Abstract
O câncer de pâncreas continua a ser um dos cancros para os quais a sobrevivência não melhorou substancialmente nos últimos décadas. Apenas 7% dos pacientes diagnosticados vai sobreviver mais do que cinco anos. De modo a compreender e imitar o microambiente de tumores pancreáticos, utilizou-se um modelo murino ortotópico de cancro do pâncreas que permite imagem não invasiva de progressão do tumor em tempo real. Células de cancro do pâncreas que expressam a proteína fluorescente verde (GFP PANC-1) foram suspensos em matriz da membrana basal, de alta concentração, (por exemplo, Matrigel HC) com meio isento de soro e, em seguida, injectado no cauda do pâncreas por laparotomia. A suspensão de células na matriz de membrana basal elevada concentração torna-se uma substância do tipo gel, uma vez que atinja a temperatura ambiente; Portanto, gelifica quando entra em contacto com o pâncreas, criando uma vedação no local da injecção e impedir qualquer fuga de células. O crescimento do tumor ea metástase para outros órgãos são monitorados em directoanimais usando fluorescência. É fundamental utilizar os filtros apropriados para a excitação e de emissão de GFP. Os passos para a implantação ortotópica são detalhados neste artigo para que os pesquisadores podem facilmente replicar o processo em ratinhos nus. Os passos principais deste protocolo são preparação da suspensão de células, a implantação cirúrgica, e todo o corpo fluorescente imagiologia in vivo. Este modelo ortotópico foi concebido para investigar a eficácia de novos terapêutica em tumores primários e metastáticos.
Introduction
O câncer de pâncreas é diagnosticada com maior frequência em comparação com outros tipos de câncer e é o 4º principal causa de mortes relacionadas ao câncer nos Estados Unidos. A partir do momento do diagnóstico, mais de 90% dos pacientes morrem dentro de cinco anos 1,2. Actualmente, a remoção cirúrgica do tumor é a única cura para o cancro do pâncreas, mas menos do que 20% dos doentes são elegíveis para se submeter a cirurgia, principalmente devido ao momento do diagnóstico da doença é em fase avançada e tem metástase 3,4. A falta de sintomas específicos faz com que o câncer de pâncreas uma doença silenciosa; alguns dos sintomas incluem dor abdominal, dor nas costas, perda de apetite, náuseas e icterícia; que pode ser facilmente interpretado como doenças digestivas comuns 4. Por esta razão, é importante desenvolver novas ferramentas farmacológicas para auxiliar no diagnóstico e tratamento de cancro pancreático.
A utilização de modelos animais nos permite compreender a biologia do pancrecâncer e atic proporciona um insight sobre a aplicação deste conhecimento para os seres humanos. Modelos ortotópicos xenoenxerto de câncer de pâncreas são realistas, porque os tumores crescem no órgão de origem 5. Em contraste com os modelos heterotópicos, onde as linhas de células tumorais ou fragmentos são implantados subcutaneamente, modelagem ortotópico permite a recriação do microambiente tumoral e imita a interacção das células tumorais com os seus arredores 6. O modelo de xenoenxerto de tumores descrito aqui deriva a partir da linha celular de cancro pancreático humano PANC-1 GFP, que é geneticamente manipulada para expressar a proteína fluorescente verde (GFP). Detecção de GFP permite para uma imagiologia e monitorização do crescimento do tumor e metástases 7 não-invasiva. O desenvolvimento do tumor ocorre rapidamente, de forma espontânea, e se assemelha a de tumores primários de pacientes com câncer pancreático humanos 8. modelos ortotópicos proporcionar uma previsão mais exacta da eficácia do fármaco em resposta a agentes terapêuticos, enquantosimulando o microambiente do tumor.
Como mencionado acima, este modelo animal permite a detecção de fluorescência do crescimento de tumores e metástases em tempo real. detecção fluorescente permite uma imagem mais direta / live comparação com luminescência. Com a fluorescência, a luz emitida é um resultado de uma excitação por luz de um outro comprimento de onda menor; Considerando que, a emissão de luz, a luz emitida é o resultado de uma reacção química e pode não ter forte emissão 9. Além disso, todo o corpo in vivo de imagens de fluorescência não é prejudicial para o animal e permite aos investigadores para monitorizar o crescimento do tumor ao longo do tempo em resposta a tratamentos terapêuticos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
O protocolo descrito a seguir é executado sob a orientação e aprovação do Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Ocidental. Todos os experimentos são realizados em conformidade com todas as orientações pertinentes, regulação e agências reguladoras.
Cultura 1. celular
- Preparação de Meio Completo
- Usando uma câmara de segurança biológica de Classe II, preparar meio completo por adição asséptica de soro fetal de bovino (FBS) e penicilina estreptomicina (P / S) para um frasco de 500 ml de meio RPMI. Misture delicadamente por agitação. A concentração final de cada um suplemento é 10% de FBS e 1% de P / S (v / v). Por exemplo, completar a 500 ml de meio com FBS a 56 ml e 6 ml de P / S.
- Coloque meio completo num banho de água a 37 ° C.
- Descongelamento e Células Propagação
- Recuperar células PANC-1 GFP de nitrogênio líquido. Descongelar o frasco por agitação suave num banho de água a 37 ° C.
Nota:O descongelamento deve ser rápida (aproximadamente 2-3 minutos). - Etiqueta frascos T-75 para ser usado com (a) o nome de linha de células, data (b) Número de passagem, (c), e as iniciais (d) do pesquisador.
- Limpe o frasco com 70% de etanol e transferência frasco a uma cabine de segurança biológica.
- Para propagar as células, adicionar 9,0 ml de meio completo a um tubo de 15 ml. Usando uma pipeta de 1,0 ml, transferir cuidadosamente a suspensão de células e suspendê-lo em 9 ml de meio completo.
- Centrifugar a 125 xg durante 8 minutos à temperatura ambiente. Transferir o frasco cónico de uma cabine de segurança biológica e aspirar o sobrenadante sem perturbar o sedimento.
- Suspende-se o sedimento em 10 ml de meio completo fresco pipetando suavemente a suspensão para cima e para baixo.
- Contar as células com um hemocitómetro e placa-los em frascos T-75 a uma densidade de 2,1 X 10 6 células / balão. Coloque balão numa incubadora a 37 ° C e 5% de CO 2.
- Monitorizar as células por dia por olho e sob o microscópio. Se a gripeID de renovação é necessária, de forma asséptica aspirar o meio de crescimento completo do frasco e descarte. Adicionar um volume igual de meio completo fresco.
- Recuperar células PANC-1 GFP de nitrogênio líquido. Descongelar o frasco por agitação suave num banho de água a 37 ° C.
- propagação Cells
- Assepticamente remover o meio do frasco. Adicionar 5 ml de solução salina de tampão de fosfato de Dulbecco (DPBS) para lavar as células e descartar.
- Separe as células a partir do balão por adição de 3 ml de 0,25% de tripsina. Incubar balão contendo tripsina a 37 ° C e CO2 a 5% durante 5 a 10 min.
- Observar células ao microscópio (aumento de 10x) e garantir que eles são redondos e desalojado.
- Neutralizar a tripsina, adicionando um volume igual de meio completo e quebrar aglomerados cuidado pipetando para cima e para baixo.
- Contar as células utilizando um hemocitómetro e transferir o volume de suspensão de células apropriado para novos frascos à densidade celular indicado em 1.2.7; adicionar meio fresco suficiente para que o volume final é de 10 ml por frasco.
- Suspens celularesPreparação ion para Injecção
Nota: Uma vez que a matriz de membrana basal, alta concentração, solidifica à temperatura ambiente, manter todos os materiais no gelo. Coloque todas as pontas de pipetas estéreis e frascos no congelador durante a noite, e manter em gelo durante o trabalho sobre a suspensão.- Mantenha uma garrafa de meio RPMI sem quaisquer aditivos no gelo. Descongelar a matriz da membrana basal, de alta concentração, seguindo as instruções do fabricante. De preferência, alíquota em frascos menores para evitar a múltiplos ciclos de congelamento e descongelamento 10.
- media aspirado de todos os frascos, e lavar com 5 ml de DPBS. Repita todas as etapas na seção anterior até ao passo 1.3.4.
- Transferir o conteúdo para um tubo cónico de 15 ml e centrifugar a 125 xg durante 8 minutos à temperatura ambiente. Transferir frasco cónico a cabine de segurança biológica e re-suspender pellet usando 10 ml de DPBS.
- Pipeta suavemente a suspensão cima e para baixo para quebrar o sedimento. Contagem de células utilizando um hemocitómetro.
- Centrifugar mais uma vez como descrito em Step 1.4.3. Aspirar o sobrenadante e, dependendo do número de células, adicionar diluente adequado, para se obter 3 X 10 6 células num volume de 50 ul. O diluente será uma mistura de meio isento de soro e membrana basal da matriz concentração elevada numa proporção de 1: (v / v) relação 1.
- Vortex a suspensão suavemente e manter em gelo em todos os momentos. A suspensão é agora pronto para a injecção.
- O implante cirúrgico
Nota: Certifique-se de que todos os materiais e instrumentos cirúrgicos são estéreis. Pratique técnicas de assepsia em todos os momentos.- Coloque uma almofada de aquecimento sobre a mesa e cobrir com uma cortina estéril. Configurar o aparelho de anestesia e assegurar todos os suprimentos estão dentro do alcance do braço.
- Coloque o focinho do animal para a máscara de anestesia e configurar a anestesia a 1 L / min de oxigênio e 2,5% de isoflurano.
- Esfregar suavemente no flanco do animal com iodo, e lavar com 70% de etanol. Repita três vezes.
- Confirme oanimal é totalmente anestesiados por beliscar a pata traseira. O animal é totalmente anestesiado e pronto para a cirurgia se não houver resposta é observada. No entanto, se o animal se encolhe, garantir que há anestesia suficiente no vaporizador e permitir que o animal mais tempo para ir completamente sob anestesia.
- Carga de aproximadamente 200 mL da suspensão de células para uma seringa de 1,0 ml de TB com uma agulha G 18 (previamente arrefecida). Substituir a agulha com uma agulha de 27 G e voltar ao gelo até estar pronto para usar.
- Localize a área geral do baço (quadrante superior esquerdo do abdome) e usando uma pinça beliscar a pele em cima daquela região. Usando uma tesoura cirúrgica fazer uma incisão de aproximadamente 1,0 cm para criar um bolso. Do mesmo modo, apertar o músculo liso no topo do baço e a atravessar a fim de aceder à cavidade peritoneal.
- Agarram delicadamente a extremidade caudal do baço e puxe-o para fora do corpo. O pâncreas será ligado ao baço. Espalhe o pâncreas usando um st molhadaerile Q-tip e localizar a cauda do pâncreas.
- Entregue a injeção de 50 mL para a cauda do pâncreas, deixe a agulha dentro de 10 seg e girar lentamente a agulha do pâncreas. A implantação bem sucedida será parecido com uma bolha superficial, sem qualquer vazamento.
- Devolver o pâncreas e baço para a cavidade peritoneal. Primeiro coloque o músculo e, em seguida, coloque a pele separadamente. Utilize uma sutura ou agrafo 6-0 para fechar a incisão. Para evitar a dor no animal, administrar cetoprofeno por via subcutânea (SC) (5 mg / kg) ao longo de 24 h. Alternativamente, SC administrar buprenorfina (0,05-0,1 mg / kg) a cada 12 horas durante um período de 36 h.
- Recuperar o animal de anestesia e devolvê-lo à sua gaiola. Igualmente controlar a dor. Os animais devem ser fornecidos com o alívio da dor no momento da (ou mesmo antes - de preferência) a cirurgia. alívio adicional da dor deve ser fornecido aos animais que experimentam a dor de acordo com IACCUC-protocolo ou como prescrito pelo notendendo veterinário ou pessoa designada.
- Na imagem in vivo
Nota: A captura de imagem foi realizada utilizando um sistema de imagem comercial equipado com uma câmara escura e os filtros apropriados para imagiologia de GFP. A aquisição de imagens foi realizada utilizando uma câmera CCD e um sistema óptico consistindo de lentes intercambiáveis excitação / emissão (excitação: 455-495 nm; emissão: 513-557 nm). as imagens de campo claro foram capturados sem um filtro de 1 x 1 binning para cada ponto de tempo. Excitação de GFP utilizada uma fonte de luz xenon multiespectral. Os animais foram mantidos sob anestesia durante o processo de imagiologia por ligar o aparelho de anestesia com um colector de anestesia de gás integrada na câmara escura do sistema de imagem.- Anestesiar o animal, tal como descrito em 1.5.2. Uma máscara de anestesia é, no interior da câmara escura do sistema de imagem comercial, a fim de manter o animal sob anestesia durante a imagiologiaprocesso.
- Configure os filtros de excitação e emissão corretas.
- Comece a obtenção de uma imagem inicial usando apenas luz branca. Mantenha a mesma posição do animal durante toda a sessão de imagem e mudar para filtros GFP para tomar uma segunda imagem.
- Para obter melhores resultados sobrepor as duas imagens. Analisar a imagem para a área fluorescente e intensidade.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Este método descreve um implante ortotópico cirúrgica das células cancerosas pancreáticas humanas fluorescentes, com foco na preparação da suspensão de células para injecção, anestesia adequada para os roedores, a entrega de suspensão de células via laparotomia, eo uso de fluorescente em imagens de pequenos animais in vivo. A detecção de um sinal verde fluorescente (sinal GFP) entre duas e três semanas pós-implantação, fornece investigadores uma sugestão visual para confirmar a presença de um tumor de cancro pancreático em desenvolvimento (Figura 1). A Figura 1 consiste em três imagens de um rato com PANC-1 GFP tumor fluorescente. O primeiro é tomado sob luz branca (Figura 1A); A segunda imagem é tomada sob luz azul fluorescente (excitação: 455-495 nm; emissão: 513-557 nm) para a imagem da fluorescência verde emitida a partir do PANC-1 tumor pancreático (Figura 1B); o terceiro é um composto deos dois primeiros e mostra a localização do tumor dentro do corpo do rato (Figura 1C). Os animais que não desenvolvem tumores não mostram sinal de GFP (Figura 2). Além disso, as imagens representativas de progressão do tumor ao longo do tempo pode ser monitorizada de forma não invasiva, através da gravação do sinal de GFP em diferentes pontos de tempo (Figura 3). Figura 3 mostra vários compósitos de sinais de GFP ao longo do tempo. À medida que o tempo avança e aumenta o tamanho do tumor, o sinal GFP aumenta. Vinte dias após a implantação, o tumor surge como um pequeno ponto verde, e 50 dias após a implantação, o tamanho do tumor aumenta significativamente. A Figura 4A mostra as metástases para o baço, fígado e tracto gastrointestinal, o que pode ser confirmado após o animal ter sido eutanizados e os órgãos são removidos por ex vivo imagiologia fluorescente (Figura 4B).
Figura 2: Implantação de problemas, a falta de fluorescência Representação de um rato em um momento em que o tumor ainda não tinha desenvolvido:. (A) A imagem foi obtida comluz branca e sem filtro. (B) A imagem foi obtida usando a luz azul e filtros específicos para GFP. (C) Uma imagem composta de A e B. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: In vivo Tempo real Fluorescent Imaging para acompanhar o crescimento do tumor primário. Na imagem in vivo de PANC-1 GFP progressão do cancro pancreático em vários pontos temporais pós-implantação. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Descreve-se um modelo murino ortotópico de cancro do pâncreas que expressa GFP, permitindo, assim, a monitorização não invasiva do crescimento do tumor usando todo o corpo in vivo imagiologia fluorescente (Figura 1). Esta técnica permite monitorar o desenvolvimento do tumor em tempo real (Figura 3); ele pode ser uma ferramenta importante para pesquisadores para estudar a eficácia terapêutica de novos agentes contra o câncer de pâncreas. Outro aspecto importante deste modelo é que GFP fluorescência fornece uma sinalização visual indicando a implantação bem sucedida e crescimento do câncer de pâncreas; que de outra forma seria difícil de medir em animais vivos. Consistente com a prática clínica, este modelo proporciona uma visão sobre a metástase. Ela mostra as metástases para órgãos circundantes: baço, nódulos linfáticos mesentéricos, fígado e tracto gastrointestinal (Figura 4). Observamos metástases tão cedo quanto 7 semanas após o transplante. PANC-1 metástases foram reported na gama de 10 - 18 semanas 11. O momento em que se observa a metástase pode depender do número de células implantadas, o implante e as técnicas de visualização. No presente estudo, optamos por uma linha verde fluorescente celular, PANC-1 GFP, que está disponível comercialmente. O modelo descrito aqui é reprodutível e as metástases pode ser facilmente visualizado, porque eles têm fluorescência brilhante. Uma limitação de xenotransplante de rato nu modelos produzidos a partir de linhas celulares de cancro estabelecidas é a possibilidade de heterogeneidade do tumor reduzido em comparação com um tumor humana original 12; no entanto, o modelo é reprodutível, fácil de desenvolver e acompanhar o seu progresso de animais vivos. Além disso, os modelos de ratos de xenotransplante continuam a ser amplamente utilizado na pesquisa do câncer.
As células marcadas por fluorescência deve ser peletizado e re-suspensas em meio livre de soro, arrefecido em gelo misturado com igual volume de gelado membrana basal 8. A suspensão de células deve ser maintained no gelo em todos os momentos para evitar a gelificação ou solidificação. É importante carregar as seringas com uma agulha de calibre 18 de modo a evitar a lise das células. Se as células são submetidas a lise, a suspensão de células torna-se inútil, e não o crescimento do tumor será atingido (Figura 2). Imediatamente após a injecção, permitir que cerca de 10 segundos para a suspensão de células a solidificar antes de remover a agulha do local de injecção. As propriedades de solidificação da suspensão permitiu-nos injectar as células sem fugas a partir do local da injecção. O vazamento de células pode levar a metástase como um artefacto em vez de a partir de difusão de células. Nós otimizamos este implante ortotópico de PANC-1 linha de células GFP usando 3 x 10 6 células por 50 pi de injecção; outros implantes linha celular deve ser determinada empiricamente. Maiores volumes de injecção até 100 jil contendo 500.000 células têm sido relatados na literatura 12. Os principais parâmetros de otimização taken em conta foram o crescimento do tumor ortotópico bem sucedido e imagiologia de tumores positivos através de fluorescência da GFP dentro de três semanas pós-implantação.
O crescimento e o desenvolvimento do tumor não só é afectada pelo número de células injectadas, mas também com a idade dos ratos utilizados. Usámos ratinhos nus atímicos e determinaram que o uso de ratos jovens entre as idades de 6 a 8 semanas produz resultados mais reprodutíveis quando comparado com os ratinhos mais velhos. Como estes ratos idade, eles começam a recuperar alguma imunidade que pode resultar na rejeição das células pancreáticas humanas. As técnicas de imagiologia aqui descritos não estão limitados à utilização ortotópico; Eles também podem ser utilizados para o implante de tumores heterotópico. Cuidados devem ser tomados para evitar a auto-fluorescência, que pode obscurecer o sinal GFP tumor. Alguns tipos de plásticos utilizados para tubos de anestesia pode produzir artefatos auto-fluorescente.
Fluorescente imagem de corpo inteiro permite uma análise rápida de crescimento e progressão tumoral 13. A grande vantagem do uso de fluorescência é a capacidade de controlar o câncer sem os pesados procedimentos tradicionais de exame histopatológico ou imuno-histoquímica 14. Este modelo tem fluorescência brilhante e permite a aquisição de imagem sem a necessidade de retalhos cutâneos ou outras manipulações. Fluorescência difere da bioluminescência na medida em que não produz luz com base em uma reação química; ele simplesmente absorve a luz e reemits-lo com uma frequência menor. modelos de xenotransplante ortotópicos fornecer conhecimento e compreensão da biologia do tumor pancreático, que pode ser traduzido em novas terapias para uso humano inestimável.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm nada para revelar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI media 1640 | Caisson Labs | RPL03-500ML | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10437-077 | |
| Penicillin Streptomycin | Thermo Ficher Sci | 15140-122 | |
| Matrigel HC basement membrane, high concentration | Corning | 354248 | |
| SutureVet PGA 6-0 PGA | Henry Schein | 39010 | |
| Alcare or Foamed Antiseptic Handrub | Steris | 639680 | |
| DPBS (Dubelcco's Phosphate-Buffered saline) | Thermo Ficher Sci | 21300025 | |
| TB Syringe 27 G 1/2 | Becton Dickinson | 305620 | |
| Isoflurane | Blutler Schein | 50562 | |
| Ketoprofen | Fort Dodge Animal Health | ||
| Surgical Scissors, 5.5" straight mayo | Henry Schein | 22-1600 | |
| PANC-1 GFP cell line | Anticancer, Inc | ||
| Small Animal Imaging System: iBox Scientia | UVP, LLC. Upland, CA. | Small Animal Imaging System to observe the fluorescent tumor in live animals |
References
- Siegel, R. Pancreatic Cancer Stats: American Cancer Society: Cancer Facts & Figures. , Available from: http://www.cancer.org/acs/groups/content/@research/documents/webcontent/acspc-042151.pdf (2014).
- Smyth, E., Cunningham, D. Harrison's Principles of Internal Medicine. Kasper, D., et al. , 19th edn, McGraw-Hill Education. (2015).
- Mahipal, A., Frakes, J., Hoffe, S., Kim, R. Management of borderline resectable pancreatic cancer. World J Gastrointest Oncol. 7, 241-249 (2015).
- De La Cruz, M. S., Young, A. P., Ruffin, M. T. Diagnosis and management of pancreatic cancer. Am Fam Physician. 89, 626-632 (2014).
- Frese, K. K., Tuveson, D. A. Maximizing mouse cancer models. Nat Rev Cancer. 7, 645-658 (2007).
- Hoffman, R. M. Patient-derived orthotopic xenografts: better mimic of metastasis than subcutaneous xenografts. Nat Rev Cancer. 15, 451-452 (2015).
- Hoffman, R. M. The multiple uses of fluorescent proteins to visualize cancer in vivo. Nat Rev Cancer. 5, 796-806 (2005).
- Jiang, Y. J. Establishment of an orthotopic pancreatic cancer mouse model: cells suspended and injected in Matrigel. World J Gastroenterol. 20, 9476-9485 (2014).
- Arranz, A., Ripoll, J. Advances in optical imaging for pharmacological studies. Front Pharmacol. 6, 189 (2015).
- Corning. Corning Matrigel Matrix: Frequently Asked Questions. , Available from: http://csmedia2.corning.com/LifeSciences/media/pdf/faq_DL_026_Corning_Matrigel_Matrix.pdf (2013).
- Metildi, C. A., Kaushal, S., Hoffman, R. M., Bouvet, M. In vivo serial selection of human pancreatic cancer cells in orthotopic mouse models produces high metastatic variants irrespective of Kras status. J Surg Res. 184, 290-298 (2013).
- Kim, M. P. Generation of orthotopic and heterotopic human pancreatic cancer xenografts in immunodeficient mice. Nat Protoc. 4, 1670-1680 (2009).
- Katz, M. H. Survival efficacy of adjuvant cytosine-analogue CS-682 in a fluorescent orthotopic model of human pancreatic cancer. Cancer Res. 64, 1828-1833 (2004).
- Bouvet, M. Real-time optical imaging of primary tumor growth and multiple metastatic events in a pancreatic cancer orthotopic model. Cancer Res. 62, 1534-1540 (2002).
