Summary
وصفنا في المختبر بروتوكول للمشاركة في ثقافة الأمعاء microbiome والزغابات المعوية لفترة طويلة باستخدام نظام microphysiological البشري القناة الهضمية على واحد في رقاقة.
Abstract
هنا، نحن تصف بروتوكول لأداء على المدى الطويل المشترك ثقافة متعددة الأنواع البشرية الأمعاء microbiome مع الزغابات المعوية microengineered في جهاز microphysiological البشري القناة الهضمية على واحد في رقاقة. نحن تلخيص واجهة الأنسجة التجويف-الشعرية المعوية في جهاز ميكروفلويديك، حيث يتم تطبيق التشوهات الميكانيكية والفسيولوجية تدفق القص السوائل باستمرار لتقليد التمعج. في متناهية التجويف، الظهارية في الأمعاء كاتشو-2 خلايا الإنسان المثقف لتشكيل "خالية من الجراثيم" زغابة ظهارة وتجديد الزغابات المعوية الصغيرة. يتم تلقيح خلايا الجرثومية قبل مثقف في الجانب التجويف لإنشاء نظام بيئي المضيف ميكروب. بعد تلتزم الخلايا الميكروبية إلى السطح القمي من الزغب، يتم استئناف تدفق السوائل والتشوهات الميكانيكية لإنتاج المكروية ثابتة للدولة التي يتم تزويد مستنبت جديدة باستمرار والبكتيريا غير منضم (وكذلك النفايات البكتيرية) يتم إزالتها بشكل مستمر. بعد تمديد ثقافة مشتركة وأيام مدمج لأسابيع، تم العثور على microcolonies متعددة ليكون موجودا بشكل عشوائي بين الزغب، وعلى حد سواء الجرثومية والخلايا الظهارية تبقى قابلة للحياة وظيفية لمدة أسبوع واحد على الأقل في الثقافة. يمكن تكييفها لدينا بروتوكول التعاون ثقافة لتوفير منصة متعددة للنظم الإيكولوجية في استضافة microbiome الأخرى التي يمكن العثور عليها في مختلف الأعضاء البشرية، التي قد تسهل الدراسة في المختبر من دور microbiome الإنسان في تنظيم الصحة والمرض.
Introduction
أمعاء الإنسان تؤوي مجموعة متنوعة بشكل مذهل من الأنواع الميكروبية (<1000 الأنواع) وعدد هائل من الخلايا الميكروبية (10 مرات أكثر من الخلايا المضيفة الإنسان) والجينات (100 مرة أكثر من الجينوم البشري) 1. هذه microbiomes البشري يلعب دورا أساسيا في استقلاب المواد الغذائية والاكسيوبيوتك، وتنظيم الاستجابات المناعية، والحفاظ على توازن الأمعاء 2. ليس من المستغرب، نظرا لهذه الوظائف المتنوعة والأمعاء microbiome المتعايشة ينظم على نطاق واسع الصحة والمرض 3. وبالتالي، فهم دور microbiome الأمعاء والمضيف ميكروب التفاعلات هي ذات أهمية كبيرة لتعزيز الجهاز الهضمي (GI) الصحة واستكشاف علاجات جديدة للاضطرابات المعوية 4. ومع ذلك، الموجودة في نماذج الأمعاء المختبر (على سبيل المثال، الثقافات ثابتة) تقييد استضافة microbiome ثقافة مشتركة لفترة قصيرة من الزمن (<1 يوم) لأن الخلايا الميكروبية اكتسى وسطا الحاجز المعويوظيفة 5. النماذج الحيوانية البديلة (على سبيل المثال، 6 أو المعدلة وراثيا خالية من الجراثيم الفئران 7) وأيضا لا تستخدم عادة لدراسة المضيف الأمعاء microbiome الحديث المتبادل لأن الاستعمار وصيانة مستقرة من microbiome أمعاء الإنسان من الصعب.
للتغلب على هذه التحديات، وضعنا مؤخرا الإنسان بيوميمتيك "الوتر على واحد في رقاقة" نظام microphysiological (الشكل 1A، يسار) لمحاكاة التفاعلات microbiome المضيف القناة الهضمية التي تحدث في أمعاء الإنسان يعيش 5،8. وmicrodevice القناة الهضمية على واحد في رقاقة يحتوي على اثنين من قنوات ميكروفلويديك موازية مفصولة مرنة، مسامية، المصفوفة خارج الخلية (ECM) غشاء المغلفة مبطنة الظهارية في الأمعاء البشري كاتشو-2 الخلايا، ومحاكاة المعوية واجهة الأنسجة التجويف-الشعرية (الشكل 1A ، يمين) 9. تشوهات متوازن دوري يحركها الفراغ لحث التشوهات الميكانيكية الفسيولوجية التي تحاكي التغيرات عادة inducإد كتبها التمعج (الشكل 1A، يمين). ومن المثير للاهتمام، عندما تزرع كاتشو-2 الخلايا في رقاقة والقناة الهضمية على اساس لأكثر من 100 ساعة، وبشكل عفوي تشكيل ثلاثي الأبعاد (3D) الزغابات المعوية مع منعطفات ضيقة، والحدود فرشاة قمي، وخلايا التكاثري تقتصر على الأقبية القاعدية، إنتاج المخاط، وزيادة النشاط يتفاعل المخدرات (على سبيل المثال، السيتوكروم P450 3A4، CYP3A4)، وتعزيز الجلوكوز امتصاص 8. في هذا المكروية "خالية من الجراثيم، وكان من الممكن أن تشارك في ثقافة بروبيوتيك GG rhamnosus اكتوباكيللوس أو تشكيل العلاجية من خليط بكتيريا بروبيوتيك مع الخلايا الظهارية المضيفة لمدة تصل إلى أسبوعين 5،10.
في هذه الدراسة، ونحن تصف بروتوكول مفصلة لأداء المضيف الأمعاء microbiome ثقافة مشتركة في الجهاز القناة الهضمية على واحد في رقاقة لفترة طويلة. وبالإضافة إلى ذلك، ونحن نناقش القضايا الهامة والتحديات المحتملة للنظر في تطبيق واسع النطاق من هذا ع ثقافة مشتركة في استضافة microbiomerotocol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. التصنيع الدقيق من جهاز الوتر على واحد في رقاقة
ملاحظة: على رقاقة القناة الهضمية على اساس هو جهاز ميكروفلويديك التي شفافة، سيليكون البوليمر المنفذة للغازات (ثنائي ميثيل بولي سيلوكسان، PDMS)، التي تحتوي على اثنين microchannels موازية (1 مم عرض × 150 ميكرون ارتفاع × 1 سم طول) مفصولة مرونة مسامية (10 ميكرون في القطر المسام، 25 ميكرون في المسام التباعد إلى المسام) PDMS الغشاء 5،9. افتعال القناة الهضمية على واحد في رقاقة (الشكل 1A، يسار) باتباع الخطوات المقدمة.
- إجراءات التصنيع الدقيق من 5،9 الوتر على واحد في رقاقة.
- إعداد غير مخمر، PDMS نزع الغاز عن طريق خلط prepolymer PDMS وكيل علاج (15: 1 ث / ث)، ووضعه في مجفف فراغ لمدة 30 دقيقة.
- صب 30 غرام و 3 غرام من غير مخمر، PDMS نزع الغاز على كل قالب السيليكون التي لديها SU-8 micropatterns أساس العليا والسفلى microchannels من على رقاقة القناة الهضمية على اساس، على التوالي. ثم علاج عند 60 درجة مئوية في الفرن الجاف لفي لترشرق 4 ساعة.
- Demold العليا والسفلى PDMS طبقات من كل قالب السيليكون عن طريق خفض حول حافة باستخدام مشرط جراحي. لكمة 6 فتحات (اثنين من مداخل، اثنان المنافذ، وغرفتين فراغ) باستخدام الناخس خزعة (2.0 ملم في حفرة قطرها).
- إعداد غشاء مسامي بصب 10 غرام من PDMS غير مخمر ونزع الغاز على رقاقة السيليكون silanized التي تحتوي على صفائف آخر مع أعمدة دائرية (10 ميكرون في القطر، 25 ميكرون في الطول) تتراكب مع شقة، silanized PDMS طبقة الدعم (15: 1، ث / ث، 1 سم سميكة). وضع الوزن كوى 3 كجم على الإعداد وعلاج البوليمر في 60 درجة مئوية لمدة 12 ساعة أو أكثر.
- Demold الإعداد للغشاء PDMS يسهل اختراقها انضمت إلى لوح دعم PDMS من رقاقة السيليكون عن طريق رفع بعناية زاوية لوح من الرقاقة، وتقشير قبالة حتى يتم فصل الغشاء PDMS يسهل اختراقها تماما من الرقاقة.
- فضح الجانب القناة من الطبقة العليا (PDMS، 15: 1، ث / ث) والجانب غشاء مسامي إلى ررأسماء التي تم إنشاؤها بواسطة المفاوض الاكليل المحمولة لمدة 1 دقيقة و 3 ثانية على التوالي.
- وضع الأسطح المعالجة البلازما الغشاء PDMS يسهل اختراقها وطبقة متناهية العليا في اتصال امتثالي عن طريق وضع كل قطعة في نفس الوقت دون أي فقاعات الهواء.
- احتضان الإعداد كله في 80 ° CO / N من أجل الربط النهائي لاثنين من PDMS طبقات.
- تقشر الطبقة دعم PDMS من التجمع من الطبقة العليا مع غشاء مسامي من خلال رفع بعناية ركن من طبقة الدعم، وتقشير قبالة حتى يتم فصل الطبقة الدعم الكامل من الطبقة العليا مع الغشاء.
- تمزيق أجزاء من هذا الغشاء الموجود على المخادع فراغ (الغرفتين تقع على جانبي القناة الرئيسية) باستخدام ملاقط غرامة طرف لجعل غرف فراغ جوفاء.
- فضح جنب مع غشاء تعلق على قطعة الأعلى والجانب مع قنوات محفورة على القطعه السفلى لالبلازما في بنفس الطريقة كما هو موضح طن خطوة 1.1.6 لمدة 1 دقيقة.
- محاذاة طبقة متناهية العليا مع غشاء مسامي وانخفاض طبقة مع جهة اتصال امتثالي عن طريق وضع كل قطعة في نفس الوقت دون أي فقاعات الهواء تحت المجسام.
- علاج الإعداد كله في الفرن الجاف في 80 ° CO / N لإنتاج نطاق القناة الهضمية على واحد في رقاقة جهاز ميكروفلويديك كاملة تحتوي على غرفتين فراغ أجوف بجانب قناة خلية ميكروفلويديك.
- ربط أنابيب إلى مدخل ومخرج من كل منفذ ربط الجزء العلوي أو السفلي microchannels في رقاقة والقناة الهضمية على اساس عبر 90 ° عازمة الفولاذ المقاوم للصدأ كليلة نهاية الإبرة.
- توصيل الأنابيب إلى الثقوب مرتبطة غرف فراغ باستخدام 90 ° عازمة الفولاذ المقاوم للصدأ كليلة نهاية الإبرة.
- تعقيم و microchannels والأنابيب التي تتدفق 70٪ (ت / ت) الإيثانول باستخدام 1 مل تعقيم الحقنة.
- تجف و microchannels وأنابيب في 60 درجة مئوية فرن جاف O / N.
2. نمو Microengineالدو المعوية الزوائد في جهاز الوتر على واحد في رقاقة
- بذور الخلايا المعوية الظهارية (على سبيل المثال كاتشو-2BBE) على 5،9 Microdevice الوتر على واحد في رقاقة.
- تعقيم الجهاز مع 70٪ (ت / ت) الإيثانول (راجع الخطوة 1.4) باستخدام 1 مل تعقيم الحقنة تليها التجفيف في 60 درجة مئوية فرن جاف O / N (راجع الخطوة 1.5) قبل تفعيل السطح.
- كشف الإعداد الكامل لالميكروسيستم القناة الهضمية على واحد في رقاقة (أي مجموعة من القناة الهضمية على واحد في رقاقة متصلة أنابيب) لضوء الأشعة فوق البنفسجية (253.7 نانومتر) والأوزون في وقت واحد لمدة 40 دقيقة.
- تهدئة الجهاز على RT لمدة 15 دقيقة تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية في خزانة السلامة البيولوجية (BSC).
- إدخال 100 ميكرولتر من طلاء ECM solution- خليط من 50 ميكروغرام / نوع مل أنا الكولاجين و 300 ميكروغرام / مل خليط المصفوفة خارج الخلية المخففة في المصل خالية Dulbecco لتعديل النسر متوسطة (DMEM) - إلى كل من microchannels العليا والسفلى باستخدام التخلص منها ، معقمة 1 مل حقنة.
- Incubaالشركة المصرية للاتصالات الإعداد كله في 37 ° C ترطيب 5٪ CO 2 الحاضنة لمدة 1 ساعة.
- ديغا 50 مل من قبل تحسنت (37 درجة مئوية) كامل مستنبت (DMEM، و 20٪، والخامس / الخامس، الجنين المصل البقري (FBS)، و 100 وحدة / البنسلين مل، و 100 ميكروغرام / الستربتومايسين مل، aliquoted في 3 مل الحقنة) باستخدام نظام الترشيح 50 مل (0.45 ميكرومتر في حجم المسام) في BSC لمدة 1 دقيقة.
- تمرير المتوسطة قبل تحسنت من خلال نظام الترشيح والاستفادة بلطف على المدى المتوسط تصفيتها لمدة 1 دقيقة لإزالة أي فقاعات أو الغاز المذاب في المتوسط.
- ضع قسامة من المتوسط كاملة نزع الغاز في الحقنة مل 3 واحتضان في 37 درجة مئوية ترطيب 5٪ CO 2 الحاضنة لمدة 1 ساعة.
- توصيل جهازي 3 المحاقن مل تحتوي على نزع الغاز، قبل حرارة متوسطة ثقافة كاملة لو microchannels العلوية والسفلية.
- تدفق مستنبت خلية كاملة نزع الغاز في متناهية العليا باستخدام مضخة الحقنة في الحجميمعدل التدفق من 30 ميكرولتر / ساعة (أي ما يعادل إجهاد القص عند 0.02 داين / سم 2) في 37 درجة مئوية ترطيب 5٪ CO 2 حاضنة O / N.
- تشكيل Microengineered كاتشو-2 الزوائد في رقاقة والوتر على اساس.
- استخدام الخلايا كاتشو-2BBE مع عدد مرور ما بين 50 و 65.
- تنمو كاتشو-2 الخلايا في قارورة T75 التي تحتوي على مستنبت كامل في 37 درجة مئوية ترطيب 5٪ CO 2 الحاضنة لمدة 4-5 أيام للحصول على خلايا متكدسة تماما.
- إضافة 10 مل من الكالسيوم والمغنيسيوم 2+ 2+ خالية من برنامج تلفزيوني بشكل كامل متموجة كاتشو-2 الخلايا المزروعة في قارورة T75، وغسل الخلايا، ثم نضح من برنامج تلفزيوني. كرر هذه الخطوة مرتين.
- إضافة 1 مل من 0.05٪ التربسين / حل EDTA واحتضان في 37 درجة مئوية ترطيب 5٪ CO 2 الحاضنة لمدة 5 دقائق.
- resuspend الخلايا فصل مع 10 مل قبل تحسنت الكامل مستنبت الخلية (مع FBS) من قبل pipetting صعودا وهبوطا 3-5 مرات.
- تدور باستمرار تعليق الخلية التي كتبها جentrifugation في 500 x ج لمدة 5 دقائق، ثم إزالة طاف.
- و resuspend مرة أخرى مع 1 مل قبل تحسنت المتوسطة كاملة لضبط كثافة الخلية في ~ 1.5 × 10 5 خلية / سم 2 في الجهاز. استخدام عدادة الكريات لتقدير كثافة الخلية.
- ضخ 100 ميكرولتر من كاتشو-2 الخلايا معلق في متناهية العليا (التجويف الجانب) عن طريق وضع 1 مل حقنة واحدة تعلق على 25 G5 / 8 إبرة على مخرج الأنبوب متصلا متناهية العليا.
- المشبك جميع المداخل والمخارج من أنابيب متصلة و microchannels العليا والسفلى باستخدام مقاطع الموثق.
- احتضان الإعداد كله في 37 درجة مئوية، وترطيب 5٪ CO 2 الحاضنة لمدة 1 ساعة حتى يتسنى للفصل كاتشو-2 خلايا التمسك سطح غشاء مسامي.
- إزالة المشابك واستئناف تدفق مستنبت فقط على متناهية العليا في 30 ميكرولتر / ساعة باستخدام مضخة الحقنة حتى تتشكل خلايا أحادي الطبقة سليمة ل24-36 ساعة. استخدام الكونترا المرحلةر أو على النقيض تدخل الفرق (DIC) المجهري للتأكد من تقاطعات خلية خلية في أحادي الطبقة الخلية.
- عندما تتشكل خلايا أحادي الطبقة، يروي مستنبت في كلا العليا (التجويف) وانخفاض (الشعرية) microchannels في نفس معدل التدفق من 30 ميكرولتر / ساعة.
- تطبيق التشوهات الميكانيكية محاكاة مثل التمعج الاقتراحات 5،9.
- بدوره على مضخة فراغ مجهزة بالمعدات التوتر.
- ربط غرف فراغ إلى وحدة تحكم فراغ عبر أنابيب مع موصل الفولاذ المقاوم للصدأ.
- ضبط الحركة تمتد من 10٪ سلالة خلية يعني على تردد 0.15 هرتز مع دوري وضع وظيفة شرط على فراغ برمجيات التحكم، ثم انقر على زر "البدء".
- الحفاظ على تدفق مستمر من مستنبت (30 ميكرولتر / ساعة) في كل متناهية العلوية والسفلية إلى متموجة كاتشو-2 أحادي الطبقة تحت التشوهات الميكانيكية (10٪، 0.15 هرتز) ب ~ 100 ساعة.
ملاحظة: كاتشو-2 خلايا المقدمينالخضوع اآلن ذاته التشكل زغابة مع التوقعات 3D بتموجات امتدت نحو تجويف متناهية الظهارية 5،8-10.
- لمحاكاة وظائف على مستوى الجهاز من أمعاء الإنسان يعيش مع واجهة الأنسجة التجويف الشعرية في الأمعاء على واحد في رقاقة 10، اتبع الخطوات كما هو موضح.
- تنمو microengineered كاتشو-2 الزغب بتكرار الخطوات 2،1-2،2.
- تتدفق من قبل تحسنت شارك في الثقافة المتوسطة (خليط من كامل كاتشو-2 زراعة الخلايا المتوسطة وHMVECs الكامل مستنبت، 1: 1 ت / ت) لو microchannels العليا والسفلى في 30 ميكرولتر / ساعة.
- إدخال 100 ميكرولتر من فصل الخلايا العادية الشعرية الإنسان الاوعية الدموية الدقيقة البطانية (HMVECs، كثافة الخلية النهائية، ~ 5.0 × 10 5 خلية / سم 2) في أدنى متناهية من خلال طريقة مماثلة هو موضح في الخطوات من 2.2.3 إلى 2.2.9.
- وضع علاجه مستطيلة PDMS قطعة (0.5 سم × 1 سم × 1 سم؛ العرض × الارتفاع × طول؛ 15: 1، ث/ ث المطاط الصناعي: وكيل علاج) على الجزء العلوي من الجهاز القناة الهضمية على واحد في رقاقة، ثم الوجه إعداد الجهاز كله رأسا على عقب (أي متناهية العليا تواجه نحو الأسفل، ومتناهية أقل يواجه نحو الأعلى).
- احتضان الإعداد في 37 درجة مئوية، ترطيب 5٪ CO 2 الحاضنة لمدة 1 ساعة للسماح HMVECs نأت إلى التمسك سطح غشاء مسامي في متناهية أقل.
- تحصل على الإعداد كله من الحاضنة CO 2، والوجه الإعداد تكرارا.
- تدفق ما قبل تحسنت المتوسطة ثقافة مشتركة (خليط من كامل كاتشو-2 زراعة الخلايا المتوسطة وHMVECs الكامل مستنبت، 1: 1 ت / ت) في كل من microchannels العليا والسفلى في 30 ميكرولتر / ساعة مع حركات تمتد الميكانيكية ( 10٪، 0.15 هرتز) لمدة ثلاثة أيام على الأقل لتشكيل تقاطعات خلية خلية من أحادي الطبقة البطانية.
3. المضيف القناة الهضمية Microbiome المشارك الثقافة في Microdevice الوتر على واحد في رقاقة
- أداء ما قبل الثقافة سو الخلايا البكتيرية على النحو التالي للمشاركة في ثقافة المتعايشة الأمعاء microbiome على الزغب المعوية microengineered.
- Resuspend وبروبيوتيك البكتيريا خليط مسحوق تجميد المجفف في 10 مل من الخليط (1: 1، ت / ت) من تعقيمها البكتريا المكونة MRS مرق وعززت المطثية المتوسطة.
- ضبط كثافة الخلية النهائية إلى ما يقرب من 0.2 وحدة الكثافة الضوئية (600 نانومتر) وذلك بإضافة كمية مناسبة من المتوسطة، ثم قسامة 3 مل من التعليق الخلية الميكروبية في 10 مل أنبوب معقم المتاح.
- مكان الأنابيب التي تحتوي على معلق الخلايا الميكروبية في حاوية اللاهوائية. إضافة علبتين من اللاهوائي الكيس توليد الغاز في الحاوية. إغلاق غطاء الحاوية بإحكام واحتضان إعداد الحاويات دون أن تهتز في 37 درجة مئوية ترطيب 5٪ CO 2 حاضنة O / N.
- تلقيح Microbiome والمشارك الثقافة مع الخلايا المعوية الظهارية 5،10.
- إعداد 3 مل المحاقن التي تحتوي على antibioti نزع الغازخالية من ج خلية ثقافة المتوسط (أي DMEM مع 20٪ FBS). انظر 2.1.6 لإجراء التفريغ من مستنبت.
- إخراج إعداد كامل للجهاز القناة الهضمية على واحد في رقاقة تحتوي على الزغب microengineered من الحاضنة CO 2، ثم الانتقال إلى مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية.
- إزالة المحاقن متصلة أنابيب مرتبطة و microchannels العلوية والسفلية. توصيل الحقن أعد 3.2.1 إلى الجهاز، يعود إلى الحاضنة CO 2، ثم تتدفق هذه الوسيلة ثقافة خالية من المضادات الحيوية لمدة 12 ساعة قبل البذر من microbiome.
- تدور باستمرار ما قبل مثقف بروبيوتيك خلايا خليط البكتيرية (انظر الخطوات في 3.1) في 10000 x ج لمدة 5 دقائق. نضح من طاف به فراغ، resuspend ثم في المتوسط DMEM مجانا المضادات الحيوية (كثافة الخلية النهائية، ~ 1.0 × 10 7 خلية / مل).
- يبث في تعليق خلية في الجانب تجويف متناهية تحتوي على الزغابات المعوية "خالية من الجراثيم" باستخدام 1 مل حقنة واحدة تعلق على 25G5 / 8 إبرة. السماح للالتزام الخلايا الميكروبية إلى السطح القمي من الزغابات المعوية ل~ 1.5 ساعة دون تدفق لقط إلى كل نهاية الأنبوب.
- يروي قبل تحسنت مستنبت مجانا للمضادات الحيوية في كل من microchannels العليا والسفلى في 40 ميكرولتر / ساعة مع تشوهات متوازن دوري (10٪، 0.15 هرتز).
- للثقافة مشتركة من البروتين مضان أخضر (GFP) -labeled E. القولونية (GFP كولاي، غير المسببة للأمراض DH5 ألفا كولاي المضيف) 10،11 الخلايا مع الزغب microengineered، قبل زراعة GFP E. خلايا القولونية في المتوسط LB تعقيمها عند 37 درجة مئوية تحت تهز حالة (200 دورة في الدقيقة) لمدة 12 ساعة. كرر الإجراء من 3.2.5 إلى 3.2.6 للقيام ثقافة مشتركة من GFP E. خلايا القولونية مع الزغب microengineered.
- خلايا صورة 5،8-10
- أداء مدينة دبي للإنترنت، epifluorescence، أو مسح بالليزر متحد البؤر المجهري لتسجيل الميكروبية والظهارية التشكل 5،8،10.
- للتصوير مدينة دبي للإنترنت، واخراج الإعداد من الميكروسيستم القناة الهضمية على واحد في رقاقة من الحاضنة CO 2، ضع إعداد الجهاز على مسرح المجهر، ثم تسجيل مورفولوجيا الخلايا.
- للتصوير مضان من ظهارة زغابة، وتدفق PBS لغسل الخلايا في 100 ميكرولتر / ساعة لمدة 10 دقيقة.
- إصلاح الزغب مع 4٪ (ث / ت) لامتصاص العرق لمدة 15 دقيقة. ثم تتدفق برنامج تلفزيوني لغسل الخلايا في 100 ميكرولتر / ساعة لمدة 10 دقيقة.
- Permeabilize الزغابات مع 0.3٪ (ت / ت) تريتون X-100 المخفف في برنامج تلفزيوني يحتوي على 2٪ (ث / ت) زلال المصل البقري (BSA) لمدة 10 دقيقة. ثم تتدفق برنامج تلفزيوني لغسل الخلايا في 100 ميكرولتر / ساعة لمدة 10 دقيقة.
- خلايا كتلة مع 2٪ (ث / ت) حل جيش صرب البوسنة في برنامج تلفزيوني لمدة 1 ساعة. ثم تتدفق برنامج تلفزيوني لغسل الخلايا في 100 ميكرولتر / ساعة لمدة 10 دقيقة.
- إضافة 300 نيوتن متر من 4، هيدروكلوريد 6 diamidino-2-phenylindole (دابي) محلول مخفف في برنامج تلفزيوني لتلطيخ النووي تحت حماية الخفيفة.
- إضافة 25 وحدة / مل من phalloidin الفلورسنت(المكورات Phalloidin-CF647) الذائب في برنامج تلفزيوني لتلطيخ F-الأكتين تحت حماية الخفيفة.
- تسجيل صور من الخلايا الملون fluorescently باستخدام ليزر المسح المجهر متحد البؤر.
ملاحظة: تم تطبيق الهدف 25X مع زووم بصري مناسب خلال الفحص المجهري متحد البؤر. في الشكل 3B، تم استخدام حوالي 525X التكبير.
- أداء مدينة دبي للإنترنت، epifluorescence، أو مسح بالليزر متحد البؤر المجهري لتسجيل الميكروبية والظهارية التشكل 5،8،10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
لمحاكاة الأمعاء النظام البيئي المضيف microbiome البشري في المختبر، فمن من الضروري وضع بروتوكول تجريبي لإعادة تشكيل مستقرة طويلة الأجل ثقافة مشتركة من بكتيريا الأمعاء والخلايا الظهارية في الأمعاء البشرية في ظل الظروف الفسيولوجية مثل الميكانيكا مثل التمعج وتدفق السوائل. هنا، نحن نستخدم بيوميمتيك microdevice القناة الهضمية على واحد في رقاقة (الشكل 1A) للمشاركة في الثقافة الحية الخلايا الميكروبية في اتصال مباشر مع الذين يعيشون الزغب البشري لفترة أسبوع أو أكثر في المختبر. الخلايا الظهارية في الأمعاء تشكل بشكل عفوي الزغب متباينة بشكل جيد عند المثقف على جانب واحد من الغشاء المغلفة ECM التي يسهل اختراقها في قناة واحدة من جهاز ميكروفلويديك 2-قناة في وجود تدفق السوائل ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية والميكانيكية التشوهات الحلقية 5. الزغابات microengineered تكرار هياكل ووظائف الزغابات المعوية صغيرة الإنسان، بما في ذلك formati على الخلايا الطلائية المبطنة من قبل الحدود فرشاة قمي، أقبية التكاثري القاعدية مع الهجرة وتمايز الخلايا ابنة تتقدم من سرداب إلى طرف زغابة، ومستويات عالية من إنتاج المخاط، وتعزيز النشاط يتفاعل المخدرات، وزيادة امتصاص الجلوكوز 8. الخلايا الحية البطانية يمكن تربيتها على الجانب الآخر من نفس غشاء لإعادة واجهة الأنسجة الأنسجة من جدار الأمعاء، والخلايا المناعية يمكن تربيتها في النظام وكذلك (10). للتحقق من صحة وظيفة واقية من الخلايا الظهارية في الأمعاء، مشددة حاجز تقاطع الزغابات المعوية التي تشكلت في القناة الهضمية على واحد في رقاقة وquantitated بشكل متقطع عن طريق قياس المقاومة الكهربائية بطريق الظهارة (طير) 5،10،12. مطلوب مراقبة روتينية من قيمة طير لتقدير سلامة أحادي الطبقة خلية أو الزغابات المعوية في كل منعطف (على سبيل المثال، قبل إضافة البكتيريا في التجويف).
هين الصفحات = "1"> لإعادة تأسيس النظام البيئي المضيف ميكروب، الخلايا الحية الميكروبية معلق في مستنبت الخلية خالية من المضادات الحيوية (كثافة الخلايا، ~ 1.0 × 10 7 خلية / مل) يتم تلقيح في تجويف متناهية الظهارية (الشكل 1B، "تلقيح"). بعد الخلايا الميكروبية تلتزم على السطح القمي من الزغب في غياب تدفق لل~ 1.5 ساعة (1B الشكل، "مرفق")، وتدفق الفسيولوجية (40 ميكرولتر / ساعة) يتم استئناف من خلال كل القنوات مع تشوهات الميكانيكية الدورية (10٪ الضغط على 0.15 هرتز) لإزالة بكتيريا الأمعاء غير منضم والمواد المغذية تزويد كل من الخلايا الظهارية البكتيرية والزغبة (1B الشكل "، المشارك الثقافة"). يسمح هذا البروتوكول شارك في ثقافة الاستعمار مستقر من أنواع متعددة من البكتيريا بروبيوتيك في الفضاء intervillus، مع microcolonies البكتيري قابلة للحياة أن يحتفظ به لمدة تصل إلى أسبوعين في الثقافة المشتركة (أرقام 2A، 2B). في هذه الدراسة، المشاركصياغة بروبيوتيك mmercial التي تحتوي على خليط من 8 مختلفة اهوائية أو إلزام، سلالات بروبيوتيك من الشقاء بريف، B. الطويل ل، B. الطفلية، الملبنة الحمضة، L. plantarum، L. paracasei، L. يستخدم بلغاري، وthermophiles العقدية.
هذه الطريقة ثقافة مشتركة يمكن تطبيقها على نطاق واسع لمحاكاة الأمعاء النظام البيئي المضيف ميكروب البشري. على سبيل المثال، غير المسببة للأمراض GFP E. يمكن أن يشترك في تربيتها القولونية على سطح الزغابات المعوية التي تزرع في جهاز الأمعاء على واحد في رقاقة. واستنادا إلى نفس البروتوكول هو موضح أعلاه، تلتزم GFP E. القولونية الخلايا على الزغابات تنمو من خلايا مفردة في 1 ساعة إلى microcolonies متعددة مع 3 أيام (الشكل 3A، 1 ساعة مقابل 72 ساعة) التي تحدد موقع في الأماكن intervillus (الشكل 3B، 1 ساعة مقابل 72 ساعة) عندما مثقف تحت يتقاطرون تدفق (40 ميكرولتر /ساعة) في وجود تشوهات مثل التمعج (10٪، 0.15 هرتز).
الشكل 1. الوتر على واحد في رقاقة البشري نظام microphysiological لالمضيف الأمعاء microbiome ثقافة مشتركة. (A) وصورة (يسار) والتخطيطي (اليمين) من قناة 2، القناة الهضمية على واحد في رقاقة جهاز ميكروفلويديك. تشير الأسهم اتجاه تدفق مستنبت (الأزرق ومتناهية العليا، الحمراء، متناهية في القاع). (ب) الرسوم التخطيطية للإجراءات المضيف الأمعاء microbiome ثقافة مشتركة في القناة الهضمية على واحد في رقاقة. بعد تشكل الخلايا الظهارية في الأمعاء الدقيقة الزوائد (~ 100 ساعة)، يتم إدخال الخلايا الميكروبية معلق في مستنبت الخلية متناهية التجويف (التلقيح)، ثم يتم إيقاف تدفق مستنبت ل~ 1.5 ساعة (مرفق). بعد تلتزم الخلايا الميكروبية إلى السطح القمي من الزغابات المعوية، يتم استئناف تدفق (شركة ğ ثقافة). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. المشارك الثقافة من البكتيريا بروبيوتيك متعددة مع الزغابات المعوية في رقاقة والقناة الهضمية على اساس (أ) تبين وهناك فرق التدخل النقيض من صورة مجهرية لمستعمرة مجهرية من الخلايا البكتيرية بروبيوتيك المتنامية بين الزغابات في رقاقة القناة الهضمية. (ب) وجهة نظر التكبير طاقة أعلى من ألف (مربع منقط أسود) تبين مستعمرة مجهرية من الخلايا البكتيرية بروبيوتيك (السهم الأحمر). V، الزغب. شريط النطاق = 20 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
لدى عودتهم 3 "SRC =" / ملفات / ftp_upload / 54344 / 54344fig3.jpg "/>
الشكل 3. المشارك ثقافة غير المسببة للأمراض، GFP المسمى E. القولونية مع الزغابات المعوية في رقاقة والقناة الهضمية على اساس. (A) مضان متراكب ومدينة دبي للإنترنت الصور المجهرية التي اتخذت في 1 و 72 ساعة، وعرض استعمار GFP E. القولونية على الزغب المعوية التي تزرع في رقاقة والقناة الهضمية على اساس. (ب) وجهات النظر التكبير عالية الطاقة من الميكروسكوب متحد البؤر مضافين مضان التي اتخذت في 1 و 72 ساعة تظهر نمو GFP المسمى E. القولونية من خلية واحدة (السهم الأحمر) إلى مستعمرة مجهرية (السهم الأبيض). الأزرق، نوى. أرجواني، F-الأكتين. شريط النطاق = 30 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
فهم التفاعلات المضيف microbiome أمر بالغ الأهمية للنهوض الطب. ومع ذلك، ونماذج زراعة الخلايا التقليدية تؤدى في طبق من البلاستيك أو لوحة جيدا ثابتة لا تدعم مستقرة ثقافة مشتركة من الخلايا المعوية الإنسان مع الذين يعيشون الميكروبات الأمعاء لأكثر من 1-2 أيام لأن الخلايا الميكروبية في الغالب اكتسى خلايا الثدييات في المختبر. السكان الميكروبية زيادة في النمو يستهلك بسرعة الأوكسجين والمواد المغذية، بعد ذلك إنتاج كمية زائدة من النفايات الأيضية (على سبيل المثال، والأحماض العضوية)، الذي تعرض لخطر كبير وظائف حاجز الأمعاء وتسبب الأمعاء موت الخلايا الظهارية. وبالتالي، منع فرط الجراثيم التي تسبب نضوب المغذيات وتراكم النفايات الميكروبية أمرا حاسما لاستمرار قابلة للحياة التعايش في استضافة microbiome لفترة طويلة (من أيام إلى أسابيع) في المكروية ثقافة مشتركة.
للتغلب على هذه التحديات، وmicrophysiologicalالقناة الهضمية على واحد في رقاقة وضعت 5،8 جهاز لتشكيل متباينة تماما الزغابات المعوية الإنسان والحفاظ على المكروية ثابتة للدولة من تجويف الأمعاء في المختبر. تصميم وظيفية وحدات (على سبيل المثال، الموائع الدقيقة غرف خلية تدفق، يحركها الفراغ التشوهات الحلقية) من القناة الهضمية على واحد في رقاقة يتم تعديل الجهاز ميكروفلويديك لمحاكاة بالضبط الفسيولوجية والبدنية والمكروية الكيميائية للميكروبات شارك في ثقافة 5، 10. تم تحديد إجهاد القص المطبقة في ثقافة ميكروفلويديك القناة الهضمية على واحد في رقاقة من قبل مجموعة الفسيولوجية تدفق اللمعية في أمعاء الإنسان 5،13. للمضيف ميكروب ثقافة مشتركة، والحفاظ على "حالة من الثبات" من المجتمعات الميكروبية في متناهية اللمعية من على رقاقة القناة الهضمية على اساس أمر بالغ الأهمية في دعم كيميائيا وغذائيا الظروف الممكنة. في الميكروسيستم القناة الهضمية على واحد في رقاقة، فمن الممكن لتقدير حالة استقرار داخل اللمعية في القناة الهضمية على واحد في رقاقة من measuriنانوغرام الرقم الهيدروجيني للثقافة المتوسط وكثافة الخلايا الميكروبية. لأن مستنبت الطازجة تدفق مستمر من خلال و microchannels، سواء الميكروبية والظهارية الخلايا لا تخضع لاستنزاف المواد الغذائية عندما يتم تحسين كثافة البذر الأولية من الخلايا الميكروبية ومعدل التدفق الحجمي للثقافة المتوسط. المتوسط مكيفة مرورا متناهية يتدفق بمعدل تعريف الحجمي تدفق (هنا، 40 ميكرولتر / ساعة)، لذلك النفايات الأيضية (على سبيل المثال، والأحماض العضوية)، وكذلك secretomes الخلوية (على سبيل المثال، السيتوكينات) تتم إزالة باستمرار من المشارك المكروية الثقافة. وبالتالي، يمكن اعتبار الجهاز القناة الهضمية على واحد في رقاقة بأنه "مفاعل حيوي مستمر" مع المكروية حالة استقرار الضرورية والكافية لغسل فعال للقضاء على الخلايا الجرثومية غير منضم أو متضخمة من تجويف متناهية الأمعاء، مما يسهل جيل من مكانة الميكروبية مستقرة غضون 2-3 أيام.
هناك اتحاد كرة القدم الحاسمةctors التي يجب أن تعتبر حل لمشاكل الناجح ثقافة مشتركة من الخلايا الميكروبية في الزغابات المعوية. أولا، لا بد من تحديد فترة حضانة الأمثل المطلوبة للحصول على الخلايا الميكروبية لنعلق على السطح من الزوائد بسبب التصاق الجراثيم يمكن أن تختلف بين الأنواع الميكروبية. على سبيل المثال، بكتيريا بروبيوتيك، مثل rhamnosus اكتوباكيللوس جغ 5، عموما تتطلب ~ 1،0-1،5 ساعة لنعلق، ولكن بعض الأنواع الميكروبية أخرى قد تتطلب أقصر (على سبيل المثال، الميكروبات الممرضة) أو وقتا أطول، وهذا يتوقف على حركية الالتصاق بهم 14. ثانيا، ينبغي تحديد كثافة البذر الأولية للخلايا الجرثومية بسبب الإفراط في أعداد الخلايا الميكروبية قد يؤدي إلى نمو البكتيريا في المرحلة المبكرة من الثقافة المشتركة، التي يمكن أن تتداخل مع تحقيق مستقرة ثابتة للدولة. لتحسين هذه الكثافة البذر، فمن المستحسن أن تميز الشخصية النمو من سلالة الميكروبية المستهدفة في عنتيبيمستنبت الخلية الحرة أذني على مختلف كثافة البذر. وأخيرا، قد تكون هناك حاجة إلى تعديل معدل التدفق الحجمي اعتمادا على أنواع الجراثيم. على سبيل المثال، سوف تكون هناك حاجة زيادة معدلات تدفق إذا كانت الخلايا الجرثومية تتكاثر بسرعة كبيرة. انها أكدت التجربة أن معدلات تدفق تصل إلى 300 ميكرولتر / ساعة (0.2 داين / سم 2) لا تمس وظيفة حاجز ومورفولوجيا الخلايا من الزغابات microengineered (لا تظهر البيانات). على الرغم من أن rhamnosus اكتوباكيللوس جغ 5، الافراط في مكافحة خليط بروبيوتيك، VSL # 3، مختبر غير المسببة للأمراض سلالة E. القولونية وكذلك E. enteroinvasive الإمراض كولاي سلالة 10 طبقت بنجاح على المدى الطويل التعاون ثقافة في لرقاقة القناة الهضمية على اساس، لا تزال هناك حاجة لاختبار مجموعة متنوعة من الأنواع الميكروبية من الجراثيم المتعايشة الأمعاء إلى الكائنات الحية الدقيقة المسببة للأمراض المعدية. يجب التفكير في cultivability من الخلايا الميكروبية في المختبر في وجود أو عدم وجودمن الخلايا المضيفة في سياق التعايش والتطور، حيث اختبار زراعة microbiome الأمعاء unculturable يمثل تحديا للفضول. وأخيرا، بروتوكول قوي للثقافة مشتركة من كل من الميكروبات الهوائية واللاهوائية في القناة الهضمية على واحد في رقاقة هو الحاجة غير الملباة الحرجة التي يتم اكتشافها في المستقبل.
هناك خطوات يمكن اتخاذها لزيادة تحسين النموذج، مثل استخدام الظهارية في الأمعاء الأساسي أو الخلايا الجذعية غير متمايزة من المواضيع الإنسان الفردية الذين لديهم أمراض الجهاز الهضمي محددة مثل مرض كرون أو سرطان القولون والمستقيم. أو التي يسببها الخلايا الجذعية المحفزة (iPSCs). ومع ذلك، مع تزايد الاهتمام في دور microbiome الإنسان في تنسيق صحة الإنسان والمرض، طريقة لدينا ثقافة مشتركة في استضافة microbiome له أهمية هائلة وإمكانات ليتم تطبيقها على تقليد النظم الإيكولوجية في استضافة microbiome الأخرى الموجودة في جسم الإنسان (على سبيل المثال وتجويف الفم 15، والجلد 16 أو تي البولي التناسليract 17). وأخيرا، وهذه الطريقة ثقافة مشتركة قد تبتكر عملية تطوير العقاقير التقليدية من خلال تحسين القدرة على التنبؤ من حيث مدى التأثيرات الأمعاء microbiome على التوافر البيولوجي، وفعالية، وسمية المركبات الدوائية الجديدة. معا، يمكن للنظام microphysiological القناة الهضمية على واحد في رقاقة توفير منصة قوية لإنشاء المكروية المعوية ثابتة للدولة المستقرة التي يمكن استخدامها لإعادة المضيف microbiome النظام البيئي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) containing 25 mM glucose and 25 mM HEPES | Gibco | 10564-011 | Warm it up at 37 °C in a water bath. |
| Difco Lactobacilli MRS broth | BD | 288120 | Run autoclave at 121 °C for 15 min. |
| Poly(dimethylsiloxane) | Dow Corning | 3097358-1004 | 15:1 (w/w), PDMS : cureing agent |
| Caco-2BBE human colorectal carcinoma line | Harvard Digestive Disease Center | Human colorectal adenocarcinoma | |
| Heat-inactivated FBS | Gibco | 10082-147 | 20% (v/v) in DMEM |
| Penicillin-streptomycin-glutamine | Gibco | 10378-016 | 1/100 dilution in DMEM |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Molecular Probes | D1306 | Nuclei staining |
| Phalloidin-CF647 conjugate (25 units/ml) | Biotium | 00041 | F-actin staining |
| Flexcell FX-5000 tension system | Flexcell International Corporation | FX5K | Peristalsis-like stretcing motion (10% cell strain, 0.15 Hz frequency) |
| Inverted epifluorescence microscope | Zeiss | Axio Observer Z1 | Imaging, DIC |
| Scanning confocal microscope | Leica | DMI6000 | Imaging, Fluorescence |
| UVO Cleaner | Jelight Company Inc | 342 | Surface activation of the gut-chip |
| Type I collagen | Gibco | A10483-01 | Extracellular matrix component for cell culture into the chip |
| Matrigel | BD | 354234 | Extracellular matrix component for cell culture into the chip |
| 1 ml disposable syringe | BD | 309628 | Cell and media injection stuff |
| 25 G 5/8 needle | BD | 329651 | Cell and media injection stuff |
| Syringe pump | Braintree Scientific Inc. | BS-8000 | Injection equipment into the chip |
| VSL#3 | Sigma-Tau Pharmaceuticals | 7-45749-01782-6 | A formulation of 8 different commensal gut microbes |
| Reinforced Clostridial Medium | BD | 218081 | Anaerobic bacteria culture medium |
| GasPak EZ Anaerobe Container System with Indicator | BD | 260001 | Anaerobic gas generating sachet |
| 4% paraformaldehyde | Electron Microscopy Science | 157-4-100 | Fixing the cells for staining |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Permeabilizing the cells |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7030 | Blocking agent for staining of the cells |
| Corona treater | Electro-Technic Products | BD-20AC | Plasma generator for fabrication of the chip |
| Steriflip | Millipore | SE1M003M00 | Degasing the complete culture medium |
| Disposable hemocytometer | iNCYTO | DHC-N01 | For manual cell counting |
References
- Turnbaugh, P. J., et al. An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest. Nature. 444, 1027-1031 (2006).
- Tremaroli, V., Backhed, F. Functional interactions between the gut microbiota and host metabolism. Nature. 489, 242-249 (2012).
- Sekirov, I., Russell, S. L., Antunes, L. C. M., Brett Finlay, B. Gut Microbiota in Health and Disease. Physiol. Rev. 90, 859-904 (2010).
- Turnbaugh, P. J., et al. The human microbiome project. Nature. 449, 804-810 (2007).
- Kim, H. J., Huh, D., Hamilton, G., Ingber, D. E. Human gut-on-a-chip inhabited by microbial flora that experiences intestinal peristalsis-like motions and flow. Lab Chip. 12, 2165-2174 (2012).
- Round, J. L., Mazmanian, S. K. The gut microbiota shapes intestinal immune responses during health and disease. Nat Rev Immunol. 9, 313-323 (2009).
- Garrett, W. S., et al. Communicable ulcerative colitis induced by T-bet deficiency in the innate immune system. Cell. 131, 33-45 (2007).
- Kim, H. J., Ingber, D. E. Gut-on-a-Chip microenvironment induces human intestinal cells to undergo villus differentiation. Integr Biol. 5, 1130-1140 (2013).
- Huh, D., Kim, H. J., et al. Microfabrication of human organs-on-chips. Nat Protoc. 8, 2135-2157 (2013).
- Kim, H. J., Li, H., Collin, J. J., Ingber, D. E. Contributions of microbiome and mechanical deformation to intestinal bacterial overgrowth and inflammation in a human gut-on-a-chip. Proc. Natl. Acad. Sci. 113, E7-E15 (2016).
- Miller, W. G., Lindow, S. E. An improved GFP cloning cassette designed for prokaryotic transcriptional fusions. Gene. 191, 149-153 (1997).
- Odijk, M., et al. Measuring direct current trans-epithelial electrical resistance in organ-on-a-chip microsystems. Lab Chip. 15, 745-752 (2015).
- Lentle, R. G., Janssen, P. W. Physical characteristics of digesta and their influence on flow and mixing in the mammalian intestine: a review. J Comp Physiol B. 178, 673-690 (2008).
- Granato, D., et al. Cell surface-associated lipoteichoic acid acts as an adhesion factor for attachment of Lactobacillus johnsonii La1 to human enterocyte-like Caco-2 cells. Appl Environ Microbiol. 65, 1071-1077 (1999).
- Dewhirst, F. E., et al. The human oral microbiome. J Bacteriol. 192, 5002-5017 (2010).
- Grice, E. A., Segre, J. A. The skin microbiome. Nat Rev Microbiol. 9, 244-253 (2011).
- Hay, P. E., et al. Abnormal bacterial colonisation of the genital tract and subsequent preterm delivery and late miscarriage. Br Med J. 308, 295-298 (1994).
