Summary
Протокол для подготовки и определения характеристик липофильный доксорубицина пролекарства загружен 1,2-distearoyl- зп глицеро-3-phosphoethanolamine- N - [амино (полиэтиленгликоль) -2000] (DSPE-PEG) мицеллы описывается.
Introduction
Химиотерапия обычно используется для лечения различных форм рака. Большинство, если не все, химиотерапевтические препараты имеют токсические побочные эффекты, которые могут отличаться от управляемых второстепенных условий, таких как тошнота и диарея, более жизненных условий, угрожающих. Поскольку большинство противоопухолевые препараты токсичны, неселективные воздействие этих препаратов в нормальной ткани неизбежно вызывает токсичность. Таким образом, существует большая потребность в терапевтическом подходе, который может избирательно доставлять лекарства в раковые клетки. Еще одна проблема, с введением противоопухолевых препаратов является их плохая растворимость в воде. Как правило, солюбилизирующие агенты необходимы для разработки таких плохо растворимых лекарств. Тем не менее, большинство солюбилизирующие агенты, такие как диметилсульфоксид (ДМСО), Cremophor EL, и полисорбат 80 (твин 80) может вызывать повреждение печени и токсичность почек, гемолизу, острые реакции гиперчувствительности и периферические невропатии. 1 Таким образом, безопасную и биологически совместимую составы необходимы для клиническое использование бедныхLY растворимые противоопухолевые препараты. Наноносителей перспективны системы доставки лекарственных средств для решения вышеуказанных проблем. Эти наноносителей включают липосомы, 2 наночастицы, 3 мицеллы, 4-7 конъюгатов полимер-наркотиков, 8 и неорганические материалы. 9 Несколько Наномедицина продуктов (например, Doxil, Abraxane и Genexol) были одобрены регулирующими органами для лечения онкологических больных. 10
Полимерные мицеллы являются перспективными нано-носителей для доставки лекарств, которые были успешно использованы для доставки противоопухолевых препаратов. 4-7,11,12 Типичные полимерные мицеллы получают из амфифильных полимеров с помощью процесса самосборки. Ядро-оболочка структурированные полимерные мицеллы включают гидрофильную оболочку и гидрофобную сердцевину. Гидрофильная оболочка может стерически стабилизировать мицеллы и продлить срок их циркуляции в кровотоке. Гидрофобным ядро может эффективно герметизировать гидрофобный дковрики. Из-за небольшого размера мицелл (обычно менее 200 нм) и свойства долгосрочной циркуляции, полимерные мицеллы, как полагают, для достижения опухолью ориентации посредством повышенной проницаемости и удерживания (EPR) эффекты (пассивный опухоль ориентации).
стабильность загрузки лекарственного средства имеет решающее значение для опухоли таргетирования способность мицеллы. Для достижения оптимальной адресности опухоли, мицеллы должны иметь минимальную утечку наркотиков до достижения место локализации опухоли, но быстро высвобождать лекарственное средство после введения раковых клеток. Кроме того, стабильность состава также является важным требованием для разработки продукта, так как стабильность состава определяет целесообразность разработки продукта, а также срок годности разработанных продуктов. В последнее время много усилий было сделано, чтобы улучшить загрузку препаратов в носителей доставки. Липофильная подход пролекарством является стратегия , которая была изучена , чтобы улучшить загрузку лекарственного средства в наночастицы липидов и эмульсий. 13,14 Призываниеugation липидов с наркотиками может значительно улучшить их липофильности и повысить загрузку и сохранение в липофильных компонентов наноносителей.
Здесь мы опишем протокол для подготовки липофильный доксорубицин пролекарственных нагруженные мицеллы. Во-первых, процедура синтеза доксорубицина липофильный пролекарства описан. Затем, протокол для генерации мицеллы с методом пленочного дисперсии вводится. Этот метод был успешно использован в наших предыдущих исследованиях. 5 DSPE-PEG был выбран в качестве материала - носителя для получения мицеллы , потому что он был успешно использован для доставки мицеллы наркотиков. 15,16 Наконец, мы опишем несколько анализов в пробирке , используемые для характеристики мицеллы препараты и оценить противоопухолевую активность.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Синтез DOX-PA
- Взвешивают 390 мг доксорубицина и 243 мг пальмитиновой кислоты гидразида, и переносят в круглодонную колбу.
- Добавить 150 мл безводного метанола в колбу с помощью стеклянного шприца. Добавьте 39 мкл трифторуксусной кислоты (ТФУ) с помощью пипетки. С помощью магнитной мешалки, перемешивают реакционную смесь в течение 18 ч при комнатной температуре в темноте.
Примечание: количество реакционных материалов можно масштабировать вверх или вниз , чтобы получить различные количества DOX-PA. Соотношение реагентов должно поддерживаться в тех же пропорциях. Реакции с использованием DOX количествах в диапазоне от 78 мг до 1170 мг может быть выполнена в обычной лаборатории химии. - Очистка DOX-PA с использованием колонки с силикагелем. 17
- Растворитель удаляют в реакционной смеси с помощью роторного испарителя. Добавьте 3 г силикагеля после того, как объем смеси снижается примерно до 20 мл. Продолжайте в роторном испарителе с получением сухих порошков и, чтобы позволить Tон адсорбцией продуктов на силикагель. Хранить образец под вакуумом в течение еще 30 мин, после образования сухих порошков.
- Упаковка 50 г силикагеля в колонке с использованием дихлорметана в качестве растворителя. Осторожно добавьте пробу силикагель, содержащий адсорбированный продукт в колонну.
- Элюируют колонку смесью дихлорметана и метанола, при этом постепенно увеличивая долю метанола, таким образом увеличивая полярности растворителя (таблица 1).
- Собирают фракции элюента в пробирках (25 мл / пробирку) и контролировать ход с помощью тонкослойной хроматографии (ТСХ).
- Смешайте все фракции, содержащие чистые DOX-PA и растворитель удаляют с помощью роторного испарителя, пока сухой порошок не образуется. Далее высушить продукт под вакуумом O / N.
- Анализ DOX-PA с помощью ТСХ.
- Вырезать 4 см х 8 см сечение ТСХ пластины. Точечные растворы проб на 0,5 см от нижней части пластины с TLC пятнистость капиллярами с использованием встретилисьhanol в качестве растворителя.
- Поместите пластину дл тонкослойной хроматографии в развивающейся камеру, содержащую смесь дихлорметана и метанола (3/1, об / об). Глубина растворителя должна быть чуть менее 0,5 см.
- Удалите пластину из проявляющего камеры, когда передний растворитель достигает верхней части пластины. Отметьте расположение фронта растворителя с карандашом и дайте пластины высохнуть. Поместите пластину дл тонкослойной хроматографии в окрашивающего камеру, содержащую насыщенный пар йода, для того, чтобы визуализировать образцы.
- Анализ DOX-PA с 1 Н-спектроскопии ядерного магнитного резонанса (1Н-ЯМР). 18
- Растворите 15 мг DOX-PA в 1 мл метилсульфоксид-d6 (DMSO) и переноса образца в ЯМР пробирку.
- Вставьте трубку ЯМР в магнит прибора ЯМР. Измерение спектра протонов, выбирая ДМСО в качестве растворителя. Извлеките трубку ЯМР от магнита. Анализ ЯМР результат 18.
2, Получение DOX-PA мицелл по методу пленочным дисперсии
- Растворите DspE-ПЭГ (40 мг) и DOX-PA (4 мг) с 2 мл метанола в стеклянную пробирку емкостью 10 мл.
- Удаления органического растворителя под вакуумом не используя роторный испаритель, до тех пор тонкой пленки формы во флаконе.
Примечание: В качестве альтернативы, испаряются органические растворители , в атмосфере инертного газа (например, газ аргон или азот) для образования пленки и держать флакон в вакуум - сушилке для дальнейшего удаления остаточного растворителя. - Передача 2 мл фосфатно-буферного раствора Дульбекко (рН 7,4, DPBS) в стеклянный флакон.
- Помещают пробирку в ультразвуковой ванне в течение 3 мин при комнатной температуре, чтобы генерировать мицеллы.
Примечание: Ультразвуковая мощность варьируется в зависимости от различных моделей ультразвуковых ванн. Выберите устройство, которое может генерировать достаточно мощности ультразвука, чтобы рассеять тонкую пленку полимера / лекарственного средства. Выходная мощность ультразвуковой ванне, используемой в данном протоколе является 110 Вт - Держите мицеллы при 4 ° С для кратковременного хранения и -20 ° С в течение долго-term хранения.
Примечание: В качестве альтернативы, мицеллы могут быть также сублимационной сушке и разводить водой перед использованием. Как правило, ни одна криопротектора или lyoprotectant не требуется для данной композиции.
3. Характеристика DOX-PA мицелл
- Определение концентрации DOX-PA в мицеллы и эффективности инкапсулирования лекарственного средства
- Растворите DOX-PA синтезируют в предыдущих шагах в ДМСО для приготовления растворов DOX-PA пяти различных концентрациях: 1 мкг / мл, 5 мкг / мл, 20 мкг / мл, 50 мкг / мл и 100 мкг / мл. Измеряют поглощение растворов DOX-PA с UV-VIS-спектрометра при 490 нм. Генерирование стандартную кривую, основанную на концентрации препарата DOX-PA, и соответствующее поглощение при длине волны 490 нм.
- Развести 25 мкл мицеллы лекарственной загруженным с 500 мкл ДМСО. Измеряют поглощение при 490 нм с помощью UV-VIS-спектрометром. Расчет концентраций лекарственного средства со стандартной кривой, полученной в 3.1.1.
- Рассчитать эффективность инкапсуляции с использованием следующего уравнения:
Инкапсуляция Drug Эффективность (%) = (количество лекарственных средств в мицеллах) / (количество добавленного лекарственного средства) × 100%
- Характеристика размера частиц с динамического рассеяния света (DLS)
- Развести мицеллы с DPBS (рН 7,4) до конечной концентрации DSPE-PEG 1 мг / мл. Анализа образца 2 мл с помощью анализатора размера частиц, чтобы получить размер и индекс полидисперсности Z-средней (PDI).
- Оценка в пробирке противоопухолевой активности
Примечание: Используйте соответствующую стерильную технику и работать внутри шкафа биологической безопасности.- Удалить среду для культивирования клеток из клеточной культуральной колбе (например, T25) , содержащие DU-145 клеток рака предстательной железы человека и прополоскать клетки с 2 мл ДЗФР (рН 7,4).
- Отберите DPBS, добавляют 1 мл раствора трипсина (0,25%), и инкубируют в течение 2 мин при 37 ° С для отделения клеток.
- Добавьте 10 мл клеточной культуральной среды (RPMI 1640 + 10% фетальной бычьей сыворотки и 1% Антибиотик-антимикотическими), когда большинство клеток отделяются от колбы. Передача клеток в 15-мл центрифужную пробирку и центрифугировать клетки при 1000 х г в течение 5 мин.
- Повторное приостановить осадок клеток с помощью 5 мл культуральной среды клеток и удалить образец для подсчета числа клеток с помощью гемоцитометра. Развести клеток с клеточной культуральной среде до плотности 50000 клеток / мл. Добавляют разбавленный-клеточные суспензии в 96-луночный культуральный планшет (100 мкл / лунку). Инкубируйте клетки в культуре клеток инкубатор (37 ° С, 5% СО 2) в течение 18 часов , чтобы позволить прикрепление клеток.
- Развести DOX раствор диметилсульфоксида (ДМСО) и раствор DOX-PA ДМСО с клеточной культуральной среды для получения необходимой концентрации препарата 0,1 мкМ, 0,5 мкМ, 2 мкМ, 5 мкМ и 10 мкМ, соответственно. Хранить Конечная концентрация ДМСО при всех указанных выше образцов до 0,5%. Развести DOX-PA мицеллы с клеточной культуральной среды для получения окончательного совместное наркотиковncentrations 0,1 мкМ, 0,5 мкМ, 2 мкМ, 5 мкМ и 10 мкМ, соответственно. Используйте пустые среда для культивирования клеток контроля.
- Удалите 96-луночный культуральный планшет из инкубатора и замените среду для культивирования клеток с 100 мкл среды, содержащей различные агенты дл обработки, приготовленный на стадии 3.3.5 (п = 4 для каждой группы). Инкубируйте клетки в культуре клеток инкубатор (37 ° C, 5% CO 2) в течение еще 72 ч.
- Аспирируйте среду и добавляют по 100 мкл среды, содержащей 0,5 мг / мл 3- (4,5-диметил-тиазол-2-ил) -2,5-дифенил-тетразолия бромид (МТТ).
- Инкубируйте клетки в культуре клеток инкубаторе в течение еще 2 ч. Осторожно удалите среду и добавьте 100 мкл ДМСО для растворения кристаллов формазана.
- Измерить оптическую плотность с микропланшетов спектрофотометре при длине волны 570 нм и длине волны 670 нм.
- Рассчитывают жизнеспособность клеток с использованием следующего уравнения:
Примечание: сравнение жизнеспособности клеток между различными группами с использованием однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) статистического теста на. Расчет IC 50 на основе жизнеспособности клеток в сравнении данных о концентрации лекарственного средства.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
На рисунке 1 показана схема синтеза из DOX-PA. DOX-PA синтезируют путем конъюгации пальмитиновой кислоты с доксорубицином через рН-чувствительный гидразонной связью. Небольшой избыток гидразида пальмитиновой кислоты был использован для содействия завершению реакции. Этот метод реакции имеет очень высокую эффективность , и только небольшое количество доксорубицина остается после реакции 18 ч (рис 2). Выход составил примерно 88%. В конце реакции, DOX-PA очищали с использованием колонки с силикагелем и сушат, чтобы получить чистый красный твердый продукт. DOX-PA анализировали с помощью ТСХ, которая показала одно пятно для очищенного DOX-PA (рисунок 2). На рисунке 3 показано 1 Н-ЯМР - спектр DOX-PA. наблюдались характерные пики ЯМР от обоих доксорубицина и пальмитиновой кислоты, которая дополнительно подтвердил успешность реакции конъюгации.
рисунке 4. Бланк DSPE-PEG мицеллы без лекарственного средства появляются в виде прозрачной жидкости. DOX-PA DSPE-PEG мицеллы появляются в виде красной жидкости; красный цвет из-за DOX-PA, загруженной в мицеллах. Типичные результаты анализа размера частиц показаны на рисунке 5. Z-средний средний размер частиц для чистых мицелл DSPE-PEG был 17,0 ± 0,5 нм (PDI = 0,034 ± 0,019). Загрузка DOX-PA немного увеличен размер частиц мицелл; Z-средний средний размер частиц для DOX-PA DSPE-PEG мицеллы составила 25,7 ± 1,6 нм (PDI = 0,407 ± 0,035).
Концентрация DOX-PA в композиции мицелл определяли по поглощению при 490 нм. DSPE-ПЭГ имеет пренебрежимо малое поглощение на этой длине волны, таким образом, не мешает при анализе концентрации DOX-PA. Концентрация DOX-PA в препарате мицеллы1,99 ± 0,11 мг / мл, а эффективность загрузка лекарственного средства была 99,3 ± 5,7%. Высокая эффективность инкапсулирования обусловлена липофильный особенностью DOX-PA, что усиливает ее удержание в гидрофобном ядре мицеллы. Препарат показал превосходную стабильность. Там не было никаких видимых осадков при хранении при температуре - 4 ° С в течение 3-х недель. Не наблюдалось существенных изменений в концентрации лекарственного средства во время хранения.
DU-145 клеток рака предстательной железы человека обрабатывали различными концентрациями свободного доксорубицина, свободный DOX-PA, и DOX-PA DSPE-PEG мицелл. Жизнеспособность клеток определяли в конце лечения 72 ч с использованием МТТ (рисунок 6). Зависимое от концентрации снижение жизнеспособности клеток было достигнуто путем обработки клеток Du145 со свободным доксорубицином (IC 50 = 0,10 мкМ), свободный DOX-PA (IC 50 = 0,33 мкМ) или DOX-PA мицелл (IC 50 = 0,25 мкМ). Хотя свободный доксорубицин более эффективно, чем свободный DOX-PA или DOX-PA мицелл при более низких концентрациях (0,1 мкМ и 0,5 мкМ), DOX-PA группы показали большее снижение жизнеспособности клеток, чем свободный доксорубицин при более высоких концентрациях (2-10 мкМ). Кроме того, казалось, не было никакого существенного различия между DOX-PA и DOX-PA мицеллы в обоих высших и более низких концентрациях. Пустые мицеллы DSPE-PEG не показали токсичности (данные не показаны), что указывает на хорошую биосовместимость и безопасность ДСФЭ-ПЭГ в качестве материала-носителя для доставки лекарственного средства.
Рисунок 1. Синтез липофильного пролекарства доксорубицин (DOX-PA) Реагенты и условия:. Доксорубицин (DOX), гидразид пальмитиновой кислоты (PA) и трифторуксусной кислоты (ТФК) , растворенную в метаноле перемешивали в течение 18 ч при комнатной температуре в темно. т = "_blank"> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. Тонкослойная хроматография (ТСХ). ТСХ (1) доксорубицина, (2) сырой реакционной смеси, (3) гидразид пальмитиновую кислоту, и (4) DOX-PA конъюгат. Образцы были разработаны со смесью дихлорметана и метанола (3/1, об / об) и окрашивали йодом. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3. 1 Н-ЯМР - DOX-PA в дейтерированном ДМСО. Наличие характерных пиков от обоих DOX и ПА демонстрирует успех реакции конъюгации.: //www.jove.com/files/ftp_upload/54338/54338fig3large.jpg "Целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4. Внешний вид мицелл. (А) DSPE-PEG мицеллы и (В) DOX-PA DSPE-PEG мицеллы. Типичные цифры представлены , чтобы продемонстрировать появление пустых DSPE-PEG мицеллы и DOX-PA DSPE-PEG мицеллы. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 5. Размер частиц и распределение по размерам мицелл. (А) DSPE-PEG мицеллы и (В) DOX -PA DSPE-PEG мицеллы. Размер мицелл определяется методом динамического светорассеяния. Характерные показатели представлены для демонстрации размер частиц и распределение по размерам. Данные , представленные представляют собой среднее ± SD (n = 3). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 6. противоопухолевую активность составов мицеллы. DU145 клетки обрабатывали в течение 72 ч и жизнеспособность клеток измеряли с помощью анализа МТТ. Данные, представленные на рисунке, среднее ± стандартное отклонение (n = 4). *, P <0,01, по сравнению с DOX лечение групп. Там нет статистической разницы между DOX-PA и DOX-PA мицеллы обработанных групп. IC 50 рассчитывали на основании жизнеспособности клеток в сравнении данных по концентрации лекарственного средства.p_upload / 54338 / 54338fig6large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Таблица 1. СН 2 Cl 2 / CH 3 OH , элюируя растворители , используемые при очистке DOX-PA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этой работе мы описываем несложный, быстрый метод пленочного дисперсии для получения мицелл. Этот метод использует свойства самосборка амфифильного полимера (например, DSPE-ПЭГ) с образованием ядро-оболочка структурированных мицеллы в водной среде. Этот метод мицеллярный препарат имеет ряд преимуществ. 1. Она включает в себя простой процесс композиции, что позволяет обойтись без использования сложных этапов сокращения размера (например, экструзией или гомогенизация) , обычно используемых при приготовлении липосом, наночастиц, и наноэмульсиями. 19 2. Он имеет хорошую воспроизводимость. Отличная консистенция от партии к партии может быть достигнуто, как только рецептура была оптимизирована и установлена. Протокол нечувствительна к изменениям параметров процесса приготовления, такие как прочность и времени обработки ультразвуком. Хотя другие методы (например, подход, диализ или эмульсионной-Выпаривание растворителя подход) доступны для подготовки мицелл, дисперсионное пленкаметод является более удобным и эффективным. Таким образом, он имеет большой потенциал, чтобы быть адаптированы для использования в крупномасштабном производстве мицеллы в фармацевтической промышленности. Ограничение этого метода состоит в том, что она зависит от самосборки свойств материалов несущих и, таким образом, ограничивается материалами с такими свойствами. Неправильный выбор полимерных материалов может привести к отказу в создании удовлетворительных формулировок мицеллы. Кроме того, способ приготовления основан на воздействии ультразвука для разгона / пленки полимера наркотиков и способствовать формированию мицеллы. Большинство коммерчески доступных ультразвуковые ванны пригодны, так как только слабый ультразвуковой мощности необходим для образования мицелл. Тем не менее, это может быть проблемой, если ультразвуковая ванна с очень слабой мощности используется.
Плохое содержание лекарственного вещества и преждевременное высвобождение лекарственного средства являются основными проблемами для доставки наркотиков мицеллы. В этом протоколе, мы разработали стратегию липофильный пролекарством для повышения нагрузкиИНГ доксорубицина в DSPE-PEG мицеллы. Конъюгирование доксорубицина с липидов значительно улучшена совместимость и взаимодействие препарата с липидным ядром DSPE-PEG мицелл. Пролекарством, DOX-PA, был синтезирован путем конъюгации доксорубицина с липидными через кислый рН реагирующих гидразонной линкера. Этот линкер стабилен при нейтральном значении рН и расщепляться при кислотном рН. 20,21 Таким образом, DOX стабильно загружена в DSPE-PEG мицелл в качестве пролекарства при нейтральном рН и имеет минимальную утечку препарата при хранении и в процессе циркуляции в крови. После того, как DOX-PA мицеллы ввести опухолевые клетки через эндоцитоз, DOX-PA пролекарством будет расщепляться и превратить в свободный DOX в ответ на кислой среде эндосом (рН 5-6). Так как DOX является более гидрофильным, чем DOX-PA, это преобразование будет нарушать взаимодействие между DOX и гидрофобного ядра мицеллы, и, таким образом, облегчить быстрое высвобождение DOX из мицелл. Эта инновационная функция конструкции позволит избежать неполного высвобождения лекарственного средства, котороеявляется одной из основных проблем , связанных с использованием конъюгатов наркотиков нерасщепляемые или медленно расщепляющие линкеров. 22 Этот подход может быть также применен к поставке других лекарственных средств. Выбор подходящего линкера имеет решающее значение для успеха этого подхода. Линкеры должны быть стабильными в физиологической среде, с тем, чтобы максимально увеличить стабильность композиции. Линкеры должны также быть эффективно расщепляется в ответ на триггеры в микросреде опухоли (например, рН, ферменты и т.д.) , чтобы освободить исходное лекарственное средство.
В этом протоколе, DOX-PA был эффективно загружены в мицеллы с высокой эффективностью инкапсулирования (~ 100%). Состав мицеллы также продемонстрировал превосходную стабильность и остались нетронутыми в течение по крайней мере за три недели без осадков наркотиков или снижения концентрации лекарственного средства. Это происходит из-за усиленного взаимодействия между липидными фрагментами в пролекарства и липидного ядра DSPE-PEG мицелл. Инженерная compatibiмируемости молекул-носителей с препаратами, увеличивающими их взаимодействие является перспективной стратегией для повышения эффективности мицелл и других наноносителей. Такой подход может повысить содержание лекарственного вещества и свести к минимуму преждевременное высвобождение лекарственного средства для этих наноносителей. 23 Выбор соответствующей пары лекарственное средство / полимер является важным шагом при разработке препарата мицеллы. Структура молекул лекарственного средства может быть изменен (подход пролекарством) или дизайн материалов носителей могут быть оптимизированы для того , чтобы улучшить совместимость и усилить взаимодействие лекарственного средства / носителя. 23 24 Кроме того, численное моделирование может быть полезным инструментом , чтобы помочь в оптимизации наноносителей и дают возможность подготовить индивидуальные разработанные nanocarrier для конкретного конкретного препарата.
В целом, мы опишем здесь метод синтеза липофильный пролекарством доксорубицина. Протоколы для подготовки и определения характеристик наркотиков загружены мицеллы также DESCRibed. Метод пленочного дисперсия является простым и перспективным способом получения различных наноразмерных систем доставки самосборки. Методы определения характеристик , описанные здесь , могут быть использованы в качестве стандарта в анализах пробирке для определения свойств нанолекарства, таким образом , может способствовать оптимизации рецептуры и процессы разработки продуктов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DSPE-PEG2K | Cordenpharm | LP-R4-039 | >95% |
| Doxorubicin | LC Laboratories | D-4000 | >99% |
| Palmitic Acid Hydrazide | TCI AMERICA | P000425G | >98.0% |
| Methanol | ACROS Organics | 610981000 | Anhydrous |
| Methylene chloride | FISHER | D151-4 | 99.90% |
| Methyl sulfoxide-d6 | ACROS Organics | AC320760075 | NMR solvent |
| Trifluoroacetic Acid | ACROS Organics | AC293811000 | 99.50% |
| Silica Gel | FISHER | L-7446 | 230-400 mesh |
| Baker Flex TLC Plates | FISHER | NC9990129 | |
| DPBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| DU 145 Prostate Cancer Cells | ATCC | HTB-81 | |
| MTT | ACROS Organics | 158990050 | 98% |
| RPMI 1640 Medium | MEDIATECH INC | 10041CV | |
| Antibiotic-Antimycotic | LIFE TECHNOLOGIES | 15240062 | 100x stock solution |
| Fetal Bovine Serum | LIFE TECHNOLOGIES | 10437077 | |
| Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy | Varian, Inc | 300 NMR | |
| Büchi R-3 Rotavapor | Buchi | 1103022V1 | Rotary evaporator |
| Ultrasonic Bath | BRANSON ULTRASONICS CORPORATION | CPX952318R | |
| UV-VIS spectrometer Biomate 3 | Thermo Spectronic | ||
| Zetasizer Nano ZS90 | Malvern Instruments | Particle Size Analyer | |
| Microplate Spectrophotometer | Rio-Rad | Benchmark Plus | |
| Cell Culture Incubator | Napco | CO2 6000 | |
| Biological Safety Cabinet | Nuaire | ||
| SigmaPlot | Systat Software, Inc. | Analytical Software | |
| 96-Well Cell Culture Plate | Becton Dickinson | 353072 | |
| Trypsin 0.25% | Corning Cellgro | 25-053-CI |
References
- Hennenfent, K. L., Govindan, R. Novel formulations of taxanes: a review. Old wine in a new bottle? ESMO. 17 (5), 735-749 (2006).
- Paliwal, S. R., Paliwal, R., Agrawal, G. P., Vyas, S. P. Liposomal nanomedicine for breast cancer therapy. Nanomedicine. 6 (6), 1085-1100 (2011).
- Mahapatro, A., Singh, D. K. Biodegradable nanoparticles are excellent vehicle for site directed in vivo delivery of drugs and vaccines. J Nanobiotechnology. 9 (55), (2011).
- Danquah, M., Li, F., Duke, C. B., Miller 3rd,, D, D., Mahato, R. I. Micellar delivery of bicalutamide and embelin for treating prostate cancer. Pharm Res. 26 (9), 2081-2092 (2009).
- Li, F., Danquah, M., Mahato, R. I. Synthesis and characterization of amphiphilic lipopolymers for micellar drug delivery. Biomacromolecules. 11 (10), 2610-2620 (2010).
- Li, F., Danquah, M., Singh, S., Hao, W., Mahato, R. Paclitaxel- and lapatinib-loaded lipopolymer micelles overcome multidrug resistance in prostate cancer. Drug Deliv. and Transl. Res. 1 (6), 9 (2011).
- Li, F., Lu, Y., Li, W., Miller, D. D., Mahato, R. I. Synthesis, formulation and in vitro evaluation of a novel microtubule destabilizer, SMART-100. J Control Release. 143 (1), 151-158 (2010).
- Minko, T., Kopeckova, P., Pozharov, V., Kopecek, J. HPMA copolymer bound adriamycin overcomes MDR1 gene encoded resistance in a human ovarian carcinoma cell line. J Control Release. 54 (2), 223-233 (1998).
- Rosenholm, J. M., Mamaeva, V., Sahlgren, C., Linden, M. Nanoparticles in targeted cancer therapy: mesoporous silica nanoparticles entering preclinical development stage. Nanomedicine. 7 (1), 111-120 (2012).
- Kaur, I. P., et al. Issues and concerns in nanotech product development and its commercialization. J Control Release. 193, 51-62 (2014).
- Jones, M., Leroux, J. Polymeric micelles - a new generation of colloidal drug carriers. Eur J Pharm Biopharm. 48 (2), 101-111 (1999).
- Wang, H., Li, F., Du, C., Mahato, R. I., Huang, Y. Doxorubicin and lapatinib combination nanomedicine for treating resistant breast cancer. Mol Pharm. 11 (8), 2600-2611 (2014).
- Ma, P., Rahima Benhabbour, S., Feng, L., Mumper, R. J. 2'-Behenoyl-paclitaxel conjugate containing lipid nanoparticles for the treatment of metastatic breast cancer. Cancer Lett. 334 (2), 253-262 (2013).
- Lundberg, B. B., Risovic, V., Ramaswamy, M., Wasan, K. M. A lipophilic paclitaxel derivative incorporated in a lipid emulsion for parenteral administration. J Control Release. 86 (1), 93-100 (2003).
- Perche, F., Patel, N. R., Torchilin, V. P. Accumulation and toxicity of antibody-targeted doxorubicin-loaded PEG-PE micelles in ovarian cancer cell spheroid model. J Control Release. 164 (1), 95-102 (2012).
- Gill, K. K., Kaddoumi, A., Nazzal, S. Mixed micelles of PEG(2000)-DSPE and vitamin-E TPGS for concurrent delivery of paclitaxel and parthenolide: enhanced chemosenstization and antitumor efficacy against non-small cell lung cancer (NSCLC) cell lines. Eur J Pharm Sci. 46 (1-2), 67-71 (2012).
- Still, W. C., Kahn, M., Mitra, A. Rapid Chromatographic Technique for Preparative Separations with Moderate Resolution. J. Org. Chem. 43 (14), 2923-2925 (1978).
- New Mexico State University. NMR Protocols and Specifications. , Available from: http://web.nmsu.edu/~kburke/Instrumentation/NMSU_NMR_300.html (2015).
- Morton, L. A., Saludes, J. P., Yin, H. Constant pressure-controlled extrusion method for the preparation of Nano-sized lipid vesicles. J Vis Exp. (64), (2012).
- Ulbrich, K., Etrych, T., Chytil, P., Jelinkova, M., Rihova, B. HPMA copolymers with pH-controlled release of doxorubicin: in vitro cytotoxicity and in vivo antitumor activity. J Controlled Release. 87 (1-3), 33-47 (2003).
- Patil, R., et al. Cellular Delivery of Doxorubicin via pH-Controlled Hydrazone Linkage Using Multifunctional Nano Vehicle Based on Poly(beta-L-Malic Acid). Int J Mol Sci. 13 (9), 11681-11693 (2012).
- Hu, X., Liu, S., Huang, Y., Chen, X., Jing, X. Biodegradable block copolymer-doxorubicin conjugates via different linkages: preparation, characterization, and in vitro evaluation. Biomacromolecules. 11 (8), 2094-2102 (2010).
- Huynh, L., Neale, C., Pomes, R., Allen, C. Computational approaches to the rational design of nanoemulsions, polymeric micelles, and dendrimers for drug delivery. Nanomedicine. 8 (1), 20-36 (2012).
- Shi, C., et al. A drug-specific nanocarrier design for efficient anticancer therapy. Nat Commun. 6, 7449 (2015).
