Summary
אנו מתארים פרוטוקול במבחנה Microbiome במעיים שיתוף תרבות villi מעיים במשך תקופה ארוכה באמצעות אדם בטן-על-שבב מערכת microphysiological.
Abstract
כאן אנו מתארים פרוטוקול לבצע לטווח ארוך שיתוף התרבות של Microbiome במעיים רב המין האנושי עם villi המעי microengineered בתוך האדם בטן-על-שבב מכשיר microphysiological. אנחנו לשחזר את ממשק רקמות לומן-נימי המעי במכשיר microfluidic, שבו דפורמציות מכני פיזיולוגיים זרימת גזירה נוזל מוחלים כל הזמן לחקות תנועה פריסטלטית. ב microchannel לומן, האפיתל במעי האדם תאים קאקו-2 הם מתורבתים לגבש האפיתל סיסי 'נבט חינם' ו להתחדש villi המעי הדק. תאי חיידקים טרום בתרבית הם מחוסנים לתוך צד לומן להקים מערכת אקולוגי מארח חיידק. אחרי תאי חיידקים לדבוק למשטח הפסגה של villi, זרימת נוזל דפורמציות מכאניים יתחדשו לייצר microenvironment יציב שבו מדיום תרבות הטריה מסופק כל זמן וחיידקים מאוגדים (כמו גם פסולי חיידקים) יוסרו באופן רציף. לאחר שיתוף התרבות המורחבת from ימים עד שבועות, microcolonies המרובה הם מצאו להיות ממוקמים באופן אקראי בין villi, ושניהם חיידקים ותאים אפיתל להישאר קיימא ופונקציונליים עבור שבוע אחד לפחות בתרבות. פרוטוקול שיתוף תרבות שלנו ניתן להתאים לספק פלטפורמה תכליתי עבור מערכות אקולוגיות מאכסן Microbiome אחרים שניתן למצוא באיברים אנושיים שונים, אשר עשוי להקל במחקר במבחנה של תפקיד Microbiome האדם מנצח בבריאות ובחולי.
Introduction
מעי האדם מטפח מערך מגוון מדהים של מינים של חיידקים (<1,000 מינים) ומספר עצום של תאי מיקרוביאליים (10 פעמים יותר מאשר תאי מארחי האדם) וגנים (100 פעמים יותר מאשר הגנום האנושי) 1. Microbiomes אדם אלה ממלא תפקיד מרכזי בחילוף חומרים מזינים xenobiotics, ויסות מערכת חיסונית, ושמירת הומאוסטזיס 2 מעיים. באופן לא מפתיע, בהתחשב פונקציות מגוונות אלה, Microbiome הבטן commensal בהרחבה מודולציה בבריאות ובחולי 3. לכן, להבנת תפקידו של Microbiome במעי אינטראקציות בין מאכסן חיידק הם בעלי חשיבות רבה לקדם עיכול (GI) בריאות ולחקור רפויים חדש לטיפול בבעיות מעיים 4. עם זאת, קיימים מודלים המעי במבחנה (למשל, תרבויות סטטי) להגביל מאכסן Microbiome שיתוף תרבות לתקופה קצרה של זמן (<1 יום) כי תאי חיידקים לגדול יותר ופשרה מחסום המעייםפונקציה 5. במודלים של בעלי חיים סרוגייט (למשל, נבט חינם 6 או מהונדסים גנטית עכברים 7) הם גם לא נפוץ ללמוד crosstalk Microbiome מארח-בטן משום קולוניזציה ותחזוקה יציבה של Microbiome מעי אנושי קשה.
כדי להתגבר על אתגרים אלה, פיתחנו האדם biomimetic לאחרונה "גוט-על-שבב" מערכת microphysiological (איור 1 א, משמאל) לחקות את האינטראקציות Microbiome מארח-gut המתרחשות במעי האדם החיים 5,8. במעיים-על-שבב microdevice מכיל שני ערוצים microfluidic במקביל מופרד על ידי מטריקס גמיש, נקבובי, תאי (ECM) קרום מצופה צופה על ידי תאים אנושי מעי אפיתל קאקו-2, חיקוי ממשק רקמות לומן-נימי המעיים (איור 1A 9, מימין). אבק מונחה דפורמציות קצבית מחזורית לגרום דפורמציות מכאניות פיסיולוגיות המחקות שינויים בדרך כלל inducאד על ידי תנועה פריסטלטית (איור 1 א, ימין). מעניין, כאשר תאי קאקו-2 גדלים בתוך מעי-על-שבב עבור יותר מ -100 שעות, הם יוצרים באופן ספונטני תלת ממדי (3D) villi מעי עם צומת הדוקים, גבולות מברשת פסגה, תאי שגשוג מוגבלים מאורות הבזליים, ייצור ליחה, פעילות חילוף חומרים סמים מוגברת (למשל, ציטוכרום P450 3A4, CYP3A4), וגלוקוז משופרת reuptake 8. ב microenvironment 'נבט חינם' זה, אפשר היה לשתף תרבות הגנרלגוברנמן רמנוסוס לקטובצילוס פרוביוטי או במערך הטיפולי של תערובת חיידקים פרוביוטיים עם תאי אפיתל המארח עד שבועיים 5,10.
במחקר זה, אנו מתארים את הפרוטוקול המפורט לביצוע Microbiome מארח-gut שיתוף תרבות במעיים-על-שבב במכשיר במשך תקופה ארוכה. בנוסף, אנו דנים בנושאים קריטיים ואתגרים פוטנציאל להיחשב עבור יישום רחב של p תרבות שיתוף מאכסן Microbiome זהrotocol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Microfabrication 1. התקן גוט-על-שבב
הערה: בטן-על-שבב הוא מכשיר microfluidic שנעשו על ידי פולימר סיליקון שקוף, גז חדיר (polydimethylsiloxane, PDMS), המכיל שני microchannels מקבילים (רוחב 1 מ"מ x 150 מיקרומטר גובה x 1 ס"מ אורך) מופרדים על ידי גמישים נקבובי (10 מיקרומטר קוטר נקבובי, 25 מיקרומטר נקבוביים המרווח להתעמק) PDMS קרום 5,9. לפברק במעיים-על-שבב (איור 1 א, משמאל) ביצוע הצעדים.
- נוהל microfabrication של גוט-על-שבב 5,9.
- הכן PDMS דפוקה, degassed על ידי ערבוב prepolymer PDMS ואת הסוכן ריפוי (15: 1 w / w), ומניחים אותו בתוך ייבוש ואקום במשך 30 דקות.
- יוצקים 30 גרם ו -3 גרם של PDMS דפוקה, degassed על כל תבנית סיליקון כי יש מבוסס SU-8 micropatterns של העליון ואת microchannels התחתון של הבטן-על-שבב, בהתאמה. ואז לרפא על 60 מעלות צלזיוס בתנור יבש במשך lhr 4 ממזרח.
- Demold שכבות PDMS העליונים והתחתונים מכל תבנית סיליקון בחתך סביב קצה באמצעות אזמל כירורגי. פונץ '6 חורים (שני פתחי כניסה, שני שקעים, ושני תאי ואקום) באמצעות אגרופן ביופסיה (2.0 מ"מ קוטר חור).
- הכן את הממברנה הנקבובי ידי שפיכת 10 גרם של PDMS הדפוקה ו degassed על פרוסות סיליקון silanized המכילות מערכים פוסט עם עמודים עגולים (10 מיקרומטר קוטר, 25 מיקרומטר גובה) שכיסו עם שטוח, silanized שכבת תמיכת PDMS (15: 1, w / w; 1 ס"מ עובי). מניחים פרסר במשקל 3 ק"ג על ההתקנה ולרפא הפולימר ב 60 מעלות צלזיוס למשך 12 שעות או יותר.
- Demold ההתקנה של קרום PDMS נקבובי דבק לוח תמיכת PDMS מן פרוסות סיליקון על ידי הרמה בפינה של הלוח בזהירות מן הרקיק, ואת הקילוף עד הממברנה PDMS הנקבובית מנותקת לחלוטין מן הרקיק.
- לחשוף את צד הערוץ של שכבה עליונה (PDMS, 15: 1, w / w) וצד הקרום הנקבובי אל plאסמא שנוצר על ידי treater קורונה כף יד דקות 1, ו -3 שניות, בהתאמה.
- מניחים את משטחי פלזמה שטופלו של קרום PDMS נקבובי שכבה microchannel העליונה איש קשר קונפורמי על ידי הצבת כל חתיכה במקביל ללא כל בועות האוויר.
- דגירת ההתקנה כולה על 80 מעלות CO / N מליטה הפיכה של שתי שכבות PDMS.
- לקלף את שכבת תמיכת PDMS מהמכלול של שכבה עליונה עם קרום נקבובי ידי הרמה בפינת בקפידה של שכבת התמיכה, ואת הקילוף עד ששכבת התמיכה מנותקת לחלוטין מן השכבה העליונה עם הקרום.
- לקרוע את המנות של קרום זה ממוקם מעל לתא הוואקום (שני התאים ממוקמים משני צדי הערוץ העיקרי) באמצעות פינצטה בסדר-עצה לעשות תאי ואקום חלולים.
- לחשוף את הצד עם הקרום המצורפת על הפיסה העליונה והצד עם ערוצי חרות על החתיכה התחתונה לפלזמה בבית באותו אופן כפי שתואר in לשלב 1.1.6 דקות 1.
- יישר את השכבה העליונה microchannel עם קרום נקבובי ועל השכבה התחתונה עם איש קשר קונפורמי על ידי הצבת כל חתיכה במקביל ללא כל בועות אוויר תחת stereoscope.
- לרפא את ההתקנה כולה בתנור יבש ב 80 מעלות CO / N כדי לייצר בקנה מידה מלא בטן-על-שבב מכשיר microfluidic המכיל שני תאי ואקום חלולים שלצד ערוץ תא microfluidic.
- חיבור צינורות אל הכניסה והיציאה של כל יציאה צמודה העליון או microchannels הנמוך בטן-על-שבב באמצעות מחט קהה-סוף הנירוסטה מכופפת 90 °.
- חבר את הצינורות עם החורים צמודים תאי הוואקום באמצעות מחט קהה סוף נירוסטה מכופפת 90 °.
- לעקר את microchannels צינורות ידי זורם 70% (V / V) אתנול באמצעות 1 מ"ל לעקר מזרק חד פעמי.
- לייבש את microchannels צינורות בתוך O בתנור יבש 60 ° C / N.
צמיחת 2. Microengineered מעי villi במעיים-על-שבב ההתקן
- תאי זרע המעיים אפיתל (למשל קאקו-2BBE) על 5,9 Microdevice גוט-על-שבב.
- לעקר את המכשיר עם 70% (V / V) אתנול (ראה שלב 1.4) באמצעות מזרק חד פעמי 1 מ"ל מעוקר ואחריו ייבוש בתוך O בתנור יבש 60 ° C / N (ראה שלב 1.5) לפני הפעלת השטח.
- לחשוף את ההגדרה השלמה של microsystem בטן-על-שבב (כלומר, גוף של מעי-על-שבב מחובר צינורות) לאור UV (253.7 nm) ו אוזון זמנית במשך 40 דקות.
- לצנן את המכשיר ב RT במשך 15 דקות תחת אור UV בתוך ארון בטיחות ביולוגית (BSC).
- הציגו 100 μl של ציפוי ECM solution- תערובת מסוג 50 מיקרוגרם / מ"ל לי קולגן 300 מיקרוגרם / מ"ל תערובת תאי מטריקס מדולל בינוני הנשר Modified-סרום חינם של Dulbecco (DMEM) - לשני microchannels העליון והתחתון באמצעות הפנויה , מזרק 1 מ"ל סטרילי.
- אינקובטוריםte ההתקנה כולה בתוך 37 ° C humidified 5% CO 2 באינקובטור במשך שעה 1.
- דגה 50 מ"ל של טרום התחמם (37 ° C) בינוני תרבות שלמה (DMEM, 20%, V / V, בסרום שור העובר (FBS), 100 יחידות / פניצילין מ"ל ו -100 מיקרוגרם / סטרפטומיצין מ"ל; aliquoted בתוך 3 מ"ל מזרק חד פעמי) באמצעות מערכת סינון 50 מיליליטר (0.45 מיקרומטר הגודל נקבובי) של BSC דקות 1.
- לעבור את המדיום מראש חימם דרך מערכת סינון והקש בעדינות על המדיום מסוננים דקות 1 כדי להסיר בועות או גז מומס המדיום.
- מניחים את aliquot של בינוני מלא degassed בתוך מזרק חד פעמי 3 מ"ל ו דגירה של 37 מעלות צלזיוס humidified 5% CO 2 באינקובטור במשך שעה 1.
- חיבור שני מזרקים חד פעמים 3 מיליליטר המכילים degassed, בינוני תרבות השלמה מחומם מראש ל microchannels העליון והתחתון.
- זרימת מדיום תרבית תאים מלאה degassed לתוך microchannel העליון באמצעות משאבת מזרק על הנפחקצב הזרימה של 30 μl / שעה (שווה ערך ל מאמץ הגזירה 0.02 דיין / 2 ס"מ) בתוך 37 ° C humidified 5% CO 2 באינקובטור O / N.
- כינונה של Microengineered קאקו-2 villi במעיים-על-שבב.
- השתמש בתאי קאקו-2BBE עם מספר המעבר בין 50 ו -65.
- לגדל תאי קאקו-2 בבקבוק T75 המכיל בינוני תרבות שלם בתוך 37 ° C humidified 5% CO 2 באינקובטור במשך 4-5 ימים כדי להשיג תאים ומחוברים במלואו.
- הוסף 10 מ"ל של Ca 2 + ו Mg 2 + ללא PBS לתאים קאקו-2 ומחוברות מלא גדל בבקבוק T75, לשטוף תאים, ואז לשאוב את PBS. חזור על פעולה זו פעמיים.
- הוסף 1 מ"ל של 0.05% טריפסין / פתרון EDTA דגירה של 37 מעלות צלזיוס humidified 5% CO 2 באינקובטור במשך 5 דקות.
- Resuspend התאים ניתק עם 10 מ"ל מחומם מראש בינוני תרבית תאים מלאה (עם FBS) על ידי pipetting למעלה ולמטה שלוש עד חמש פעמים.
- ספין למטה השעית התא על ידי גentrifugation ב XG 500 במשך 5 דקות, ולאחר מכן להסיר את supernatant.
- Resuspend שוב עם 1 מ"ל מחומם מראש בינוני מלא להתאים צפיפות התאים ב ~ 1.5 x 10 5 תאים / 2 ס"מ במכשיר. השתמש hemocytometer כדי להעריך את צפיפות התאים.
- להשרות 100 μl של תאים קאקו-2 resuspended לתוך (הצד לומן) microchannel העליון על ידי הצבת מזרק חד פעמי 1 מ"ל מצורף מחט 25 G5 / 8 על היציאה של צינורות המחוברים microchannel העליון.
- הצמד את כל פתחי הכניסה שקעים של צינורות המחוברים microchannels העליון והתחתון באמצעות קליפים קלסר.
- דגירת ההתקנה כולה בתוך 37 ° C חממה, humidified 5% CO 2 עבור שעה 1 כדי לאפשר תאים ניתקת קאקו-2 לדבוק פני השטח של הקרום הנקבובי.
- הסר את המהדק לחדש את זרימת בינוני התרבות היחידה אל microchannel העליון 30 μl / hr באמצעות משאבת מזרק עד תאים מהווים בשכבת תילן 24-36 שעות. השתמש הקונטראס שלבt או התערבות הפרש לעומת זאת (DIC) מיקרוסקופיה לאשר צמתי תאי תאים בשכבת תא.
- כאשר תאי יוצרי monolayer, perfuse מדיום התרבות לשני (לומן) עליון ותחתון (נימים) microchannels באותו קצב הזרימה של 30 μl / hr.
- יישום של דפורמציות מכאנית מחקה תנועות כמו-peristalsis 5,9.
- הפעל את משאבת הוואקום המצויד בציוד המתח.
- חבר את תאי הוואקום אל בקר הוואקום דרך צינורות עם מחבר נירוסטה.
- הגדר את ההצעה המתיחה של זן תא ממוצע 10% בתדר של 0.15 הרץ עם מצב הפונקציה סינוס המחזורי על התוכנה לשליטת הוואקום, ולאחר מכן לחץ על "התחל".
- לשמור על הזרימה הקבועה של מדיום התרבות (30 μl / שעה) בשני microchannel העליון והתחתון בשכבת קאקו-2 ומחוברות תחת דפורמציות מכאני (10%, 0.15 הרץ) עבור ~ 100 שעות.
הערה: קאקו-2 תאים sponבו-זמנית לעבור morphogenesis סיסי עם תחזיות 3D התנחשלו מושטת לומן של microchannel אפיתל 5,8-10.
- כדי לחקות את תפקודי אברים שונים בגוף ברמה של המעי האנושי חי עם ממשק רקמות לומן-נימים במעיים-על-שבב 10, בצע את השלבים כמתוארים.
- לגדול villi קאקו-2 microengineered ידי חזרה צעדים 2.1 כדי 2.2.
- זרימת מדיום שיתוף ההתרבות המחוממת מראש (תערובת של מדיום תרבית תאי קאקו-2 מלא מדיום תרבות HMVECs המלא, 1: 1 v / v) אל microchannels העליון והתחתון 30 μl / hr.
- הציג 100 μl של תאי אנדותל כלי דם נימי אדם נורמלים ניתקים (HMVECs; צפיפות תא סופית, ~ 5.0 x 10 5 תאים / 2 סנטימטר) לתוך microchannel הנמוך בשיטה הזהה כמתואר צעדים מן 2.2.3 כדי 2.2.9.
- מניחים פיסת PDMS מלבני נרפא (0.5 ס"מ x 1 ס"מ x 1 ס"מ; גובה x אורך x רוחב; 15: 1, w/ w אלסטומר: סוכן ריפוי) על גבי במעי-על-שבב המכשיר, ואז להעיף את התקנת המכשיר כולו במהופך (כלומר, microchannel העליון פונה כלפי מטה, ואת microchannel התחתון פונה כלפי מעלה).
- דגירת ההתקנה ב CO 2 באינקובטור 5% 37 מעלות צלזיוס, humidified במשך שעה 1 כדי לאפשר HMVECs ניתק לדבוק פני השטח של הקרום הנקבובי של microchannel הנמוך.
- להוציא התקנה כולה מן CO 2 באינקובטור, ולוחץ על ההתקנה מחדש.
- זרימה בינוני תרבות שיתוף מחוממת מראש (תערובת של מדיום תרבית תאי קאקו-2 מלא מדיום תרבות HMVECs המלא, 1: 1 v / v) לשני microchannels העליון ותחתון 30 μl / hr בתנועות מתיחה מכאניות ( 10%, 0.15 הרץ) במשך שלושה ימים לפחות כדי ליצור צמתים תאים תאים של monolayer האנדותל.
3. Host-gut Microbiome משותף התרבות בתוך גוט-על-שבב Microdevice
- בצע-תרבות מראש of תאים חיידקיים כדלקמן לשתף תרבות Microbiome commensal הבטן על villi המעי microengineered.
- Resuspend את התערובת אבקתי חיידקי פרוביוטיקה מיובש בהקפאה ב 10 מ"ל של תערובת (1: 1, V / V) של מרק לקטובצילוס MRS autoclaved וחיזקו קלוסטרידיאל בינוני.
- התאם את צפיפות התאים הסופי בכ -0.2 יחידות צפיפות אופטית (ב 600 ננומטר) על ידי הוספת כמות מתאימה של המדיום, אז aliquot 3 מ"ל של תרחיף תאים מיקרוביאליים בתוך שפופרת סטרילית חד פעמיות 10 מ"ל.
- מקום צינורות המכילים resuspended תאי חיידקים במכל אנאירובי. להוסיף שתי חפיסות של שקיות חשמל באמצעות גז אנאירובי בתוך המיכל. סגור את מכסה מיכל בחוזקה דגירה ההתקנה מיכל בלי ללחוץ בתוך 37 ° C humidified 5% CO 2 באינקובטור O / N.
- הרכבה של Microbiome ושיתוף תרבות עם מעיים אפיתל תאים 5,10.
- כן 3 מיליליטר מזרקים חד פעמים המכילים antibioti degassedג ללא תרבית תאים בינוניים (כלומר, DMEM עם 20% FBS). ראה 2.1.6 עבור הליך degassing של המדיום לתרבות.
- להוציא ההתקנה כולה של המעי-על-שבב מכשיר המכיל villi microengineered מן החממה CO2, ולאחר מכן לעבור את ארון בטיחות ביולוגית.
- סור מזרקים מחוברים צינורות צמודים microchannels העליון והתחתון. חבר מזרקים ערוכים 3.2.1 למכשיר, להחזיר אל CO 2 באינקובטור, ואז לזרום בינוני תרבות ללא אנטיביוטיקה הזה במשך 12 שעות לפני זריעה של Microbiome.
- ספין למטה תאי תערובת חיידקים פרוביוטיים מראש תרבותי (ראה שלבים 3.1) ב XG 10,000 במשך 5 דקות. לשאוב את supernatant באמצעות ואקום, ואז resuspend במדיום DMEM ללא אנטיביוטיקה (צפיפות התאים הסופי, ~ 1.0 x 10 7 CFU / ml).
- להשרות את השעית התא לתוך צד לומן של microchannel המכיל את villi "ניבט חינם" המעיים באמצעות מזרק חד פעמי 1 מיליליטר מחובר 25מחט G5 / 8. אפשר את הדבקות של תאי חיידקים כדי למשטח הפסגה של villi המעי עבור ~ 1.5 שעות ללא זרימה על ידי כיווץ לכל סוף הצינורות.
- Perfuse מדיום תרבות אנטיביוטיקה ללא מחומם מראש לשני microchannels העליון ותחתונים ב 40 μl / שעה עם דפורמציות קצבית מחזורית (10%, 0.15 הרץ).
- עבור שיתוף התרבות של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) -labeled E. coli (coli GFP א; שאינם פתוגניים DH5-אלפא מארח E. coli) 10,11 תאים עם villi microengineered, מראש לטפח GFP E. קולי תאים במדיום LB autoclaved ב 37 מעלות צלזיוס מתחת רועד במצב (200 סל"ד) למשך 12 שעות. חזור על הליך מ 3.2.5 ל 3.2.6 לבצע שיתוף התרבות של GFP E. קולי תאים עם villi microengineered.
- תאי תמונה 5,8-10
- בצע דסק"ש, epifluorescence, או סריקת לייזר מיקרוסקופיה confocal להקלטת מיקרוביאליים אפיתל מורפולוגיה 5,8,10.
- עבור הדמית דסק"ש, להוציא התקנה ממעי-על-שבב microsystem מן CO 2 באינקובטור, למקם את הגדרת המכשיר על הבמה של מיקרוסקופ, ואז להקליט את מורפולוגיה התא.
- עבור דימות פלואורסצנטי של האפיתל סיסי, לזרום PBS לרחיצת התאים ב 100 μl / hr במשך 10 דקות.
- תקן villi עם 4% (w / v) paraformaldehyde במשך 15 דקות. ואז לזרום PBS לרחיצת התאים ב 100 μl / hr במשך 10 דקות.
- Permeabilize villi עם 0.3% (v / v) טריטון X-100 בדילול מלא PBS המכיל 2% (w / v) אלבומין בסרום שור (BSA) במשך 10 דקות. ואז לזרום PBS לרחיצת התאים ב 100 μl / hr במשך 10 דקות.
- תאי בלוק עם 2% (w / v) פתרון BSA ב PBS עבור שעה 1. ואז לזרום PBS לרחיצת התאים ב 100 μl / hr במשך 10 דקות.
- הוספת 300 ננומטר של 4 ', dihydrochloride 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) פתרון מדולל PBS עבור המכתים הגרעיני תחת הגנת אור.
- הוסף 25 יחידות / מ"ל של phalloidin ניאון(המצומד Phalloidin-CF647) מומס PBS מכתים F- יקטין תחת הגנת אור.
- תמונות שיא של התאים המוכתמים fluorescently באמצעות מיקרוסקופ confocal סריקת ליזר.
הערה: מטרת 25x יושמה עם זום אופטי מתאים במהלך מיקרוסקופיה confocal. באיור 3 ב, כ הגדלה 525X היה בשימוש.
- בצע דסק"ש, epifluorescence, או סריקת לייזר מיקרוסקופיה confocal להקלטת מיקרוביאליים אפיתל מורפולוגיה 5,8,10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כדי לחקות את המערכת האקולוגית מאכסן Microbiome אדם מעיים במבחנה, זה צורך לפתח פרוטוקול ניסוי להקים מחדש את שיתוף התרבות ארוך טווח היציבה של חיידקי מעיים ותאים אפיתל אדם מעיים בתנאים פיסיולוגיים כגון מכניקת זרימת נוזל דמוי הפריסטלטיקה. כאן, אנו מנצלים biomimetic בטן-על-שבב microdevice (איור 1A) לשתף התרבות תאים חיים חיידקים במגע ישיר עם החיים villi אדם לתקופות של שבוע או יותר במבחנה. תאי אפיתל במעי יוצרים באופן ספונטני גם בדיל villi כאשר בתרבית על צד אחד של הממברנה ECM המצופה נקבובית בערוץ אחד של מכשיר microfluidic 2 ערוצים בנוכחות זרימת נוזל רלוונטית מבחינה פיסיולוגי דפורמציות מכאניות מחזוריות 5. Villi microengineered לשכפל מבנה ותפקוד של villi המעי הדק האדם, formati כולל על תאי אפיתל עמודים ולאורכו גבול מברשת פסגה, מאורות שגשוג הבזליים עם הגירה והבחנה של לתאי בת מתקדמים מן הקבר עד קצה סיסי, רמות גבוהות של ייצור ריר, פעילות חילוף חומרי סמים משופרת, ספיגה חוזרת של גלוקוז מוגברת 8. יכול להיות מתורבת חי לתאי אנדותל בצד השני של אותו קרום לשחזר את ממשק רקמות רקמה של דופן המעי, ותאי החיסון יכול להיות מתורבת במערכת כמו גם 10. כדי לאמת את התפקיד ההגנתי של תאי אפיתל במעי, מחסום צומת הדוק של villi המעי שהסתדר בטן-על-שבב הוא ונרשם לסירוגין על ידי מדידת ההתנגדות החשמלית transepithelial (TEER) 5,10,12. ניטור שגרתי של ערך TEER נדרש להעריך את תקינות monolayer תא או villi המעי בכל צומת (למשל, לפני הוספת חיידקים לתוך לומן).
הין-page = "1"> כדי להחזיר את המערכת האקולוגית מארח חיידק, תאים חיים חיידקים resuspended במדיום תרבית תאים ללא אנטיביוטיקה (צפיפות התאים, ~ 1.0 x 10 7 CFU / ml) הם מחוסן לתוך לומן של microchannel אפיתל (איור 1 ב ', "חיסון"). אחרי תאי חיידקים לדבוק על למשטח הפסגה של villi בהעדר הזרימה עבור ~ 1.5 שעות (איור 1 ב ', "התקשרות"), זרימה פיזיולוגית (40 μl / hr) יתחדש דרך שני הערוצים עם דפורמציות מכאניים מחזוריים (10% זן 0.15 הרץ) כדי להסיר חיידקי מעיים מאוגדים וחומרים מזינים אספקה לתאים האפיתל חיידקי שליה היא (איור 1 ב ', "Co-התרבות"). פרוטוקול שיתוף תרבות זו מאפשר קולוניזציה היציבה של מינים רבים של חיידקים פרוביוטיים במרחב intervillus, עם ומתוחזק microcolonies חיידקי קיימא עבור עד שבועות שיתוף התרבות (איורים 2A, 2B). במחקר זה, שותףניסוח פרוביוטיים mmercial המכיל אוכלוסייה מעורבת של 8 אנאירובי פקולטטיבי או לחייב שונים, זנים פרוביוטיים של Bifidobacterium ברווה, B. longum, B. infantis, לקטובצילוס אצידופילוס, L. Plantarum, L. paracasei, L. bulgaricus, ו תרמופיל סטרפטוקוקוס משמש.
שיטת שיתוף תרבות זו יכולה להיות מיושמת באופן נרחב לחקות את המערכת האקולוגית מארח חיידק מעי האדם. למשל, שאינם פתוגניים GFP E. coli יכול להיות שיתוף תרבותי על פני השטח של villi המעי גדל מכשיר בטן-על-שבב. בהתבסס על אותו הפרוטוקול שתואר לעיל, דבקת GFP E. coli תאים על villi לגדול מ תאים בודדים ב 1 hr כדי microcolonies מרובים עם 3 ימים (איור 3 א, 1 hr לעומת 72 שעות) כי לאתר בחללים intervillus (איור 3B, 1 hr לעומת 72 שעות) כאשר בתרבית תחת מטפטפים לזרום (40 μl /hr) בנוכחות של דפורמציות דמוי הפריסטלטיקה (10%, 0.15 הרץ).
איור 1. גוט-על-שבב אנושי מערכת microphysiological לתרבות משותפת Microbiome מארח-הבטן. (א) תצלום (משמאל) מול סכמטי (מימין) של 2 ערוצים, בטן-על-שבב מכשיר microfluidic. החצים מצביעים על כיוון הזרימה בינוני תרבות (כחול, microchannel העליון; אדום, microchannel למטה). (ב) דיאגרמות סכמטי של הליך של שיתוף תרבות Microbiome מארח-gut במעיים-על-שבב. אחרי תאי האפיתל במעי יוצרים villi (~ 100 שעות), תאי חיידקים resuspended במדיום תרבית תאים מוצגים בפני microchannel לומן (חיסון), אז את זרימת בינוני תרבות מושעה עבור ~ 1.5 שעות (Attachment). אחרי תאי חיידקים לדבוק למשטח הפסגה של villi המעי, זרימה תתחדש (Co -culture). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. משותף התרבות של חיידקים פרוביוטיים מרובים עם villi המעי במעי-על-שבב. (א) מיקרוסקופ התערבות ההפרש לעומת זאת מראה microcolony של תאים חיידקיים פרוביוטיים הגוברת בין villi בשבב הבטן. (ב) השקפת הגדלת כוח עליונה של A (ריבוע מקווקו שחור) מראה את microcolony של תאי חיידקיים פרוביוטיים (חץ אדום). V, villi; סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
יור 3 "src =" / files / ftp_upload / 54,344 / 54344fig3.jpg "/>
איור 3. עמית תרבות שאינם פתוגניים, GFP שכותרתו E. coli עם villi מעי במעי-על-שבב. (א) קרינה מעולפת ודסק"ש תמונות מיקרוסקופיות נלקחו ב 1 ו -72 שעות, מוצגות קולוניזציה של GFP E. coli על villi המעי גדל במעיים-על-שבב. (ב) נופי הגדלת הספק גבוה של micrographs confocal קרינה המעולפת נלקח ב hr 1 ו -72 מראים את הצמיחה של GFP שכותרתו E. coli מתא בודד (חץ אדום) על microcolony (חץ לבן). כחול, גרעינים; מגנטה, F- אקטין; סרגל קנה מידה = 30 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הבנת יחסי גומלין בין מאכסן Microbiome היא קריטית לקידום רפואה; עם זאת, מודלי תרבית תאים מסורתיים מתבצעים צלחת פלסטיק או צלחת היטב סטטי אינם תומכים שיתוף התרבות היציבה של תאי מעי אדם עם חי חיידקים במעי במשך יותר מ 1-2 ימים, כי תא חיידקים בעיקר לגדול יותר התאים היונקים במבחנה. אוכלוסיית חיידקים overgrowing צורכת במהירות חמצן וחומרים מזינים, ובהמשך לייצר כמות מוגזמת של פסולת מטבולית (למשל, חומצות אורגניות), אשר ברצינות להתפשר פונקציות מחסום המעי ולגרום מוות של תאים אפיתל במעי. לפיכך, מניעת צמיחת יתר של חיידקים שגורמת דלדול של חומרי הזנה ואת הצטברות של פסולת מיקרוביאלי הוא חיוני לקיום דו-קיום בין מאכסן Microbiome קיימא במשך תקופה ארוכה (ימים עד שבועות) ב במיקרו-סביבה של שיתוף תרבות.
כדי להתגבר על אתגרים אלה, microphysiologicalבטן-על-שבב 5,8 מכשיר פותח כדי ליצור villi מעי אנושי בדיל באופן מלא ולשמור על המיקרו-הסביבה היציבה של חלל המעי במבחנה. יחידות העיצוב פונקציונלי (למשל, תאי תא זרימת microfluidic, דפורמציות מחזורית מונחה ואקום) של בטן-על-שבב מכשיר microfluidic הם שונים לחקות את פיזיולוגיים בדיוק, פיסיים microenvironment כימי עבור חיידקי שיתוף התרבות 5, 10. מאמץ הגזירה הוחל במעיים-על-שבב תרבות microfluidic נקבע על ידי לטווח הפיזיולוגי של זרימה לומינל במעי האדם 5,13. על שיתוף התרבות המארח-חיידק, שמירה על "המצב היציב" של אוכלוסייה המיקרוביאלית של microchannel luminal של מעי-על-שבב היא קריטית בתמיכה כימית תזונתי תנאים אפשריים. במעיים-על-שבב Microsystem, אפשר להעריך את מצב יציב התוך לומינל במעיים-על-שבב ידי measuring ה- pH של מדיום התרבות ואת צפיפות התאים של חיידקים. בגלל בינוני התרבות הטרי זורם ברציפות דרך microchannels, שני תאי מיקרוביאליים אפיתל אינם עוברים דלדול מזין כאשר צפיפות הזריעה הראשונית של תאי חיידקים ואת הספיקה של מדיום התרבות מותאמות. המדיום המותנה עובר דרך microchannel זורם החוצה בכל ספיקה מוגדרת (כאן, 40 μl / שעה), כך פסול מטבולית (למשל, חומצות אורגניות) וכן secretomes הסלולר (למשל, ציטוקינים) יוסרו ברציפות מן השיתוף המיקרו-סביבה ותרבות. לפיכך, במעיים-על-שבב המכשיר יכול להיחשב "bioreactor מתמשך" עם microenvironment יציב הכרחי ומספיק לשטוף ביעילות את תאי חיידקים מאוגדים או מגודל מן לומן של microchannel המעיים, המאפשר דור נישת חיידקים יציבה תוך 2-3 ימים.
ישנם מכריע factors כי חייב להיחשב לפתרון בעיות עבור שיתוף ההתרבות המוצלחת של תאי חיידקים על villi המעי. ראשית, יש צורך לקבוע את זמן דגירת אופטימיזציה נדרש עבור תאי החיידקים לצרף אל פני השטח של villi בגלל הידבקות של חיידקים יכולה להשתנות בין מינים של חיידקים. למשל, חיידקים פרוביוטיים, כגון לקטובצילוס רמנוסוס GG 5, בדרך כלל דורשים ~ 1.0-1.5 hr לצרף, אבל כמה מינים של חיידקים אחרים עשויים לדרוש קצרים (למשל, חיידקים פתוגניים) או יותר פעמים, תלוי קינטיקה ההידבקות שלהם 14. שנית, צפיפות זריעה ראשונית של תאים מיקרוביאליים צריך להיות מזוהה, מכיוון שמספר התא של חיידקים מופרז עלול להוביל תולדה של חיידקים בשלב מוקדם של תרבות משותפת, אשר יכול להפריע השגת המצב היציב יציבה. כדי לייעל את צפיפות זריעה זו, מומלץ לאפיין את פרופיל הצמיחה של זן חיידקי יעד antibiתרבית תאים בינונית otic ללא בצפיפויות זריעה שונות. לבסוף, התאמה של ספיקה שיידרש תלוי מינים של חיידקים. לדוגמא, שיעורי זרימה מוגברות יידרשו אם תאי החיידקים מתרבים בקצב מהיר מאוד. זה היה הניסוי אישר כי ספיקות עד 300 μl / hr (0.2 דיין / 2 ס"מ) לא מתפשרים על תפקוד המחסום ומורפולוגיה תא של villi microengineered (מידע לא מוצג). למרות לקטובצילוס רמנוסוס GG 5, Over-the-counter תערובת פרוביוטית, VSL # 3, שאינם פתוגניים זן מעבדה E. coli וכן א enteroinvasive פתוגניים coli זן 10 יושמו בהצלחה על שיתוף לתרבות לטווח ארוך במעיים-על-שבב, הוא עדיין נדרש לבדוק מגוון של מינים של חיידקים מן החיידקים במעיים commensal מיקרואורגניזמים פתוגניים זיהומיות. Cultivability של תאי חיידקים במבחנה צריך להיות נשוא בנוכחות או בהעדרשל תאי המארחים בהקשר של סימביוזה ואבולוציה, שבו במבחן ובטיפוח Microbiome הבטן unculturable מהווה אתגר מסקרן. לבסוף, פרוטוקול חזק עבור שיתוף התרבות של שני חיידקים אירוביים ואנאירוביים במעיים-על-השבב הוא צורך מסופק קריטי להתגלות בעתיד.
ישנם צעדים שניתן לנקוט על מנת לשפר יותר את המודל, כגון השימוש של אפיתל העיקרי מעיים או תאי גזע מובחנים מן בבני אדם בודדים שיש להם מחלות ספציפיות עיכול כמו מחלת קרוהן או סרטן מעי גס; או תאי גזע מושרים (iPSCs). עם זאת, עם ריבית המתפתחת בתפקיד Microbiome האדם מנצח לבריאות האדם ומחלות, שיטת שיתוף התרבות המארחת-Microbiome שלנו יש משמעות ופוטנציאל אדיר להיות מיושם לחקות מערכות אקולוגיות מאכסן Microbiome אחרים המצויים בגוף האדם (למשל , חלל פי 15, עור 16, או לא ואברי מיןract 17). לבסוף, שיטת שיתוף התרבות זו עשויה לחדש את תהליך פיתוח תרופות הקונבנציונלי על ידי שיפור יכולת החיזוי במונחים של איך את השפעות Microbiome בטן על הזמינות הביולוגית, יעיל, הרעילות של תרכובות תרופה חדשות. יחדיו, במעיים-על-שבב מערכת microphysiological יכולה לספק פלטפורמה יציבה להקים microenvironment מעי יציב יציב שניתן להשתמש בו כדי לשקם מערכת אקולוגית מאכסן Microbiome.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) containing 25 mM glucose and 25 mM HEPES | Gibco | 10564-011 | Warm it up at 37 °C in a water bath. |
| Difco Lactobacilli MRS broth | BD | 288120 | Run autoclave at 121 °C for 15 min. |
| Poly(dimethylsiloxane) | Dow Corning | 3097358-1004 | 15:1 (w/w), PDMS : cureing agent |
| Caco-2BBE human colorectal carcinoma line | Harvard Digestive Disease Center | Human colorectal adenocarcinoma | |
| Heat-inactivated FBS | Gibco | 10082-147 | 20% (v/v) in DMEM |
| Penicillin-streptomycin-glutamine | Gibco | 10378-016 | 1/100 dilution in DMEM |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Molecular Probes | D1306 | Nuclei staining |
| Phalloidin-CF647 conjugate (25 units/ml) | Biotium | 00041 | F-actin staining |
| Flexcell FX-5000 tension system | Flexcell International Corporation | FX5K | Peristalsis-like stretcing motion (10% cell strain, 0.15 Hz frequency) |
| Inverted epifluorescence microscope | Zeiss | Axio Observer Z1 | Imaging, DIC |
| Scanning confocal microscope | Leica | DMI6000 | Imaging, Fluorescence |
| UVO Cleaner | Jelight Company Inc | 342 | Surface activation of the gut-chip |
| Type I collagen | Gibco | A10483-01 | Extracellular matrix component for cell culture into the chip |
| Matrigel | BD | 354234 | Extracellular matrix component for cell culture into the chip |
| 1 ml disposable syringe | BD | 309628 | Cell and media injection stuff |
| 25 G 5/8 needle | BD | 329651 | Cell and media injection stuff |
| Syringe pump | Braintree Scientific Inc. | BS-8000 | Injection equipment into the chip |
| VSL#3 | Sigma-Tau Pharmaceuticals | 7-45749-01782-6 | A formulation of 8 different commensal gut microbes |
| Reinforced Clostridial Medium | BD | 218081 | Anaerobic bacteria culture medium |
| GasPak EZ Anaerobe Container System with Indicator | BD | 260001 | Anaerobic gas generating sachet |
| 4% paraformaldehyde | Electron Microscopy Science | 157-4-100 | Fixing the cells for staining |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Permeabilizing the cells |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7030 | Blocking agent for staining of the cells |
| Corona treater | Electro-Technic Products | BD-20AC | Plasma generator for fabrication of the chip |
| Steriflip | Millipore | SE1M003M00 | Degasing the complete culture medium |
| Disposable hemocytometer | iNCYTO | DHC-N01 | For manual cell counting |
References
- Turnbaugh, P. J., et al. An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest. Nature. 444, 1027-1031 (2006).
- Tremaroli, V., Backhed, F. Functional interactions between the gut microbiota and host metabolism. Nature. 489, 242-249 (2012).
- Sekirov, I., Russell, S. L., Antunes, L. C. M., Brett Finlay, B. Gut Microbiota in Health and Disease. Physiol. Rev. 90, 859-904 (2010).
- Turnbaugh, P. J., et al. The human microbiome project. Nature. 449, 804-810 (2007).
- Kim, H. J., Huh, D., Hamilton, G., Ingber, D. E. Human gut-on-a-chip inhabited by microbial flora that experiences intestinal peristalsis-like motions and flow. Lab Chip. 12, 2165-2174 (2012).
- Round, J. L., Mazmanian, S. K. The gut microbiota shapes intestinal immune responses during health and disease. Nat Rev Immunol. 9, 313-323 (2009).
- Garrett, W. S., et al. Communicable ulcerative colitis induced by T-bet deficiency in the innate immune system. Cell. 131, 33-45 (2007).
- Kim, H. J., Ingber, D. E. Gut-on-a-Chip microenvironment induces human intestinal cells to undergo villus differentiation. Integr Biol. 5, 1130-1140 (2013).
- Huh, D., Kim, H. J., et al. Microfabrication of human organs-on-chips. Nat Protoc. 8, 2135-2157 (2013).
- Kim, H. J., Li, H., Collin, J. J., Ingber, D. E. Contributions of microbiome and mechanical deformation to intestinal bacterial overgrowth and inflammation in a human gut-on-a-chip. Proc. Natl. Acad. Sci. 113, E7-E15 (2016).
- Miller, W. G., Lindow, S. E. An improved GFP cloning cassette designed for prokaryotic transcriptional fusions. Gene. 191, 149-153 (1997).
- Odijk, M., et al. Measuring direct current trans-epithelial electrical resistance in organ-on-a-chip microsystems. Lab Chip. 15, 745-752 (2015).
- Lentle, R. G., Janssen, P. W. Physical characteristics of digesta and their influence on flow and mixing in the mammalian intestine: a review. J Comp Physiol B. 178, 673-690 (2008).
- Granato, D., et al. Cell surface-associated lipoteichoic acid acts as an adhesion factor for attachment of Lactobacillus johnsonii La1 to human enterocyte-like Caco-2 cells. Appl Environ Microbiol. 65, 1071-1077 (1999).
- Dewhirst, F. E., et al. The human oral microbiome. J Bacteriol. 192, 5002-5017 (2010).
- Grice, E. A., Segre, J. A. The skin microbiome. Nat Rev Microbiol. 9, 244-253 (2011).
- Hay, P. E., et al. Abnormal bacterial colonisation of the genital tract and subsequent preterm delivery and late miscarriage. Br Med J. 308, 295-298 (1994).
