Summary
Vi beskriver en in vitro-protokol til at co-kultur gut microbiome og intestinal villi i en længere periode ved anvendelse af en human gut-on-a-chip microphysiological system.
Abstract
Her beskriver vi en protokol til at udføre langsigtede co-kultur af flere arter menneskelige tarm microbiome med microengineered intestinale villi i en menneskelig gut-on-a-chip microphysiological enhed. Vi rekapitulere den intestinale lumen-kapillære væv grænseflade i en mikrovæskeanordning, hvor fysiologiske mekaniske deformationer og flow væske shear konstant anvendes til at efterligne peristaltikken. I lumen mikrokanalplade, humane intestinale epiteliale Caco-2 celler dyrkes for at danne en "kim-fri" villus epithelium og regenerere tyndtarmen villi. Pre-dyrkede mikrobielle celler podes i lumen side at etablere en vært-mikrobe økosystem. Efter mikrobielle celler klæbe til den apikale overflade af villi, er fluidstrømning og mekaniske deformationer genoptaget for at fremstille en stabil mikromiljø, hvori frisk dyrkningsmedium konstant tilføres og ubundne bakterier (samt bakterielle affald) fjernes kontinuerligt. Efter forlænget co-kultur from dage til uger, findes flere mikrokolonier at være tilfældigt placeret mellem villi, og begge mikrobielle og epitelceller forbliver levedygtige og funktionelle i mindst en uge i kultur. Vores co-kultur protokol kan tilpasses til at tilvejebringe en alsidig platform for andre værtsplanter-microbiome økosystemer, der kan findes i forskellige humane organer, der kan lette in vitro-undersøgelse af den rolle af humant microbiome for tilrettelæggelsen sundhed og sygdom.
Introduction
Den humane tarm huser et fantastisk forskelligartet array af mikrobielle arter (<1.000 arter) og en enorm række af mikrobielle celler (10 gange mere end de humane værtsceller) og gener (100 gange mere end det humane genom) 1. Disse humane microbiomes spiller en central rolle i metabolizing næringsstoffer og xenobiotika, regulering immunresponser, og opretholde intestinal homeostase 2. Ikke overraskende, givet disse forskellige funktioner, den kommensale tarm microbiome modulerer udstrakt sundhed og sygdom 3. Således at forstå betydningen af tarmen microbiome og vært-mikrobe interaktioner er af stor betydning for at fremme gastrointestinal (GI) sundhed og udforske nye lægemidler til tarmlidelser 4. Men de eksisterende in vitro tarmen modeller (f.eks, statiske kulturer) begrænse host-microbiome co-kultur til en kort periode (<1 dag), fordi mikrobielle celler gror og kompromittere tarmbarrierenfunktion 5. Surrogat dyremodeller (f.eks kim-fri 6 eller genetisk manipulerede mus 7) også ikke almindeligt anvendt til at studere vært-gut microbiome krydstale fordi kolonisering og stabil opretholdelse af menneskets tarme microbiome er vanskelige.
For at overvinde disse udfordringer, vi for nylig udviklet en biomimetisk menneske "Gut-on-a-chip" microphysiological (figur 1A, venstre) at efterligne vært-gut microbiome samspil, der opstår i levende menneske tarm 5,8. Tarmen-on-a-chip microdevice indeholder to parallelle mikrofluidkanaler adskilt af en fleksibel, porøs, ekstracellulær matrix (ECM) overtrukne membran foret med human intestinal epitel Caco-2 celler, der efterligner den intestinale lumen-kapillære væv interface (figur 1A , højre) 9. Vakuum-drevet cykliske rytmiske deformationer fremkalde fysiologiske mekaniske deformationer, der efterligner ændringer normalt induced ved peristaltik (figur 1A, højre). Interessant, når Caco-2-celler dyrkes i tarmen-on-a-chip til mere end 100 timer, de spontant danner tredimensionale (3D) intestinal villi med tight junctions, apikale børste grænser, proliferative celler begrænset til basale krypter, slimproduktion, øget stofmetaboliserende aktivitet (fx cytochrom P450 3A4, CYP3A4), og øget glucose reuptake 8. I denne "kim-fri" mikromiljø, var det muligt at co-kultur den probiotiske Lactobacillus rhamnosus GG eller et terapeutisk dannelse af en probiotisk bakterie blanding med vært epitelceller i op til to uger 5,10.
I denne undersøgelse beskriver vi detaljeret protokol til at udføre host-gut microbiome co-kultur i tarmen-on-a-chip enhed i en længere periode. Desuden diskuterer vi kritiske spørgsmål og potentielle udfordringer, der skal i betragtning til en bred anvendelse af denne vært-microbiome co-kultur protokol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. mikrofabrikation af en Gut-on-a-chip-enhed
Bemærk: gut-on-a-chip er en mikrofluidanordning lavet af gennemsigtigt, gaspermeabelt siliconepolymer (polydimethylsiloxan, PDMS), der indeholder to parallelle mikrokanaler (1 mm bredde x 150 um højde x 1 cm længde) adskilt af en fleksibel porøs (10 um i porediameter, 25 um i afstand pore pore) PDMS membranen 5,9. Fabrikere tarmen-on-a-chip (figur 1A, venstre) efter de angivne trin.
- Mikrofabrikation Procedure af Gut-on-a-chip 5,9.
- Forbered uhærdede, afgasset PDMS ved blanding af PDMS præpolymeren og hærdningsmidlet (15: 1 vægt / vægt), og placer den i vakuumdesikkator i 30 min.
- Hæld 30 g og 3 g uhærdet, afgasset PDMS på hver siliciumformen der har SU-8-baserede micropatterns af de øvre og de nedre mikrokanaler i tarmen-on-a-chip hhv. Derefter hærde ved 60 ° C i en tørreovn i løst 4 timer.
- Afformning de øvre og nedre PDMS lag fra hver siliciumformen ved at skære rundt om kanten med en kirurgisk skalpel. Punch 6 huller (to fjorde, to udløb, og to vakuumkamre) ved hjælp af en biopsi puncher (2,0 mm i diameter hul).
- Forbered den porøse membran ved at hælde 10 g af uhærdet og afgasset PDMS på en silaniseret silicium wafer indeholdende post-arrays med cirkulære søjler (10 um i diameter, 25 um i højden) overlejring med en flad, silaniseret PDMS bærelaget (15: 1, w / w; 1 cm tyk). Placer en 3 kg vægt presser på opsætningen og helbredelse polymeren ved 60 ° C i 12 timer eller længere.
- Afformning opsætningen af en porøs PDMS membran klæbet til PDMS support plade fra siliciumskiven ved forsigtigt at løfte op i hjørnet af pladen fra skiven, og skrælning indtil den porøse PDMS membran er fuldstændig frigjort fra skiven.
- Udsætte kanal side af et øvre lag (PDMS, 15: 1, vægt / vægt) og den porøse membran side til den plasma genereret af en håndholdt koronabehandler i 1 min, og 3 sek hhv.
- Placer plasma-behandlede overflader af porøse PDMS membran og øvre mikrokanal lag i en overensstemmende kontakt ved at placere hvert stykke parallelt uden luftbobler.
- Inkubér hele opsætningen ved 80 ° CO / N for irreversibel binding af de to PDMS lag.
- Skrælle PDMS bærelag fra samlingen af et øvre lag med en porøs membran ved forsigtigt at løfte op i hjørnet af støttelaget, og skrælning indtil bærelaget er fuldstændig frigjort fra det øvre lag med membranen.
- Riv de dele af denne membran placeret over vakuum kamre (de to kamre er placeret på hver side af den vigtigste kanal) ved hjælp af en fin-tip pincet til at gøre hule vakuumkamre.
- Eksponere den side med membranen fastgjort på overdelen og den side med kanalerne indgraveret på den nedre stykke til plasma i en samme måde som beskrevet in trin 1.1.6 i 1 min.
- Juster øverste mikrokanalplade lag med en porøs membran og det nedre lag med en konform kontakt ved at placere hvert stykke parallelt uden luftbobler under en Stereoskopet.
- Cure hele opsætningen i en tør ovn ved 80 ° CO / N for at fremstille en komplet skala gut-on-a-chip mikrofluidanordning indeholdende to hule vakuumkamre siden af mikrofluid celle kanal.
- Tilslut slangen til indløbet og udløbet af hver port forbundet til den øvre eller den nedre mikrokanalerne i en gut-on-a-chip via en 90 ° bøjet rustfrit stål stumpendet nål.
- Tilslut slangen til hullerne forbundet med vakuumkamrene bruger 90 ° bøjet rustfrit stål stumpendet nål.
- Steriliser mikrokanalerne og rør ved at strømme 70% (v / v) ethanol under anvendelse af en 1 ml steriliseret engangssprøjte.
- Tør de mikrokanaler og slanger i en 60 ° C tør ovn O / N.
2. Vækst af mikromaskineob- Intestinal Villi i Gut-on-a-chip-enhed
- Seed intestinale epitelceller (f.eks Caco-2BBE) på en Gut-on-a-chip Microdevice 5,9.
- Sterilisere anordningen med 70% (v / v) ethanol (se trin 1.4) ved anvendelse af en 1 ml steriliseret engangssprøjte efterfulgt af tørring i en 60 ° C tør ovn O / N (se trin 1.5) før aktivering overflade.
- Udsætte den komplette opsætning af en gut-on-a-chip mikrosystem (dvs. et legeme af tarmen-on-a-chip forbundet med slanger) for UV-lys (253,7 nm) og ozon samtidigt i 40 min.
- Køl ned enheden ved stuetemperatur i 15 minutter under UV-lys i en biosikkerhed kabinet (BSC).
- Indføre 100 pi ECM overtræk opløsnings- en blanding af 50 pg / ml type I collagen og 300 ug / ml ekstracellulær matrix blandingen fortyndet i serumfri Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) - i både øvre og nedre mikrokanaler anvendelse af en engangs , steril 1 ml sprøjte.
- Incubate hele opsætningen i en 37 ° C befugtet 5% CO2 inkubator i 1 time.
- Degas 50 ml foropvarmet (37 ° C) komplet dyrkningsmedium (DMEM, 20%, v / v, føtalt bovint serum (FBS), 100 enheder / ml penicillin, og 100 ug / ml streptomycin; alikvoteret i en 3 ml engangssprøjte) anvendelse af en 50 ml filtreringssystem (0,45 um porestørrelse) i BSC i 1 min.
- Før forvarmet medium gennem filtrering system og tryk forsigtigt på filtrerede medium for 1 min for at fjerne eventuelle bobler eller opløst gas i mediet.
- Placer alikvot af afgasset komplet medium i en 3 ml engangssprøjte og inkuberes i et 37 ° C befugtet 5% CO2 inkubator i 1 time.
- Forbind to 3 ml engangssprøjter indeholdende afgasset, forvarmet komplet dyrkningsmedium til de øvre og nedre mikrokanaler.
- Flow den afgasset komplet celledyrkningsmedium ind i den øvre mikrokanal anvendelse af en sprøjtepumpe i den volumetriskestrømningshastighed på 30 gl / time (svarende til forskydningsspændingen ved 0,02 dyn / cm2) i en 37 ° C befugtet 5% CO2 inkubator O / N.
- Dannelse af Microengineered Caco-2 Villi i Gut-on-a-chip.
- Brug Caco-2BBE celler med passagen tal mellem 50 og 65.
- Grow Caco-2-celler i en T75 kolbe indeholdende komplet dyrkningsmedium i en 37 ° C befugtet 5% CO2 inkubator i 4-5 dage for at opnå fuldt konfluente celler.
- Der tilsættes 10 ml Ca 2+ og Mg 2+ -fri PBS til fuldt sammenflydende Caco-2 celler dyrket i en T75 kolbe, vask celler, derefter suge ud PBS. Gentag dette trin to gange.
- Der tilsættes 1 ml 0,05% trypsin / EDTA-opløsning og inkuber i et 37 ° C befugtet 5% CO2-inkubator i 5 minutter.
- Resuspendere dissocierede celler med 10 ml forvarmet komplet celledyrkningsmedium (med FBS) ved pipettering op og ned tre til fem gange.
- Spin ned cellesuspensionen ved centrifugation ved 500 xg i 5 min, så fjern supernatanten.
- Resuspendere igen med 1 ml forvarmet komplet medium til justering celledensitet på ~ 1,5 x 10 5 celler / cm2 i enheden. Brug hæmocytometer at estimere celledensiteten.
- Indgyde 100 pi af de resuspenderede Caco-2 celler i den øvre mikrokanal (lumen side) ved at placere en 1 ml engangssprøjte fastgjort til en 25 G5 / 8 nål på udløbet fra slangen forbundet til den øvre mikrokanal.
- Klemme alle tilgangs- og afgangsåbninger i rør forbundet til den øvre og nedre mikrokanaler vha bindemiddel klip.
- Inkubér hele opsætningen i en 37 ° C, befugtet 5% CO2 inkubator i 1 time for at tillade dissocierede Caco-2 celler til at klæbe til overfladen af den porøse membran.
- Fjern klemmerne og genoptage strømmen af kulturmedium alene til det øvre mikrokanalplade ved 30 pl / time under anvendelse af en sprøjtepumpe indtil celler danner et intakt monolag i 24-36 timer. Brug kontraer faset eller differential interferens kontrast (DIC) mikroskopi for at bekræfte celle-celle kryds i en celle monolag.
- Når celler danner et monolag, perfundere dyrkningsmediet i både øvre (lumen) og nedre (kapillære) mikrokanaler med samme strømningshastighed på 30 gl / time.
- Anvendelse af mekaniske deformationer efterligner peristaltik-lignende bevægelser 5,9.
- Tænd vakuumpumpen udstyret med spændingen udstyr.
- Tilslut vakuumkamrene til vakuumstyreenhed via en slange med en rustfri stål-stik.
- Indstil strække bevægelse på 10% gennemsnitlig celle belastning ved en frekvens på 0,15 Hz med den cykliske sinusfunktion mode på vakuum kontrollerende software og klik på "Start".
- Opretholde den konstante strøm af dyrkningsmedium (30 pl / hr) i både øvre og nedre mikrokanalplade til sammenflydende Caco-2-monolag under mekaniske deformationer (10%, 0,15 Hz) for ~ 100 timer.
Bemærk: Caco-2 celler SPONtidigt undergår villus morfogenese med bølgeformede 3D projektioner forlænget mod lumen epitelial mikrokanal 5,8-10.
- For at efterligne funktionerne organ niveau af levende menneske tarm med lumen-kapillær væv grænseflade i tarmen-on-a-chip 10, følge trinene som beskrevet.
- Grow microengineered Caco-2 villi ved at gentage få skridt fra 2.1 og 2.2.
- Flow forvarmet co-dyrkningsmedium (en blanding af den komplette Caco-2 celledyrkningsmedium og den fuldstændige HMVECs dyrkningsmediet, 1: 1 v / v) til den øvre og nedre mikrokanaler på 30 pi / time.
- Indføre 100 pi dissocierede normale humane kapillære mikrovaskulære endotelceller (HMVECs; endelig celletæthed, ~ 5,0 x 10 5 celler / cm2) i den nedre mikrokanalplade af den identiske fremgangsmåde, der er beskrevet i trin fra 2.2.3 til 2.2.9.
- Placer et hærdet firkantet PDMS stykke (0,5 cm x 1 cm x 1 cm; bredde x længde x højde; 15: 1, w/ w elastomer: hærder) oven på gut-on-a-chip-enhed, derefter vende enhed setup hele hovedet (dvs. det øvre mikrokanalplade ansigter på nedsiden, og den nederste mikrokanalplade ansigter på opsiden).
- Inkubér opsætningen i en 37 ° C, befugtet 5% CO2 inkubator i 1 time for at tillade dissocierede HMVECs at klæbe til overfladen af den porøse membran i den nedre mikrokanalplade.
- Tag en hele opsætningen fra CO 2 inkubator, og flip opsætningen igen.
- Flow forvarmet co-dyrkningsmedium (en blanding af den komplette Caco-2 celledyrkningsmedium og den fuldstændige HMVECs dyrkningsmediet, 1: 1 v / v) i både øvre og nedre mikrokanaler på 30 pi / time med mekanisk stretching bevægelser ( 10%, 0,15 Hz) i mindst tre dage for at danne celle-celle-forbindelserne af et endotelmonolaget.
3. Vært-gut microbiome Co-kultur i en Gut-on-a-chip Microdevice
- Udfør forkultur of bakteriecellerne som følger at co-kultur kommensale gut microbiome på microengineered tarm villi.
- Resuspender den frysetørrede probiotiske bakteriel pulverblanding i 10 ml af blandingen (1: 1, v / v) af autoklaveret Lactobacilli MRS bouillon og Forstærket clostridium Medium.
- Juster endelige celledensitet til ca. 0,2 densitetsenheder optiske (ved 600 nm) ved tilsætning af passende mængde medium, derefter alikvot 3 ml mikrobiel celle suspension i en 10 ml engangs sterilt rør.
- Rørene anbringes indeholdende resuspenderet mikrobielle celler i den anaerobe beholder. Tilsæt to pakninger med anaerob gasdannende pose i beholderen. Luk beholderlåget stramt og inkuber beholderen setup uden omrystning i et 37 ° C befugtet 5% CO2 inkubator O / N.
- Podning af microbiome og Co-kultur med tarmepitelceller 5,10.
- Forbered 3 ml engangssprøjter indeholdende afgasset antibiotic-fri celledyrkningsmedium (dvs. DMEM med 20% FBS). Se 2.1.6 for proceduren af dyrkningsmediet afgasning.
- Tag en hel opsætning af enheden gut-on-a-chip, der indeholder microengineered villi fra CO 2 inkubator, derefter flytte til biosikkerhed kabinet.
- Fjern sprøjter forbundet til rør, der er knyttet til de øvre og nedre mikrokanaler. Tilslut sprøjter udarbejdet i 3.2.1 til enheden, bringe tilbage til CO 2 inkubator, så flyde dette antibiotikum-frit dyrkningsmedium for 12 timer forud for såning af microbiome.
- Spin ned præ-dyrkede probiotiske bakterielle blanding celler (se trin i 3.1) ved 10.000 xg i 5 min. Aspirer ud supernatanten under anvendelse af vakuum, derefter resuspenderes i antibiotikum-frit DMEM-medium (endelig celledensitet, ~ 1,0 x 10 7 CFU / ml).
- Infunder cellesuspensionen i lumen side af mikrokanalplade indeholder "kimfri" intestinale villi under anvendelse af en 1 ml engangssprøjte fastgjort til en 25G5 / 8 nål. Tillad vedhæftningen af mikrobielle celler til den apikale overflade af den intestinale villi for ~ 1,5 time uden flow ved klemning til alle slangen ende.
- Perfundere forvarmet antibiotikum-frit dyrkningsmedium i både øvre og nedre mikrokanaler på 40 pi / time med cykliske rytmiske deformationer (10%, 0,15 Hz).
- For co-kultur af grøn fluorescens protein (GFP) -mærkede E. coli (GFP E. coli; Ikke-patogen DH5-Alpha E. coli vært) 10,11 celler med microengineered villi, præ-dyrke GFP E. coli-celler i autoklaveret LB-medium ved 37 ° C under omrystning betingelse (200 rpm) i 12 timer. Gentag proceduren fra 3.2.5 til 3.2.6 at udføre co-kultur af GFP E. coli-celler med microengineered villi.
- Billede Cells 5,8-10
- Udfør DIC, epifluorescens, eller laserscanning konfokal mikroskopi til optagelse mikrobiel og epithelmorfologi 5,8,10.
- For DIC billedbehandling, tegne en opsætning af gut-on-a-chip mikrosystem fra CO 2 inkubator, placere setup enheden på scenen af et mikroskop, derefter optage cellen morfologi.
- Til fluorescens billeddannelse af villus epithelium, flow PBS i vaske cellerne ved 100 ul / time i 10 minutter.
- Fix villi med 4% (vægt / volumen) paraformaldehyd i 15 min. Strømmer derefter PBS i vaske cellerne ved 100 ul / time i 10 minutter.
- Permeabilisere villi med 0,3% (vol / vol) Triton X-100 fortyndet i PBS indeholdende 2% (vægt / vol) bovint serumalbumin (BSA) i 10 minutter. Strømmer derefter PBS i vaske cellerne ved 100 ul / time i 10 minutter.
- Bloker celler med 2% (vægt / volumen) BSA-opløsning i PBS i 1 time. Strømmer derefter PBS i vaske cellerne ved 100 ul / time i 10 minutter.
- Tilsæt 300 nM af 4 ', 6-diamidino-2-phenylindol dihydrochlorid (DAPI) opløsning fortyndet i PBS i den nukleare farvning under let beskyttelse.
- Tilsættes 25 enheder / ml fluorescerende phalloidin(Phalloidin-CF647 konjugat) opløst i PBS i F-actin-farvning under let beskyttelse.
- Optag billeder af fluorescens farvede celler under anvendelse af en laser konfokalt mikroskop.
Bemærk: En 25X mål blev anvendt med passende optisk zoom under konfokal mikroskopi. I figur 3B blev ca. 525X forstørrelse anvendes.
- Udfør DIC, epifluorescens, eller laserscanning konfokal mikroskopi til optagelse mikrobiel og epithelmorfologi 5,8,10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
At efterligne det humane intestinale vært-microbiome økosystem in vitro, er det nødvendigt at udvikle en eksperimentel protokol til at rekonstituere den stabile langsigtede co-kultur af tarmbakterier og humane intestinale epitelceller under fysiologiske betingelser, såsom peristaltik-lignende mekanik og fluidstrømning. Her anvender vi en biomimetisk gut-on-a-chip microdevice (Figur 1A) til at co-kultur levende mikrobielle celler i direkte kontakt med levende menneskeligt villi i perioder på en uge eller mere in vitro. De intestinale epitelceller danner spontant godt differentieret villi når de dyrkes på en side af en porøs ECM-coatede membran i en kanal af et 2-kanals mikrofluidanordning i nærværelse af fysiologisk relevante fluidstrømning og cykliske mekaniske deformationer 5. De microengineered villi replikere strukturer og funktioner af humane små intestinale villi, herunder formatipå af søjleformede epitelceller foret med en apikal børste grænse, basale proliferative krypter med migration og differentiering af datterceller forløber fra krypten til villus tip, høje niveauer af slim produktion, forbedret farmaka aktivitet og øget glukose reuptake 8. Levende endotelceller kan dyrkes på den modsatte side af den samme membran for at genskabe det væv-vævsgrænseflade af tarmvæggen, og immunceller kan dyrkes i systemet samt 10. For at validere den beskyttende funktion af intestinale epitelceller, tight junction barriere af intestinale villi dannet i en tarm-on-a-chip intermitterende kvantificeres ved at måle transepitel elektriske modstand (TEER) 5,10,12. Rutinemæssig monitorering af TEER værdi er påkrævet at estimere integriteten af en celle monolag eller intestinal villi ved hvert tidspunkt (f.eks inden tilsætning bakterier ind i lumen).
7 CFU / ml) podes i lumen af epitel mikrokanal (figur 1B, "Podning"). Efter mikrobielle celler klæbe på den apikale overflade af villi i fravær af flow for ~ 1,5 timer (figur 1 B, "Attachment"), fysiologisk strømning (40 pl / hr) genoptages gennem begge kanaler med cykliske mekaniske deformationer (10% deformation ved 0,15 Hz) for at fjerne ubundne tarmbakterier og forsyningsnet næringsstoffer til både bakterielle og villus epitelceller (figur 1B, "Co-kultur"). Denne co-kultur protokol har de stabile kolonisering af flere arter af probiotiske bakterier i intervillus rummet, med levedygtige bakterielle mikrokolonier opretholdes i op til to uger i co-kultur (figur 2A, 2B). I denne undersøgelse en commercial probiotiske formulering, der indeholder en blandet population af 8 forskellige fakultative eller obligat anaerobe, probiotiske stammer af Bifidobacterium breve, B. longum, B. infantis, Lactobacillus acidophilus, L. plantarum, L. paracasei, L. bulgaricus og Streptococcus termofiler anvendes.
Denne co-kultur metode kan bredt anvendes til at efterligne den menneskelige tarm vært-mikrobe økosystem. For eksempel ikke-patogene GFP E. coli kan co- dyrkes på overfladen af intestinale villi, der dyrkes i en gut-on-a-chip enhed. Baseret på den samme protokol beskrevet ovenfor, overholdes GFP E. coli celler på villi vokse fra enkelte celler efter 1 time til flere mikrokolonier med 3 dage (figur 3A, 1 time vs. 72 timer), der finder i intervillus rum (figur 3B, 1 time vs. 72 timer) ved dyrkning under rislende flow (40 pl /h) i nærvær af peristaltik-lignende deformationer (10%, 0,15 Hz).
Figur 1. Den humane Gut-on-a-Chip microphysiological system til host-gut microbiome co-dyrkning. (A) Et fotografi (venstre) og en skematisk (højre) af en 2-kanal, gut-on-a-chip mikrofluidapparatet. Pile angiver retningen af dyrkningsmediet flow (blå, top mikrokanalplade, rød, bund mikrokanal). (B) Skematisk tegning af fremgangsmåden ifølge host-gut microbiome co-kultur i tarmen-on-a-chip. Efter intestinale epitelceller danner villi (~ 100 timer), er mikrobielle celler resuspenderet i celledyrkningsmediet introduceret til lumen mikrokanalplade (Podning), så strømmen af kulturmedium suspenderes ~ 1,5 timer (Attachment). Efter mikrobielle celler klæbe til den apikale overflade af de intestinale villi, er strømningen genoptages (Co -kultur). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Co-kultur af flere probiotiske bakterier med intestinale villi i tarmen-on-a-chip. (A) En differentiel interferens kontrast mikrografi viser en mikrokoloni af probiotiske bakterieceller vokser mellem villi i tarmen chip. (B) En højere forstørring visning af A (en sort stiplet firkant) viser mikrokoloni af probiotiske bakterieceller (en rød pil). V, villi; Scale bar = 20 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
ure 3 "src =" / files / ftp_upload / 54344 / 54344fig3.jpg "/>
Figur 3. Co-kultur af ikke-patogen, GFP-mærkede E. coli med intestinal villi i tarmen-on-a-chip. (A) Overlaid fluorescens og DIC mikroskopiske billeder taget ved 1 og 72 timer, viser kolonisering af GFP E. coli på de intestinale villi dyrket i tarmen-on-a-chip. (B) Høj effekt forstørrelse synspunkter overlejret fluorescens konfokale mikrografier taget på en og 72 timer viser væksten af GFP-mærkede E. coli fra en enkelt celle (en rød pil) til en mikrokoloni (en hvid pil). Blå, kerner; magenta, F-actin; Scale bar = 30 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Forståelse host-microbiome interaktioner er afgørende for at fremme medicin; imidlertid har traditionelle cellekulturmodeller udført i en plastik skål eller en statisk brønds plade ikke understøtter den stabile co-dyrkning af humane tarmceller med levende gut mikrober i mere end 1-2 dage, fordi mikrobielle celler meste overgrow de mammale celler in vitro. Den tilgroning mikrobielle population hurtigt forbruger ilt og næringsstoffer, efterfølgende at producere stor mængde af metaboliske affald (f.eks organiske syrer), som i alvorlig grad kompromitterer tarm barriere funktioner og forårsage intestinal epitelcelle død. Derfor er afgørende for at opretholde levedygtige vært-microbiome sameksistens i en længere periode (fra dage til uger) i co-kultur mikromiljø forhindre mikrobiel tilgroning, der forårsager udtømning af næringsstoffer og ophobning af mikrobielle affald.
For at overvinde disse udfordringer, en microphysiologicalgut-on-a-chip enhed 5,8 er blevet udviklet til at danne fuldt differentieret human intestinal villi og opretholde steady-state mikromiljø tarmlumen in vitro. Design og funktionelle enheder (f.eks mikrofluide flowcellen kamre, vakuum-drevet cykliske deformationer) af en gut-on-a-chip mikrofluidanordning modificeres til præcist efterligne den fysiologiske, fysiske og kemiske mikromiljø for den mikrobielle samdyrkning 5, 10. Forskydningsspændingen påført i tarmen-on-a-chip mikrofluid kultur blev bestemt ved det fysiologiske område af luminal strømning i den menneskelige tarm 5,13. For værten-mikrobe co-kultur og fastholde den "steady-state" af mikrobielle population i den luminale mikrokanalplade af tarmen-on-a-chip er afgørende i den kemisk og ernæringsmæssigt gennemførlige betingelser. I tarmen-on-a-chip mikrosystem, er det muligt at estimere steady-state intra-luminale i tarmen-on-a-chip ved measuring pH af dyrkningsmediet og den mikrobielle celledensitet. Fordi frisk dyrkningsmedium strømmer kontinuerligt gennem mikrokanalerne, behøver både mikrobielle og epitelceller ikke undergår næringsstof udtømning, når den indledende udsåningstæthed af mikrobielle celler og den volumetriske strømningshastighed af dyrkningsmediet optimeres. Det konditionerede medium passerer gennem mikrokanalplade strømmer ud ved en defineret volumetriske strømningshastighed (her 40 pi / time), så metaboliske affald (f.eks organiske syrer) samt cellulære secretomes (fx cytokiner) fjernes kontinuerligt fra co- kultur mikromiljø. Således kan gut-on-a-chip enhed betragtes som en "kontinuerlig bioreaktor" med en steady-state mikromiljø nødvendig og tilstrækkelig til effektivt udvaske ubundet eller tilgroet mikrobielle celler fra lumen i den intestinale mikrokanal, hvilket letter dannelsen af en stabil mikrobiel niche inden for 2-3 dage.
Der er afgørende factors, der skal overvejes som fejlfinding for en vellykket co-kultur af mikrobielle celler på tarmens villi. Det første er det nødvendigt at bestemme den optimerede inkubationstid kræves for de mikrobielle celler til at vedhæfte til overfladen af villi fordi mikrobiel vedhæftning kan variere mellem mikrobielle arter. For eksempel, probiotiske bakterier, såsom Lactobacillus rhamnosus GG 5, kræver generelt ~ 1,0-1,5 hr at vedhæfte, men nogle andre mikrobielle arter kan kræve kortere (f.eks patogene mikrober) eller længere tider, afhængigt af deres adhæsion kinetik 14. For det andet bør den initiale udsåningstæthed af de mikrobielle celler identificeres Eftersom overdreven mikrobielle celle tal kan føre til udvæksten af bakterier i den tidlige fase af co-kultur, som kan forstyrre opnåelsen af en stabil ligevægt. For at optimere denne podningsdensitet, anbefales det at karakterisere væksten profil af målet mikrobielle stamme i antibiotisk-frit celledyrkningsmedium ved forskellige seeding tætheder. Endelig kan det være nødvendigt justering af den volumetriske strømningshastighed afhængigt af mikrobielle arter. For eksempel vil forøgede strømningshastigheder være påkrævet, hvis de mikrobielle celler prolifererer meget hurtigt. Det blev eksperimentelt bekræftet, at flowhastigheder på op til 300 gl / time (0,2 dyn / cm 2) ikke bringer den barriere funktion og celle morfologi microengineered villi (data ikke vist). Selvom Lactobacillus rhamnosus GG 5, over-the-counter probiotiske blanding, VSL # 3, ikke-patogene laboratorium stamme E. coli samt den patogene enteroinvasiv E. coli-stamme 10 blev anvendt med succes til den langsigtede co-kultur i tarmen-on-a-chip, er det stadig nødvendigt for at afprøve en række mikrobielle arter fra kommensal tarmens mikrobiota til patogene infektiøse mikroorganismer. Den cultivability af mikrobielle celler in vitro bør overvejes i nærvær eller fraværaf værtsceller i forbindelse med symbiose og evolution, hvor testen af at dyrke den unculturable tarm microbiome er en spændende udfordring. Endelig en robust protokol for co-dyrkning af både aerobe og anaerobe mikrober i tarmen-on-a-chip er et kritisk udækket behov at blive opdaget i fremtiden.
Der er skridt, der kan træffes for yderligere at forbedre modellen, såsom brugen af primær tarm epitel eller udifferentierede stamceller fra individuelle mennesker, der har specifikke gastrointestinale sygdomme såsom Crohns sygdom eller colorectal cancer; eller inducerede pluripotente stamceller (iPSCs). Men med den spirende interesse i rollen som menneskelige microbiome i orkestrere menneskers sundhed og sygdom, vores vært-microbiome co-kultur-metoden har en enorm betydning og potentiale, der skal anvendes til at efterligne andre host-microbiome økosystemer findes i den menneskelige krop (f.eks , mundhulen 15, huden 16, eller urogenitale tRACT 17). Endelig kan dette samarbejde dyrkningsmetode innovere den konventionelle lægemiddeludviklingsprocessen ved at forbedre forudsigeligheden med hensyn til, hvordan gut microbiome indflydelse på biotilgængeligheden, effekt og toksicitet nye lægemiddelkandidater forbindelser. Tilsammen kan tarmen-on-a-chip microphysiological systemet give en robust platform til at etablere en stabil ligevægt intestinal mikromiljø, der kan anvendes til at rekonstituere host-microbiome økosystem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) containing 25 mM glucose and 25 mM HEPES | Gibco | 10564-011 | Warm it up at 37 °C in a water bath. |
| Difco Lactobacilli MRS broth | BD | 288120 | Run autoclave at 121 °C for 15 min. |
| Poly(dimethylsiloxane) | Dow Corning | 3097358-1004 | 15:1 (w/w), PDMS : cureing agent |
| Caco-2BBE human colorectal carcinoma line | Harvard Digestive Disease Center | Human colorectal adenocarcinoma | |
| Heat-inactivated FBS | Gibco | 10082-147 | 20% (v/v) in DMEM |
| Penicillin-streptomycin-glutamine | Gibco | 10378-016 | 1/100 dilution in DMEM |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Molecular Probes | D1306 | Nuclei staining |
| Phalloidin-CF647 conjugate (25 units/ml) | Biotium | 00041 | F-actin staining |
| Flexcell FX-5000 tension system | Flexcell International Corporation | FX5K | Peristalsis-like stretcing motion (10% cell strain, 0.15 Hz frequency) |
| Inverted epifluorescence microscope | Zeiss | Axio Observer Z1 | Imaging, DIC |
| Scanning confocal microscope | Leica | DMI6000 | Imaging, Fluorescence |
| UVO Cleaner | Jelight Company Inc | 342 | Surface activation of the gut-chip |
| Type I collagen | Gibco | A10483-01 | Extracellular matrix component for cell culture into the chip |
| Matrigel | BD | 354234 | Extracellular matrix component for cell culture into the chip |
| 1 ml disposable syringe | BD | 309628 | Cell and media injection stuff |
| 25 G 5/8 needle | BD | 329651 | Cell and media injection stuff |
| Syringe pump | Braintree Scientific Inc. | BS-8000 | Injection equipment into the chip |
| VSL#3 | Sigma-Tau Pharmaceuticals | 7-45749-01782-6 | A formulation of 8 different commensal gut microbes |
| Reinforced Clostridial Medium | BD | 218081 | Anaerobic bacteria culture medium |
| GasPak EZ Anaerobe Container System with Indicator | BD | 260001 | Anaerobic gas generating sachet |
| 4% paraformaldehyde | Electron Microscopy Science | 157-4-100 | Fixing the cells for staining |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Permeabilizing the cells |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7030 | Blocking agent for staining of the cells |
| Corona treater | Electro-Technic Products | BD-20AC | Plasma generator for fabrication of the chip |
| Steriflip | Millipore | SE1M003M00 | Degasing the complete culture medium |
| Disposable hemocytometer | iNCYTO | DHC-N01 | For manual cell counting |
References
- Turnbaugh, P. J., et al. An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest. Nature. 444, 1027-1031 (2006).
- Tremaroli, V., Backhed, F. Functional interactions between the gut microbiota and host metabolism. Nature. 489, 242-249 (2012).
- Sekirov, I., Russell, S. L., Antunes, L. C. M., Brett Finlay, B. Gut Microbiota in Health and Disease. Physiol. Rev. 90, 859-904 (2010).
- Turnbaugh, P. J., et al. The human microbiome project. Nature. 449, 804-810 (2007).
- Kim, H. J., Huh, D., Hamilton, G., Ingber, D. E. Human gut-on-a-chip inhabited by microbial flora that experiences intestinal peristalsis-like motions and flow. Lab Chip. 12, 2165-2174 (2012).
- Round, J. L., Mazmanian, S. K. The gut microbiota shapes intestinal immune responses during health and disease. Nat Rev Immunol. 9, 313-323 (2009).
- Garrett, W. S., et al. Communicable ulcerative colitis induced by T-bet deficiency in the innate immune system. Cell. 131, 33-45 (2007).
- Kim, H. J., Ingber, D. E. Gut-on-a-Chip microenvironment induces human intestinal cells to undergo villus differentiation. Integr Biol. 5, 1130-1140 (2013).
- Huh, D., Kim, H. J., et al. Microfabrication of human organs-on-chips. Nat Protoc. 8, 2135-2157 (2013).
- Kim, H. J., Li, H., Collin, J. J., Ingber, D. E. Contributions of microbiome and mechanical deformation to intestinal bacterial overgrowth and inflammation in a human gut-on-a-chip. Proc. Natl. Acad. Sci. 113, E7-E15 (2016).
- Miller, W. G., Lindow, S. E. An improved GFP cloning cassette designed for prokaryotic transcriptional fusions. Gene. 191, 149-153 (1997).
- Odijk, M., et al. Measuring direct current trans-epithelial electrical resistance in organ-on-a-chip microsystems. Lab Chip. 15, 745-752 (2015).
- Lentle, R. G., Janssen, P. W. Physical characteristics of digesta and their influence on flow and mixing in the mammalian intestine: a review. J Comp Physiol B. 178, 673-690 (2008).
- Granato, D., et al. Cell surface-associated lipoteichoic acid acts as an adhesion factor for attachment of Lactobacillus johnsonii La1 to human enterocyte-like Caco-2 cells. Appl Environ Microbiol. 65, 1071-1077 (1999).
- Dewhirst, F. E., et al. The human oral microbiome. J Bacteriol. 192, 5002-5017 (2010).
- Grice, E. A., Segre, J. A. The skin microbiome. Nat Rev Microbiol. 9, 244-253 (2011).
- Hay, P. E., et al. Abnormal bacterial colonisation of the genital tract and subsequent preterm delivery and late miscarriage. Br Med J. 308, 295-298 (1994).
