Summary
En protokol til forberedelse og karakterisering af lipofile doxorubicin pro-drug indlæst 1,2-distearoyl- sn-3-phosphoethanolamine- N - [amino (polyethylenglycol) -2000] (DSPE-PEG) miceller beskrives.
Introduction
Kemoterapi er almindeligt anvendt til behandling af forskellige former for kræft. De fleste, hvis ikke alle, kemoterapi narkotika har toksiske bivirkninger, som kan variere fra håndterbare mindre forhold, såsom kvalme og diarré, til mere livstruende tilstande. Fordi de fleste anticancerlægemidler er giftige, ikke-selektiv eksponering af disse lægemidler til normale væv uvægerligt forårsager toksicitet. Der er derfor et stort behov for en terapeutisk tilgang, der selektivt kan tilføre lægemidler til kræftceller. En anden udfordring med indgivelsen af lægemidler mod cancer er deres ringe vandopløselighed. Normalt er der behov solubiliseringsmidler at formulere disse tungtopløselige lægemidler. Fleste solubiliseringsmidler, såsom dimethylsulfoxid (DMSO), Cremophor EL, og polysorbat 80 (Tween 80), kan imidlertid forårsage lever og nyre toksicitet, hæmolyse, akutte overfølsomhedsreaktioner og perifere neuropatier. 1 Derfor er der behov for sikre og biokompatible formuleringer til den kliniske anvendelse af fattigely opløselige anticancer lægemidler. Nanocarriers er lovende drug delivery systemer til opfyldelse af ovennævnte udfordringer. Disse nanocarriers omfatter liposomer, 2 nanopartikler, 3 miceller, 4-7 polymer-lægemiddel-konjugater, 8 og uorganiske materialer. 9 Flere nanomedicin produkter (f.eks Doxil, Abraxane, og Genexol) er blevet godkendt af de regulerende instanser til behandling af kræftpatienter. 10
Polymere miceller er lovende nano-skala lægemiddelafgivelsessystemer luftfartsselskaber, der med succes er blevet anvendt til levering af lægemidler mod cancer. 4-7,11,12 Typiske polymere miceller er fremstillet af amfifile polymerer gennem en selvstændig samling proces. Kerne-skal strukturerede polymermiceller omfatter en hydrofil skal og en hydrofob kerne. Den hydrofile skal kan sterisk stabilisere miceller og forlænge deres omsætning i blodet. Den hydrofobe kerne effektivt kan indkapsle hydrofobe dtæpper. På grund af den lille størrelse af miceller (typisk mindre end 200 nm) og lange cirkulation egenskaber, er polymere miceller menes at opnå tumor målretning gennem øget permeabilitet og fastholdelse (EPR) effekter (passiv tumor målretning).
Lægemiddelfyldning stabilitet er kritisk for tumortargeting evne af miceller. For at opnå optimal tumor målretning bør miceller har minimal lægemiddel lækage, før de når tumorstedet, men hurtigt frigive lægemidlet efter indtastning cancerceller. Desuden formuleringsstabilitet er også et væsentligt krav for produktudvikling, fordi formulering stabilitet bestemmer mulighederne for produktudvikling samt holdbarheden af udviklede produkter. For nylig er der gjort en stor indsats for at forbedre læsningen af lægemidler ind leveringstid bærere. Den lipofile pro-drug tilgang er en strategi, der er blevet undersøgt for at forbedre lægemiddelfyldning i lipide nanopartikler og emulsioner. 13,14 The conjugation af lipider med lægemidler kan forbedre betydeligt deres lipofilicitet og forbedre lastning og fastholdelse i de lipofile komponenter i nanocarriers.
Her beskriver vi en protokol for at forberede lipofile doxorubicin pro-drug indlæst miceller. Først syntese fremgangsmåde for doxorubicin lipofile pro-drug beskrevet. Derefter en protokol til at generere miceller med en film-spredning metode indført. Denne fremgangsmåde er med succes blevet anvendt i tidligere undersøgelser. 5 DSPE-PEG blev valgt som bæremateriale til fremstilling miceller, fordi det har været brugt med held til levering micelle lægemiddel. 15,16 Endelig beskriver vi flere in vitro assays anvendes til at karakterisere micelle formuleringer og evaluere anticanceraktivitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Syntese af DOX-PA
- Afvej 390 mg doxorubicin og 243 mg palmitinsyre hydrazid, og overføres til en rundbundet kolbe.
- Tilføj 150 ml vandfrit methanol til kolben med et glas sprøjte. Tilføj 39 pi trifluoreddikesyre (TFA) med en pipette. Anvendelse af en magnetisk omrører, reaktionsblandingen omrøres i 18 timer ved stuetemperatur i mørke.
BEMÆRK: Mængden af reaktions- materialer kan skaleres op eller ned for at opnå forskellige mængder af DOX-PA. Forholdet mellem reaktanterne bør opretholdes i samme forhold. Reaktioner under anvendelse DOX mængder i området fra 78 mg til 1.170 mg kan udføres i en almindelig kemi laboratorium. - Oprensning af DOX-PA under anvendelse af en silicagelsøjle. 17
- Fjern opløsningsmidlet i reaktionsblandingen med en rotationsfordamper. Tilsæt 3 g silicagel efter blandingens volumen er reduceret til omkring 20 ml. Fortsæt rotationsinddampning for at give tørpulvere og tillade than Adsorption af produkter på silicagelen. Hold prøven under vakuum i yderligere 30 minutter efter de tørre pulvere dannes.
- Pack 50 g silicagel i en søjle under anvendelse af dichlormethan som opløsningsmiddel. Forsigtigt tilføje silicagelen prøve indeholdende adsorberet produkt til søjlen.
- Søjlen elueres med en blanding af dichlormethan og methanol, medens den gradvist øge andelen af methanol og derved øge opløsningsmiddel polaritet (tabel 1).
- Saml fraktioner af eluenten i reagensglas (25 ml / rør) og overvåge fremskridtene ved tyndtlagskromatografi (TLC).
- Kombiner alle fraktioner indeholdende rent DOX-PA og opløsningsmidlet fjernes på en rotationsfordamper, indtil tørt pulver dannes. Yderligere tørre produktet under et vakuum O / N.
- Analyse af DOX-PA ved TLC.
- Skær en 4 cm x 8 cm sektion af TLC-plade. Spot prøveopløsninger 0,5 cm fra bunden af pladen med TLC spotting kapillærer hjælp opfyldthanol som opløsningsmiddel.
- Placer TLC-pladen til en udvikling kammer indeholdende en blanding af dichlormethan og methanol (3/1, vol / vol). Dybden af opløsningsmiddel skal være lige mindre end 0,5 cm.
- Fjern pladen fra kammeret, når vaeskefronten når toppen af pladen. Markere placeringen af opløsningsmiddelfronten med en blyant og så pladen tørre. Placer TLC-pladen i en farvnings- kammer indeholdende mættet ioddamp for at visualisere prøver.
- Analyse af DOX-PA med 1H-kernemagnetisk resonans spektroskopi (1H-NMR). 18
- Opløs 15 mg DOX-PA i 1 ml methylsulfoxid-d6 (DMSO) og overføre prøven i et NMR-rør.
- Sæt NMR-rør ind i magneten af NMR-instrument. Mål protonspektret, vælge DMSO som opløsningsmiddel. Fjern NMR-rør fra magneten. Analyser NMR resultat 18.
2. Fremstilling af DOX-PA Miceller af Film-dispersion Metode
- Opløs DSPE-PEG (40 mg) og DOX-PA (4 mg) med 2 ml methanol i en 10 ml hætteglas.
- Fjern det organiske opløsningsmiddel under vakuum under anvendelse af en rotationsfordamper, indtil en tynd film former i hætteglasset.
Bemærkning: Alternativt inddampes de organiske opløsningsmidler under inert gas (fx argon eller nitrogen gas) til dannelse af en film og holde hætteglasset i et vakuumtørreskab for yderligere at fjerne resterende opløsningsmiddel. - Transfer 2 ml Dulbeccos phosphatbufret saltvand (pH 7,4, DPBS) til hætteglasset.
- Placer hætteglasset i et ultrasonisk bad i 3 minutter ved stuetemperatur til frembringelse af miceller.
BEMÆRK: Ultrasonic magt varierer blandt forskellige modeller af ultralyd bade. Vælg en enhed, der kan generere nok ultralyd magt for at sprede den tynde polymer / drug film. Udgangseffekten af ultralydsbad anvendes i denne protokol er 110 W. - Hold miceller ved 4 ° C til kortvarig opbevaring og -20 ° C i lange-term opbevaring.
BEMÆRK: Alternativt kan miceller også frysetørres og rekonstitueres med vand før brug. Normalt er der ikke behov kryobeskyttelsesmiddel eller lyoprotectanten for denne formulering.
3. Karakterisering af DOX-PA Miceller
- Bestemmelse af DOX-PA koncentration i miceller og narkotika indkapslingseffektivitet
- Opløs DOX-PA syntetiseret i tidligere trin i DMSO for at forberede DOX-PA opløsninger af fem forskellige koncentrationer: 1 ug / ml, 5 ug / ml, 20 ug / ml, 50 ug / ml og 100 ug / ml. Måle absorptionen af DOX-PA løsninger med et UV-VIS spektrometer ved 490 nm. Danne en standardkurve baseret på DOX-PA lægemiddelkoncentrationer og deres tilsvarende absorption ved 490 nm.
- Fortynd 25 pi medikamentfyldt micelle med 500 pi DMSO. Mål absorptionen ved 490 nm med en UV-VIS spektrometer. Beregn medikamentkoncentrationer med standardkurven genereret i 3.1.1.
- Beregn indkapslingseffektivitet hjælp af følgende ligning:
Drug Indkapslingseffektivitet (%) = (mængden af medicin i miceller) / (mængde af tilsat lægemiddel) × 100%
- Karakterisering af partikelstørrelse med dynamisk lysspredning (DLS)
- Fortynd miceller med DPBS (pH 7,4) til en endelig DSPE-PEG koncentration på 1 mg / ml. Analysere en 2 ml prøve med en partikelstørrelse analysator til opnåelse af Z-gennemsnitlig størrelse og polydispergeringsindeks (PDI).
- Evaluering af in vitro anticanceraktivitet
BEMÆRK: Anvend passende steril teknik og fungere inden for en biosikkerhed kabinet.- Fjern cellekulturmediet fra en cellekultur kolbe (f.eks T25) indeholdende humane DU-145 prostatacancerceller og skyl cellerne med 2 ml DPBS (pH 7,4).
- Aspirer DPBS tilsættes 1 ml trypsin-opløsning (0,25%), og inkuberes i 2 minutter ved 37 ° C for at løsne cellerne.
- Tilføj 10 ml celledyrkningsmedium (RPMI 1640 + 10% kalvefosterserum + 1% Antibiotikum-antimykotisk), når de fleste af cellerne er frigjort fra kolben. Overfør celler til en 15-ml centrifugerør og centrifugeres cellerne ved 1.000 xg i 5 min.
- Resuspender cellepelleten med 5 ml celledyrkningsmedium og fjerne en prøve til tælling celleantal med et hæmocytometer. Fortynd cellerne med celledyrkningsmedium til en densitet på 50.000 celler / ml. Tilsæt de fortyndede-cellesuspensioner i en 96-brønds cellekultur plade (100 pl / brønd). Inkubér cellerne i en cellekultur inkubator (37 ° C, 5% CO2) i 18 timer for at tillade cellevedhæftning.
- Fortynd DOX dimethylsulfoxid (DMSO) opløsning og DOX-PA DMSO-opløsning med celledyrkningsmedium for at opnå endelige medikamentkoncentrationer af 0,1 pM, 0,5 pM, 2 pM, 5 pM, og 10 uM. Holde DMSO-slutkoncentration i alle ovennævnte prøver til 0,5%. Fortynd DOX-PA micelle med celledyrkningsmedium at opnå endelige lægemiddel concentrations på 0,1 pM, 0,5 pM, 2 pM, 5 pM, og 10 um, hhv. Brug den tomme celledyrkningsmedium en kontrol.
- Fjern 96 cellekulturplade plade fra inkubatoren og erstatte cellekulturmediet med 100 pi medium indeholdende forskellige behandlingsmidler fremstillet i Trin 3.3.5 (n = 4 for hver gruppe). Inkubér cellerne i cellekultur inkubator (37 ° C, 5% CO2) i yderligere 72 timer.
- Aspirer mediet, og der tilsættes 100 pi medium indeholdende 0,5 mg / ml 3- (4,5-dimethyl-thiazol-2-yl) -2,5-diphenyl tetrazoliumbromid (MTT).
- Inkubér cellerne i cellekultur inkubator i yderligere 2 timer. Fjern forsigtigt mediet og tilsæt 100 ul DMSO at opløse formazankrystaller.
- Mål absorbansen med mikropladen spektrofotometer ved en bølgelængde på 570 nm og en reference bølgelængde på 670 nm.
- Beregn cellelevedygtigheden ved følgende formel:
BEMÆRK: Sammenlign cellen levedygtighed mellem forskellige grupper ved hjælp af en envejs variansanalyse (ANOVA) statistisk test. Beregn IC50 baseret på cellelevedygtighed vs. lægemiddelkoncentrationsenhederne data.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 viser syntesen arrangement med DOX-PA. DOX-PA blev syntetiseret ved konjugering af palmitinsyre med doxorubicin gennem en pH-følsom hydrazonbinding. Et lille overskud af palmitinsyre hydrazid blev anvendt til at lette færdiggørelsen af reaktionen. Denne reaktion fremgangsmåde har en meget høj effektivitet og kun en lille mængde af doxorubicin tilbage efter en 18 timers reaktion (figur 2). Udbyttet var ca. 88%. Ved slutningen af reaktionen blev DOX-PA oprenset ved anvendelse af en silicagelsøjle og tørret til opnåelse af et rent rødt fast produkt. DOX-PA blev analyseret med TLC, som viste en enkelt plet for renset DOX-PA (figur 2). Figur 3 viser 1H-NMR-spektret af DOX-PA. Karakteristiske NMR toppe fra både doxorubicin og palmitinsyre blev observeret, hvilket yderligere bekræftet succes konjugationsreaktionen.
figur 4. Blank DSPE-PEG-miceller uden lægemiddel fremstå som en transparent væske. DOX-PA DSPE-PEG miceller fremstå som en rød væske; den røde farve skyldes den DOX-PA lagt i micellerne. Repræsentative resultater af partikelstørrelse analyse er vist i figur 5. Z-gennemsnitlig middelpartikelstørrelse for datoer DSPE-PEG-miceller var 17,0 ± 0,5 nm (PDI = 0,034 ± 0,019). Lastningen af DOX-PA øget micelle partikelstørrelse lidt; Z-gennemsnitlig middelpartikelstørrelse for DOX-PA DSPE-PEG-miceller var 25,7 ± 1,6 nm (PDI = 0,407 ± 0,035).
koncentrationen DOX-PA i micelle formulering blev bestemt på grundlag af absorptionen ved 490 nm. DSPE-PEG har ubetydelig absorption ved denne bølgelængde, således ikke blande sig i analysen af DOX-PA-koncentration. Koncentrationen af DOX-PA i micellen formuleringen var1,99 ± 0,11 mg / ml og lægemidlet belastningseffektivitet var 99,3 ± 5,7%. Den høje indkapslingseffektivitet skyldes den lipofile træk ved DOX-PA, hvilket forbedrer dens fastholdelse i den hydrofobe kerne af miceller. Formuleringen udviste fremragende stabilitet. Der var ingen synlig udfældning ved opbevaring ved - 4 ° C i 3 uger. Ingen signifikant ændring i koncentration lægemiddel blev observeret under opbevaring.
DU-145 human prostatacancer-celler blev behandlet med forskellige koncentrationer af frit doxorubicin, gratis DOX-PA og DOX-PA DSPE-PEG-miceller. Cellelevedygtighed blev bestemt ved afslutningen af en 72 timers behandling ved anvendelse af et MTT-assay (figur 6). En koncentrationsafhængig reduktion i cellelevedygtighed blev opnået ved at behandle DU145 celler med frit doxorubicin (IC50 = 0,10 uM), fri DOX-PA (IC50 = 0,33 uM), eller DOX-PA miceller (IC50 = 0,25 uM). Selvom fri doxorubicin er mere effektiv end frit DOX-PA eller DOX-PA miceller ved lavere koncentrationer (0,1 pM og 0,5 pM), viste DOX-PA grupper større reduktion i cellernes levedygtighed end frit doxorubicin ved højere koncentrationer (2-10 uM). Også, der syntes at være nogen signifikant forskel mellem DOX-PA og DOX-PA miceller ved både højere og lavere koncentrationer. Datoer DSPE-PEG-miceller viste ingen toksicitet (data ikke vist), hvilket indikerer god biokompatibilitet og sikkerhed for DSPE-PEG som et lægemiddelafgivelsessystem bærermateriale.
Figur 1. Syntese af lipofile pro-drug af doxorubicin (DOX-PA) Reagenser og betingelser:. Doxorubicin (DOX), palmitinsyre hydrazid (PA) og trifluoreddikesyre (TFA) opløst i methanol blev omrørt i 18 timer ved stuetemperatur i mørk. t = "_ blank"> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Tyndtlagskromatografi (TLC). TLC af (1) doxorubicin, (2) rå reaktionsblanding, (3) palmitinsyre hydrazid, og (4) DOX-PA konjugat. Prøver blev udviklet med en blanding af dichlormethan og methanol (3/1, v / v) og farvet med jod. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. 1H-NMR af DOX-PA i deutereret DMSO. Tilstedeværelsen af karakteristiske toppe fra både DOX og PA demonstrerer succesen af konjugationsreaktionen.: //www.jove.com/files/ftp_upload/54338/54338fig3large.jpg "Target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Udseende af miceller. (A) DSPE-PEG-miceller og (B) DOX-PA DSPE-PEG-miceller. Repræsentative tal præsenteres for at demonstrere fremkomsten af tomme DSPE-PEG miceller og DOX-PA DSPE-PEG miceller. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. Partikelstørrelse og størrelsesfordeling af miceller. (A) DSPE-PEG-miceller og (B) DOX -PA DSPE-PEG-miceller. Micellen størrelsen bestemmes ved dynamisk lysspredning. Repræsentative tal præsenteres for at demonstrere partikelstørrelse og størrelsesfordeling. Data er gennemsnit ± SD (n = 3). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6. Anticancer aktivitet af micelle-formuleringer. DU145-celler blev behandlet i 72 timer og cellelevedygtighed blev målt under anvendelse af MTT-assayet. Data præsenteret i figuren er middelværdi ± SD (n = 4). *, P <0,01, sammenlignet med DOX behandlede grupper. Der er ingen statistisk forskel mellem DOX-PA og DOX-PA miceller behandlede grupper. IC50 blev beregnet på grundlag cellelevedygtighed vs. lægemiddelkoncentrationsenhederne data.p_upload / 54.338 / 54338fig6large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Tabel 1. CH2C 2 / CH3OH eluering opløsningsmidler anvendt i oprensningen af DOX-PA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I dette arbejde beskriver vi en ukompliceret, hurtig film-dispersion fremgangsmåde til fremstilling af miceller. Denne metode udnytter selvsamlende egenskaber af en amfifil polymer (f.eks DSPE-PEG) til dannelse af kerne-skal strukturerede miceller i et vandigt miljø. Denne micelle fremstillingsmetode har flere fordele. 1. Den omfatter en simpel formulering proces, som undgår anvendelsen af komplicerede trin størrelse-reduktion (såsom ekstrudering eller homogenisering), almindeligvis anvendes i fremstillingen af liposomer, nanopartikler og nanoemulsioner. 19 2. Det har en god reproducerbarhed. Fremragende batch-til-batch ensartethed kan opnås, når formuleringen er blevet optimeret og etableret. Protokollen er tolerant over for variationer i forberedelse procesvariable, såsom lydbehandling styrke og tid. Selv om andre metoder (såsom dialyse tilgang eller emulsionen-opløsningsmiddelafdampning tilgang) er tilgængelige til fremstilling miceller, filmen dispersionmetode er mere bekvem og effektiv. Derfor har et stort potentiale til at blive tilpasset til anvendelse i stor skala produktion af miceller i den farmaceutiske industri. Begrænsningen ved denne metode er, at det afhænger af selvsamlende egenskaber af bærermaterialer og således er begrænset til materialer med sådanne egenskaber. Den upassende udvælgelse af polymermaterialer kan føre til svigt i at generere tilfredsstillende micelle formuleringer. Desuden fremstillingsmetoden er afhængig af ultralydsbehandling for at dispergere polymeren / lægemiddel film og for at lette dannelsen af miceller. De fleste kommercielt tilgængelige ultralyd bade er egnet, fordi kun en svag ultralyd magt er nødvendig for at danne miceller. Det kan imidlertid være et problem, hvis der anvendes et ultrasonisk bad med en meget svag strøm.
Dårlig medikamentbelastning og for tidlig frigivelse af lægemiddel er store bekymringer for levering micelle stof. I denne protokol, udviklede vi et lipofilt pro-drug strategi for at øge belastningening af doxorubicin ind DSPE-PEG-miceller. Konjugation af doxorubicin med lipider betydeligt forbedret kompatibilitet og interaktion af lægemidlet med lipid kerne af DSPE-PEG-miceller. Pro-drug, DOX-PA, blev syntetiseret ved at konjugere doxorubicin med lipid gennem en sur pH-responsiv hydrazon-linker. Denne linker er stabil ved neutral pH og spaltelig ved sur pH. 20,21 således DOX stabilt lagt i DSPE-PEG-miceller som et pro-drug ved neutral pH og har minimal lægemiddel lækage under opbevaring og under cirkulation i blodet. Når DOX-PA miceller indtaste tumorceller gennem endocytose, vil DOX-PA prodrug spaltes og omdannes til fri DOX som reaktion på den sure endosom miljø (pH 5-6). Da DOX er mere hydrofilt end DOX-PA, vil denne konvertering forstyrre samspillet mellem DOX og den hydrofobe kerne af miceller, og dermed lette hurtig frigivelse af DOX fra miceller. Denne innovative design funktion vil undgå ufuldstændig stof udgivelse, somer et stort problem i forbindelse med medikamentkonjugater anvender ikke-spaltelige eller langsom-spaltende linkere. 22 Denne fremgangsmåde kan også anvendes til afgivelse af andre lægemidler. Valget af en passende linker er kritisk for succes i denne tilgang. Linkerne bør være stabile i et fysiologisk miljø for at maksimere stabiliteten af formuleringen. Linkerne bør også effektivt spaltes som reaktion på udløser i tumormikromiljøet (f.eks pH, enzymer, etc.) for at frigive det oprindelige lægemiddel.
I denne protokol, blev DOX-PA effektivt indlæst i miceller med høj indkapslingseffektivitet (~ 100%). Micellen formulering demonstrerede også overlegen stabilitet og forblev intakt i mindst tre uger uden lægemiddel udfældning eller reduktion af lægemiddelkoncentration. Dette skyldes den forbedrede samspil mellem lipiddele i pro-drug og lipid kerne af DSPE-PEG-miceller. Engineering compatibiheden af bærermolekyler med medicin til at forbedre deres interaktion er en lovende strategi for at forbedre ydeevnen af miceller og andre nanocarriers. Denne tilgang kan forbedre lægemiddelfyldning og minimere pre-modne lægemiddelfrigivelse for disse nanocarriers. 23 Udvælgelsen af et passende lægemiddel / polymer-par er et kritisk trin i udformningen af micelleformulering. Strukturen af lægemiddelmolekyler kan modificeres (prodrug tilgang) eller til udformning af bærematerialer kan optimeres for at forbedre kompatibiliteten og øge lægemiddel / bærer-interaktioner. 23 24 Derudover kan datamodellering være et nyttigt redskab til at hjælpe i optimering af nanocarriers og gøre det muligt at fremstille en skræddersyet designet Nanobærer til specifik et specifikt lægemiddel.
Sammenfattende beskriver vi her en metode til at syntetisere et lipofilt prodrug for doxorubicin. Protokoller for udarbejdelse og karakterisering af narkotika indlæst miceller er også descrIBED. Filmen-dispersion fremgangsmåde er en enkel og lovende fremgangsmåde til fremstilling af en bred vifte af nanoskala selvsamlende leveringssystemer. De karakteriseringsmetoder her beskrevne kan anvendes som standard in vitro-assays for at bestemme egenskaberne af nanomedicin, således kan lette optimering af formulerings- og produktudvikling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DSPE-PEG2K | Cordenpharm | LP-R4-039 | >95% |
| Doxorubicin | LC Laboratories | D-4000 | >99% |
| Palmitic Acid Hydrazide | TCI AMERICA | P000425G | >98.0% |
| Methanol | ACROS Organics | 610981000 | Anhydrous |
| Methylene chloride | FISHER | D151-4 | 99.90% |
| Methyl sulfoxide-d6 | ACROS Organics | AC320760075 | NMR solvent |
| Trifluoroacetic Acid | ACROS Organics | AC293811000 | 99.50% |
| Silica Gel | FISHER | L-7446 | 230-400 mesh |
| Baker Flex TLC Plates | FISHER | NC9990129 | |
| DPBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| DU 145 Prostate Cancer Cells | ATCC | HTB-81 | |
| MTT | ACROS Organics | 158990050 | 98% |
| RPMI 1640 Medium | MEDIATECH INC | 10041CV | |
| Antibiotic-Antimycotic | LIFE TECHNOLOGIES | 15240062 | 100x stock solution |
| Fetal Bovine Serum | LIFE TECHNOLOGIES | 10437077 | |
| Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy | Varian, Inc | 300 NMR | |
| Büchi R-3 Rotavapor | Buchi | 1103022V1 | Rotary evaporator |
| Ultrasonic Bath | BRANSON ULTRASONICS CORPORATION | CPX952318R | |
| UV-VIS spectrometer Biomate 3 | Thermo Spectronic | ||
| Zetasizer Nano ZS90 | Malvern Instruments | Particle Size Analyer | |
| Microplate Spectrophotometer | Rio-Rad | Benchmark Plus | |
| Cell Culture Incubator | Napco | CO2 6000 | |
| Biological Safety Cabinet | Nuaire | ||
| SigmaPlot | Systat Software, Inc. | Analytical Software | |
| 96-Well Cell Culture Plate | Becton Dickinson | 353072 | |
| Trypsin 0.25% | Corning Cellgro | 25-053-CI |
References
- Hennenfent, K. L., Govindan, R. Novel formulations of taxanes: a review. Old wine in a new bottle? ESMO. 17 (5), 735-749 (2006).
- Paliwal, S. R., Paliwal, R., Agrawal, G. P., Vyas, S. P. Liposomal nanomedicine for breast cancer therapy. Nanomedicine. 6 (6), 1085-1100 (2011).
- Mahapatro, A., Singh, D. K. Biodegradable nanoparticles are excellent vehicle for site directed in vivo delivery of drugs and vaccines. J Nanobiotechnology. 9 (55), (2011).
- Danquah, M., Li, F., Duke, C. B., Miller 3rd,, D, D., Mahato, R. I. Micellar delivery of bicalutamide and embelin for treating prostate cancer. Pharm Res. 26 (9), 2081-2092 (2009).
- Li, F., Danquah, M., Mahato, R. I. Synthesis and characterization of amphiphilic lipopolymers for micellar drug delivery. Biomacromolecules. 11 (10), 2610-2620 (2010).
- Li, F., Danquah, M., Singh, S., Hao, W., Mahato, R. Paclitaxel- and lapatinib-loaded lipopolymer micelles overcome multidrug resistance in prostate cancer. Drug Deliv. and Transl. Res. 1 (6), 9 (2011).
- Li, F., Lu, Y., Li, W., Miller, D. D., Mahato, R. I. Synthesis, formulation and in vitro evaluation of a novel microtubule destabilizer, SMART-100. J Control Release. 143 (1), 151-158 (2010).
- Minko, T., Kopeckova, P., Pozharov, V., Kopecek, J. HPMA copolymer bound adriamycin overcomes MDR1 gene encoded resistance in a human ovarian carcinoma cell line. J Control Release. 54 (2), 223-233 (1998).
- Rosenholm, J. M., Mamaeva, V., Sahlgren, C., Linden, M. Nanoparticles in targeted cancer therapy: mesoporous silica nanoparticles entering preclinical development stage. Nanomedicine. 7 (1), 111-120 (2012).
- Kaur, I. P., et al. Issues and concerns in nanotech product development and its commercialization. J Control Release. 193, 51-62 (2014).
- Jones, M., Leroux, J. Polymeric micelles - a new generation of colloidal drug carriers. Eur J Pharm Biopharm. 48 (2), 101-111 (1999).
- Wang, H., Li, F., Du, C., Mahato, R. I., Huang, Y. Doxorubicin and lapatinib combination nanomedicine for treating resistant breast cancer. Mol Pharm. 11 (8), 2600-2611 (2014).
- Ma, P., Rahima Benhabbour, S., Feng, L., Mumper, R. J. 2'-Behenoyl-paclitaxel conjugate containing lipid nanoparticles for the treatment of metastatic breast cancer. Cancer Lett. 334 (2), 253-262 (2013).
- Lundberg, B. B., Risovic, V., Ramaswamy, M., Wasan, K. M. A lipophilic paclitaxel derivative incorporated in a lipid emulsion for parenteral administration. J Control Release. 86 (1), 93-100 (2003).
- Perche, F., Patel, N. R., Torchilin, V. P. Accumulation and toxicity of antibody-targeted doxorubicin-loaded PEG-PE micelles in ovarian cancer cell spheroid model. J Control Release. 164 (1), 95-102 (2012).
- Gill, K. K., Kaddoumi, A., Nazzal, S. Mixed micelles of PEG(2000)-DSPE and vitamin-E TPGS for concurrent delivery of paclitaxel and parthenolide: enhanced chemosenstization and antitumor efficacy against non-small cell lung cancer (NSCLC) cell lines. Eur J Pharm Sci. 46 (1-2), 67-71 (2012).
- Still, W. C., Kahn, M., Mitra, A. Rapid Chromatographic Technique for Preparative Separations with Moderate Resolution. J. Org. Chem. 43 (14), 2923-2925 (1978).
- New Mexico State University. NMR Protocols and Specifications. , Available from: http://web.nmsu.edu/~kburke/Instrumentation/NMSU_NMR_300.html (2015).
- Morton, L. A., Saludes, J. P., Yin, H. Constant pressure-controlled extrusion method for the preparation of Nano-sized lipid vesicles. J Vis Exp. (64), (2012).
- Ulbrich, K., Etrych, T., Chytil, P., Jelinkova, M., Rihova, B. HPMA copolymers with pH-controlled release of doxorubicin: in vitro cytotoxicity and in vivo antitumor activity. J Controlled Release. 87 (1-3), 33-47 (2003).
- Patil, R., et al. Cellular Delivery of Doxorubicin via pH-Controlled Hydrazone Linkage Using Multifunctional Nano Vehicle Based on Poly(beta-L-Malic Acid). Int J Mol Sci. 13 (9), 11681-11693 (2012).
- Hu, X., Liu, S., Huang, Y., Chen, X., Jing, X. Biodegradable block copolymer-doxorubicin conjugates via different linkages: preparation, characterization, and in vitro evaluation. Biomacromolecules. 11 (8), 2094-2102 (2010).
- Huynh, L., Neale, C., Pomes, R., Allen, C. Computational approaches to the rational design of nanoemulsions, polymeric micelles, and dendrimers for drug delivery. Nanomedicine. 8 (1), 20-36 (2012).
- Shi, C., et al. A drug-specific nanocarrier design for efficient anticancer therapy. Nat Commun. 6, 7449 (2015).
