Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Co-kultur av levnads- Microbiome med Microengineered Human Intestinal Villi i en Gut-on-a-chip mikroflödessystem enhet

Published: August 30, 2016 doi: 10.3791/54344

Summary

Vi beskriver en in vitro-protokoll för att co-kultur gut microbiome och intestinal villi under en längre tid med användning av en human gut-on-a-chip microphysiological systemet.

Abstract

Här beskriver vi ett protokoll för att utföra långsiktiga samodling av flera arter människans tarm microbiome med microengineered tarmludd i människans tarm-on-a-chip microphysiological enhet. Vi sammanfatta tarm lumen-kapillära vävnadsgränssnittet i en mikroflödessystem enhet, där fysiologiska mekaniska deformationer och fluidfriktionsflöde ständigt tillämpas för att efterlikna peristaltiken. I lumen mikrokanal, humana intestinala epiteliala Caco-2-celler odlas för att bilda en 'bakteriefri' villus epitel och regenerera tunntarms villi. Pre-odlade mikrobiella cellerna inokuleras in i lumen sidan för att etablera en värd mikrob ekosystemet. Efter mikrobiella cellerna vidhäftar till den apikala ytan av villi, är vätskeflöde och mekaniska deformationer återupptogs för att producera en steady-state mikromiljö i vilken färskt odlingsmedium konstant matas och obundna bakterier (såväl som bakteriella avfall) kontinuerligt avlägsnas. Efter förlängd samodling from dagar till veckor, har flera mikrokolonier befunnits vara slumpmässigt placerad mellan villi, och både mikrobiella och epitelceller förbli livskraftig och funktionell för åtminstone en vecka i kultur. Vår samodling protokollet kan anpassas för att tillhandahålla en mångsidig plattform för andra värd-microbiome ekosystem som kan hittas i olika mänskliga organ, som kan underlätta in vitro-studie av den roll som humant microbiome i orchestrating hälsa och sjukdom.

Introduction

Den mänskliga tarmen hyser en förbluffande mångfald av mikrobiella arter (<1000 arter) och ett mycket stort antal av mikrobiella celler (10 gånger mer än de humana värdcellerna) och gener (100 gånger mer än det mänskliga genomet) 1. Dessa mänskliga microbiomes spelar en nyckelroll i metaboliserande näringsämnen och xenobiotika, reglering av immunsvar, och upprätthålla tarm homeostas 2. Inte överraskande, med tanke på dessa olika funktioner, kommen tarmen microbiome modulerar omfattande hälsa och sjukdom 3. Således, förstå betydelsen av tarm microbiome och värd-mikrob-interaktioner är av stor betydelse för att främja gastrointestinal (GI) hälsa och utforska nya läkemedel för tarmsjukdomar 4. Emellertid befintliga in vitro tarmmodeller (t.ex., statiska kulturer) begränsar värd-microbiome sam-kultur till en kort tidsperiod (<1 dag) eftersom mikrobiella celler växa över och äventyra tarmbarriärenfunktion 5. Surrogatdjurmodeller (t.ex. bakteriefri sex eller genetiskt modifierade möss 7) är inte heller vanligt förekommande för att studera värd gut microbiome överhörning eftersom koloniseringen och stabilt upprätthållande av människans tarm microbiome är svåra.

För att övervinna dessa utmaningar, nyligen utvecklade vi en biomimetisk människa "Gut-on-a-chip" microphysiological systemet (Figur 1A, vänster) för att efterlikna de värd gut microbiome samspel som sker i den levande mänskliga tarmen 5,8. Tarmen-on-a-chip mikroanordning innehåller två parallella mikroflödessystem kanaler separerade av en flexibel, porös, extracellulär matris (ECM) -belagda membran kantad av human intestinal epithelial Caco-2-celler, som imiterar den intestinala lumen-kapillära vävnadskontaktytan (Figur 1A , höger) 9. Vakuumdriven cykliska rytmiska deformationer framkallar fysiologiska mekaniska deformationer som efterliknar förändringar normalt Induced av peristaltiken (Figur 1A, höger). Intressant, när Caco-2-celler odlas i tarmen-on-a-chip för mer än 100 timmar, de spontant bilda tredimensionella (3D) tarmludd med tight junctions, apikal borst gränser, proliferativa celler begränsade till basal kryptor, slemproduktion, ökad läkemedelsmetaboliserande aktivitet (t.ex. cytokrom P450 3A4, CYP 3A4) och förbättrad glukosupptags 8. I detta 'bakteriefri' mikromiljö, var det möjligt att co-kultur den probiotiska Lactobacillus rhamnosus GG eller en terapeutisk bildning av en probiotisk bakterieblandning med värdepitelceller för upp till två veckor 5,10.

I denna studie beskriver vi detaljerat protokoll för att utföra värd-gut microbiome samodling i tarmen-on-a-chip-enhet under en längre period. Dessutom diskuterar vi kritiska frågor och potentiella problem att komma ifråga för en bred tillämpning av denna värd microbiome samodling protocol.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Mikro av en Gut-on-a-chip-enhet

Obs! Gut-on-a-chip är en mikroflödessystem enhet gjord av transparent, gasgenomtränglig silikonpolymer (polydimetylsiloxan, PDMS), innehållande två parallella mikro (1 mm bredd x 150 um höjd x 1 cm längd) separerade av en flexibel porös (10 nm i pordiameter, 25 nm i avstånd por till por) PDMS membran 5,9. Tillverka tarmen-on-a-chip (Figur 1A, till vänster) att följa stegen som anges.

  1. Mikroordningen för Gut-on-a-chip 5,9.
    1. Förbered ohärdade, avgasade PDMS genom att blanda PDMS prepolymer och härdare (15: 1 v / v), och placera den i vakuumexsickator under 30 minuter.
    2. Häll 30 g och 3 g ohärdade, avgasade PDMS på varje kiselform som har SU-8 baserade micropatterns av övre och nedre mikro i tarmen-on-a-chip, respektive. Sedan härda vid 60 ° C i en torr ugn under åtmin löster 4 h.
    3. Urformning de övre och nedre PDMS skikt från varje kiselform genom att skära runt kanten med en kirurgisk skalpell. Punch 6 hål (två inlopp, två utlopp och två vakuumkammare) med en biopsi laget (2,0 mm håldiameter).
    4. Förbereda det porösa membranet genom att hälla 10 g av ohärdade och avgasade PDMS på en silaniserad kiselskiva innehållande placera sina matriser med cirkulära pelare (10 ^ m i diameter, 25 | j, m i höjd) överliggande med en platt, silaniserad PDMS stödskiktet (15: 1, w / v; 1 cm tjock). Placera en 3 kg vikt pressar på installationen och härda polymeren vid 60 ° C under 12 timmar eller längre.
    5. Urformningstid installationen av ett poröst PDMS-membran fäst till PDMS stödplattan från kiselskivan genom att försiktigt lyfta upp hörnet av plattan från skivan, och skalning av tills det porösa PDMS membranet är helt lossnar från skivan.
    6. Exponera kanalsidan av ett övre skikt (PDMS, 15: 1, vikt / vikt) och det porösa membranet sidan till den plasma som genereras av en handhållen coronabehandlingsanordning under 1 min, och 3 sek, respektive.
    7. Placera de plasmabehandlade ytorna av det porösa PDMS membranet och övre mikrokanalskikt i en anpassad kontakt genom att placera varje bit parallellt utan några luftbubblor.
    8. Inkubera hela installationen vid 80 ° CO / N för irreversibel bindning av de två PDMS lagren.
    9. Dra av PDMS stödskiktet från sammansättningen av ett övre skikt med ett poröst membran genom att försiktigt lyfta upp hörnet av stödskiktet, och skalar tills stödskiktet är helt lossnar från det övre skiktet med membranet.
    10. Riv de delar av detta membran som ligger över vakuumkammare (de två kamrarna är belägna på vardera sidan av huvudkanalen) med en fin spets pincett för att göra ihåliga vakuumkammare.
    11. Exponera sidan med membranet fäst på överstycket och sido med kanalerna graverade på det undre stycket till plasma i en samma sätt som beskrivs in steg 1.1.6 under 1 minut.
    12. Rikta in övre mikro skikt med ett poröst membran och det undre skiktet med en konform kontakt genom att placera varje bit parallellt utan några luftbubblor enligt ett stereoskop.
    13. Bota hela installationen i en torr ugn vid 80 ° CO / N för att producera en komplett skala gut-on-a-chip mikroflödessystem enhet som innehåller två ihåliga vakuumkammare bredvid mikroflödessystem cell kanalen.
  2. Ansluta slangen till inloppet och utloppet hos varje port kopplad till den övre eller de nedre mikrokanaler i en gut-on-a-chip via en 90 ° böjd rostfritt stål trubbig ände nål.
  3. Ansluta slangen till hålen som är kopplade till de vakuumkamrarna med hjälp av en 90 ° böjd rostfritt stål trubbig ände nål.
  4. Sterilisera mikrokanaler och slangar genom att flöda 70% (volym / volym) etanol under användning av en 1 ml steriliserade engångsspruta.
  5. Torka ut mikro och slangar i en 60 ° C torr ugn O / N.

2. Tillväxt av MicroengineEred Intestinal Villi i Gut-on-a-chip-enhet

  1. Seed intestinala epitelceller (t.ex. Caco-2BBE) på en Gut-on-a-chip mikroanordning 5,9.
    1. Sterilisera anordningen med 70% (volym / volym) etanol (se steg 1.4) med användning av en 1 ml steriliserad engångsspruta följt av torkning i en 60 ° C torr ugn O / N (se steg 1,5) innan ytan aktivering.
    2. Exponera fullständig uppsättning med en gut-on-a-chip mikro (dvs en kropp gut-on-a-chip är ansluten till slang) för UV samtidigt under 40 minuter ljus (253,7 nm) och ozon.
    3. Kyl ner enheten vid RT under 15 minuter under UV-ljus i en biosäkerhet skåp (BSC).
    4. Introducera 100 pl av ECM beläggningen lösning- en blandning av 50 | ig / ml typ I-kollagen och 300 pg / ml extracellulär matrix blandningen ut i serumfritt Dulbeccos modifierade Eagles Medium (DMEM) - in i både övre och nedre mikrokanaler med användning av en disponibel , steril 1 ml spruta.
    5. Incubate hela installationen i en 37 ° C befuktad 5% CO2 inkubator under 1 timme.
    6. Degas 50 ml förvärmd (37 ° C) komplett odlingsmedium (DMEM, 20%, volym / volym, fetalt bovint serum (FBS), 100 enheter / ml penicillin och 100 | ig / ml streptomycin, alikvoterades i en 3 ml engångsspruta) med användning av en 50 ml filtreringssystem (0,45 | im i porstorlek) i BSC under 1 min.
      1. Passera förvärmda medium genom filtreringssystemet och knacka försiktigt på den filtrerade mediet under 1 min för att avlägsna eventuella bubblor eller löst gas i mediet.
    7. Placera alikvot av avgasas fullständigt medium i en 3 ml engångsspruta och inkubera i ett 37 ° C befuktad 5% CO2 inkubator under 1 timme.
    8. Ansluta två 3 ml engångssprutor innehållande avgasas, förvärmda komplett odlingsmedium till de övre och undre mikrokanaler.
    9. Flöda avgas fullständigt cellodlingsmediet i den övre mikro med en sprutpump vid volymetriskaflödeshastighet av 30 | il / timme (motsvarande skjuvspänningen vid 0,02 dyn / cm 2) i en 37 ° C befuktad 5% CO2 inkubator O / N.
  2. Bildandet av Microengineered Caco-2 Villi i Gut-on-a-chip.
    1. Använda Caco-2BBE celler med passagen tal mellan 50 och 65.
    2. Växa Caco-2-celler i en T75-kolv innehållande komplett odlingsmedium i en 37 ° C befuktad 5% CO2 inkubator under 4-5 dagar för att erhålla fullt konfluenta celler.
    3. Tillsätt 10 ml Ca2 + och Mg2 + -fri PBS till fullt konfluenta Caco-2-celler som odlas i en T75-flaska, tvätta cellerna, sedan aspirera ut PBS. Upprepa detta steg två gånger.
    4. Tillsätt 1 ml 0,05% trypsin / EDTA-lösning och inkubera i ett 37 ° C befuktad 5% CO2 inkubator under 5 min.
    5. Resuspendera dissocierade cellerna med 10 ml förvärmda komplett cellkulturmedium (med FBS) genom att pipettera upp och ned tre till fem gånger.
    6. Centrifugera ner cellsuspensionen genom centrifugation vid 500 xg under 5 minuter, avlägsna supernatanten.
    7. Resuspendera igen med 1 ml förvärmda fullständigt medium för att justera celltäthet vid ~ 1,5 x 10 5 celler / cm 2 i anordningen. Använda hemocytometer för att uppskatta celltätheten.
    8. Ingjuta 100 | il av de återsuspenderade Caco-2-celler i den övre mikrokanalen (lumensidan) genom att placera en 1 ml engångsspruta fäst vid en 25 G5 / 8 nål på utloppet av slangen ansluten till den övre mikrokanalen.
    9. Klämma alla inlopp och utlopp slangar som är anslutna till de övre och undre mikrokanaler med användning av bindemedel klipp.
    10. Inkubera hela installationen i en 37 ° C, fuktad 5% CO2 inkubator under 1 h för att tillåta dissocierade Caco-2-celler att vidhäfta till ytan av det porösa membranet.
    11. Ta bort klämmorna och återuppta flödet av odlingsmedium enbart till den övre mikrokanalen vid 30 | j, l / timme med en sprutpump tills cellerna bildar ett intakt monoskikt för 24-36 timmar. Använd fas contrast eller differential interferens kontrast (DIC) mikroskopi för att bekräfta cellcellkontakter i en cell monolager.
    12. När cellerna bildar ett monolager, BEGJUTA odlingsmediet in i de båda övre (lumen) och nedre (kapillär) mikrokanaler vid samma flödeshastighet av 30 | j, l / timme.
    13. Tillämpning av mekaniska deformationer härma peristaltiken-liknande rörelser 5,9.
      1. Slår på vakuumpumpen utrustad med spännutrustning.
      2. Anslut vakuumkammare i vakuumstyrenheten via slang med en koppling i rostfritt stål.
      3. Ställ sträckningen rörelse 10% medelcellstam med en frekvens på 0,15 Hz med den cykliska sinusfunktionsläget på vakuum kontrollerande mjukvaran, klicka sedan på "Start".
    14. Bibehålla konstant flöde av odlingsmedium (30 ^ / tim) i både övre och nedre mikro till sammanflytande Caco-2 monolager under mekanisk deformationer (10%, 0,15 Hz) för ~ 100 timmar.
      Beakta: Caco-2-celler spondigt genomgå villus morfogenes med vågformade 3D ​​projektioner utsträckta mot lumen i epitel mikro 5,8-10.
  3. Att emulera orgel nivå funktioner levande mänskliga tarmen med lumen-kapillär vävnad gränssnitt i tarmen-on-a-chip 10, följ stegen som beskrivs.
    1. Väx microengineered Caco-2 tarmludd genom att upprepa stegen 2,1-2,2.
    2. Flöda den förvärmda sam-odlingsmedium (en blandning av den kompletta Caco-2 cellodlingsmedium och den fullständiga HMVECs odlingsmediet, 1: 1 v / v) till de övre och undre mikrokanaler på 30 | j, l / timme.
    3. Introducera 100 pl av dissocierade normala humana kapillär mikrovaskulära endotelceller (HMVECs; slutlig celldensitet, ~ 5,0 x 10 5 celler / cm 2) i den nedre mikrokanalen genom den identiska metod som beskrivs i steg från 2.2.3 till 2.2.9.
    4. Placera en härdad rektangulärt PDMS bit (0,5 cm x 1 cm x 1 cm, bredd x längd x höjd; 15: 1, w/ w elastomer: härdare) ovanpå gut-on-a-chip-enhet, sedan vända hela ställa in enheten upp och ned (dvs. står den övre mikro på nedsidan, och den nedre mikro ansikten på uppsidan).
    5. Inkubera setup i en 37 ° C, fuktad 5% CO2-inkubator under 1 h för att tillåta dissocierade HMVECs att vidhäfta till ytan av det porösa membranet i den nedre mikrokanalen.
    6. Ta ut en hel installation från CO2 inkubator, och vänd installationen igen.
    7. Flödes förvärmda sam-odlingsmedium (en blandning av den kompletta Caco-2 cellodlingsmedium och den fullständiga HMVECs odlingsmediet, 1: 1 volym / volym) i både övre och nedre mikrokanaler på 30 | j, l / timme med mekaniska sträckningsrörelser ( 10%, 0,15 Hz) under minst tre dagar för att bilda cell-cell junctions av en endotel monolager.

3. Värd gut Microbiome Co-kultur i en Gut-on-a-chip mikroanordning

  1. Utföra förkultur of bakteriecellerna enligt följande för att samarbeta kultur kommen gut microbiome på microengineered tarm villi.
    1. Resuspendera den frystorkade probiotiska bakteriepulverblandningen i 10 ml av blandningen (1: 1, v / v) av autoklaverat Lactobacilli MRS Broth och förstärkt Clostridial Medium.
    2. Justera den slutliga celldensiteten till cirka 0,2 optiska enheter densitet (vid 600 nm) genom att tillsätta lämplig mängd medium, sedan alikvot 3 ml mikrobiell cellsuspension i en 10 ml engångs sterilt rör.
    3. Placera rören innehållande suspenderas mikrobiella celler i anaeroba behållare. Tillsätt två förpackningar med anaerob gasgenererande påse i behållaren. Stäng locket behållaren väl och inkubera behållaren installationen utan skakning i en 37 ° C fuktad 5% CO2 inkubator O / N.
  2. Ympning av Microbiome och Co-kultur med intestinala epitelceller 5,10.
    1. Förbereda 3 ml engångssprutor innehåller avgasad antibiotic fritt cellodlingsmedium (dvs DMEM med 20% FBS). Se 2.1.6 för avgasförfarande odlingsmediet.
    2. Ta ut en hel uppsättning av tarmen-on-a-chip-enhet som innehåller microengineered villi från CO2 inkubator, sedan flytta till biosäkerhet skåpet.
    3. Avlägsna sprutor som är anslutna till slangar kopplade till de övre och undre mikrokanaler. Anslut sprutor upprättats i 3.2.1 till enheten föra tillbaka till CO2 inkubator, sedan flöda denna antibiotikafritt odlingsmedium under 12 timmar före sådd av microbiome.
    4. Spinn ner pre-odlade probiotiska bakterieblandningen celler (se steg 3,1) vid 10000 xg under 5 minuter. Sug ut supernatanten med användning av vakuum och sedan återsuspendera i antibiotikafritt DMEM-medium (slutlig celldensitet, ~ 1,0 x 10 7 CFU / ml).
    5. Ingjuta cellsuspensionen in i lumen sida av mikrokanalen som innehåller de "bakteriefria" intestinala villi med användning av en 1 ml engångsspruta fäst vid en 25G5 / 8 nål. Tillåta vidhäftning av mikrobiella celler till den apikala ytan av tarm villi för ~ 1,5 h utan flöde genom fastspänning till alla slangar ände.
    6. BEGJUTA förvärmda antibiotikafritt odlingsmedium in i både övre och nedre mikrokanaler vid 40 | j, l / h med cykliska rytmiska deformationer (10%, 0,15 Hz).
    7. För co-kultur av grönt fluorescerande protein (GFP) -märkt E. coli (GFP E. coli, icke-patogena DH5-alfa E. coli-värd) 10,11 celler med microengineered villi, pre-odla GFP E. coli-celler i autoklaverat LB-medium vid 37 ° C under skakning villkoret (200 rpm) under 12 h. Upprepa proceduren från 3.2.5 till 3.2.6 att genomföra samodling av GFP E. coli-celler med microengineered villi.
  3. Bildceller 5,8-10
    1. Utför DIC, epifluorescence eller laserskanning konfokalmikroskopi för inspelning mikrobiell och epitelial morfologi 5,8,10.
      1. För DIC imaging, ta ut en inställning av gut-on-a-chip mikro från CO2 inkubator, placera inställningsanordningen på scenen av ett mikroskop, sedan spela in cellmorfologin.
      2. För fluorescens avbildning av villus epitel, flödes PBS för att tvätta cellerna vid 100 | il / h under 10 min.
        1. Fixa villi med 4% (vikt / volym) paraformaldehyd under 15 min. Då strömma PBS för att tvätta cellerna vid 100 | il / h under 10 min.
        2. Permeabilize villi med 0,3% (volym / volym) Triton X-100 utspätt i PBS innehållande 2% (vikt / volym) bovint serumalbumin (BSA) under 10 min. Då strömma PBS för att tvätta cellerna vid 100 | il / h under 10 min.
        3. Blockera celler med 2% (vikt / volym) BSA-lösning i PBS under en timme. Då strömma PBS för att tvätta cellerna vid 100 | il / h under 10 min.
        4. Tillsätt 300 nM av 4 ', 6-diamidino-2-fenylindol-dihydroklorid (DAPI) lösning utspädd i PBS för nukleär färgning under lätt skydd.
        5. Tillsätt 25 enheter / ml av fluorescerande falloidin(Phalloidin-CF647-konjugat) löst i PBS för F-aktin färgning under ljusskydd.
        6. Spela in bilder av fluorescent färgade celler med hjälp av en laserskanning konfokalmikroskop.
          Obs: 25x mål tillämpades med lämplig optisk zoom under konfokalmikroskopi. I figur 3B, var cirka 525X förstoring används.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Att efterlikna den mänskliga tarmen värd microbiome ekosystem in vitro, är det nödvändigt att utveckla ett experimentellt protokoll för att rekonstruera långsiktigt stabil samodling av tarmbakterier och mänskliga intestinala epitelceller under fysiologiska förhållanden såsom peristaltiken-liknande mekanik och vätskeflöde. Här använder vi en biomimetisk gut-on-a-chip mikroanordning (Figur 1A) att samarbeta kultur levande mikrobiella celler i direkt kontakt med levande mänsklig villi för perioder av en vecka eller mer in vitro. De intestinala epitelceller bildas spontant väl differentierad villi när de odlas på en sida av en porös ECM-belagda membranet i en kanal av en 2-kanals mikrofluidanordning i närvaro av fysiologiskt relevant vätskeflöde och cykliska mekaniska deformationer 5. De microengineered villi replikera strukturer och funktioner av humana tunntarmens villi, inklusive formatipå av kolumnära epitelceller kantas av en apikal borste gräns, basala proliferativa kryptor med migration och differentiering av dotterceller fortskrider från kryptan till villus spets, höga nivåer av slemproduktion, förbättrad läkemedelsmetaboliserande aktivitet och ökad glukosupptags 8. Levande endotelceller kan odlas på den motsatta sidan av samma membran för att återskapa vävnad-vävnadsgränssnittet i tarmväggen, och immunceller kan odlas i systemet såväl 10. För att validera skyddande funktion intestinala epitelceller, Täta fogar barriär av intestinala villi bildade i en gut-on-a-chip intermittent kvantifieras genom att mäta transepiteliala elektriska motståndet (TEER) 5,10,12. Rutinövervakning av TEER värde krävs för att uppskatta integriteten hos ett cellmonoskikt eller intestinal villi vid varje tidpunkt (t ex före tillsats bakterier in i lumen).

7 CFU / ml) ympas in i lumen av den epiteliala mikrokanalen (Figur 1B, "Inokulering"). Efter mikrobiella celler vidhäfta på den apikala ytan av villi i frånvaro av flöde för ~ 1,5 h (Figur 1B, "Attachment"), fysiologisk flöde (40 | j, l / h) återupptas genom båda kanalerna med cykliska mekaniska deformationer (10% töjning vid 0,15 Hz) för att avlägsna obundna tarmbakterier och försörjnings näringsämnen till både bakterie- och villusen epitelceller (Figur 1B, "Co-kultur"). Detta co-kultur-protokollet möjliggör stabila kolonisering av flera arter av probiotiska bakterier i intervillus utrymme, med livskraftiga bakteriemikrokolonier bibehålls i upp till två veckor i samodling (figurerna 2A, 2B). I denna studie, en commercial probiotisk formulering som innehåller en blandad population av åtta olika fakultativt eller obligata anaeroba, probiotiska stammar av Bifidobacterium breve, B. longum, B. infantis, Lactobacillus acidophilus, L. plantarum, L. paracasei, L. bulgaricus och Streptococcus termo används.

Denna samodling metoden kan tillämpas i stora drag för att emulera det mänskliga tarmvärd-mikrob ekosystemet. Till exempel, icke-patogena GFP E. coli kan samodlas på ytan av intestinala villi som odlas i en gut-on-a-chip-enhet. Baserat på samma protokoll som beskrivits ovan, vidhäftas GFP E. coli celler på villi växa från enstaka celler på en timme till flera mikrokolonier med 3 dagar (figur 3A, en timme jämfört med 72 timmar) som fixerar i intervillus utrymmen (Figur 3B, en timme jämfört med 72 timmar) vid odling i sippra flöde (40 l /h) i närvaro av peristaltiken liknande deformationer (10%, 0,15 Hz).

Figur 1
Figur 1. Den mänskliga Gut-on-a-chip microphysiological system för värd gut microbiome co-kultur. (A) Ett fotografi (till vänster) och en schematisk (höger) av en 2-kanals, gut-on-a-chip mikrofluidikanordning. Pilarna anger riktningen för odlingsmediet flöde (blå, topp mikrokanal; rött, botten mikrokanal). (B) Schematiskt diagram över förfarandet i värd-gut microbiome samodling i tarmen-on-a-chip. Efter intestinala epitelceller bildar villi (~ 100 hr), är mikrobiella celler återsuspenderades i cellodlingsmediet införes i lumen mikrokanal (Inokulering), då flödet av odlingsmediet suspenderas för ~ 1,5 h (Attachment). Efter mikrobiella celler vidhäfta till apikala ytan av intestinala villi, är flödet återupptas (Co -kultur). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 2
Figur 2. Samtidig odling av flera probiotiska bakterier med tarmludd i tarmen-on-a-chip. (A) En differentialinterferenskontrastmikrofoto visar en microcolony av probiotiska bakterieceller som växer mellan villi i tarmen chip. (B) en högre makt förstoring bild av A (en svart prickad fyrkant) visar microcolony av probiotiska bakterieceller (röd pil). V, villi; Skala bar = 20 pm. Klicka god här för att se en större version av denna siffra.

ure 3 "src =" / filer / ftp_upload / 54.344 / 54344fig3.jpg "/>
Figur 3. Co-kultur av icke-patogena, GFP-märkta E. coli med intestinal villi i tarmen-on-a-chip. (A) överlagrade fluorescens och DIC mikroskopiska bilder tagna på en och 72 timmar, visar koloniseringen av GFP E. coli på tarmludd odlas i tarmen-on-a-chip. (B) med hög effekt förstoring utsikt över överlagrade fluorescens konfokala mikrofotografier tagna vid en och 72 timmar som visar tillväxten av GFP-märkt E. coli från en enda cell (en röd pil) till en microcolony (en vit pil). Blå, kärnor; magenta, F-aktin; Skala bar = 30 pm. Klicka god här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Förstå värd microbiome interaktioner är avgörande för att främja medicin; emellertid gör traditionella cellodlingsmodeller som utförs i en plastskål eller en statisk brunnsplatta stöder inte den stabila samodling av humana intestinala celler med levande tarm mikrober under mer än 1-2 dagar eftersom mikrobiella celler växa över mestadels däggdjurscellerna in vitro. Den igenväxning mikrobiell population förbrukar snabbt syre och näringsämnen, därefter producerar överdriven mängd metaboliska avfall (t.ex. organiska syror), vilket allvarligt äventyrar tarmbarriärfunktioner och orsaka intestinal epitel celldöd. Därför är det avgörande för att upprätthålla livskraftiga värd microbiome samexistens under en längre tid (från dagar till veckor) i co-kultur mikro förhindra mikrobiell överväxt som orsakar utarmning av näringsämnen och ackumuleringen av mikrobiella avfall.

För att övervinna dessa utmaningar, en microphysiologicalgut-on-a-chip-enhet 5,8 har utvecklats för att bilda fullt differentierad human intestinal villi och bibehålla steady-state mikro av tarmlumen in vitro. Designen och funktionella enheter (t.ex. mikroflödesflödescellkammare, vakuumdriven cykliska deformationer) av en gut-on-a-chip mikroflödessystem enhet modifieras för att exakt efterlikna fysiologiska, fysikaliska och kemiska mikro för mikrobiell co-kultur 5, 10. Skjuvspänningen appliceras i tarmen-on-a-chip mikroflödes kultur bestämdes genom det fysiologiska området av luminala flödet i den mänskliga tarmen 5,13. För värd mikrob co-kultur, upprätthålla "steady-state" av mikrobiell population i den luminala mikro i tarmen-on-a-chip är avgörande för att stödja kemiskt och näringsmässigt genomförbara förhållanden. I gut-on-a-chip mikro, är det möjligt att uppskatta inom luminala steady-state i tarmen-on-a-chip från measuring av pH för odlingsmedium och den mikrobiella celldensitet. Eftersom färskt odlingsmedium strömmar kontinuerligt genom de mikrokanaler, vet både mikrobiella och epitelceller genomgår inte näringsämne utarmning när den första såddtäthet av mikrobiella celler och den volumetriska flödeshastigheten av odlingsmediet är optimerade. Det konditionerade mediet som passerar genom mikrokanalen strömmar ut vid ett definierat volymetriska flödeshastigheten (här, 40 | j, l / h), så metaboliska avfall (t.ex. organiska syror) samt cellulära secretomes (t ex cytokiner) avlägsnas kontinuerligt från den sam- kultur mikromiljö. Sålunda kan gut-on-a-chip-enhet betraktas som en "kontinuerlig bioreaktor" med en steady-state-mikromiljön är nödvändig och tillräcklig för att effektivt tvätta bort obundna eller överväxta mikrobiella celler från lumen av tarmmikrokanalen, vilket underlättar genereringen av en stabil mikrobiell nisch inom 2-3 dagar.

Det är avgörande factors som måste beaktas som felsökning för ett framgångsrikt samarbete odling av mikrobiella celler på tarm villi. För det första är det nödvändigt att bestämma den optimerade inkubation tid som krävs för de mikrobiella cellerna att fästa till ytan av villi eftersom mikrobiell vidhäftning kan variera mellan mikrobiella arter. Till exempel, probiotiska bakterier, såsom Lactobacillus rhamnosus GG 5, kräver i allmänhet ~ 1,0-1,5 h för att fästa, men vissa andra mikrobiella arter kan kräva kortare (t.ex. patogena mikrober) eller längre tider, beroende på deras vidhäftnings kinetik 14. För det andra bör den initiala såddtäthet av de mikrobiella cellerna identifieras eftersom alltför stora mikrobiella cellantal kan leda till utväxt av bakterier i ett tidigt skede av samodling, som kan interferera med uppnåendet av ett stabilt stationärt tillstånd. För att optimera denna såddtäthet, är det rekommenderat att karakterisera tillväxtprofilen av målet mikrobstam i antibiöron fritt cellodlingsmedium vid olika sådd densitet. Slutligen kan justering av den volymetriska flödeshastigheten krävas beroende på de mikrobiella arter. Till exempel, kommer ökade flödeshastigheter att krävas om de mikrobiella cellerna prolifererar mycket snabbt. Det var experimentellt bekräftade att flödeshastigheter på upp till 300 l / timme (0,2 dyn / cm2) inte äventyrar barriärfunktion och cellmorfologin av microengineered villi (data visas ej). Även Lactobacillus rhamnosus GG 5, over-the-counter probiotiska blandning, VSL # 3, icke-patogena laboratorium stam E. coli samt patogena enteroinvasivt E. coli-stam 10 har framgångsrikt tillämpats på lång sikt co-kultur i gut-on-a-chip, är det fortfarande krävs för att testa en mängd olika mikrobiella arter från kommentarmfloran till patogena infektiösa mikroorganismer. Den cultivability av mikrobiella celler in vitro bör övervägas i närvaro eller frånvaroav värdceller i samband med symbios och evolution, där testet för att odla unculturable gut microbiome är en intressant utmaning. Slutligen är en robust protokoll för samodlingen av både aeroba och anaeroba mikrober i tarmen-on-a-chip ett kritiskt icke tillgodosett behov att upptäckas i framtiden.

Det finns åtgärder som kan vidtas för att ytterligare förbättra modellen, såsom användning av primär intestinal epitel eller odifferentierade stamceller från enskilda försökspersoner som har specifika gastrointestinala sjukdomar såsom Crohns sjukdom eller kolorektal cancer; eller inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs). Men med den spirande intresse för rollen av human microbiome i orchestrating människors hälsa och sjukdom, har vår värd-microbiome sam-odlingsmetoden en enorm betydelse och potential som skall tillämpas för att efterlikna andra värd-microbiome ekosystem som finns i människokroppen (t.ex. , munhålan 15, hud 16, eller urogenitala tract 17). Slutligen kan denna sam-odlingsmetoden förnya den konventionella läkemedelsutvecklingen genom att förbättra förutsägbar i termer av hur de gut microbiome influenser på biotillgängligheten, effekten och toxiciteten hos nya läkemedelssubstanser. Sammantaget kan gut-on-a-chip microphysiological systemet ger en robust plattform för att skapa en stabil steady-state intestinal mikro som kan användas för att återskapa värd microbiome ekosystem.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) containing 25 mM glucose and 25 mM HEPES Gibco 10564-011 Warm it up at 37 °C in a water bath.
Difco Lactobacilli MRS broth BD 288120 Run autoclave at 121 °C for 15 min.
Poly(dimethylsiloxane) Dow Corning 3097358-1004 15:1 (w/w), PDMS : cureing agent
Caco-2BBE human colorectal carcinoma line Harvard Digestive Disease Center Human colorectal adenocarcinoma 
Heat-inactivated FBS Gibco 10082-147 20% (v/v) in DMEM
Penicillin-streptomycin-glutamine Gibco 10378-016 1/100 dilution in DMEM
4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride Molecular Probes D1306 Nuclei staining
Phalloidin-CF647 conjugate (25 units/ml) Biotium 00041 F-actin staining
Flexcell FX-5000 tension system Flexcell International Corporation FX5K Peristalsis-like stretcing motion (10% cell strain, 0.15 Hz frequency)
Inverted epifluorescence microscope Zeiss Axio Observer Z1 Imaging, DIC
Scanning confocal microscope Leica DMI6000 Imaging, Fluorescence
UVO Cleaner Jelight Company Inc 342 Surface activation of the gut-chip
Type I collagen  Gibco A10483-01 Extracellular matrix component for cell culture into the chip
Matrigel BD 354234 Extracellular matrix component for cell culture into the chip
1 ml disposable syringe BD 309628 Cell and media injection stuff
25 G 5/8 needle BD 329651 Cell and media injection stuff
Syringe pump Braintree Scientific Inc. BS-8000 Injection equipment into the chip
VSL#3 Sigma-Tau Pharmaceuticals 7-45749-01782-6 A formulation of 8 different commensal gut microbes
Reinforced Clostridial Medium BD 218081 Anaerobic bacteria culture medium
GasPak EZ Anaerobe Container System with Indicator BD 260001 Anaerobic gas generating sachet 
4% paraformaldehyde Electron Microscopy Science 157-4-100 Fixing the cells for staining
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787 Permeabilizing the cells
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A7030 Blocking agent for staining of the cells
Corona treater Electro-Technic Products BD-20AC Plasma generator for fabrication of the chip
Steriflip  Millipore SE1M003M00 Degasing the complete culture medium
Disposable hemocytometer iNCYTO DHC-N01 For manual cell counting

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Turnbaugh, P. J., et al. An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest. Nature. 444, 1027-1031 (2006).
  2. Tremaroli, V., Backhed, F. Functional interactions between the gut microbiota and host metabolism. Nature. 489, 242-249 (2012).
  3. Sekirov, I., Russell, S. L., Antunes, L. C. M., Brett Finlay, B. Gut Microbiota in Health and Disease. Physiol. Rev. 90, 859-904 (2010).
  4. Turnbaugh, P. J., et al. The human microbiome project. Nature. 449, 804-810 (2007).
  5. Kim, H. J., Huh, D., Hamilton, G., Ingber, D. E. Human gut-on-a-chip inhabited by microbial flora that experiences intestinal peristalsis-like motions and flow. Lab Chip. 12, 2165-2174 (2012).
  6. Round, J. L., Mazmanian, S. K. The gut microbiota shapes intestinal immune responses during health and disease. Nat Rev Immunol. 9, 313-323 (2009).
  7. Garrett, W. S., et al. Communicable ulcerative colitis induced by T-bet deficiency in the innate immune system. Cell. 131, 33-45 (2007).
  8. Kim, H. J., Ingber, D. E. Gut-on-a-Chip microenvironment induces human intestinal cells to undergo villus differentiation. Integr Biol. 5, 1130-1140 (2013).
  9. Huh, D., Kim, H. J., et al. Microfabrication of human organs-on-chips. Nat Protoc. 8, 2135-2157 (2013).
  10. Kim, H. J., Li, H., Collin, J. J., Ingber, D. E. Contributions of microbiome and mechanical deformation to intestinal bacterial overgrowth and inflammation in a human gut-on-a-chip. Proc. Natl. Acad. Sci. 113, E7-E15 (2016).
  11. Miller, W. G., Lindow, S. E. An improved GFP cloning cassette designed for prokaryotic transcriptional fusions. Gene. 191, 149-153 (1997).
  12. Odijk, M., et al. Measuring direct current trans-epithelial electrical resistance in organ-on-a-chip microsystems. Lab Chip. 15, 745-752 (2015).
  13. Lentle, R. G., Janssen, P. W. Physical characteristics of digesta and their influence on flow and mixing in the mammalian intestine: a review. J Comp Physiol B. 178, 673-690 (2008).
  14. Granato, D., et al. Cell surface-associated lipoteichoic acid acts as an adhesion factor for attachment of Lactobacillus johnsonii La1 to human enterocyte-like Caco-2 cells. Appl Environ Microbiol. 65, 1071-1077 (1999).
  15. Dewhirst, F. E., et al. The human oral microbiome. J Bacteriol. 192, 5002-5017 (2010).
  16. Grice, E. A., Segre, J. A. The skin microbiome. Nat Rev Microbiol. 9, 244-253 (2011).
  17. Hay, P. E., et al. Abnormal bacterial colonisation of the genital tract and subsequent preterm delivery and late miscarriage. Br Med J. 308, 295-298 (1994).

Tags

Bioteknik Co-kultur gut-on-a-chip tarm microbiome villi microphysiological systemet interaktion värd mikrob
Co-kultur av levnads- Microbiome med Microengineered Human Intestinal Villi i en Gut-on-a-chip mikroflödessystem enhet
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kim, H. J., Lee, J., Choi, J. H.,More

Kim, H. J., Lee, J., Choi, J. H., Bahinski, A., Ingber, D. E. Co-culture of Living Microbiome with Microengineered Human Intestinal Villi in a Gut-on-a-Chip Microfluidic Device. J. Vis. Exp. (114), e54344, doi:10.3791/54344 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter