Summary
Nous décrivons un protocole in vitro de co-culture gut microbiome et villosités intestinales pendant une période prolongée en utilisant un système microphysiological humain gut-on-a-chip.
Abstract
Ici, nous décrivons un protocole pour effectuer à long terme de co-culture de plusieurs espèces microbiome intestinal humain avec villosités intestinales microengineered dans un dispositif humain gut-on-a-chip microphysiological. Nous récapitulons l'interface tissu intestinal lumen-capillaires dans un dispositif microfluidique, où des déformations mécaniques physiologiques et des flux de cisaillement de fluide sont constamment appliquées pour imiter le péristaltisme. Dans le microcanal de la lumière, l'épithélium intestinal Caco-2 sont cultivées des cellules humaines pour former un épithélium villosités 'exempt de germes »et régénérer villosités intestinales. les cellules microbiennes cultivées sont pré-inoculées dans le côté de la lumière pour établir un écosystème microbe hôte. Après que les cellules microbiennes adhèrent à la surface apicale des villosités, l'écoulement du fluide et des déformations mécaniques sont repris pour produire un microenvironnement état d'équilibre dans lequel le milieu de culture frais est constamment fourni et les bactéries non liées (ainsi que les déchets bactériens) sont continuellement retirés. Après prolongée co-culture fjour de ROM vers semaines, plusieurs microcolonies sont trouvés être situés de façon aléatoire entre les villosités et les deux microbes et les cellules épithéliales restent viables et fonctionnelles pendant au moins une semaine de culture. Notre protocole de co-culture peut être adapté pour fournir une plate - forme polyvalente pour d' autres écosystèmes d'accueil-microbiome qui peuvent être trouvés dans divers organes humains, qui peuvent faciliter étude in vitro du rôle du microbiome humain dans l' orchestration de la santé et de la maladie.
Introduction
L'intestin humain héberge un réseau incroyablement diversifié d'espèces microbiennes (<1.000 espèces) et un très grand nombre de cellules microbiennes (10 fois plus que les cellules hôtes humaines) et des gènes (100 fois plus que le génome humain) 1. Ces microbiomes humains jouent un rôle clé dans le métabolisme des nutriments et des xénobiotiques, la régulation des réponses immunitaires, et le maintien de l' homéostasie intestinale 2. Sans surprise, compte tenu de ces diverses fonctions, l'intestin microbiome commensal modulant largement la santé et de la maladie 3. Ainsi, la compréhension du rôle des interactions gut microbiome et hôte-microbe sont d' une grande importance pour promouvoir gastro - intestinal (GI) la santé et explorer de nouvelles thérapies pour les troubles intestinaux 4. Cependant, existant dans les modèles in vitro de l' intestin (par exemple, les cultures statiques) limitent la co-culture de l' hôte microbiome à une courte période de temps (<1 jour) parce que les cellules microbiennes et supplantent compromettent la barrière intestinalefonction 5. Modèles animaux de substitution (par exemple, 6 ou génétiquement exempt de germes de souris 7) sont également pas couramment utilisées pour étudier l' hôte-gut microbiome diaphonie parce que la colonisation et l' entretien stable de microbiome intestin humain sont difficiles.
Pour relever ces défis, nous avons récemment développé un humain biomimétique "Gut-on-a-Chip" système microphysiological (figure 1A, gauche) pour émuler les interactions microbiome hôte intestin qui se produisent dans l'intestin humain vivant 5,8. Microdispositif intestin sur une puce comporte deux canaux microfluidiques parallèles séparés par une poreuse, une matrice extracellulaire souple (ECM) de membrane revêtu de bordée par épithéliales intestinales humaines Caco-2 cellules, mimant l'interface tissu intestinal lumière capillaire (figure 1A , à droite) 9. déformations rythmiques cycliques entraînée sous vide induisent des déformations mécaniques physiologiques qui imitent les changements normalement induced par péristaltisme (figure 1A, à droite). Fait intéressant, lorsque cellules Caco-2 sont cultivées dans le tube digestif-on-a-chip pendant plus de 100 heures, ils forment spontanément en trois dimensions (3D) villosités intestinales avec des jonctions serrées, les bordures en brosse apicale, les cellules proliférantes limitées à cryptes de base, la production de mucus, augmentation de l' activité médicamenteuse de métabolisation (par exemple, le cytochrome P450 3A4, CYP 3A4), et le glucose amélioré recapture 8. Dans ce microenvironnement 'exempt de germes », il était possible de co-culture de la GG Lactobacillus rhamnosus probiotique ou une formation thérapeutique d'un mélange bactérien probiotique avec des cellules épithéliales hôte jusqu'à deux semaines 5,10.
Dans cette étude, nous décrivons le protocole détaillé pour effectuer hôte-gut microbiome co-culture dans le dispositif gut-on-a-chip pour une période prolongée. En outre, nous discutons des questions critiques et les défis potentiels à prendre en considération pour une large application de cet hôte-microbiome co-culture protocole.
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Protocol
1. microfabrication d'un dispositif Gut-on-a-chip
Remarque: La puce boyau sur un dispositif microfluidique produit par, un polymère de silicone transparent perméable aux gaz (polydiméthylsiloxane PDMS), comportant deux micro-canaux parallèles (1 mm de largeur x 150 um de hauteur x 1 cm de longueur) séparés par une souplesse poreux (10 m de diamètre des pores, 25 um d'espacement des pores de pores) PDMS membrane 5,9. Fabriquez l'intestin-on-a-chip (figure 1A, gauche) suivant les étapes prévues.
- Microfabrication procédure du Gut-5,9 sur-une-puce.
- Préparer PDMS non durcies, dégazés en mélangeant le prépolymère PDMS et l'agent de durcissement (15: 1 en poids / poids) et la placer dans le dessiccateur à vide pendant 30 min.
- Verser 30 g et 3 g de non durcies, PDMS dégazés sur chaque moule en silicone qui a SU-8 micropatterns base de la tige et les microcanaux inférieurs de la puce gut-sur, respectivement. Puis durcir à 60 ° C dans un four sec pour au lest 4 h.
- Démouler les PDMS couches supérieure et inférieure de chaque moule de silicium en coupant autour du bord à l'aide d'un scalpel chirurgical. Percez 6 trous (deux entrées, deux sorties et deux chambres à vide) en utilisant un perforateur de biopsie (2,0 mm de diamètre du trou).
- Préparer la membrane poreuse en versant 10 g de PDMS non durcis et dégazé sur une plaquette de silicium silané contenant de soumettre des tableaux avec des piliers circulaires (10 um de diamètre, 25 um de hauteur) recouvrant avec une surface plane, silanisé couche de support PDMS (15: 1, w / w; 1 cm d'épaisseur). Placez 3 kg de poids presseur sur la configuration et durcir le polymère à 60 ° C pendant 12 heures ou plus.
- Démouler la mise en place d'une membrane poreuse PDMS collée sur le support de la dalle PDMS la plaquette de silicium soigneusement en soulevant un coin de la dalle de la plaquette et se décolle jusqu'à ce que la membrane poreuse PDMS est complètement détachée de la plaquette.
- Exposer le côté de canal d'une couche supérieure (PDMS, 15: 1, p / p) et du côté de la membrane poreuse au plasma généré par une couronne treater terminal mobile pendant 1 min et 3 s, respectivement.
- Placer les surfaces traitées par plasma de la membrane poreuse PDMS et d'une couche supérieure de microcanaux dans un contact conforme en plaçant chaque pièce en parallèle, sans aucune bulle d'air.
- Incuber l'ensemble de l'installation à 80 ° CO / N pour la liaison irréversible des deux couches PDMS.
- Décoller la couche PDMS de support de l'ensemble d'une couche supérieure d'une membrane poreuse par précaution en soulevant le coin de la couche de support, et décoller jusqu'à ce que la couche de support est complètement détaché de la couche supérieure avec la membrane.
- Détachez les parties de cette membrane située au-dessus des chambres à vide (les deux Chambers situés de chaque côté du canal principal) à l'aide d'une pointe fine pince à épiler pour faire des chambres à vide creux.
- Exposer le côté avec la membrane fixée sur la partie supérieure et le côté avec les canaux gravés sur la pièce inférieure au plasma dans un même manière que décrit in 1.1.6 étape pendant 1 min.
- Aligner la couche de microcanaux supérieure d'une membrane poreuse et la couche inférieure avec un contact conforme en plaçant chaque pièce en parallèle, sans aucune bulle d'air sous un stéréoscope.
- Cure l'ensemble de l'installation dans un four sec à 80 ° CO / N pour produire un dispositif microfluidique complet échelle gut-on-a-chip contenant deux chambres à vide creux à côté du canal cellulaire microfluidique.
- Connecter le tuyau à l'entrée et à la sortie de chaque port relié à la tige ou les microcanaux inférieurs dans un gut-on-a-chip via une coudée en acier inoxydable aiguille 90 ° blunt-end.
- Connecter le tuyau aux trous liés aux chambres à vide en utilisant une coudée en acier inoxydable aiguille 90 ° blunt-end.
- Stériliser les micro-canaux et de tubes en faisant circuler de 70% (v / v) d'éthanol en utilisant une seringue de 1 ml stérilisées à usage unique.
- Sécher les microcanaux et les tubes dans un 60 ° C four sec O / N.
2. Croissance du micromoteurEred Intestinal Villi dans le dispositif Gut-on-a-chip
- Seed cellules épithéliales intestinales (par exemple Caco-2BBE) sur un Microdevice Gut-5,9 sur-une-puce.
- Stériliser l'appareil avec 70% (v / v) d'éthanol (voir étape 1.4), en utilisant une seringue stérile de 1 ml à usage unique suivie d'un séchage dans un four à 60 ° C sec O / N (voir étape 1.5) avant l'activation de la surface.
- Exposer la configuration complète d'un microsystème gut-on-a-chip ( à savoir, un corps de l'intestin-on-a-chip relié à un tube) à la lumière UV (253,7 nm) et à l' ozone simultanément pendant 40 min.
- Refroidir l'appareil à température ambiante pendant 15 min sous la lumière UV dans une enceinte de sécurité biologique (BSC).
- Introduire 100 pi de la couche d'ECM Solution- un mélange de 50 pg / type ml de collagène et un mélange de la matrice extracellulaire 300 pg / ml dilués dans le sans sérum du milieu Eagle modifié Dulbecco (DMEM) - dans les deux micro-canaux supérieur et inférieur en utilisant un jetable stérile, seringue de 1 ml.
- incubatE l'ensemble de l' installation dans un 37 ° C humidifié à 5% de CO 2 incubateur pendant 1 h.
- Dégazer 50 ml de pré-chauffé (37 ° C) au milieu de culture complet (DMEM, 20% v / v de sérum bovin fœtal (FBS), 100 unités / ml de pénicilline et 100 pg / ml de streptomycine, aliquotées dans un 3 ml seringue jetable) en utilisant un système de filtration de 50 ml (0,45 um de taille des pores) dans la BSC pendant 1 min.
- Passez le milieu de pré-chauffé à travers le système de filtration et appuyez doucement sur le milieu filtré pour 1 min pour éliminer les bulles ou gaz dissous dans le milieu.
- Placer l'aliquote de milieu complet dégazé dans une seringue jetable de 3 ml et incuber dans un 37 ° C humidifié à 5% de CO 2 incubateur pendant 1 heure.
- Branchez deux 3 seringues jetables ml contenant dégazé, milieu de culture complet préchauffée à microcanaux supérieure et inférieure.
- Débit du milieu de culture cellulaire complète dégazé dans le microcanal supérieur en utilisant une pompe seringue à la volumétriquetaux de 30 ul / h débit (équivalent à la contrainte de cisaillement à 0,02 dyne / cm 2) dans un 37 ° C humidifié à 5% de CO 2 incubateur O / N.
- Formation de Microengineered Caco-2 Villi dans la puce Gut-on.
- Utiliser des cellules Caco-2BBE avec le nombre de passage compris entre 50 et 65.
- Cultiver les cellules Caco-2 dans un flacon T75 contenant du milieu de culture complet dans un 37 ° C humidifié à 5% de CO 2 pendant 4-5 jours pour obtenir des cellules confluentes complètement.
- Ajouter 10 ml de Ca 2+ et Mg 2+ -free PBS complètement confluentes cellules Caco-2 cultivées dans un flacon T75, laver les cellules, puis Aspirer PBS. Répéter deux fois cette étape.
- Ajouter 1 ml de solution de trypsine à 0,05% / EDTA et on incube dans un 37 ° C humidifié à 5% de CO 2 pendant 5 min.
- Remettre en suspension les cellules dissociées avec 10 ml de milieu de culture cellulaire complet préchauffée (avec du FBS), par pipetage de haut en bas trois à cinq fois.
- Centrifuger la suspension cellulaire par centrifugation à 500 xg pendant 5 min, puis retirez le surnageant.
- Resuspendre à nouveau avec 1 ml préchauffé milieu complet pour ajuster la densité cellulaire à ~ 1,5 x 10 5 cellules / cm2 dans le dispositif. Utiliser hémocytomètre pour estimer la densité cellulaire.
- 100 pi de perfuser les remises en suspension des cellules Caco-2 dans le microcanal supérieur (lumière latérale) en plaçant une seringue jetable de 1 ml fixée à une aiguille 8 25 G5 / sur la sortie d'un tube relié à la partie supérieure microcanal.
- Serrer toutes les entrées et sorties des tubes reliés aux micro-canaux supérieur et inférieur à l'aide de clips de liaison.
- Incuber l'ensemble de l' installation dans un 37 ° C, humidifié à 5% de CO 2 incubateur pendant 1 heure pour permettre dissociées cellules Caco-2 à adhérer à la surface de la membrane poreuse.
- Enlever les colliers de serrage et de reprendre l'écoulement du milieu de culture uniquement au microcanal supérieure à 30 ul / h en utilisant une pompe à seringue jusqu'à ce que les cellules forment une monocouche intacte pendant 24-36 h. Utilisez les contras de phaset ou le contraste interférentiel différentiel (DIC) au microscope pour confirmer les jonctions cellule-cellule dans une monocouche cellulaire.
- Lorsque les cellules forment une monocouche, perfuser le milieu de culture dans les deux supérieures (lumen) et inférieure (capillaires) microcanaux au même taux de 30 ul / h débit.
- Application des déformations mécaniques imitant péristaltisme-like motions 5,9.
- Allumez la pompe à vide équipé du matériel de traction.
- Relier les chambres à vide sur le régulateur de vide par l'intermédiaire d'un tube avec un raccord en acier inoxydable.
- Réglez le mouvement d'étirement de 10% souche cellulaire moyenne à une fréquence de 0,15 Hz avec le mode de fonction sinus cyclique sur le logiciel de contrôle sous vide, puis cliquez sur "Démarrer".
- Maintenir le flux constant de milieu de culture (30 ul / h) dans les deux microcanaux supérieure et inférieure à la confluentes Caco-2 monocouche sous déformations mécaniques (10%, 0,15 Hz) pour ~ 100 h.
Remarque: cellules Caco-2 Sponsubir tanément villosités morphogenèse avec des projections 3D ondulées étendues vers la lumière du microcanal épithéliale 5,8-10.
- Pour émuler les fonctions au niveau des organes de l'intestin humain vivant avec une interface de tissu lumen-capillaire dans l'intestin-on-a-chip 10, suivez les étapes décrites.
- Cultivez microengineered Caco-2 villosités en répétant les étapes 2,1 à 2,2.
- L'écoulement du milieu de co-culture préchauffée (un mélange de cellules Caco-2 du milieu de culture cellulaire complet et le milieu de culture HMVECs complète, 1: 1 v / v) pour les microcanaux supérieurs et inférieurs à 30 ul / h.
- Introduire 100 pi de cellules dissociées normales microvasculaires capillaires endothéliales humaines (les HMVECs, la densité cellulaire finale, ~ 5,0 x 10 5 cellules / cm 2) dans le microcanal inférieure par la méthode décrite dans les étapes identiques de 2.2.3 à 2.2.9.
- Placez un morceau de PDMS rectangulaire durci (0,5 cm x 1 cm x 1 cm, largeur x longueur x hauteur; 15: 1, w/ w élastomère: agent de durcissement) sur le dessus de l'appareil gut-on-a-chip, puis retournez la configuration de l' ensemble du dispositif à l' envers (ie, le microcanal supérieur fait face à la baisse, et le microcanal inférieur fait face à la hausse).
- Incuber l'installation dans un 37 ° C humidifiée à 5% de CO 2 incubateur pendant 1 heure pour permettre HMVECs dissociées à adhérer à la surface de la membrane poreuse dans le microcanal inférieure.
- Prenez toute une installation à partir du CO 2 incubateur, et retourner la configuration à nouveau.
- Écoulement du milieu de co-culture préchauffée (un mélange de cellules Caco-2 du milieu de culture cellulaire complet et le milieu de culture HMVECs complète, 1: 1 v / v) dans les deux micro-canaux supérieurs et inférieurs à 30 ul / h, avec des mouvements d'étirement mécanique ( 10%, 0,15 Hz) pendant au moins trois jours pour former des jonctions cellule-cellule endothéliale d'une monocouche.
3. Hôte-gut Co-culture microbiome dans un Microdevice Gut-on-a-chip
- Effectuer pré-culture of les cellules bactériennes comme suit pour co-culture commensal gut microbiome sur les villosités intestinales microengineered.
- Remettre en suspension le mélange en poudre bactérienne probiotique lyophilisé dans 10 ml de mélange (1: 1, v / v) de lactobacilles autoclavée MRS Broth et clostridium moyenne.
- Ajuster la densité cellulaire finale d'environ 0,2 unités de densité optique (à 600 nm) en y ajoutant quantité appropriée de milieu, puis aliquote de 3 ml de suspension de cellules microbiennes dans un tube stérile jetable de 10 ml.
- Placer les tubes contenant les cellules microbiennes remises en suspension dans le réservoir anaérobie. Ajouter deux paquets de sachets anaérobie produisant du gaz dans le récipient. Fermez le couvercle du récipient bien et incuber la configuration du récipient sans agitation dans un 37 ° C humidifié à 5% de CO 2 incubateur O / N.
- Ensemencement des microbiome et co-culture avec des cellules épithéliales intestinales 5,10.
- Préparer des seringues jetables de 3 ml contenant antibioti dégazéc exempt de milieu de culture cellulaire ( par exemple, du DMEM avec 20% de FBS). Voir 2.1.6 pour la procédure de dégazage du milieu de culture.
- Prenez toute une configuration de l'appareil gut-on-a-chip contenant villosités microengineered du CO 2 incubateur, puis passer à l'enceinte de sécurité biologique.
- Retirer les seringues raccordées à un tube relié à microcanaux supérieure et inférieure. Connecter les seringues préparées 3.2.1 à l'appareil, ramener à l'incubateur à CO 2, alors circuler ce milieu de culture sans antibiotique pendant 12 heures avant l'ensemencement du microbiome.
- Isoler les cellules bactériennes probiotiques pré-cultivées mélange (voir étapes 3.1) à 10.000 xg pendant 5 min. Aspirer le surnageant en utilisant le vide, puis remise en suspension dans un milieu DMEM sans antibiotique (densité cellulaire finale, ~ 1,0 x 10 7 UFC / ml).
- Perfuser la suspension cellulaire sur le côté de la lumière du microcanal contenant les villosités intestinales "axéniques" en utilisant une seringue jetable de 1 ml fixée à une 25G5 aiguille / 8. Permettre l'adhérence des cellules microbiennes à la surface apicale des villosités intestinales pendant environ 1,5 heure sans écoulement par serrage à l'ensemble de l'extrémité de la tubulure.
- Perfuser le milieu de culture sans antibiotique préchauffée dans les deux micro-canaux supérieurs et inférieurs à 40 ul / h, avec des déformations cycliques cadencés (10%, 0,15 Hz).
- Pour la co-culture de la protéine de fluorescence verte (GFP) marqué à E. coli (E. coli GFP; non-pathogène DH5-Alpha E. coli hôtes) 10,11 cellules avec villosités microengineered, pré-cultiver GFP E. cellules coli dans un milieu LB autoclave à 37 ° C sous agitation condition (200 rpm) pendant 12 heures. Répétez la procédure à partir de 3.2.5 à 3.2.6 pour mener à bien la co-culture de la GFP E. cellules coli avec villosités microengineered.
- Les cellules de l' image 5,8-10
- Effectuer DIC, épifluorescence ou balayage laser microscopie confocale pour l' enregistrement microbienne et épithéliales morphologie 5,8,10.
- Pour l'imagerie DIC, prendre une configuration de microsystème gut-on-a-chip du CO 2 incubateur, placez le réglage de l' appareil sur la scène d'un microscope, puis enregistrer la morphologie cellulaire.
- Pour l'imagerie de fluorescence de villosités épithélium, l'écoulement du PBS pour le lavage des cellules dans 100 ul / h pendant 10 min.
- Fixer villosités avec 4% (p / v) de paraformaldehyde pendant 15 minutes. Ensuite, l'écoulement du PBS pour le lavage des cellules à 100 ul / h pendant 10 min.
- Perméabiliser les villosités avec 0,3% (v / v) de Triton X-100 dilué dans du PBS contenant 2% (p / v) de sérum-albumine bovine (BSA) pendant 10 min. Ensuite, l'écoulement du PBS pour le lavage des cellules à 100 ul / h pendant 10 min.
- des cellules de bloc avec 2% (p / v) de BSA dans une solution PBS pendant 1 heure. Ensuite, l'écoulement du PBS pour le lavage des cellules à 100 ul / h pendant 10 min.
- Ajouter 300 nM de 4 ', dichlorhydrate 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) solution diluée dans du PBS pour la coloration nucléaire sous la protection de la lumière.
- Ajouter 25 unités / ml de phalloïdine fluorescente(Phalloïdine-CF647 conjugué) dissous dans du PBS pour la coloration F-actine sous la protection de la lumière.
- Enregistrement des images des cellules colorées par fluorescence à l'aide d'un microscope confocal à balayage laser.
Note: Un objectif 25X a été appliqué avec zoom optique approprié au cours de la microscopie confocale. La figure 3B, le grossissement d' environ 525X a été utilisé.
- Effectuer DIC, épifluorescence ou balayage laser microscopie confocale pour l' enregistrement microbienne et épithéliales morphologie 5,8,10.
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Representative Results
Pour émuler l'intestin écosystème hôte microbiome humain in vitro, il est nécessaire de développer un protocole expérimental pour reconstituer la co-culture stable à long terme des bactéries intestinales et les cellules épithéliales intestinales humaines dans des conditions physiologiques telles que la mécanique péristaltisme-like et l'écoulement du fluide. Ici, nous utilisons un microdispositif biomimétique gut-on-a-chip (Figure 1A) à la co-culture vivante des cellules microbiennes en contact direct avec la vie villosités humaine pour des périodes d'une semaine ou plus in vitro. Les cellules épithéliales intestinales se forment spontanément des villosités bien différenciées lorsqu'elles sont cultivées sur un côté d'une membrane poreuse revêtue de l' ECM dans un canal d'un dispositif microfluidique à 2 canaux , en présence d' un écoulement de fluide physiologique pertinent et déformations mécaniques cycliques 5. Les villosités microengineered répliquent les structures et les fonctions des villosités intestinales humaines, y compris Formatisur des cellules épithéliales bordées par une bordure en brosse apicale, cryptes proliférantes basales avec la migration et la différenciation des cellules filles progressent de la crypte à la pointe des villosités, des niveaux élevés de production de mucus, une meilleure activité médicament métabolisant, et l' augmentation de la recapture de glucose 8. Les cellules endothéliales vivantes peuvent être cultivées sur le côté opposé de la même membrane pour recréer l'interface tissu-tissu de la paroi intestinale, et les cellules immunitaires peuvent être cultivées dans le système et 10. Pour valider la fonction de protection des cellules épithéliales intestinales, étanche barrière de jonction de villosités intestinales formées dans un gut-on-a-chip est intermittente quantifiée en mesurant la résistance électrique transépithélial (TEER) 5,10,12. La surveillance régulière de la valeur TEER est nécessaire pour estimer l'intégrité d'une monocouche cellulaire ou villosités intestinales à chaque moment (par exemple, avant d'ajouter des bactéries dans la lumière).
7 UFC / d'ml) "1" est inoculé dans la lumière du micro - canal epithelial (figure 1B, «Ensemencement»). Après que les cellules microbiennes adhèrent à la surface apicale des villosités en l'absence d'écoulement pour ~ 1,5 h (figure 1B, "pièce jointe"), le débit physiologique (40 pi / h) est repris par les deux canaux avec des déformations mécaniques cycliques (10% de déformation à 0,15 Hz) pour éliminer les bactéries intestinales non liées et les nutriments d'alimentation à la fois des cellules épithéliales bactériennes et villosités (Figure 1B, "Co-culture»). Ce protocole de co-culture permet la colonisation stable de plusieurs espèces de bactéries probiotiques dans l'espace intervillus, avec microcolonies bactériennes viables étant maintenues pendant jusqu'à deux semaines en co-culture (Figures 2A, 2B). Dans cette étude, un coformule probiotique mmercial qui contient une population mixte de 8 différents ou d' obliger anaérobie facultative, des souches probiotiques de Bifidobacterium breve, B. longum, B. infantis, Lactobacillus acidophilus, L. plantarum, L. paracasei, L. bulgaricus et Streptococcus thermophilus est utilisé.
Cette méthode de co-culture peut être largement appliquée pour émuler l'intestin écosystème hôte microbe humain. Par exemple, la GFP non pathogène E. coli peut être co-cultivées sur la surface des villosités intestinales cultivées dans un dispositif de l' intestin sur une puce. Basés sur le même protocole décrit ci - dessus, adhérant GFP E. coli cellules sur les villosités se développent à partir des cellules individuelles à 1 h à plusieurs microcolonies avec 3 jours (figure 3A, 1 h contre 72 h) qui localisent dans les espaces de intervillus (figure 3B, 1 h contre 72 h) lorsqu'il est cultivé dans ruisselant débit (40 pl /h) en présence de déformations péristaltisme-like (10%, 0,15 Hz).
Figure 1. L'intestin-on-a-chip de Gut-on-a-Chip humain système microphysiological pour l' hôte-gut microbiome co-culture. (A) Une photographie ( à gauche) et un schéma ( à droite) d'un canal 2, dispositif microfluidique. Les flèches indiquent la direction de la culture moyen débit (bleu, top microcanaux; rouge, microcanaux bas). (B) Schémas de la procédure de l' hôte-gut microbiome co-culture dans la puce gut-sur-. Après que les cellules épithéliales de l'intestin forment villosités (~ 100 h), les cellules microbiennes remises en suspension dans le milieu de culture cellulaire sont introduits dans la lumière de microcanaux (Inoculation), puis l'écoulement du milieu de culture est mis en suspension pendant environ 1,5 heure (annexe). Après que les cellules microbiennes adhèrent à la surface apicale des villosités intestinales, l'écoulement est repris (Co -Culture). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Co-culture de multiples bactéries probiotiques avec villosités intestinales dans la puce gut-on. (A) Un différentiel de contraste d'interférence micrographie montre une microcolonies de cellules bactériennes probiotiques qui poussent entre les villosités dans la puce de l' intestin. (B) Une vue plus grande puissance de grossissement de A (un carré pointillé noir) montrant la microcolonies de cellules bactériennes probiotiques (une flèche rouge). V, villosités; Barre d'échelle = 20 pm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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La figure 3. Co-culture de non-pathogène, la GFP marquée E. coli avec villosités intestinales dans la puce gut-on. (A) fluorescence Overlaid et DIC images microscopiques prises à 1 et 72 heures, l' affichage de la colonisation de la GFP E. coli sur les villosités intestinales cultivées dans la puce gut-sur-. (B) vues haute puissance de grossissement de fluorescence superposée micrographies confocales prises à 1 et 72 heures montrant la croissance de la GFP marquée E. coli à partir d' une seule cellule (une flèche rouge) à un microcolonies (une flèche blanche). Bleu, les noyaux; magenta, F-actine; Barre d'échelle = 30 pm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Comprendre les interactions hôte-microbiome est essentiel pour faire avancer la médecine; Cependant, les modèles de culture de cellules traditionnelles réalisées dans une boîte en plastique ou une plaque de puits statique ne prennent pas en charge la co-culture stable de cellules intestinales humaines avec des microbes de l' intestin vivant pendant plus de 1-2 jours parce que les cellules microbiennes envahissent la plupart des cellules de mammifères in vitro. La population microbienne overgrowing consomme rapidement de l' oxygène et de nutriments, la production de la suite quantité excessive de déchets métaboliques (par exemple, des acides organiques), qui compromettent sérieusement les fonctions de barrière intestinale et provoquent la mort des cellules épithéliales intestinales. Par conséquent, la prévention de la prolifération microbienne qui provoque l'épuisement des nutriments et de l'accumulation de déchets microbiennes est cruciale pour le maintien de la viabilité de l'hôte coexistence microbiome pendant une période prolongée (de quelques jours à plusieurs semaines) dans le microenvironnement de co-culture.
Pour surmonter ces défis, un microphysiologicalgut-on-a-chip 5,8 de l' appareil a été développé pour former complètement différenciées villosités intestinales humaines et de maintenir le microenvironnement état d' équilibre de la lumière intestinale in vitro. La conception et les unités fonctionnelles (par exemple, microfluidiques chambres de cellules d'écoulement, déformations cycliques entraîné sous vide) d'un gut-on-a-chip dispositif microfluidique sont modifiés pour émuler précisément physiologique, physique et microenvironnement chimique pour la co-culture microbienne 5, 10. La contrainte de cisaillement appliquée dans la culture microfluidique gut-on-a-chip a été déterminée par la plage physiologique de l' écoulement luminale dans l'intestin humain 5,13. Pour la co-culture hôte-microbe, le maintien de la "état stable" de la population microbienne dans le microcanal luminale de l'intestin a-chip-on-est essentiel pour soutenir chimiquement et nutritionnellement conditions possibles. Dans le microsystème gut-on-a-chip, il est possible d'estimer l'état d'équilibre intra-luminale de l'intestin-on-a-chip par DE MESUREng du pH du milieu de culture et la densité cellulaire microbienne. Étant donné que le milieu de culture frais circule en continu à travers les micro-canaux, à la fois des cellules microbiennes et epitheliales ne subissent pas l'épuisement des nutriments lorsque la densité d'ensemencement initial de cellules microbiennes et le débit volumétrique du milieu de culture sont optimisées. Le milieu conditionné passant à travers le microcanal coule à un débit défini volumétrique d'écoulement (ici, 40 ul / h), de sorte que les déchets métaboliques (par exemple, des acides organiques), ainsi que secrétomes cellulaires (par exemple, cytokines) sont constamment retirées de la co culture microenvironnement. Ainsi, le dispositif gut-on-a-chip peut être considéré comme un «bioréacteur continu» avec un microenvironnement nécessaire et suffisante pour laver efficacement les cellules microbiennes non liées ou envahies de la lumière du microcanal intestinale état d'équilibre, ce qui facilite la génération de une niche microbienne stable dans les 2-3 jours.
Il y a fa crucialecteurs qui doivent être considérés comme le dépannage pour la co-culture réussie de cellules microbiennes sur les villosités intestinales. Tout d'abord, il est nécessaire de déterminer le temps d'incubation nécessaire pour optimiser les cellules microbiennes à fixer à la surface des villosités parce que l'adhésion microbienne peut varier selon les espèces microbiennes. Par exemple, des bactéries probiotiques telles que Lactobacillus rhamnosus GG 5, nécessitent généralement de 1,0 à 1,5 h ~ à joindre, mais d'autres espèces microbiennes peuvent nécessiter plus courtes (par exemple, les microbes pathogènes) , ou plus de fois, en fonction de leur cinétique d'adhésion 14. Deuxièmement, la densité d'ensemencement initiale des cellules microbiennes doit être identifié en raison du nombre de cellules microbiennes excessives peut conduire à l'excroissance des bactéries dans le stade précoce de la co-culture, qui peut interférer avec la réalisation d'un état d'équilibre stable. Pour optimiser cette densité d'ensemencement, il est recommandé de caractériser le profil de la souche microbienne cible de croissance dans le Antibimilieu de culture cellulaire otique libre à diverses densités de semis. Enfin, le réglage du débit volumétrique peut être nécessaire en fonction des espèces microbiennes. Par exemple, l'augmentation des débits seront nécessaires si les cellules microbiennes prolifèrent très rapidement. Il a été confirmé expérimentalement que des débits allant jusqu'à 300 ul / h (0,2 dynes / cm 2) ne pas compromettre la fonction barrière et la morphologie des cellules des villosités microengineered (données non présentées). Bien que Lactobacillus rhamnosus GG 5, over-the-counter de mélange de probiotiques, VSL # 3, la souche de laboratoire non pathogène E. coli, ainsi que le pathogène E. entéro coli 10 ont été appliquées avec succès à long terme de co-culture dans la puce gut-on, il est encore nécessaire de tester une variété d'espèces microbiennes de commensal microbiote intestinal à des micro - organismes pathogènes infectieux. La cultivabilité de cellules microbiennes in vitro devrait être envisagée en présence ou en l'absencedes cellules hôtes dans le contexte de la symbiose et de l'évolution, où le test de cultiver l'intestin microbiome incultivable est un défi fascinant. Enfin, un protocole robuste pour la co-culture des deux microbes aérobies et anaérobies dans l'intestin-on-a-chip est un besoin non satisfait essentiel à découvrir dans l'avenir.
Il y a des mesures qui peuvent être prises pour améliorer encore le modèle, comme l'utilisation de l'épithélium intestinal primaire ou des cellules souches indifférenciées provenant de sujets humains individuels qui ont des maladies gastro-intestinales spécifiques telles que la maladie de Crohn ou d'un cancer colorectal; ou des cellules souches pluripotentes induites (CISP). Cependant, avec l'intérêt croissant pour le rôle du microbiome humain dans l' orchestration de la santé humaine et de la maladie, notre méthode de co-culture hôte microbiome a une énorme signification et le potentiel à appliquer à imiter d' autres écosystèmes d'accueil-microbiome trouvés dans le corps humain (par exemple , , la cavité buccale 15, de la peau 16, ou urogénital tract 17). Enfin, cette méthode de co-culture peut innover dans le processus de développement des médicaments conventionnels en améliorant la prévisibilité en termes de la façon dont les influences gut microbiome sur la biodisponibilité, l'efficacité et la toxicité des nouveaux composés médicamenteux. Pris ensemble, le système de microphysiological gut-on-a-chip peut fournir une plate-forme solide pour établir un état stable microenvironnement intestinal stable qui peut être utilisé pour reconstituer hôte microbiome écosystème.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) containing 25 mM glucose and 25 mM HEPES | Gibco | 10564-011 | Warm it up at 37 °C in a water bath. |
| Difco Lactobacilli MRS broth | BD | 288120 | Run autoclave at 121 °C for 15 min. |
| Poly(dimethylsiloxane) | Dow Corning | 3097358-1004 | 15:1 (w/w), PDMS : cureing agent |
| Caco-2BBE human colorectal carcinoma line | Harvard Digestive Disease Center | Human colorectal adenocarcinoma | |
| Heat-inactivated FBS | Gibco | 10082-147 | 20% (v/v) in DMEM |
| Penicillin-streptomycin-glutamine | Gibco | 10378-016 | 1/100 dilution in DMEM |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Molecular Probes | D1306 | Nuclei staining |
| Phalloidin-CF647 conjugate (25 units/ml) | Biotium | 00041 | F-actin staining |
| Flexcell FX-5000 tension system | Flexcell International Corporation | FX5K | Peristalsis-like stretcing motion (10% cell strain, 0.15 Hz frequency) |
| Inverted epifluorescence microscope | Zeiss | Axio Observer Z1 | Imaging, DIC |
| Scanning confocal microscope | Leica | DMI6000 | Imaging, Fluorescence |
| UVO Cleaner | Jelight Company Inc | 342 | Surface activation of the gut-chip |
| Type I collagen | Gibco | A10483-01 | Extracellular matrix component for cell culture into the chip |
| Matrigel | BD | 354234 | Extracellular matrix component for cell culture into the chip |
| 1 ml disposable syringe | BD | 309628 | Cell and media injection stuff |
| 25 G 5/8 needle | BD | 329651 | Cell and media injection stuff |
| Syringe pump | Braintree Scientific Inc. | BS-8000 | Injection equipment into the chip |
| VSL#3 | Sigma-Tau Pharmaceuticals | 7-45749-01782-6 | A formulation of 8 different commensal gut microbes |
| Reinforced Clostridial Medium | BD | 218081 | Anaerobic bacteria culture medium |
| GasPak EZ Anaerobe Container System with Indicator | BD | 260001 | Anaerobic gas generating sachet |
| 4% paraformaldehyde | Electron Microscopy Science | 157-4-100 | Fixing the cells for staining |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Permeabilizing the cells |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7030 | Blocking agent for staining of the cells |
| Corona treater | Electro-Technic Products | BD-20AC | Plasma generator for fabrication of the chip |
| Steriflip | Millipore | SE1M003M00 | Degasing the complete culture medium |
| Disposable hemocytometer | iNCYTO | DHC-N01 | For manual cell counting |
References
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