Summary
Wir beschreiben ein in vitro - Protokoll zur Zusammenarbeit Kultur gut microbiome und Darmzotten für einen längeren Zeitraum einen menschlichen Darm-on-a-Chip - microphysiological System.
Abstract
Hier beschreiben wir ein Protokoll langfristige Co-Kultur von Multi-Spezies-menschlichen Darm microbiome mit mikro Darmzotten in einem menschlichen Darm-on-a-Chip-microphysiological Gerät auszuführen. Wir rekapitulieren das Darmlumen-Kapillargewebe Schnittstelle in einer mikrofluidischen Vorrichtung, wo physiologische mechanische Verformungen und Fluidscherströmung sind Peristaltik ständig angewendet zu imitieren. Im Lumen Mikrokanal sind menschliche Darmepithelzellen Caco-2-Zellen, die eine "keimfrei" villus Epithel zu bilden und kleine Darmzotten regenerieren. Vorkultiviert mikrobiellen Zellen werden in die Lumenseite beimpft einen Wirt-Mikroben-Ökosystem zu schaffen. Nach mikrobiellen Zellen an die apikale Oberfläche der Zotten, Fluidströmung und der mechanischen Verformungen haften wieder aufgenommen eine steady-state-Mikroumgebung, in der frisches Kulturmedium zu produzieren konstant zugeführt wird, und ungebundene Bakterien (sowie bakterielle Abfälle) werden kontinuierlich entfernt. Nach längerer Co-Kultur-from Tage bis Wochen, werden mehrere Mikrokolonien gefunden zufällig zwischen den Zotten angeordnet zu sein, und beide mikrobiellen und Epithelzellen bleiben lebensfähig und funktionell für mindestens eine Woche in Kultur. Unsere co-culture - Protokoll kann angepasst werden , eine vielseitige Plattform für andere Host-microbiome Ökosysteme zu schaffen , die in verschiedenen menschlichen Organen gefunden werden können, die in orchestriert Gesundheit und Krankheit in vitro Untersuchung der Rolle des menschlichen microbiome erleichtern.
Introduction
Der menschliche Darm beherbergt eine erstaunlich Vielfalt von mikrobiellen Spezies (<1000 Arten) und eine enorme Anzahl von mikrobiellen Zellen (10 - mal mehr als die menschliche Wirtszellen) und Gene , (100 - mal mehr als das menschliche Genom) 1. Diese menschlichen microbiomes spielen eine Schlüsselrolle in den Nährstoffen und Xenobiotika metabolisierenden, Regulierung Immunantworten und Aufrechterhaltung Darm-Homöostase 2. Es überrascht nicht, da diese verschiedenen Funktionen, die commensal gut microbiome moduliert ausgiebig Gesundheit und Krankheit 3. Somit sind die Rolle des Darms microbiome und Wirt-Mikroben - Interaktionen zu verstehen , von großer Bedeutung , gastrointestinale (GI) zur Förderung der Gesundheit und neue Therapeutika für Darmerkrankungen 4 erkunden. Jedoch bestehenden in vitro Modelle Darm (zB statische Kulturen) host-microbiome Kokultur nach kurzer Zeit (<1 Tag) beschränken , da mikrobielle Zellen überwuchern und kompromittieren DarmbarriereFunktion 5. Surrogate Tiermodellen (zB keimfrei 6 oder gentechnisch veränderte Mäuse 7) sind ebenfalls nicht allgemein zu studieren Host-gut microbiome Übersprechens , weil die Kolonisierung und stabile Aufrechterhaltung des menschlichen Darms microbiome sind schwierig verwendet.
Um diese Herausforderungen zu meistern, haben wir vor kurzem eine biomimetische Mensch "Gut-on-a-Chip" microphysiological System (Abbildung 1A, links) , um die Host-gut microbiome Wechselwirkungen zu emulieren , die 5,8 im lebenden menschlichen Darm vorkommen. Der Darm-on-a-Chip - Mikrovorrichtung enthält zwei parallel mikrofluidischen Kanälen durch eine flexible, poröse, extrazelluläre Matrix (ECM) beschichteten Membran von menschlichen Darmepithelzellen Caco-2 - Zellen ausgekleidet abgetrennt, das Darmlumen-Kapillar - Gewebe - Grenzfläche nachzuahmen (1A 9, rechts). Vakuumgesteuerte zyklische rhythmische Verformungen physiologischen mechanischen Verformungen hervorrufen, die Änderungen nachahmen normalerweise INDUCed durch Peristaltik (1A, rechts). Interessanterweise, wenn Caco-2-Zellen für mehr als 100 Stunden im Darm-on-a-Chip gewachsen sind, sie sich spontan bilden dreidimensionale (3D) Darmzotten mit tight junctions, apikale Bürstensaum, proliferative auf basale Krypten begrenzt Zellen, Schleimproduktion, erhöht Droge metabolisierenden Aktivität (zB Cytochrom P450 3A4, CYP 3A4) und verbesserte Glucose - Wiederaufnahme - 8. In diesem "keimfrei" Mikroumgebung, war es möglich , die probiotische Lactobacillus rhamnosus GG oder eine therapeutische Bildung einer probiotischen Bakterienmischung mit Wirts Epithelzellen für bis zu zwei Wochen 5,10 bis Kokultur.
In dieser Studie beschreiben wir das detaillierte Protokoll Host-gut microbiome Co-Kultur im Darm-on-a-Chip-Gerät über einen längeren Zeitraum durchzuführen. Darüber hinaus diskutieren wir kritische Fragen und mögliche Herausforderungen für eine breite Anwendung dieser Host-microbiome Co-Kultur-p berücksichtigt werdenrotokoll.
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Protocol
1. Mikrofertigung eines Gut-on-a-Chip-Gerät
Hinweis: Der Darm-on-a-Chip ist eine Mikrofluidik-Vorrichtung mit transparenten, gasdurchlässige Silikonpolymer (Polydimethylsiloxan PDMS) hergestellt, enthaltend zwei parallel Mikrokanäle (1 mm Breite x 150 & mgr; m Höhe x 1 cm Länge), getrennt durch eine flexible poröse (10 & mgr; m Porendurchmesser, 25 & mgr; m Abstand Pore zu Pore) PDMS Membran 5,9. Fabrizieren den Darm-on-a-Chip (1A, links) im Anschluss an die Schritte zur Verfügung gestellt.
- Mikrofabrikationsverfahren des Gut-on-a-Chip 5,9.
- Bereiten Sie nicht ausgehärteten, entgastem PDMS durch die PDMS-Präpolymer Mischen und des Härters (15: 1 w / w), und legen Sie es im Vakuumexsikkator für 30 min.
- Gießen 30 g und 3 g ungehärtete, entgastem PDMS auf jede Silikonform, die SU-8-basierte Mikromuster des oberen und unteren Mikrokanäle der gut-on-a-Chip hat, respectively. Dann härten bei 60 ° C in einem Trockenofen bei lOst 4 Stunden.
- Entformen die oberen und unteren Schichten PDMS von jeder Silikonform um die Kante durch Schneiden eines chirurgischen Skalpell. Lochen 6 Löcher (zwei Eingänge, zwei Ausgänge und zwei Vakuumkammern) unter Verwendung einer Biopsie Puncher (2,0 mm Lochdurchmesser).
- Bereiten Sie die poröse Membran durch Gießen von 10 g des ungehärteten und entgastem PDMS auf einer silanisierten Silizium-Wafer enthält, Stift-Arrays mit kreisförmigen Säulen (10 um Durchmesser, 25 & mgr; m in der Höhe) mit einer flachen Überlagerung, silanisiert PDMS Trägerschicht (15: 1, w / w; 1 cm dick). Legen Sie ein 3 kg Gewicht Presser auf den Aufbau und die Heilung des Polymers bei 60 ° C für 12 Stunden oder länger.
- Entformen den Aufbau einer porösen PDMS-Membran auf den Träger geklebt PDMS Bramme von dem Silizium-Wafer durch vorsichtiges die Ecke der Bramme aus dem Wafer anheben und bis die poröse PDMS-Membran wird von dem Wafer vollständig abgelöst Abschälen.
- Belichten der Kanalseite einer oberen Schicht (PDMS, 15: 1, w / w) und die poröse Membran Seite der plasma durch eine Handkoronabehandlungs erzeugt für 1 min und 3 sec, respectively.
- Legen Sie die plasmabehandelten Oberflächen der porösen Membran PDMS und oberen Mikrokanalschicht in einem konformen Kontakt durch jedes Stück parallel ohne Luftblasen platzieren.
- Inkubiere die gesamte Einrichtung bei 80 ° CO / N für die irreversible Bindung der beiden Schichten PDMS.
- Abziehen der PDMS Trägerschicht von der Anordnung einer oberen Schicht mit einer porösen Membran durch vorsichtiges Anheben der Ecke der Trägerschicht ab, und, bis die Trägerschicht vollständig von der oberen Schicht mit der Membran abgelöst Abschälen.
- Reißen die Teile dieser Membran liegt über den Vakuumkammern (die zwei Kammern an jeder Seite des Hauptkanals) unter Verwendung einer feinen Pinzette Spitze aus Hohlvakuumkammern bilden.
- Setzen Sie die Seite mit der Membran auf dem Oberteil befestigt ist und die Seite mit den Kanälen auf dem unteren Stück eingraviert in gleicher Weise zu Plasma, wie ich beschriebenn 1.1.6 für 1 min Schritt.
- Richten Sie die obere Mikrokanalschicht mit einer porösen Membran und die untere Schicht mit einem konformen Kontakt durch jedes Stück parallel ohne Luftblasen unter einem Stereoskop platzieren.
- Cure die gesamte Einrichtung in einem Trockenofen bei 80 ° CO / N eine komplette Skala gut-on-a-Chip-Mikrofluidik-Vorrichtung, die zwei hohle Vakuumkammern neben der mikrofluidischen Zellkanal zu erzeugen.
- Schließen Sie Schlauch an den Einlass und Auslass jeder verknüpften Port an den oberen oder den unteren Mikrokanäle in einem gut-on-a-Chip über einen 90 ° gebogen Edelstahl blunt-end Nadel.
- Den Schlauch an die verknüpften Löcher in die Vakuumkammern mit einem 90 ° gebogen Edelstahl blunt-end Nadel.
- Sterilisieren die Mikrokanäle und die Schläuche um 70% fließt (v / v) Ethanol, um eine 1 ml sterilisierte Einmalspritze verwendet.
- Trocknen Sie die Mikrokanäle und die Schläuche in einem 60 ° C Trockenofen O / N.
2. Wachstum von MikroEred Darmzotten im Gut-on-a-Chip-Gerät
- Seed Darmepithelzellen (zB Caco-2BBE) auf einem Gut-on-a-Chip - Microdevice 5,9.
- Sterilisieren der Vorrichtung mit 70% (v / v) Ethanol (siehe Schritt 1.4) unter Verwendung einer 1 ml sterilisierte Einmalspritze anschließend in einem 60 ° C Trockenofen O Trocknungs- / N (siehe Schritt 1.5) vor der Oberflächenaktivierung.
- Setzen Sie die komplette Einrichtung eines gut-on-a-Chip - Mikro (dh ein Körper von der gut-on-a-Chip - Schlauch verbunden) mit UV - Licht (253,7 nm) und Ozon gleichzeitig für 40 min.
- Das Abkühlen der das Gerät bei RT für 15 min unter UV-Licht in einem Bio-Sicherheitsschrank (BSC).
- Einführung von 100 & mgr; l des ECM Beschichtung eine Mischung aus 50 & mgr; g / ml Typ lösungs- I Kollagen und 300 & mgr; g / ml extrazellulären Matrixmischung in dem serumfreien Dulbeccos modifiziertem Eagle Medium (DMEM) verdünnt - in die beiden oberen und unteren Mikrokanäle eine Wegwerf Verwendung , sterile 1 ml Spritze.
- Incubate die gesamte Einrichtung in einem 37 ° C befeuchteten 5% CO 2 Inkubator für 1 Stunde.
- Entgasen 50 ml vorgewärmtes (37 ° C) vollständigem Kulturmedium (DMEM, 20%, v / v, fötales Rinderserum (FBS), 100 Einheiten / ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin; aliquotiert in einem 3 ml Einwegspritze), um eine 50 ml-Filtrationssystem (0,45 & mgr; m Porengrße) in der BSC für 1 min verwendet wird.
- Führen Sie das vorgewärmte Medium, durch das Filtersystem und tippen Sie sanft auf das gefilterte Medium für 1 min keine Blasen oder gelösten Gases in dem Medium zu entfernen.
- Legen Sie die aliquote Menge von entgast vollständigen Medium in einem 3 ml Einwegspritze und Inkubation in einem 37 ° C befeuchteten 5% CO 2 Inkubator für 1 Stunde.
- Schließen Sie zwei 3 ml Einwegspritzen entgast enthält, vorgewärmte komplettem Kulturmedium zu den oberen und unteren Mikrokanäle.
- Fließen die entgast komplette Zellkulturmedium in den oberen Mikrokanal eine Spritzenpumpe mit dem Volumen mitStrömungsgeschwindigkeit von 30 & mgr; l / h (äquivalent zu der Scherspannung bei 0,02 dyne / cm 2) in einem 37 ° C befeuchteten 5% CO 2 -Inkubator O / N.
- Die Bildung von mikro Caco-2-Villi im Gut-on-a-Chip.
- Verwenden Caco-2BBE Zellen mit der Passagezahl zwischen 50 und 65.
- Wachsen Caco-2 - Zellen in einem T75 - Kolben mit komplettem Kulturmedium in einem 37 ° C befeuchteten 5% CO 2 Inkubator für 4-5 Tage vollständig konfluenten Zellen zu erhalten.
- 10 ml Ca 2+ und Mg 2+ -freier PBS vollständig konfluenten Caco-2 - Zellen in einer T75 - Flasche gezüchtet, Zellen waschen, dann absaugen aus PBS. Zweimal wiederholen Sie diesen Schritt.
- 1 ml 0,05% Trypsin / EDTA - Lösung und Inkubation in einem 37 ° C befeuchteten 5% CO 2 Inkubator für 5 min.
- Resuspendieren der dissoziierten Zellen mit 10 ml vorgewärmten komplette Zellkulturmedium (mit FBS) durch Auf- und Abpipettieren drei bis fünf Mal.
- Spin down die Zellsuspension durch centrifugation bei 500 xg für 5 min, dann entfernen Sie den Überstand.
- Resuspendieren erneut mit 1 ml vorgewärmtes Komplettmedium Zelldichte bei ~ 1,5 x 10 5 Zellen / cm 2 in dem Gerät einzustellen. Verwenden Sie Hemocytometer die Zelldichte zu schätzen.
- angebracht 100 ul der resuspendierten Caco-2-Zellen in den oberen Mikrokanal (Lumenseite) durch eine 1 ml Einmalspritze Plazieren in einen 25 G5 / 8 Nadel an dem Auslass eines Rohres mit dem oberen Mikrokanal infundieren.
- Festzuklemmen alle Einlässe und Auslässe von Schläuchen mit den oberen und unteren Mikrokanäle unter Verwendung von Binderclips.
- Inkubiere die gesamte Einrichtung in einem 37 ° C, befeuchteten 5% CO 2 Inkubator für 1 Stunde zu erlauben , Caco-2 - Zellen dissoziiert an der Oberfläche der porösen Membran zu haften.
- Entfernen Sie die Klemmen und Fortsetzen des Flusses von Kulturmedium nur auf den oberen Mikrokanal bei 30 & mgr; l / h eine Spritzenpumpe, bis die Zellen eine intakte Monolayer für 24-36 h bilden. Verwenden Sie die Phase contrast oder die Differentialinterferenzkontrast (DIC) Mikroskopie Zell-Zell-Übergänge in einer Zell-Monoschicht zu bestätigen.
- Wenn die Zellen eine Monoschicht bilden, perfundieren das Kulturmedium in die beiden oberen (Lumen) und unteren (Kapillare) Mikrokanäle mit der gleichen Strömungsrate von 30 & mgr; l / Std.
- Die Anwendung von mechanischen Verformungen imitiert Peristaltik artigen Bewegungen 5,9.
- Schalten Sie die Vakuumpumpe mit dem Spanntechnik ausgestattet.
- Schließen Sie die Vakuumkammern mit dem Vakuum-Controller über einen Schlauch mit einem Edelstahl-Anschluss.
- Stellen Sie die Streckbewegung von 10% mittlere Zellstamm bei einer Frequenz von 0,15 Hz mit dem zyklischen Sinusfunktion Modus auf der Vakuumsteuerungssoftware, klicken Sie dann auf "Start".
- Aufrechterhaltung der konstanten Fluss von Kulturmedium (30 & mgr; l / h) in den beiden oberen und unteren Mikrokanal zum konfluenten Caco-2-Monoschicht unter mechanischer Verformungen (10%, 0,15 Hz) für ~ 100 Stunden.
Hinweis: Caco-2-Zellen Sponzeitiges laufen villus Morphogenese mit ondulierten 3D - Projektionen in Richtung des Lumens des epithelialen Mikrokanal verlängert 5,8-10.
- Um emulieren die Orgel-Level - Funktionen des lebenden menschlichen Darms mit Lumen Kapillargewebe Schnittstelle im Darm-on-a-Chip 10, folgen Sie den Schritten , wie beschrieben.
- Wachsen mikro Caco-2-Zotten von Schritten von 2.1 zu 2.2 zu wiederholen.
- Fließt, um den vorgewärmten Co-Kulturmedium (eine Mischung des vollständigen Caco-2-Zellkulturmedium und die komplette HMVECs Kulturmedium, 1: 1 v / v) zu den oberen und unteren Mikrokanäle bei 30 & mgr; l / Std.
- Einführung von 100 & mgr; l dissoziierten normalen menschlichen kapillaren mikrovaskulären Endothelzellen (HMVECs; Endzelldichte, ~ 5,0 × 10 5 Zellen / cm 2) in den unteren Mikrokanal durch das gleiche Verfahren beschrieben in Schritten von 2.2.3 bis 2.2.9.
- Legen Sie einen gehärteten rechteckigen PDMS Stück (0,5 cm x 1 cm x 1 cm, Breite x Länge x Höhe; 15: 1, w/ w Elastomer: Härter) auf dem gut-on-a-Chip - Gerät, dann die gesamte Geräte - Setup - Flip den Kopf (dh steht der obere Mikrokanal nach unten, und der untere Mikrokanal nach oben steht).
- Inkubieren Sie das Setup in einem 37 ° C, befeuchteten 5% CO 2 Inkubator für 1 Stunde dissoziierten HMVECs zu ermöglichen an die Oberfläche der porösen Membran in der unteren Mikrokanal zu halten.
- Nehmen Sie eine komplette Anlage aus dem CO 2 Inkubator heraus, und klappen Sie den Setup immer wieder.
- Strömungsvorgewärmten Co-Kulturmedium (eine Mischung des vollständigen Caco-2-Zellkulturmedium und die komplette HMVECs Kulturmedium, 1: 1 v / v) in den beiden oberen und unteren Mikrokanäle bei 30 & mgr; l / h mit einer mechanischen Streckbewegungen ( 10%, 0,15 Hz) für mindestens drei Tage Zell-Zell-Junctions einer endothelialen Monoschicht zu bilden.
3. Host-gut Microbiome Co-Kultur in einem Gut-on-a-Chip-Microdevice
- Führen Sie Vorkultur of die Bakterienzellen wie folgt zusammen Kultur commensal gut microbiome auf der mikro Darmzotten.
- Resuspendieren des gefriergetrockneten probiotischen Bakterien pulverige Mischung in 10 ml des Gemisches (1: 1, v / v) von autoklaviert Lactobacilli MRS Broth und Reinforced Clostridial Medium.
- Stellen Sie die endgültige Zelldichte auf etwa 0,2 Einheiten der optischen Dichte (bei 600 nm) durch eine entsprechende Menge des Mediums Zugabe, dann 3 ml Aliquot der mikrobiellen Zellsuspension in einem 10 ml sterilen Einweg-Röhrchen.
- Die Röhrchen enthaltenden mikrobiellen Zellen in dem anaeroben Behälter resuspendiert. In zwei Packungen von anaeroben Gaserzeugungs Beutel in den Behälter. Schließen Sie den Behälterdeckel fest und brüten die Container Setup ohne in einem 37 ° C schüttelnd befeuchteten 5% CO 2 Inkubator O / N.
- Inokulation von Microbiome und Co-Kultur mit Darmepithelzellen 5,10.
- Bereiten Sie 3 ml Einwegspritzen enthält entgastem antibiotic freien Zellkulturmedium (dh DMEM mit 20% FBS). Siehe 2.1.6 für die Entgasung des Kulturmediums.
- Nehmen Sie eine ganze Einrichtung der gut-on-a-Chip - Gerät mikro Zotten aus dem CO 2 Inkubator, dann bewegen , um die biologische Sicherheit Kabinett.
- Entfernen Spritzen verbunden ist, um den oberen und unteren Mikrokanäle verbunden Schläuche. Schließen Sie Spritzen vorbereitet in 3.2.1 auf dem Gerät wieder an die CO 2 Inkubator, dann fließen diese antibiotikafreien Kulturmedium für 12 Stunden vor der Aussaat von microbiome.
- Spin down die vorkultiviert probiotische Bakterienmischung Zellen (siehe Schritte in 3.1) bei 10.000 × g für 5 min. Saugen Sie den Überstand unter Verwendung von Vakuum, resuspendieren dann in antibiotikafreies DMEM - Medium (endgültige Zelldichte, ~ 1,0 x 10 7 CFU / ml).
- die Zellsuspension in die Lumenseite des Mikrokanals infundieren die "keimfrei" Darmzotten unter Verwendung einer 1 ml Einwegspritze mit einer 25 angebracht enthaltendG5 / 8 Nadel. Ermöglichen das Anhaften von mikrobiellen Zellen an die apikale Oberfläche der Darmzotten für ~ 1,5 h ohne Strömung durch alle dem Rohrende festzuklemmen.
- Perfundieren die vorgewärmte antibiotikafreien Kulturmedium in die beiden oberen und unteren Mikrokanäle bei 40 & mgr; l / h mit cyclischen rhythmische Verformungen (10%, 0,15 Hz).
- Für die Co-Kultur von grün fluoreszierendes Protein (GFP) -markierten E. coli (E. coli GFP; Nicht pathogen DH5-Alpha E. coli - Wirt) 10,11 Zellen mit mikro Zotten, vorge pflegen GFP E. coli - Zellen in autoklavierte LB - Medium bei 37 ° C unter 12 hr Zustand (200 rpm) ausgeschüttelt. Wiederholen Sie den Vorgang von 3.2.5 bis 3.2.6 durchzuführen Co-Kultur von GFP E. coli - Zellen mit mikro Zotten.
- Bildzellen 5,8-10
- Führen DIC, Epifluoreszenz oder Laser - Scanning - konfokale Mikroskopie für die Aufzeichnung von mikrobiellen und epitheliale Morphologie 5,8,10.
- Für die DIC - Bildgebung, nehmen Sie eine Einrichtung von gut-on-a-Chip - Mikro aus dem CO 2 Inkubator aus, legen Sie die Geräte - Setup auf der Bühne eines Mikroskops, dann die Zellmorphologie aufzuzeichnen.
- Für Fluoreszenz-Bildgebung von villus Epithel, Strömungs PBS für die Zellen in 100 & mgr; l / h Waschen für 10 min.
- Fix Zotten mit 4% (w / v) Paraformaldehyd für 15 min. Dann PBS fließen die Zellen bei 100 & mgr; l / h für 10 Minuten zum Waschen.
- Permeabilisieren die Zotten mit 0,3% (v / v) Triton X-100 verdünnt in PBS 2% (w / v) Rinderserumalbumin (BSA) für 10 min. Dann PBS fließen die Zellen bei 100 & mgr; l / h für 10 Minuten zum Waschen.
- Block-Zellen mit 2% (w / v) BSA-Lösung in PBS für 1 Stunde. Dann PBS fließen die Zellen bei 100 & mgr; l / h für 10 Minuten zum Waschen.
- Hinzufügen von 300 nM von 4 ', 6-Diamidino-2-phenylindol-Dihydrochlorid (DAPI) Lösung für die Kernfärbung unter Lichtschutz in PBS verdünnt.
- In 25 Einheiten / ml fluoreszierender phalloidin(Phalloidin-CF647-Konjugat) in PBS gelöst, für F-Actin-Färbung unter Lichtschutz.
- Nehmen Sie Bilder der fluoreszierend gefärbten Zellen ein Laser-Scanning-konfokalen Mikroskop.
Hinweis: Ein 25X Ziel wurde mit geeigneten optischen Zoom während der konfokalen Mikroskopie angewendet. In 3B wurde etwa 525x Vergrößerung verwendet.
- Führen DIC, Epifluoreszenz oder Laser - Scanning - konfokale Mikroskopie für die Aufzeichnung von mikrobiellen und epitheliale Morphologie 5,8,10.
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Representative Results
Um den menschlichen Darm - Wirt-microbiome Ökosystem in vitro nachzuahmen, ist es notwendig, um eine experimentelle Protokoll zu entwickeln, um die stabile langfristige Co-Kultur von Darmbakterien und humanen intestinalen Epithelzellen unter physiologischen Bedingungen wie Peristaltik-ähnliche Mechanik und Fluidfluss wiederherzustellen. Hier nutzen wir eine biomimetische gut-on-a-Chip-Mikroeinrichtungs (1A) zu Co-Kultur in direkten Kontakt mikrobiellen Zellen lebend mit menschlichen Zotten für Zeiträume von einer Woche oder mehr leben in vitro. Die intestinalen Epithelzellen sich spontan gut differenzierten Zotten bilden , wenn sie kultiviert auf einer Seite einer porösen ECM-beschichtete Membran in einem Kanal eines 2-Kanal - Mikrofluidik - Vorrichtung in Gegenwart von physiologisch relevanten Fluidströmung und cyclischer mechanischen Verformungen 5. Die mikro Zotten replizieren Strukturen und Funktionen von menschlichen Dünn Darmzotten, einschließlich formatiauf der säulen aus der Gruft zu villus Spitze voran durch eine apikale Bürstensaum, basal proliferative Krypten mit Migration und Differenzierung von Tochterzellen ausgekleidet Zellen epithelialen, hohe Schleimproduktion, verbesserte Arzneimittel metabolisierende Aktivität und erhöhte Glukose - Wiederaufnahme - 8. Lebende Endothelzellen können auf der gegenüberliegenden Seite derselben Membran die gewebe Gewebe - Grenzfläche der Darmwand zu erstellen , kultiviert werden, und Immunzellen können in dem System als auch 10 kultiviert werden. Um die Schutzfunktion der intestinalen Epithelzellen, enge Kontaktbarriere der Darmzotten gebildet in einem gut-on-a-Chip - Validierung wird durch Messung des transepithelialen elektrischen Widerstands (TEER) 5,10,12 intermittierend quantitativ bestimmt. Routineüberwachung von TEER - Wert erforderlich , um die Unversehrtheit einer Zellschicht oder Darmzotten an jeder Stelle abzuschätzen (beispielsweise vor der Bakterien in das Lumen Zugabe).
7 KBE / ml) resuspendiert leben in das Lumen des epithelialen Mikrokanal geimpft (1B "Inoculation"). Nach mikrobiellen Zellen auf der apikalen Oberfläche der Zotten in Abwesenheit von Strömungs für ~ 1,5 h (1B "Anhang"), physiologische Fluss (40 & mgr; l / h) anhaften wird mit cyclischen mechanischen Verformungen durch beide Kanäle wieder aufgenommen (10% Dehnung bei 0,15 Hz) ungebundene Darmbakterien und Nährstoffen versorgen sowohl bakterielle und Zotten Epithelzellen (Abbildung 1B, "Co-Kultur") zu entfernen. Diese Co-Kultur - Protokoll ermöglicht die stabile Kolonisierung von mehreren Arten von probiotischen Bakterien im intervillus Raum, mit lebensfähigen bakteriellen Mikrokolonien für bis zu zwei Wochen in Kokultur (2A, 2B) gehalten werden. In dieser Studie wurde ein commercial probiotischen Formulierung , die eine gemischte Population von 8 verschiedenen fakultatives oder obligat anaerobe, probiotische Stämme von Bifidobacterium breve enthält, B. longum, B. infantis, Lactobacillus acidophilus, L. plantarum, L. paracasei, L. bulgaricus und Streptococcus Thermophilen verwendet.
Diese Co-Kultur-Methode kann im Großen und Ganzen den menschlichen Darm-Wirt-Mikroben-Ökosystem zu emulieren angewendet werden. Beispielsweise nicht-pathogene E. GFP coli kann in einem gut-on-a-Chip - Gerät aufgewachsen auf der Oberfläche der Darmzotten co-kultiviert werden. Basierend auf dem gleichen Protokoll oben beschrieben, eingehalten GFP E. coli - Zellen auf den Zotten aus einzelnen Zellen in 1 Stunde bis mehrere Mikrokolonien mit 3 Tagen (3A, 1 h vs. 72 Stunden) wachsen, die in den intervillus Räumen (3B, 1 Stunde gegen 72 h) , wenn die Kultur unter rieselt lokalisieren Fluss (40 & mgr; l /h) in Gegenwart von Peristaltik artigen Verformungen (10%, 0,15 Hz).
Abbildung 1. Der menschliche Darm-on-a-Chip microphysiological System für Host-gut microbiome Co-Kultur. (A) Ein Foto (links) und eine schematische (rechts) eines 2-Kanal, gut-on-a-Chip Mikrofluidik-Vorrichtung. Die Pfeile zeigen die Richtung des Kulturmediums Strom (blau, oben Mikrokanal, rot, unten Mikrokanal). (B) Schematische Darstellung des Verfahrens der Host-gut microbiome Co-Kultur im Darm-on-a-Chip. Nach intestinalen Epithelzellen Zotten (~ 100 hr) bilden, in dem Zellkulturmedium resuspendiert mikrobiellen Zellen in das Lumen Mikrokanal (Inokulation) eingeführt werden, dann wird die Strömung des Kulturmediums für ~ 1,5 h (Attachment) suspendiert. Nach mikrobiellen Zellen an die apikale Oberfläche der Darmzotten anhaften wird Fluss wieder aufgenommen (Co -Kultur). Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Co-Kultur von mehreren probiotischen Bakterien mit Darmzotten im Darm-on-a-Chip. (A) eine Differentialinterferenzkontrastmikroskopische Aufnahme zeigt eine Mikrokolonie von probiotischen Bakterienzellen zwischen der Villi im Darm Chip wächst. (B) eine höhere Leistung Vergrößerung Ansicht von A (eine schwarze gepunktete Quadrat) , um die Mikrokolonie von probiotischen Bakterienzellen zeigt (ein roter Pfeil). V, Zotten; Maßstabsbalken = 20 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Abbildung 3. Co-Kultur von nicht-pathogenen, GFP-markiertem E. coli mit Darmzotten im Darm-on-a-Chip. (A) Überlagerte Fluoreszenz und DIC mikroskopische Aufnahmen bei 1 und 72 Stunden entnommen, die Besiedlung von GFP E. Anzeige coli auf den Darm im Darm-on-a-Chip gewachsen Zotten. (B) Hohe Leistung Vergrößerung Ansichten von überlagerten Fluoreszenz konfokalen Mikroskopaufnahmen genommen auf 1 und 72 Stunden , das Wachstum von GFP-markierten E. zeigt coli aus einer einzigen Zelle (a roter Pfeil) auf einer Mikrokolonie (ein weißer Pfeil). Blau, Kerne; magenta, F-Aktin; Maßstabsbalken = 30 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Host-microbiome Wechselwirkungen zu verstehen, ist entscheidend für die Medizin voran; jedoch nicht traditionellen Zellkulturmodellen in einer Kunststoffschale oder einem statischen Well - Platte durchgeführt , unterstützen die stabile Co-Kultur von menschlichen Darmzellen mit lebenden Mikroben gut für mehr als 1-2 Tage , weil mikrobiellen Zellen meist die Säugerzellen in vitro überwuchern. Die zuwachs mikrobiellen Population verbraucht schnell mit Sauerstoff und Nährstoffen, anschließend übermäßige Menge an Stoffwechselabfälle (zB organische Säuren) sein kann , die einen schweren Darmbarrierefunktionen und verursachen Darmepithel Zelltod gefährden. Daher ist die mikrobielle Wucherung zu verhindern, dass die Abreicherung von Nährstoffen und die Ansammlung von mikrobiellen Abfälle verursacht, ist entscheidend für die Aufrechterhaltung lebensfähiger Host-microbiome Koexistenz für einen längeren Zeitraum (Tage bis Wochen) in der Co-Kultur-Mikroumgebung.
Zur Überwindung dieser Herausforderungen eine microphysiologicalDarm-on-a-Chip - Gerät 5,8 entwickelt wurde vollständig differenzierten humanen Darmzotten zu bilden und die Steady-State - Mikroumgebung des Darmlumen in vitro zu halten. Das Design und die Funktionseinheiten (zB mikrofluidischen Flusszelle Kammern, Vakuum-driven zyklischen Verformungen) eines gut-on-a-Chip - Mikrofluidik - Vorrichtung modifiziert werden , um präzise die physiologischen, physikalischen und chemischen Mikro für die mikrobielle Co-Kultur 5, emulieren 10. Die Scherspannung im Darm-on-a-Chip - Mikrofluidik - Kultur angelegt wurde vom physiologischen Bereich von Luminal Fluss im menschlichen Darm 5,13 bestimmt. Für die Host-Mikrobe Co-Kultur, in der luminalen Mikrokanal des Darms-on-a-Chip der "steady-state" der mikrobiellen Population aufrechtzuerhalten ist von entscheidender Bedeutung in chemisch und ernährungsphysiologisch machbar Bedingungen zu unterstützen. Im Darm-on-a-Chip-Mikrosystem ist es möglich, die intraluminale Steady-State im Darm-on-a-Chip von measuri zu schätzenng der pH des Kulturmediums und die mikrobielle Zelldichte. Weil frisches Kulturmedium sowohl mikrobielle und Epithelzellen nicht unterziehen Nährstoffverarmung kontinuierlich die Mikrokanäle durchströmt, wenn die anfängliche Aussaatdichte von mikrobiellen Zellen und die volumetrische Strömungsgeschwindigkeit des Kulturmediums optimiert sind. Das konditionierte Medium durch den Mikrokanal vorbei strömt bei einem definierten Volumendurchsatz (hier : 40 & mgr; l / h), so metabolischen Abfälle (zB organische Säuren) sowie zelluläre secretomes (zB Cytokine) kontinuierlich aus dem co- entfernt Kultur Mikroumgebung. Somit kann der Darm-on-a-Chip-Vorrichtung, die als "kontinuierliche Bioreaktor" mit einem Steady-State-Mikroumgebung notwendig und ausreichend, um effektiv auswaschen ungebunden oder bewachsen mikrobiellen Zellen aus dem Lumen des Darmmikrokanal in Betracht gezogen werden, die die Erzeugung erleichtert eine stabile mikrobielle Nische innerhalb von 2-3 Tagen.
Es gibt entscheidende factors, die als Fehlersuche in Betracht gezogen werden für die erfolgreiche Co-Kultur von mikrobiellen Zellen auf der Darmzotten müssen. Erstens ist es notwendig, die optimierte Inkubationszeit für den mikrobiellen Zellen erforderlich zu bestimmen, auf die Oberfläche der Zotten zu befestigen, da mikrobielle Adhäsion zwischen mikrobiellen Spezies variieren kann. Zum Beispiel probiotische Bakterien, wie Lactobacillus rhamnosus GG 5, erfordern in der Regel ~ 1,0-1,5 hr zu befestigen, aber einige andere mikrobielle Spezies erfordern kürzere (zB pathogene Mikroben) oder längere Zeiten, abhängig von ihrer Haftung kinetics 14. Zweitens sollte die anfängliche Aussaatdichte der mikrobiellen Zellen identifiziert werden, da eine übermäßige mikrobiellen Zellzahlen zum Auswachsen von Bakterien in der frühen Stufe der Co-Kultur führen kann, die mit dem Erreichen eines stabilen stationären Zustand stören können. Um diese Einsaatdichte optimieren, wird empfohlen, das Wachstumsprofil der Zielmikrobenstamm in der antibi zu charakterisierenotic freien Zellkulturmedium bei verschiedenen Einsaatdichten. Schließlich wird die Einstellung der volumetrischen Strömungsgeschwindigkeit kann in Abhängigkeit von den mikrobiellen Spezies erforderlich sein. Zum Beispiel werden erhöhte Strömungsraten benötigt werden, wenn die mikrobiellen Zellen sehr schnell vermehren. Es wurde experimentell nachgewiesen, dass Flussraten bis zu 300 & mgr; l / h bestätigt (0,2 dyn / cm 2) nicht gefährden die Barrierefunktion und die Zellmorphologie der mikro Zotten (Daten nicht gezeigt). Obwohl Lactobacillus rhamnosus GG 5, over-the-counter probiotische Mischung, VSL # 3, nicht-pathogenen Laborstamm E. coli sowie das pathogene enteroinvasive E. coli - Stamm 10 wurden für die langfristige Co-Kultur im Darm-on-a-Chip erfolgreich angewendet wird , ist es immer noch eine Vielzahl von mikrobiellen Spezies von commensal Darmmikrobiota auf pathogene infektiöse Mikroorganismen zu testen erforderlich. Die Kultivierbarkeit von mikrobiellen Zellen in vitro sollte in Gegenwart oder Abwesenheit in Betracht gezogen werden ,von Wirtszellen im Zusammenhang mit der Symbiose und Entwicklung, wo der Test die kultivierbarer gut microbiome des Anbaus eine faszinierende Herausforderung. Schließlich wird ein robustes Protokoll für die Co-Kultur von aeroben und anaeroben Mikroben im Darm-on-a-Chip ist ein kritischer unerfüllten Bedarf in der Zukunft entdeckt werden.
Es sind Schritte, die weiter entnommen werden kann, um das Modell, wie die Verwendung von primären intestinalen epithelialen oder undifferenzierte Stammzellen, die aus einzelnen menschlichen Subjekten zu verbessern, die bestimmte gastrointestinale Erkrankungen, wie Morbus Crohn oder Darmkrebs haben; oder induzierte pluripotente Stammzellen (iPS-Zellen). Doch mit dem wachsenden Interesse an der Rolle der menschlichen microbiome in orchestriert die menschliche Gesundheit und Krankheit, unser Gastgeber-microbiome Co-Kultur - Methode hat eine enorme Bedeutung und das Potenzial angewendet werden auf andere Host-microbiome Ökosysteme im menschlichen Körper gefunden nachahmen (zB , der Mundhöhle 15, die Haut 16 oder urogenitalen tract 17). Schließlich kann diese Co-Kultur-Verfahren der herkömmlichen Arzneimittelentwicklung innovativ durch die Vorhersehbarkeit in Bezug darauf, wie das Darm microbiome Einflüsse auf die Bioverfügbarkeit, Wirksamkeit zu verbessern und Toxizität neuer Wirkstoffe. Zusammengenommen der Darm-on-a-Chip kann microphysiological System eine robuste Plattform bieten so einen stabilen stationären Zustand Darm-Mikroumgebung zu schaffen, die verwendet werden können, Host-microbiome Ökosystem wiederherzustellen.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) containing 25 mM glucose and 25 mM HEPES | Gibco | 10564-011 | Warm it up at 37 °C in a water bath. |
| Difco Lactobacilli MRS broth | BD | 288120 | Run autoclave at 121 °C for 15 min. |
| Poly(dimethylsiloxane) | Dow Corning | 3097358-1004 | 15:1 (w/w), PDMS : cureing agent |
| Caco-2BBE human colorectal carcinoma line | Harvard Digestive Disease Center | Human colorectal adenocarcinoma | |
| Heat-inactivated FBS | Gibco | 10082-147 | 20% (v/v) in DMEM |
| Penicillin-streptomycin-glutamine | Gibco | 10378-016 | 1/100 dilution in DMEM |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Molecular Probes | D1306 | Nuclei staining |
| Phalloidin-CF647 conjugate (25 units/ml) | Biotium | 00041 | F-actin staining |
| Flexcell FX-5000 tension system | Flexcell International Corporation | FX5K | Peristalsis-like stretcing motion (10% cell strain, 0.15 Hz frequency) |
| Inverted epifluorescence microscope | Zeiss | Axio Observer Z1 | Imaging, DIC |
| Scanning confocal microscope | Leica | DMI6000 | Imaging, Fluorescence |
| UVO Cleaner | Jelight Company Inc | 342 | Surface activation of the gut-chip |
| Type I collagen | Gibco | A10483-01 | Extracellular matrix component for cell culture into the chip |
| Matrigel | BD | 354234 | Extracellular matrix component for cell culture into the chip |
| 1 ml disposable syringe | BD | 309628 | Cell and media injection stuff |
| 25 G 5/8 needle | BD | 329651 | Cell and media injection stuff |
| Syringe pump | Braintree Scientific Inc. | BS-8000 | Injection equipment into the chip |
| VSL#3 | Sigma-Tau Pharmaceuticals | 7-45749-01782-6 | A formulation of 8 different commensal gut microbes |
| Reinforced Clostridial Medium | BD | 218081 | Anaerobic bacteria culture medium |
| GasPak EZ Anaerobe Container System with Indicator | BD | 260001 | Anaerobic gas generating sachet |
| 4% paraformaldehyde | Electron Microscopy Science | 157-4-100 | Fixing the cells for staining |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Permeabilizing the cells |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7030 | Blocking agent for staining of the cells |
| Corona treater | Electro-Technic Products | BD-20AC | Plasma generator for fabrication of the chip |
| Steriflip | Millipore | SE1M003M00 | Degasing the complete culture medium |
| Disposable hemocytometer | iNCYTO | DHC-N01 | For manual cell counting |
References
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