Abstract
अग्नाशय के कैंसर के कैंसर के लिए जो अस्तित्व के पिछले कुछ दशकों में काफी हद तक सुधार नहीं हुआ है की बनी हुई है। केवल निदान रोगियों के 7% पांच साल से अधिक समय बच जाएगा। आदेश में समझने और अग्नाशय के ट्यूमर का microenvironment नकल करने में, हम अग्नाशय के कैंसर के एक murine मॉडल ओर्थोटोपिक वास्तविक समय में ट्यूमर प्रगति के गैर इनवेसिव इमेजिंग की अनुमति देता है कि उपयोग किया। हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (Panc-1 GFP) व्यक्त अग्नाशय के कैंसर की कोशिकाओं तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स, उच्च एकाग्रता, (जैसे, Matrigel एचसी) सीरम मुक्त मीडिया के साथ और फिर laparotomy के माध्यम से अग्न्याशय की पूंछ में इंजेक्शन में निलंबित कर दिया गया था। उच्च एकाग्रता तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स में सेल निलंबन एक जेल की तरह पदार्थ एक बार यह कमरे के तापमान तक पहुँच बन जाता है; इसलिए, यह जैल जब यह अग्न्याशय के साथ संपर्क में आता है, इंजेक्शन स्थल पर एक मुहर बनाने और किसी भी सेल रिसाव को रोकने। ट्यूमर के विकास और अन्य अंगों को मेटास्टेसिस लाइव में निगरानी कर रहे हैंप्रतिदीप्ति का उपयोग करके जानवरों। यह उत्तेजना और GFP के उत्सर्जन के लिए उपयुक्त फिल्टर का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है। ओर्थोटोपिक आरोपण के लिए कदम इस लेख में विस्तृत कर रहे हैं ताकि शोधकर्ताओं आसानी से नग्न चूहों में प्रक्रिया को दोहराने कर सकते हैं। इस प्रोटोकॉल के मुख्य कदम vivo इमेजिंग में सेल निलंबन की तैयारी, शल्य आरोपण, और पूरे शरीर फ्लोरोसेंट हैं। इस ओर्थोटोपिक मॉडल प्राथमिक और metastatic ट्यूमर पर उपन्यास चिकित्सा की प्रभावकारिता की जांच करने के लिए बनाया गया है।
Introduction
अग्नाशय के कैंसर अन्य कैंसर की तुलना में वृद्धि की आवृत्ति के साथ का निदान और संयुक्त राज्य अमेरिका में कैंसर से संबंधित मौतों के 4 वें प्रमुख कारण है। निदान के समय से, रोगियों के 90% से अधिक पांच साल के भीतर 1,2 मर जाते हैं। वर्तमान में, शल्य चिकित्सा ट्यूमर को हटाने अग्नाशय के कैंसर के लिए ही इलाज है, लेकिन रोगियों के 20% से कम है, क्योंकि निदान के समय रोग अग्रिम चरण में है और 3,4 metastasized है पर मुख्य रूप से सर्जरी से गुजरना करने के पात्र हैं। विशिष्ट लक्षणों की कमी अग्नाशय के कैंसर के एक खामोश बीमारी बनाता है; लक्षणों में से कुछ पेट दर्द, पीठ दर्द, भूख न लगना, पीलिया और मतली के नुकसान शामिल हैं; जो आसानी से आम पाचन बीमारियों 4 के रूप में व्याख्या की जा सकती है। इस कारण से, यह निदान और अग्नाशय के कैंसर के उपचार में सहायता करने के लिए नए औषधीय उपकरण विकसित करने के लिए महत्वपूर्ण है।
पशु मॉडल का उपयोग pancre के जीव विज्ञान को समझने के लिए हमें की अनुमति देता हैatic कैंसर और मनुष्य के लिए इस ज्ञान को लागू करने में एक अंतर्दृष्टि प्रदान करता है। क्योंकि ट्यूमर मूल 5 के अंग में बढ़ने अग्नाशय के कैंसर के Xenograft ओर्थोटोपिक मॉडल, यथार्थवादी हैं। Heterotopic मॉडल, जहां सेल लाइनों या ट्यूमर के टुकड़े subcutaneously प्रत्यारोपित कर रहे हैं के विपरीत, ओर्थोटोपिक मॉडलिंग उसके आसपास 6 के साथ ट्यूमर microenvironment और mimics ट्यूमर कोशिकाओं की बातचीत के मनोरंजन के लिए अनुमति देता है। जेनोग्राफ्ट मॉडल यहाँ वर्णित मानव अग्नाशय के कैंसर कोशिका लाइन Panc-1 GFP, जो आनुवांशिक रूप से हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) को व्यक्त करने के लिए इंजीनियर से ट्यूमर निकला है। GFP का पता लगाने के लिए एक गैर इनवेसिव इमेजिंग और ट्यूमर के विकास और मेटास्टेसिस 7 की निगरानी के लिए सक्षम बनाता है। ट्यूमर के विकास, तेजी से होता है अनायास, और बारीकी से मानव अग्नाशय के कैंसर के रोगियों 8 के प्राथमिक ट्यूमर की है कि जैसा दिखता है। Orthotopic मॉडल, चिकित्सीय एजेंट के जवाब में दवा की प्रभावकारिता के एक अधिक सटीक भविष्यवाणी प्रदान करते हुएट्यूमर microenvironment नकल उतार।
जैसा कि ऊपर कहा, इस पशु मॉडल ट्यूमर के विकास और वास्तविक समय में मेटास्टेसिस के फ्लोरोसेंट का पता लगाने के लिए अनुमति देता है। फ्लोरोसेंट का पता लगाने के लिए एक और अधिक प्रत्यक्ष / लाइव luminescence की तुलना में इमेजिंग के लिए अनुमति देता है। प्रतिदीप्ति साथ प्रकाश उत्सर्जित एक छोटी तरंग दैर्ध्य की एक और प्रकाश द्वारा एक उत्तेजना का परिणाम है; luminescence में, जबकि प्रकाश उत्सर्जित एक रासायनिक प्रतिक्रिया का परिणाम है और मजबूत उत्सर्जन 9 नहीं हो सकता है। इसके अलावा, विवो फ्लोरोसेंट इमेजिंग में पूरे शरीर को पशु के लिए हानिकारक नहीं है और शोधकर्ताओं चिकित्सीय उपचार के जवाब में समय के साथ ट्यूमर के विकास पर नजर रखने के लिए अनुमति देता है।
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Protocol
नीचे वर्णित प्रोटोकॉल मार्गदर्शन और पश्चिमी विश्वविद्यालय के पशु की देखभाल और उपयोग समिति के अनुमोदन के तहत मार डाला है। सभी प्रयोगों सभी प्रासंगिक दिशा निर्देशों, विनियमन और नियामक एजेंसियों के साथ अनुपालन में प्रदर्शन कर रहे हैं।
1. सेल संस्कृति
- पूरा मध्यम की तैयारी
- एक द्वितीय श्रेणी के जैविक सुरक्षा कैबिनेट का प्रयोग, aseptically RPMI माध्यम से एक 500 मिलीलीटर की बोतल के लिए भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) और पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन (पी / एस) जोड़कर पूरा मध्यम तैयार करते हैं। घूमता द्वारा धीरे मिलाएं। प्रत्येक पूरक के अंतिम एकाग्रता है 10% FBS और 1% पी / एस (वी / वी)। उदाहरण के लिए, 56 मिलीलीटर FBS और 6 मिलीग्राम पी / एस के साथ मीडिया की 500 मिलीलीटर के पूरक है।
- 37 डिग्री सेल्सियस पर एक पानी के स्नान में पूरा मध्यम रखें।
- विगलन और प्रचार कोशिकाओं
- तरल नाइट्रोजन से Panc-1 GFP कोशिकाओं निकालते हैं। 37 डिग्री सेल्सियस पर एक पानी के स्नान में कोमल आंदोलन के द्वारा शीशी पिघलना।
ध्यान दें:(- 3 मिनट के लगभग 2) विगलन तेजी से होना चाहिए। - लेबल टी 75 बोतल (क) सेल लाइन का नाम, (ख) बीतने संख्या, (ग) तिथि, और (घ) के शोधकर्ता के हस्ताक्षर के साथ इस्तेमाल किया जाएगा।
- एक जैव सुरक्षा कैबिनेट के लिए 70% इथेनॉल और हस्तांतरण शीशी के साथ शीशी साफ कर लें।
- कोशिकाओं का प्रचार करने के लिए, एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब पूरा माध्यम से 9.0 मिलीलीटर जोड़ें। एक 1.0 मिलीलीटर पिपेट का प्रयोग, ध्यान सेल निलंबन हस्तांतरण और पूरा मध्यम के 9 मिलीलीटर में यह रोक देते हैं।
- आरटी पर 8 मिनट के लिए 125 XG पर अपकेंद्रित्र। एक जैव सुरक्षा कैबिनेट को शंक्वाकार शीशी स्थानांतरण और गोली परेशान बिना सतह पर तैरनेवाला aspirate।
- धीरे निलंबन ऊपर और नीचे pipetting द्वारा ताजा पूरा माध्यम के 10 मिलीलीटर में गोली निलंबित।
- एक hemocytometer के साथ कोशिकाओं की गणना और 2.1 x 10 6 कोशिकाओं / कुप्पी के घनत्व पर टी 75 बोतल में उन्हें थाली। 37 डिग्री सेल्सियस पर एक मशीन में कुप्पी रखें और 5% सीओ 2।
- आंखों से और माइक्रोस्कोप के तहत दैनिक कोशिकाओं की निगरानी। अगर फ्लूआईडी नवीकरण की जरूरत है, aseptically कुप्पी से पूरा मध्यम विकास aspirate और त्यागें। ताजा पूरा माध्यम के बराबर मात्रा में जोड़ें।
- तरल नाइट्रोजन से Panc-1 GFP कोशिकाओं निकालते हैं। 37 डिग्री सेल्सियस पर एक पानी के स्नान में कोमल आंदोलन के द्वारा शीशी पिघलना।
- प्रकोष्ठों प्रचार
- Aseptically कुप्पी से मध्यम निकालें। Dulbecco फॉस्फेट बफर खारा (DPBS) के 5 मिलीलीटर कोशिकाओं कुल्ला और त्यागने में जोड़े।
- 0.25% trypsin के 3 मिलीलीटर जोड़कर कुप्पी से कोशिकाओं को अलग करें। 5 से 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर trypsin और 5% सीओ 2 युक्त कुप्पी सेते हैं।
- माइक्रोस्कोप (10X बढ़ाई) के तहत कोशिकाओं का निरीक्षण करें और सुनिश्चित करें कि वे गोल और उखाड़ फेंकना कर रहे हैं।
- पूरा मध्यम के एक बराबर मात्रा जोड़कर trypsin बेअसर और धीरे से ऊपर और नीचे pipetting द्वारा clumps को तोड़ने।
- एक hemocytometer का उपयोग कोशिकाओं की गणना और सेल 1.2.7 में उल्लेख घनत्व में नई बोतल के लिए उचित मात्रा सेल निलंबन स्थानांतरण; पर्याप्त ताजा मीडिया जोड़ें ताकि अंतिम मात्रा कुप्पी प्रति 10 मिलीलीटर है।
- सेल सस्पेंसइंजेक्शन के लिए आयन तैयारी
नोट: चूंकि तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स, उच्च एकाग्रता, आरटी पर solidifies, बर्फ पर सभी सामग्री रखने के लिए। सभी बाँझ पिपेट सुझावों और फ्रीजर में रात भर शीशियों प्लेस, और जबकि निलंबन पर काम कर बर्फ पर रहते हैं।- बर्फ पर किसी भी additives के बिना RPMI मीडिया की एक बोतल रखें। तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स, उच्च एकाग्रता, निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए गला लें। अधिमानतः, छोटे शीशियों में विभाज्य कई फ्रीज पिघलना चक्र 10 से बचने के लिए।
- सभी बोतल से महाप्राण मीडिया, और DPBS के 5 मिलीलीटर से कुल्ला। कदम के लिए ऊपर 1.3.4 पिछले भाग पर सभी चरणों को दोहराएँ।
- सामग्री आरटी पर 8 मिनट के लिए 125 XG पर एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब और अपकेंद्रित्र के लिए स्थानांतरण। जैव सुरक्षा कैबिनेट को शंक्वाकार शीशी स्थानांतरण और फिर से निलंबित DPBS के 10 मिलीलीटर का उपयोग कर गोली।
- धीरे निलंबन विंदुक ऊपर और नीचे गोली को तोड़ने के लिए। एक hemocytometer का उपयोग कोशिकाओं की गणना।
- फिर से के रूप में में उल्लिखित सेंट्रीफ्यूज1.4.3 TEP। महाप्राण सतह पर तैरनेवाला और कोशिकाओं की संख्या पर निर्भर करता है, 50 μl की मात्रा में 3 एक्स 10 6 कोशिकाओं उपज के उचित मंदक जोड़ें। 1 (वी / वी) अनुपात: मंदक एक 1 में सीरम स्वतंत्र मीडिया और उच्च एकाग्रता तहखाने मैट्रिक्स झिल्ली का एक मिश्रण होगा।
- निलंबन धीरे भंवर और हर समय बर्फ पर रहते हैं। निलंबन अब इंजेक्शन के लिए तैयार है।
- शल्य आरोपण
नोट: यह सुनिश्चित करें कि सभी शल्य चिकित्सा सामग्री और उपकरणों बाँझ कर रहे हैं। हर समय सड़न रोकनेवाला तकनीक का अभ्यास करें।- मेज पर एक हीटिंग पैड प्लेस और एक बाँझ कपड़ा के साथ कवर। संज्ञाहरण मशीन सेट करें और सुनिश्चित करें कि सभी आपूर्ति हाथ की पहुंच के भीतर हैं।
- पशु के थूथन संज्ञाहरण नकाब में रखें और 1 एल / मिनट ऑक्सीजन की और 2.5% isoflurane संज्ञाहरण की स्थापना की।
- धीरे आयोडीन के साथ जानवर की ओर से हाथ धोने, और 70% इथेनॉल के साथ कुल्ला। तीन बार दोहराएँ।
- पुष्टिजानवर पूरी तरह से हिंद पंजा pinching द्वारा anesthetized है। यदि कोई जवाब नहीं मनाया जाता है पशु शल्य चिकित्सा के लिए पूरी तरह से anesthetized और तैयार है। हालांकि, अगर पशु flinches, यह सुनिश्चित vaporizer में पर्याप्त संज्ञाहरण है और पशु संज्ञाहरण के तहत पूरी तरह से जाने के लिए और अधिक समय की अनुमति देते हैं।
- लोड लगभग एक 18 जी सुई के साथ एक 1.0 मिलीलीटर टीबी सिरिंज में सेल निलंबन के 200 μl (पहले ठंडा)। एक 27 जी सुई के साथ सुई की जगह है और उपयोग के लिए तैयार है जब तक बर्फ में लौटने।
- तिल्ली के सामान्य क्षेत्र (पेट के ऊपरी बाएँ चतुर्थ भाग) और संदंश का उपयोग उस क्षेत्र के शीर्ष पर त्वचा चुटकी। शल्य कैंची लगभग 1.0 सेमी की एक चीरा बनाने का उपयोग कर एक जेब बनाने के लिए। इसी तरह, तिल्ली के शीर्ष पर चिकनी मांसपेशियों चुटकी और पेरिटोनियल गुहा उपयोग करने के क्रम में के माध्यम से कटौती।
- धीरे तिल्ली की दुम अंत हड़पने के लिए और इसे शरीर से बाहर खींच। अग्न्याशय तिल्ली से जुड़ी होगी। अग्न्याशय एक गीला सेंट का उपयोग फैलerile क्यू की नोक और अग्न्याशय की पूंछ का पता लगाने।
- अग्न्याशय की पूंछ में 50 μl इंजेक्शन देने, 10 सेकंड के लिए अंदर सुई छोड़ दें और धीरे-धीरे अग्न्याशय से बाहर सुई घुमाएगी। एक सफल प्रत्यारोपण किसी भी लीक के बिना एक सतही बुलबुले की तरह दिखेगा।
- पेरिटोनियल गुहा को अग्न्याशय और तिल्ली लौटें। सबसे पहले पेशी लगा देना और फिर त्वचा अलग से लगा देना। चीरा बंद करने के लिए एक 6-0 सीवन या प्रधान का प्रयोग करें। जानवर में दर्द से बचने के लिए, प्रशासन ketoprofen subcutaneously (अनुसूचित जाति) (5 मिलीग्राम / किग्रा) 24 घंटा से अधिक। (- 0.1 मिलीग्राम / किलो 0.05) एक 36 मानव संसाधन की अवधि में हर 12 घंटे के वैकल्पिक रूप से, buprenorphine सुप्रीम कोर्ट प्रशासन।
- संज्ञाहरण से जानवर को ठीक करने और इसे अपने पिंजरे में लौटने। इसके अलावा दर्द के लिए निगरानी। सर्जरी - पशु (अग्रकय या यहां तक कि पहले) के समय में दर्द से राहत के साथ प्रदान की जानी चाहिए। अतिरिक्त दर्द से राहत जानवरों है कि IACCUC प्रोटोकॉल के अनुसार या के रूप में द्वारा निर्धारित दर्द का अनुभव करने के लिए प्रदान किया जाना चाहिएपशु चिकित्सक या designee प्रवृत्त।
- Vivo इमेजिंग में
नोट: छवि पर कब्जा एक अंधेरे कक्ष और GFP इमेजिंग के लिए उपयुक्त फिल्टर से लैस एक वाणिज्यिक इमेजिंग प्रणाली का उपयोग किया गया था। (: -;: 513 - 557 एनएम उत्सर्जन 495 एनएम 455 उत्तेजना) छवि अधिग्रहण एक सीसीडी कैमरा और एक ऑप्टिकल विनिमेय / उत्तेजना उत्सर्जन लेंस से मिलकर प्रणाली का उपयोग कर पूरा किया गया। उज्ज्वल क्षेत्र छवियों 1 एक्स 1 हर समय बिंदु के लिए binning पर एक फिल्टर के बिना कब्जा कर लिया गया। GFP की उत्तेजना एक क्सीनन multispectral प्रकाश स्रोत का उपयोग किया। पशु एक गैस संज्ञाहरण इमेजिंग प्रणाली के अंधेरे कक्ष में एकीकृत करने के लिए कई गुना संज्ञाहरण मशीन जोड़ने के द्वारा इमेजिंग प्रक्रिया के दौरान संज्ञाहरण के तहत बनाए रखा गया।- पशु anesthetize के रूप में 1.5.2 में उल्लिखित। एक संज्ञाहरण मुखौटा आदेश इमेजिंग के दौरान संज्ञाहरण के तहत पशु रखने के लिए वाणिज्यिक इमेजिंग सिस्टम के अंधेरे कक्ष के भीतरी इलाकों में हैप्रक्रिया।
- सही उत्तेजना और उत्सर्जन फिल्टर सेट करें।
- केवल सफेद रोशनी का उपयोग कर एक प्रारंभिक छवि प्राप्त करने के द्वारा शुरू करो। इमेजिंग सत्र के दौरान पशु की इसी स्थिति को बनाये रखने और GFP फिल्टर करने के लिए स्विच एक दूसरी छवि लेने के लिए।
- सबसे अच्छा परिणाम के लिए दोनों छवियों मिलाना। फ्लोरोसेंट क्षेत्र और तीव्रता के लिए छवि का विश्लेषण।
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Representative Results
इस विधि फ्लोरोसेंट मानव अग्नाशय के कैंसर की कोशिकाओं की एक शल्य ओर्थोटोपिक आरोपण का वर्णन है, इंजेक्शन, मूषक के लिए उचित संज्ञाहरण, laparotomy के माध्यम से सेल निलंबन के वितरण के लिए सेल निलंबन की तैयारी पर ध्यान केंद्रित है, और फ्लोरोसेंट इन विवो छोटे जानवर इमेजिंग का उपयोग करें। दो और तीन सप्ताह के बीच एक हरे रंग की रोशनी संकेत (GFP संकेत) के बाद आरोपण का पता लगाने, शोधकर्ताओं ने एक दृश्य संकेत एक विकासशील अग्नाशय के कैंसर के ट्यूमर (चित्रा 1) की उपस्थिति की पुष्टि करने के लिए प्रदान करता है। चित्रा 1 के साथ एक माउस के तीन छवियों के होते हैं Panc-1 GFP फ्लोरोसेंट ट्यूमर। पहले सफेद प्रकाश (चित्रा 1 ए) के तहत लिया जाता है; दूसरी छवि नीले फ्लोरोसेंट रोशनी के तहत लिया जाता है (उत्तेजना: 455 - 495 एनएम, उत्सर्जन: 513 - 557 एनएम) छवि के लिए हरी प्रतिदीप्ति Panc-1 अग्नाशय के ट्यूमर (चित्रा 1 बी) से उत्सर्जित; तीसरे की एक समग्र हैपहले दो और माउस (चित्रा 1 सी) के शरीर के भीतर ट्यूमर के स्थान से पता चलता है। पशु जो ट्यूमर GFP संकेत नहीं दिखा विकसित नहीं है (चित्रा 2)। इसके अलावा, समय के साथ ट्यूमर प्रगति की छवियों प्रतिनिधि गैर invasively नजर रखी, अलग अलग समय बिंदुओं (चित्रा 3) में GFP संकेत रिकॉर्डिंग से हो सकता है। चित्रा 3 समय के साथ GFP संकेतों के कई कंपोजिट पता चलता है। समय की प्रगति और ट्यूमर का आकार बढ़ता है, GFP संकेत बढ़ जाती है। बीस दिनों के आरोपण के बाद, ट्यूमर एक छोटे से हरे रंग की बिंदी के रूप में प्रकट होता है, और 50 दिनों के आरोपण के बाद, ट्यूमर का आकार काफी बढ़ जाती है। चित्रा -4 ए मेटास्टेसिस तिल्ली, जिगर, और जठरांत्र संबंधी मार्ग, जिसके बाद जानवर किया गया है इस बात की पुष्टि की जा सकती है को दर्शाता है euthanized और अंगों पूर्व vivo फ्लोरोसेंट इमेजिंग (चित्रा 4 बी) के लिए निकाल रहे हैं।
चित्रा 2: आरोपण समस्या निवारण, एक समय में एक माउस के प्रतिदीप्ति प्रतिनिधित्व जहां ट्यूमर अभी तक विकसित नहीं था का अभाव:। (ए) छवि के साथ प्राप्त किया गया थासफेद रोशनी और कोई फिल्टर। (बी) छवि नीली बत्ती और GFP के लिए विशेष फिल्टर का उपयोग (सी) ए ए और बी के समग्र छवि प्राप्त हुई थी। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3: विवो रीयल टाइम फ्लोरोसेंट इमेजिंग में प्राथमिक ट्यूमर के विकास को ट्रैक करने के लिए। विभिन्न समय बिंदुओं के बाद आरोपण पर Panc-1 GFP अग्नाशय कैंसर की प्रगति के vivo इमेजिंग में। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
हम अग्नाशय के कैंसर की एक orthotopic murine मॉडल है जो GFP व्यक्त वर्णन है, इस प्रकार (चित्रा 1) विवो फ्लोरोसेंट इमेजिंग में पूरे शरीर का उपयोग कर ट्यूमर के विकास के गैर इनवेसिव निगरानी की इजाजत दी। इस तकनीक को वास्तविक समय में ट्यूमर के विकास पर नजर रखने के लिए हमें की अनुमति देता है (चित्रा 3); यह शोधकर्ताओं अग्नाशय के कैंसर के खिलाफ उपन्यास एजेंटों की चिकित्सीय प्रभावकारिता का अध्ययन करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण हो सकता है। इस मॉडल का एक अन्य महत्वपूर्ण पहलू यह है कि GFP प्रतिदीप्ति एक दृश्य संकेत सफल प्रत्यारोपण और अग्नाशय के कैंसर के विकास का संकेत प्रदान करता है; जो अन्यथा जीवित पशुओं में गेज के लिए मुश्किल होगा। नैदानिक सेटिंग के अनुरूप, इस मॉडल मेटास्टेसिस पर एक अंतर्दृष्टि प्रदान करता है। तिल्ली, mesenteric लिम्फ नोड्स, जिगर, और जठरांत्र संबंधी मार्ग (चित्रा 4): यह आसपास के अंगों को मेटास्टेसिस पता चलता है। हम के रूप में जल्दी 7 सप्ताह के बाद प्रत्यारोपण के रूप में मेटास्टेसिस मनाया। Panc-1 मेटास्टेसिस प्रतिनिधि किया गया है18 सप्ताह 11 - 10 के रेंज में orted। जो समय पर मेटास्टेसिस मनाया जाता है प्रत्यारोपित कोशिकाओं, आरोपण और दृश्य तकनीकों की संख्या पर निर्भर हो सकता है। वर्तमान अध्ययन में, हम एक हरी फ्लोरोसेंट सेल लाइन, Panc-1 GFP, जो व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है चुना है। मॉडल यहाँ वर्णित प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है और मेटास्टेसिस आसानी से देखे जा सकते हैं, क्योंकि वे उज्ज्वल प्रतिदीप्ति है। जेनोग्राफ्ट नग्न माउस स्थापित कैंसर कोशिका लाइनों से उत्पादित मॉडल की एक सीमा कम हो ट्यूमर विविधता एक मूल मानव ट्यूमर 12 की तुलना की संभावना है; फिर भी मॉडल, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने के लिए विकसित और जीवित पशुओं में अपनी प्रगति का पालन करने के लिए आसान है। इसके अलावा, जेनोग्राफ्ट चूहों मॉडल कैंसर अनुसंधान के क्षेत्र में व्यापक रूप से इस्तेमाल किया जाना जारी है।
Fluorescently लेबल कोशिकाओं pelletized किया जाना चाहिए और बर्फ के ठंडे सीरम मुक्त मध्यम ठंडा तहखाने झिल्ली 8 की बराबर मात्रा के साथ मिलाया में फिर से निलंबित कर दिया। सेल निलंबन मीटर होना चाहिएबीच बढ़िया तालमेल या solidification रोकने के लिए सभी समय पर बर्फ पर aintained। यह आदेश कोशिकाओं lysing से बचने के लिए एक 18 गेज सुई के साथ सीरिंज लोड करने के लिए महत्वपूर्ण है। कोशिकाओं lysed रहे हैं, तो सेल निलंबन बेकार गाया है, और कोई ट्यूमर के विकास (चित्रा 2) प्राप्त हो जाएगा। इसके तत्काल बाद इंजेक्शन, सेल निलंबन के लिए लगभग 10 सेकंड के इंजेक्शन साइट से सुई को हटाने के लिए पहले जमना करने की अनुमति। निलंबन के solidification गुण इंजेक्शन साइट से रिसाव के बिना कोशिकाओं इंजेक्षन करने के लिए हमें की अनुमति दी। कोशिकाओं के रिसाव एक विरूपण साक्ष्य के रूप में करने के बजाय सेल प्रसार से मेटास्टेसिस के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। हम 3 एक्स 10 6 इंजेक्शन μl 50 प्रति कोशिकाओं का उपयोग Panc-1 GFP सेल लाइन के इस ओर्थोटोपिक आरोपण अनुकूलित है; अन्य सेल लाइन implantations अनुभव से निर्धारित किया जाना चाहिए। 500,000 कोशिकाओं से युक्त 100 μl अप करने के लिए इंजेक्शन का अधिक मात्रा साहित्य 12 में सूचना दी गई है। मुख्य अनुकूलन मानकों को टाखाते में केन तीन सप्ताह के बाद आरोपण के भीतर सफल ओर्थोटोपिक ट्यूमर के विकास और GFP प्रतिदीप्ति के माध्यम से सकारात्मक ट्यूमर इमेजिंग थे।
ट्यूमर के विकास और विकास ही है, लेकिन यह भी इस्तेमाल चूहों की उम्र से इंजेक्शन कोशिकाओं की संख्या से प्रभावित नहीं है। हम athymic नग्न चूहों का इस्तेमाल किया और निर्धारित किया है कि 6 से 8 सप्ताह की उम्र के बीच युवा चूहों का उपयोग पैदावार अधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम जब बड़े चूहों की तुलना में है। इन चूहों की उम्र के रूप में, वे कुछ प्रतिरोधक क्षमता है जो मानव अग्नाशय कोशिकाओं की अस्वीकृति में परिणाम हो सकता है फिर से हासिल करने के लिए शुरू। इमेजिंग तकनीक यहाँ वर्णित ओर्थोटोपिक उपयोग करने के लिए सीमित नहीं हैं; उन्होंने यह भी ट्यूमर के Heterotopic आरोपण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। जॉब ऑटो प्रतिदीप्ति जो ट्यूमर GFP संकेत अस्पष्ट हो सकता से बचने के लिए लिया जाना चाहिए। संज्ञाहरण ट्यूबिंग के लिए इस्तेमाल कुछ प्लास्टिक ऑटो फ्लोरोसेंट कलाकृतियों का उत्पादन कर सकता है।
फ्लोरोसेंट पूरे शरीर इमेजिंग ट्यूमर के विकास और प्रगति 13 के तेजी से विश्लेषण में सक्षम बनाता है। प्रतिदीप्ति का उपयोग करने का एक प्रमुख लाभ Histopathological परीक्षा या immunohistochemistry 14 के पारंपरिक बोझिल प्रक्रिया के बिना कैंसर को ट्रैक करने की क्षमता है। यह मॉडल उज्ज्वल प्रतिदीप्ति है और त्वचा फ्लैप या अन्य जोड़तोड़ की आवश्यकता के बिना छवि अधिग्रहण के लिए सक्षम बनाता है। प्रतिदीप्ति है कि यह एक रासायनिक प्रतिक्रिया के आधार पर प्रकाश पैदा नहीं करता है में bioluminescence से अलग है; यह बस प्रकाश अवशोषित और एक कम आवृत्ति पर यह reemits। Orthotopic जेनोग्राफ्ट मॉडल अमूल्य ज्ञान और जो मानव उपयोग के लिए उपन्यास उपचारों में अनुवाद किया जा सकता है अग्नाशय के ट्यूमर जीव विज्ञान की समझ प्रदान करते हैं।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI media 1640 | Caisson Labs | RPL03-500ML | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10437-077 | |
| Penicillin Streptomycin | Thermo Ficher Sci | 15140-122 | |
| Matrigel HC basement membrane, high concentration | Corning | 354248 | |
| SutureVet PGA 6-0 PGA | Henry Schein | 39010 | |
| Alcare or Foamed Antiseptic Handrub | Steris | 639680 | |
| DPBS (Dubelcco's Phosphate-Buffered saline) | Thermo Ficher Sci | 21300025 | |
| TB Syringe 27 G 1/2 | Becton Dickinson | 305620 | |
| Isoflurane | Blutler Schein | 50562 | |
| Ketoprofen | Fort Dodge Animal Health | ||
| Surgical Scissors, 5.5" straight mayo | Henry Schein | 22-1600 | |
| PANC-1 GFP cell line | Anticancer, Inc | ||
| Small Animal Imaging System: iBox Scientia | UVP, LLC. Upland, CA. | Small Animal Imaging System to observe the fluorescent tumor in live animals |
References
- Siegel, R. Pancreatic Cancer Stats: American Cancer Society: Cancer Facts & Figures. , Available from: http://www.cancer.org/acs/groups/content/@research/documents/webcontent/acspc-042151.pdf (2014).
- Smyth, E., Cunningham, D. Harrison's Principles of Internal Medicine. Kasper, D., et al. , 19th edn, McGraw-Hill Education. (2015).
- Mahipal, A., Frakes, J., Hoffe, S., Kim, R. Management of borderline resectable pancreatic cancer. World J Gastrointest Oncol. 7, 241-249 (2015).
- De La Cruz, M. S., Young, A. P., Ruffin, M. T. Diagnosis and management of pancreatic cancer. Am Fam Physician. 89, 626-632 (2014).
- Frese, K. K., Tuveson, D. A. Maximizing mouse cancer models. Nat Rev Cancer. 7, 645-658 (2007).
- Hoffman, R. M. Patient-derived orthotopic xenografts: better mimic of metastasis than subcutaneous xenografts. Nat Rev Cancer. 15, 451-452 (2015).
- Hoffman, R. M. The multiple uses of fluorescent proteins to visualize cancer in vivo. Nat Rev Cancer. 5, 796-806 (2005).
- Jiang, Y. J. Establishment of an orthotopic pancreatic cancer mouse model: cells suspended and injected in Matrigel. World J Gastroenterol. 20, 9476-9485 (2014).
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