 g pendant 8 min à température ambiante. Transférer le flacon conique à une enceinte de sécurité biologique et aspirer le surnageant sans perturber le culot.
- Suspendre le culot dans 10 ml de milieu complet frais par pipetage doucement la suspension de haut en bas.
- Compter les cellules avec un hémocytomètre et la plaque dans les flacons T-75 à une densité de 2,1 x 10 6 cellules / flacon. Placer ballon dans un incubateur à 37 ° C et 5% de CO 2.
- Surveiller les cellules quotidiennement à l'oeil nu et au microscope. Si la grippeid renouvellement est nécessaire, de manière aseptique Aspirer le milieu de croissance complet du flacon et le jeter. Ajouter un volume égal de milieu complet frais.
- Récupérer les cellules PANC-1 GFP de l'azote liquide. Décongeler le flacon par agitation douce dans un bain d'eau à 37 ° C.
- Propager cellules
- retirer aseptique moyen du ballon. Ajouter 5 ml de tampon phosphate solution saline de Dulbecco (DPBS) pour rincer les cellules et les jeter.
- Détacher les cellules du flacon en ajoutant 3 ml de trypsine à 0,25%. Incuber flacon contenant de la trypsine à 37 ° C et 5% de CO 2 pendant 5 à 10 min.
- Observer les cellules au microscope (grossissement 10X) et veiller à ce qu'ils sont ronds et délogé.
- Neutraliser la trypsine en ajoutant un volume égal de milieu complet et de briser les mottes en pipetant doucement monter et descendre.
- Compter les cellules en utilisant un hémocytomètre et transférer le volume de la suspension cellulaire appropriée pour les nouveaux flacons à la densité cellulaire mentionnée dans 1.2.7; ajouter suffisamment de milieu frais de sorte que le volume final est de 10 ml par flacon.
- Suspens cellulairesPréparation pour injection d'ions
Remarque: La matrice de la membrane basale, une forte concentration, se solidifie à température ambiante, garder tous les matériaux sur la glace. Placez tous les conseils et les flacons de pipettes stériles dans le congélateur pendant une nuit, et garder sur la glace tout en travaillant sur la suspension.- Gardez une bouteille de RPMI médias sans aucun additif sur la glace. Décongeler la matrice de la membrane basale, une forte concentration, en suivant les instructions du fabricant. De préférence, aliquote en petits flacons pour éviter de multiples cycles de gel-dégel 10.
- Aspirer le milieu de tous les flacons, et rincer avec 5 ml de DPBS. Répétez toutes les étapes de la section précédente jusqu'à l'étape 1.3.4.
- Transférer le contenu dans un tube conique de 15 ml et on centrifuge à 125 g pendant 8 min à température ambiante. Transférer flacon conique enceinte de sécurité biologique et remettre en suspension à granulés en utilisant 10 ml de DPBS.
- pipeter doucement la suspension de haut en bas pour briser le culot. Compter les cellules en utilisant un hémocytomètre.
- Centrifuger à nouveau comme indiqué dans sTep 1.4.3. Aspirer le surnageant et en fonction du nombre de cellules, ajouter un diluant approprié pour donner 3 x 10 6 cellules dans un volume de 50 ul. Le diluant sera un mélange de milieu sans sérum et une forte concentration membranaire de matrice basale en 1 (v / v) rapport 1.
- Vortex la suspension doucement et garder sur la glace en tout temps. La suspension est maintenant prête pour l'injection.
- Implantation chirurgicale
Remarque: Veiller à ce que tous les matériaux et instruments chirurgicaux sont stériles. Pratiquer des techniques aseptiques en tout temps.- Placez un coussin chauffant sur la table et couvrir d'un drap stérile. Mettre en place l'appareil d'anesthésie et de veiller à toutes les fournitures sont à portée de main.
- Placez le museau de l'animal dans le masque d'anesthésie et de mettre en place l'anesthésie à 1 L / min d'oxygène et 2,5% d'isoflurane.
- Frottez doucement le flanc de l'animal avec de l'iode, et rincer à l'éthanol à 70%. Répétez trois fois.
- Confirmer leanimal est complètement anesthésié par pincement de la patte arrière. L'animal est entièrement anesthésié et prêt pour la chirurgie si aucune réponse est observée. Toutefois, si l'animal sursaute, assurer qu'il ya une anesthésie suffisante dans le vaporisateur et laisser l'animal plus de temps pour aller complètement sous anesthésie.
- Charge d'environ 200 pi de la suspension cellulaire dans une seringue de 1,0 ml de TB avec une aiguille 18 G (préalablement refroidi). Remplacer l'aiguille avec une aiguille 27 G et revenir à la glace jusqu'à utilisation.
- Localisez la zone générale de la rate (quadrant supérieur gauche de l'abdomen) et en utilisant une pince pincer la peau au-dessus de cette région. Avec des ciseaux chirurgicaux faire une incision d'environ 1,0 cm pour créer une poche. De même, pincer le muscle lisse sur le dessus de la rate et couper à travers afin d'accéder à la cavité péritonéale.
- saisir délicatement l'extrémité caudale de la rate et le tirer hors du corps. Le pancréas est attaché à la rate. Étaler le pancréas en utilisant un st humideerile Q-tip et de localiser la queue du pancréas.
- Livrer l'injection de 50 pi dans la queue du pancréas, laissez l'aiguille à l'intérieur pendant 10 secondes et tourner lentement l'aiguille du pancréas. Une implantation réussie va ressembler une bulle superficielle sans fuite.
- Retour du pancréas et de la rate à la cavité péritonéale. Tout d'abord joindre le muscle, puis enfermer la peau séparément. Utilisez une suture 6-0 ou une agrafe pour fermer l'incision. Pour éviter la douleur chez l'animal, administrer kétoprofène sous-cutanée (SC) (5 mg / kg) sur 24 heures. Alternativement, administrer buprénorphine sc (0,05 à 0,1 mg / kg) toutes les 12 heures sur une période de 36 h.
- Récupérer l'animal de l'anesthésie et le retourner à sa cage. Surveillez également la douleur. Les animaux doivent être munis de soulagement de la douleur au moment de (ou même avant - préemptive) chirurgie. soulagement de la douleur supplémentaire doit être fournie aux animaux qui éprouvent de la douleur selon IACCUC protocole ou tel que prescrit par le autendant vétérinaire ou la personne désignée.
- Dans l' imagerie in vivo
Remarque: la capture d'image a été effectuée en utilisant un système d'imagerie commercial équipé d'une chambre noire et les filtres appropriés pour l'imagerie de la GFP. L'acquisition des images a été effectuée en utilisant une caméra CCD et un système optique composé de lentilles interchangeables d'excitation / d'émission (excitation: 455-495 nm; émission: 513-557 nm). images de champ lumineux ont été capturés sans filtre à 1 x 1 binning pour chaque point de temps. Excitation de la GFP utilisé une source au xénon de lumière multispectrale. Les animaux ont été maintenus sous une anesthésie tout au long du processus d'imagerie en connectant l'appareil d'anesthésie à un collecteur de gaz d'anesthésie intégrée dans la chambre sombre du système d'imagerie.- Anesthetize l'animal tel que décrit dans 1.5.2. Un masque d'anesthésie est à l'intérieur de la chambre noire du système d'imagerie commerciale afin de maintenir l'animal sous anesthésie au cours de l'imagerieprocessus.
- Mettre en place les filtres d'excitation et d'émission corrects.
- Commencez par l'obtention d'une image initiale à l'aide de la lumière blanche seulement. Gardez la même position de l'animal tout au long de la session d'imagerie et de passer à des filtres de GFP pour prendre une seconde image.
- Pour de meilleurs résultats superposer les deux images. Analyser l'image pour la zone et l'intensité de fluorescence.
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Representative Results
Cette méthode décrit une implantation chirurgicale orthotopique de cellules fluorescentes cancéreuses pancréatiques humaines, en mettant l' accent sur la préparation de la suspension cellulaire pour l' injection, l' anesthésie appropriée pour les rongeurs, la livraison de la suspension cellulaire par laparotomie, et l'utilisation de fluorescence in vivo l' imagerie du petit animal. La détection d'un signal vert de fluorescence (signal GFP) entre deux et trois semaines après l'implantation, permet aux chercheurs un repère visuel pour confirmer la présence d'une tumeur du cancer du pancréas en développement (Figure 1). La figure 1 se compose de trois images d'une souris avec PANC-1 GFP de la tumeur fluorescente. La première est prise sous une lumière blanche (figure 1A); la seconde image est prise sous la lumière bleue fluorescente (excitation: 455-495 nm; émission: 513-557 nm) à l' image de la fluorescence verte émise par le PANC-1 tumeur pancréatique (figure 1B); le troisième est un composite deles deux premiers et montre la localisation de la tumeur dans le corps de la souris (figure 1C). Les animaux qui ne développent pas de tumeurs ne présentent pas de signal de la GFP (Figure 2). En outre, des images représentatives de la progression de la tumeur au fil du temps peut être contrôlée de façon non invasive, en enregistrant le signal de la GFP à différents points dans le temps (figure 3). La figure 3 montre plusieurs signaux composites de GFP au cours du temps. Comme le temps progresse et la taille tumeur augmente, le signal GFP augmente. Vingt jours après l'implantation de la tumeur apparaît sous la forme d' un petit point vert, et 50 jours après l' implantation, la taille de la tumeur augmente de manière significative. La figure 4A montre des métastases à la rate, le foie et le tractus gastro - intestinal, qui peut être confirmée après que l'animal a été euthanasiés et les organes sont prélevés ex vivo pour l' imagerie de fluorescence (figure 4B).
Figure 2: Implantation Dépannage, Manque de Fluorescence Représentation d'une souris à un moment où la tumeur n'a pas encore mis au point:. (A) L' image a été obtenue aveclumière blanche et sans filtre. (B) image a été obtenue en utilisant la lumière bleue et des filtres spécifiques pour la GFP. (C) Une image composite de A et B. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3: In vivo en temps réel Fluorescent Imaging pour suivre la croissance de la tumeur primaire. Dans l' imagerie in vivo de PANC-1 GFP la progression du cancer du pancréas à divers points de temps après l'implantation. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Nous décrivons un modèle murin orthotopique de cancer du pancréas qui exprime la GFP, permettant ainsi une surveillance non invasive de la croissance tumorale en utilisant corps in vivo , l' imagerie de fluorescence (figure 1). Cette technique nous permet de suivre l'évolution de la tumeur en temps réel (Figure 3); il peut être un outil important pour les chercheurs d'étudier l'efficacité thérapeutique des nouveaux agents contre le cancer du pancréas. Un autre aspect important de ce modèle est que la fluorescence de la GFP fournit un repère visuel indiquant l'implantation et la croissance du cancer du pancréas réussi; qui serait autrement difficile à évaluer chez des animaux vivants. Conformément à la clinique, ce modèle donne un aperçu sur les métastases. Elle montre des métastases dans les organes environnants: rate, ganglions lymphatiques mésentériques, le foie et le tractus gastro - intestinal (figure 4). Nous avons observé des métastases dès 7 semaines après la transplantation. PANC-1 métastases ont été repdans la gamme signalés auparavant de 10 - 18 semaines 11. Le moment auquel on observe des métastases peut dépendre du nombre de cellules implantées, l'implantation et des techniques de visualisation. Dans l'étude actuelle, nous avons choisi une ligne verte fluorescente cellulaire, PANC-1 GFP, qui est disponible dans le commerce. Le modèle décrit ici est reproductible et les métastases peuvent être facilement visualisés car ils ont une fluorescence brillante. Une limitation des modèles murins de xénogreffes nue produite à partir de lignées de cellules cancéreuses établies est la possibilité de l' hétérogénéité tumorale réduite par rapport à une tumeur humaine d' origine 12; néanmoins le modèle est reproductible, facile à développer et suivre ses progrès dans les animaux vivants. En outre, des modèles de souris xénogreffes continuent à être largement utilisé dans la recherche sur le cancer.
Les cellules marquées par fluorescence doivent être transformés en pastilles et remises en suspension dans un milieu sans sérum froid glace mélangée avec un volume égal de la membrane basale glacée 8. La suspension cellulaire doit être maintained sur la glace en tout temps pour empêcher la gélification ou de solidification. Il est important de charger la seringue avec une aiguille de calibre 18 afin d'éviter la lyse des cellules. Si les cellules sont lysées, la suspension cellulaire est rendue inutile, et aucune croissance de la tumeur sera atteinte (figure 2). Immédiatement après l'injection, laisser environ 10 secondes pour la suspension cellulaire se solidifier avant de retirer l'aiguille du site d'injection. Les propriétés de solidification de la suspension nous a permis d'injecter les cellules sans fuite à partir du site d'injection. Fuites des cellules peut conduire à des métastases comme un artefact plutôt que de la diffusion cellulaire. Nous avons optimisé cette implantation orthotopique de PANC-1 lignée cellulaire de GFP en utilisant 3 x 10 6 cellules par 50 ul d' injection; d'autres implantations de lignées cellulaires doivent être déterminées de manière empirique. Des volumes plus élevés d'injection jusqu'à 100 pi contenant 500.000 cellules ont été rapportés dans la littérature 12. Les principaux paramètres d'optimisation taken en compte étaient la croissance de la tumeur orthotopique réussie et l'imagerie des tumeurs positives par fluorescence de la GFP dans les trois semaines après l'implantation.
La croissance tumorale et le développement sont affectées non seulement par le nombre de cellules injectées, mais aussi par l'âge des souris utilisées. Nous avons utilisé des souris nude athymiques et déterminé que l'utilisation de jeunes souris entre les âges de 6 à 8 semaines donne des résultats plus reproductibles par rapport à des souris âgées. Comme ces souris âge, ils commencent à retrouver une certaine immunité qui peut entraîner le rejet des cellules pancréatiques humaines. Les techniques d'imagerie décrits ici ne sont pas limités à une utilisation orthotopique; ils peuvent également être utilisés pour l'implantation ectopique de tumeurs. Des précautions doivent être prises pour éviter l'auto-fluorescence qui peuvent obscurcir le signal de la GFP de la tumeur. Certains plastiques utilisés pour les tubes d'anesthésie peuvent produire des artefacts d'auto-fluorescent.
Fluorescent imagerie du corps entier permet une analyse rapide de la croissance et la progression tumorale 13. Un avantage majeur de l' utilisation de fluorescence est la possibilité de suivre le cancer sans la lourdeur des procédures traditionnelles d'examen ou d' immunohistochimie 14 histopathologique. Ce modèle a fluorescence lumineuse et permet l'acquisition d'images sans avoir besoin de lambeaux de peau ou d'autres manipulations. La fluorescence diffère de la bioluminescence en ce qu 'elle ne crée pas de lumière sur la base d'une réaction chimique; il absorbe tout simplement la lumière et la réémet à une fréquence inférieure. des modèles de xénogreffes orthotopique fournissent des connaissances et de la compréhension de la biologie de la tumeur du pancréas qui peut être traduit en nouvelles thérapies pour usage humain inestimable.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à dévoiler.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI media 1640 | Caisson Labs | RPL03-500ML | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10437-077 | |
| Penicillin Streptomycin | Thermo Ficher Sci | 15140-122 | |
| Matrigel HC basement membrane, high concentration | Corning | 354248 | |
| SutureVet PGA 6-0 PGA | Henry Schein | 39010 | |
| Alcare or Foamed Antiseptic Handrub | Steris | 639680 | |
| DPBS (Dubelcco's Phosphate-Buffered saline) | Thermo Ficher Sci | 21300025 | |
| TB Syringe 27 G 1/2 | Becton Dickinson | 305620 | |
| Isoflurane | Blutler Schein | 50562 | |
| Ketoprofen | Fort Dodge Animal Health | ||
| Surgical Scissors, 5.5" straight mayo | Henry Schein | 22-1600 | |
| PANC-1 GFP cell line | Anticancer, Inc | ||
| Small Animal Imaging System: iBox Scientia | UVP, LLC. Upland, CA. | Small Animal Imaging System to observe the fluorescent tumor in live animals |
References
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