Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

Concurrerende Transplantaties om hematopoietische stamcellen Fitness Evalueer

Published: August 31, 2016 doi: 10.3791/54345

Introduction

Hematopoiese is een regeneratief proces dat het aanvullen van bloedcellen die zijn verloren door letsel, straling en celdood verzekert. Dit proces verzekert hematopoietische stamcellen (HSC) die grotendeels in de volwassen beenmerg bevinden. Bovendien kunnen hematopoëtische stamcellen worden gebruikt voor therapeutische doeleinden in auto-immuunziekten, hematologische maligniteiten en immuundeficiënties 1. Er is dus behoefte aan een beter begrip van de mechanismen die HSC functie te reguleren, met inbegrip van hun proliferatieve expansie en hun vermogen om te bereiken en engraft de ontvanger beenmerg na de transplantatie. Hoewel recente studies verschillende celoppervlak markers, zoals de SLAM familieleden CD150 en CD48, prospectief verrijken HSCs volwassen en foetale HSCs ongeveer 50% zuiver 2-4 gemeld, de gouden standaard maat voor functionele HSCs blijft in vivo repopulatie assay bepalen hun vermogen om te herstellen bloed cell productie in een bestraald gastheer 5.

De in vivo klonale opnieuw bevolken test werd oorspronkelijk ontwikkeld door Till McCulloch en 6 en is sindsdien verfijnd en uitgebreid. Zoals oorspronkelijk gedefinieerd, HSC zorgen voor levenslang productie bloedcellen door middel van zelf-vernieuwing en differentiatie. De overdracht van HSC in een bestraalde ontvanger laat ons dus beoordelen: hun vermogen om te differentiëren door de analyse van de verschillende bloedcellijnen (T lymfocyten, B lymfocyten, granulocyten, monocyten) en hun vermogen tot zelfvernieuwing via seriële transplantatie. De test zou meestal om de vergelijking van de functionaliteit en / of de hoeveelheid van twee populaties van HSCs, bijvoorbeeld cellen uit twee muizen van verschillende genotypen of cellen die zijn behandeld of onbehandeld met verschillende factoren die de handhaving of uitbreiding van HSCs invloed kunnen hebben in de cultuur. Donor chimerisme, of de bijdrage van de overgedragen donor HSC to bloedcellen kan dan worden bepaald met stroomcytometrie analyse in het perifere bloed en beenmerg middels celoppervlaktemerkers of andere methoden die donor cellen onderscheiden van de ontvanger of gastheer. De meest gebruikte markers zijn zeker de twee allelen van het gen Ptprc of CD45 leukocyt antigen 7 die is gekozen voor de onderstaande voorbeelden.

De klonale herbevolking test kan zowel competitief of niet-competitief zijn. In een niet-competitieve omgeving, zijn de controle en test HSC overgebracht in afzonderlijke ontvangende muizen en de resultaten voor elk celtype wordt onafhankelijk van de andere. In een competitieve omgeving, is de functie van zowel test- en controle HSCs afgemeten inwoners concurrent HSCs. De hier beschreven protocol gebruikt de competitieve omgeving maar kan ook worden aangepast voor niet-competitieve situaties. Beide benaderingen hebben hun voordelen en beperkingen, en we zullen ze te vergelijken in detail in dediscussie. We beschrijven ook verschillende benaderingen van het eigen vermogen van het aantal getransplanteerde HSC te garanderen, wordt uitgelegd hoe u de test voor de kwantificering van HSC aan te passen door beperkende verdunning assay (LDA), en geeft voorbeelden van zowel de geslaagde en mislukte transplantaties voor de interpretatie van de resultaten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle in dit protocol beschreven procedures zijn goedgekeurd door de institutionele dier ethische commissie en volg de Canadese Raad over Animal Care richtlijnen.

Opmerking: Om steriele / specifieke pathogeen-vrije woonomstandigheden te behouden, voeren alle procedures in verband met directe omgang met levende muizen in een biologische veiligheid kast of een laminaire stroming kap. Reinigen of steriliseren kooien, beveiligingssystemen, huisvesting materialen, voer en water verstrekt aan de dieren op de juiste wijze. Gebruik alleen steriele, wegwerp naalden voor de injecties en voor bloedafname. Aseptische techniek is cruciaal tijdens de bereiding van het transplantaat.

1. Bereiding van ontvangende muizen

  1. Identificeer ontvangende muizen met oor inkepingen (of een andere methode door de lokale dier ethische commissie 8 is goedgekeurd) aan de individuele opvolging van perifeer bloed en beenmerg reconstructie na verloop van tijd mogelijk te maken. Weeg de muizen voor post-transplantatie follow-up. Onse ontvangende muizen die tussen 7 en 12 weken (minder dan 25 g).
    Let op: In de verstrekte voorbeeld werden CD45.1 + CD45.2 + ontvanger muizen in huis gefokt door het kruisen van C57BL / 6 muizen met congene B6.SJL muizen.
  2. Bestralen ontvangende muizen met twee doses van 450 rad hematopoietische activiteit te vernietigen. Geef de eerste dosis van de dag vóór de transplantatie en de tweede 1-2 uur vóór de transplantatie.
    Let op: X-ray of gammastraling kan zowel worden gebruikt afhankelijk van de beschikbaarheid van geschikte faciliteiten.

2. Voorbereiding van de Donor en Concurrent Bone Marrow Cells

  1. Euthanaseren donor (test- en controle; CD45.2 +) en concurrent (CD45.1 +; B6.SJL) muizen door CO 2 stikken, gevolgd door cervicale dislocatie of het gebruik van methoden die door de lokale dier ethische commissie goedgekeurd.
  2. Plaats muizen op hun rug, benen wijd open, in een lege petrischaal of op een steriel gaasje (om het werkoppervlak schoon te houden) inside een biologisch veiligheidskabinet. Bevochtig de huid en vacht met 70% ethanol / 30% H 2 O (v / v).
  3. Snijd de voet met een chirurgisch mes of een scherpe schaar. Opengesneden de huid langs het been en trek de huid weg met behulp van gekartelde tang. Knip overtollige spier.
  4. Ontwrichten dijbeen door aan het been bot en het gebruik schaarbladen tegen het bekken als tegenkracht. Maak scheenbeen en het dijbeen van de knieschijf en verwijder de overige bits van de spieren en pezen. Plaats de botten in 2-3 ml steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) in een 6-well weefselkweekplaat.
  5. Verzamel beenmergcellen door spoelen beenderen met 5 ml steriel PBS.
    1. Houd het been voorzichtig met een pincet en plaats een 25 G naald bevestigd aan een 1 ml spuit gevuld met een uiteinde van het bot. Druk op de zuiger en het verzamelen van de cellen in een 15 ml conische buis. Herhaal zonodig om het centrum van het bot is wit.
  6. Distantiëren de cellen door herhaalde die door de naaldhet verkrijgen van een enkele celsuspensie. Vermijd luchtbellen en teveel kracht. Opmerking: Gebruik een iets grotere naald (22 G) levensvatbaarheid van de cellen te verbeteren bij deze stap.
  7. Passeren de cellen door middel van een 70 um nylon zeef om te zorgen voor uniforme celsuspensie en puin en klonten te verwijderen.
  8. Verwijder een aliquot voor celtelling met een hemocytometer. Centrifugeer de resterende celsuspensie bij 200 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Passen celdichtheid zoals vereist in steriel PBS (10 8 cellen / ml). Houd de cellen op ijs.

3. Vaststelling van Donor Cell HSC equivalenten

  1. Breng het equivalent van 3 x 10 6 cellen (30 ul) in een 5 ml ronde bodem polystyreen buis flowcytometrie kleuring. Voeg een gelijk volume van niet-gemerkt antilichaam tegen CD16 / CD32 om niet-specifieke kleuring te blokkeren (verdund in kleurbuffer (PBS aangevuld met 0,1% runderserumalbumine (BSA) en 1 mM EDTA) tot een eindconcentratie van 2,5 ug / ml). Incubeer 5 minuten bij kamertemperatuur.
  2. Voeg 90 ul fluorochroom-geconjugeerd antilichaam master mix bereid in vlekken buffer: gebiotinyleerde Lineage cocktail (B220, CD3e, CD11b, GR1, TER119), SCA1, CD117, CD135, CD150. Incubeer op ijs gedurende 30 min, beschermd tegen licht.
    Opmerking: Geschikte verdunningen bepaald voor elke partij van antilichaam. Zie Tabel Materialen voor verdunningen gebruikt in deze studie.
  3. Voeg 2 ml kleurbuffer aan de cellen vortex en centrifugeer bij 200 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C om ongebonden antilichaam te verwijderen. Giet supernatant en resuspendeer pellet door de knop.
  4. Voeg 10 ul fluorochroom-geconjugeerde streptavidine verdund in vlekken buffer (zie Materials tabel). Incubeer op ijs gedurende 20 min, beschermd tegen licht. Was als in stap 3.3 om ongebonden streptavidine te verwijderen.
  5. Het verwerven van de celmonsters met een flow cytometer met ten minste zes detektoren 9. Bepaal de frequentie van Lin - SCA1 + CD117 + CD135 - CD150 Figuur 2 en zoals eerder gemeld 10,11.
    Opmerking: De frequentie van functionele HSC binnen die bevolking kan worden geschat tussen 1/3 en 1/5 2,12.
  6. Vaststellen geschatte HSC equivalenten voor alle monsters 11, via een monster (typisch de concurrent B6.SJL CD45.1 + in dit voorbeeld) en basislijn zoals hieronder en in figuur 2.
    1. Bereken het aantal cellen vereist volgens de volgende formules:
      #transplanted HSCs / ontvanger = 5 x 10 5 cellen x HSC geschatte frequentie (vastgesteld referentiemonster, dit aantal is meestal tussen 75 en 125 voor wildtype C57BL / 6-muizen) 10-12.
      Opmerking: In figuur 2, voor monster A het resultaat 139 HSCs.
      Totaal getransplanteerde cellen (bij andere monsters, zoals Monster B in figuur 2) = # transgeplant HSC / HSC frequentie.
      Opmerking: In figuur 2, voor monster B, is het resultaat 197.826 (of ongeveer 2 x 10 5) totaal beenmergcellen.
  7. Bereken het totale aantal cellen nodig per graft ontvanger voor elk monster met behulp van de bovenstaande resultaten verkregen.
    Opmerking: Dit nummer moet 5 x 10 5 voor de basislijn monster (concurrent) zijn.
    1. Vermenigvuldig verkregen uit stap 3.7 door het aantal ontvangende muizen aantal en voeg voldoende cellen voor ten minste twee extra muizen ter compensatie van het dode volume in de spuit.
  8. Meng concurrent (bv CD45.1 +) en testcellen (CD45.2 +) in 1: 1 HSC equivalentverhouding berekend in stap 3.6 en pas het eindvolume van 200 ul per injectie met steriele PBS.
    Opmerking: Voor een groep van vijf ontvangende muizen zou de voorgestelde volume dus minstens 1,4 ml, bevattende 3,5 x 10 6 concurrent beenmergcellen (of973 geschatte HSCs voor monster A in figuur 2) en het equivalente aantal testcellen (in figuur 2, het equivalent voor monster B zou 197.826 x 7 = 1.384.782 beenmergcellen).

4. Beenmergplantatie

  1. Warm de ontvangende muizen bestraald in stap 1.2 met een rode warmtelamp verwijding van de bloedvaten te waarborgen en om de laterale staartaders meer toegankelijk.
  2. Bereid een 1 ml tuberculine spuit uitgerust met een 27 G naald (of kleiner). Aspireren ongeveer 750 ul van de bereide celsuspensie (3 ontvangende muizen). Zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de spuit.
  3. Plaats de muis in een beveiligingssysteem. Onderzoek de staart en zoek naar de laterale staartaders die duidelijk zichtbaar op beide zijden van de staart moet zijn. Veeg de injectieplaats met ethanol. Steek de naald bevel op, parallel aan de huid en zachtjes op de zuiger. Injectie moet eenvoudig zijn. Als kracht is rewenste, de naald niet in de ader.
    Opmerking: Oudere muizen hebben dikkere huid, die kan het vinden van de ader moeilijker. Als de naald niet in de ader, plaats de naald proximaal van de eerste injectie.
  4. Verwijder de naald en druk op de injectieplaats met een steriel gaasje voor een paar seconden om het bloeden te stoppen. Breng de muis in een schone kooi.
    Let op: Gebruik dezelfde spuit en naald voor drie injecties, waarna de naald te saai kunnen worden.
  5. Voor post-transplantatie follow-up Injecteer 1 ml steriel PBS subcutaan aan de muizen rehydrateren van de eerste vijf dagen. antibiotica toe te voegen in het drinkwater om infecties te voorkomen (indien nodig; optioneel). Weeg muizen elke twee tot drie dagen voor de eerste drie weken en euthanize muizen die meer dan 15-20% van hun pre-transplantatie lichaamsgewicht verloren (of zoals bepaald door de lokale ethische commissie dier).

5. Analyse van perifeer bloed

  1. Verzamel een druppel bloed (eenpprox. 50-100 pi) in EDTA-buisjes.
    1. Om bloed te verzamelen van de onderkaak ader, gebruik dan een lancet of een 22 G naald op de huid van het gezicht in de buurt van de haarloze plek onder het kaakbeen doorboren en plaats het verzamelen buis naar de druppel bloed 13 te ontvangen. Verzamelen van bloed bij 4, 8, 12 en 16 weken na transplantatie om multi-lijn reconstitutie volgen.
  2. Voeg 1 ml vers bereide RT rode bloedcel lysisbuffer (9 delen 0,16 M NH4Cl + 1 deel 0,17 M Tris-HCl pH 7,65) naar de druppel bloed verzameld in stap 5.1.1. Meng en overdracht monster aan een 5 ml ronde bodem polystyreen buis geschikt voor flowcytometrie. Laat staan ​​voor 4 min bij RT.
  3. Voeg 4 volumina ijskoude PBS. Meng door draaien end-to-end en breng onmiddellijk op ijs. Centrifugeer 10 minuten bij 200 xg bij 4 ° C.
  4. Giet supernatant en resuspendeer pellet door de knop. Supernatant moet helder en rood. Voeg 2 ml vlekken buffer en vortex kort. Centrifugeer 5 minuten bij 200 XGAt 4 ° C.
  5. Giet supernatant en resuspendeer pellet door de knop.
  6. Ga verder met flowcytometrie kleuring met behulp van de algemeen protocol beschreven in stappen 3,1-3,3 en de volgende antilichamen voor de master mix: CD45.1, CD45.2, CD3e, CD19, GR1.
  7. Het verwerven van de celmonsters met een flow cytometer met ten minste zes detektoren 9. Bepaal de frequentie van donor-afgeleide cellen voor elke stam (CD19 + B-lymfocyten, CD3e + T-lymfocyten, granulocyten GR1 licht) in elk monster met behulp van de analyse template uit figuur 3 en zoals gepubliceerd 10,11.

6. Analyse van Bone Marrow Reconstitutie

  1. Verzamel beenmergcellen zoals beschreven in paragraaf 2. Vlek de cellen voor flowcytometrie-analyse met behulp van de algemeen protocol beschreven in stappen 3,1-3,3 en de volgende antilichamen voor de master mix: Lineage cocktail, SCA1, CD117, CD135, CD150, CD45.1 , CD45.2. Detect lineage cocktail antilichamen onder gebruikmaking fluorochroom-geconjugeerd streptavidine zoals beschreven in stap 3.4.
  2. Verwerven celmonsters met een flow cytometer met ten minste acht detectoren 9. Als slechts zes beschikbaar, voeg CD135 op hetzelfde kanaal als lineage paneel CD135 + cellen wordt uitgesloten. Bepaal de frequentie van donor afgeleide Lin - SCA1 + CD117 + CD135 - CD150 + HSCs in elk monster met behulp van de analyse template uit figuur 4 en zoals gepubliceerd 10.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Een algemene beschrijving van de competitieve transplantatie setting, met inbegrip van de secundaire transplantaties (hieronder verder besproken) kan worden gevonden in figuur 1. Een vertegenwoordiger analyse voor pre-transplantatie van beenmerg HSC is te vinden in figuur 2. Meer gedetailleerde informatie over de uitsluiting van doubletten en dode cellen kan elders 9 te vinden.

Figuren 3 en 4 voorbeelden van flowcytometrieanalyse sjablonen voor perifeer bloed en beenmerg, respectievelijk. Het is normaal om enkele gastheer T-lymfocyten te detecteren (tot 20% van T-cellen Figuur 3B), zoals T-cellen zijn radio-resistent. Concurrent-afgeleide cellen moeten in alle drie lijnen zijn. De detectiegrens is sterk afhankelijk van het totale aantal verkregen cellen voor analyse, maar in onze ervaring totaal 20.000 cellen in deéén leukocyt poort meestal voldoende. Middels een willekeurige drempel van 1% of 0,5%, als donorcellen vormen een kleiner deel dan de cutoff in een gegeven lijn (B lymfoïde T lymfoïde of myeloïde zie figuur 3), wordt de muis niet positief voor multilineage reconstitutie geacht . Dit concept wordt belangrijk wanneer de concurrerende transplantaties worden gecombineerd met een beperkende verdunning bepaling om donor HSCs kwantificeren zoals in de discussie. Het is zeker mogelijk om bijvoorbeeld donor afgeleide T-lymfocyten en B maar geleidelijk verlies van myeloïde cellen, die gewoonlijk suggereert alleen transiënte reconstitutie hebben. Lymfocyten langere halfwaardetijden dan myeloïde cellen (vooral Gr1hi SSChi granulocyten / neutrofielen) en kunnen aanhouden, zelfs bij afwezigheid van beenmerg HSCs 10.

Figuur 5 toont representatieve resultaten voor perifere bloed chimerism onder verschillende situties. Als donor HSCs zijn functioneel equivalent aan cellen concurrent was het aantal donor (CD45.2 +) en concurrent (CD45.1 +) afgeleide cellen equivalent (Figuur 5A). De resterende gastheercellen (CD45.1 + CD45.2 +) in figuur 5A en 5B zijn bijna uitsluitend T lymfocyten ze meer radio-resistent. Wanneer donorcellen bieden een veel kleiner percentage perifeer bloed leukocyten (figuur 5B), een aantal aspecten van HSC functie waarschijnlijk defect en verdere studies zijn nodig zoals beschreven in de discussie. De aanwezigheid van concurrent cellen bevestigt dat de test goed werkte, maar donor beenmerg was gewoon minder effectief. Dit in tegenstelling tot de in figuur 5C, waarin donor en concurrent cellen in lage aantallen en gastheercellen de meerderheid van perifere bloedcellen resultaat. In dit geval was de transplantatie mislukt en ikt is niet mogelijk om conclusies te trekken over de relatieve functionaliteit van donor versus concurrent cellen. Verschillende oplossingen worden hierna besproken.

Figuur 1
. Figuur 1. Experimentele design (A) voor een concurrerend transplantatie, beenmergcellen van donor muizen (CD45.2 +; C57Bl6 achtergrond; controle en test) en congenic concurrent muizen (CD45.1 +; B6.SJL) worden gemengd in een verhouding 1: 1 en geïnjecteerd in de staartader van bestraalde ontvanger muizen (CD45.1 + CD45.2 +, F1 nakomelingen van C57Bl6 x B6.SJL broedparen). De werkzaamheid van beenmerg reconstitutie wordt bepaald in perifeer bloed (PB) op 4, 8, 12 en 16 weken na transplantatie en in het beenmerg op 16 weken na transplantatie of hoger. (B) Om de zelf-vernieuwing van getransplanteerde cellen verder te evalueren, bone merg cellen hersteld van transplantatie ontvangers na 16 weken kan worden overgebracht naar bestraalde secundaire ontvanger muizen. HSC, hematopoietische stamcellen; MPP, multipotente voorlopercellen cel; LMPP, lymfe-gegrond MPP. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2. Pre-transplantatie van beenmerg HSC analyse template. Binnen enkele cellen, selecteert HSPCs volgens cKit (CD117) en Lineage expressie. Binnen het Lin dim / - cel populatie, selecteert u de cKit heldere SCA1 + populatie (LSK). Binnen LSKs, selecteert CD150 + CD135 - HSC. Deze populatie bevat zowel de lange termijn en korte termijn repopulatie HSC (de frequentie van een opnieuw bevolken cel in deze populatie is tetussen 1/3 en 1/5). De geschatte frequentie van beenmerg HSC wordt berekend door het aantal gebeurtenissen in de HSC poort te delen door het aantal gebeurtenissen in de single cell gate. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 3
Figuur 3. Post-transplantatie perifere bloed analyse template. (A) Binnen enkele cellen, selecteert u eerst GR1 heldere SSC hi granulocyten. (B) Selecteer vervolgens CD19 + CD3e - B-lymfocyten en CD3e + CD19 - T-lymfocyten. Muis perifeer bloed bevat een grote hoeveelheid lymfocyten, B-lymfocyten met zijn het belangrijkste celtype (ongeveer 50% alle perifere bloedcellen). CE) Teken 2D flowcytometrie percelen voor elke subset van CD45,2 op een as en CD45.1 anderzijds. Identificeer donor (CD45.2 +), host (CD45.1 + CD45.2 +) en concurrent cellen (CD45.1 +) voor elke lijn, zoals getoond. Het is normaal om een aantal resterende gastheercellen hebben, met name in de T-lymfocyt bevolking zoals te zien in paneel E. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 4
Figuur 4. Post-transplantatie van beenmerg HSC analyse template. Binnen enkele cellen, selecteert HSPCs en LSKs zoals voor Figuur 2. Binnen LSKs, selecteert CD150 + CD135- HSC, CD150- CD135- multipotente voorlopercellen (of MPP) en CD150- CD135 + lymfatische geprimed MPP's (of LMPPs). Het aandeel LMPPs lager na transplantatie dan bij niet-bestraalde muizen. Teken 2D stroming cytometry percelen voor elke subset met CD45.2 aan de ene as en CD45.1 aan de andere kant. Identificeer donor, gastheer en concurrent cellen voor elke subpopulatie zoals afgebeeld. Als de bestraling en transplantatie succesvol zijn, moeten er zeer weinig overgebleven gastheer HSPCs. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 5
Figuur 5. Representatieve resultaten voor perifere bloed chimerisme. (A) Succesvolle transplantatie waar de donor HSC zijn functioneel gelijkwaardig is aan de deelnemer cellen. De meeste overblijvende gastheercellen (CD45.1 + CD45.2 +) gewoonlijk T-lymfocyten. (B) Succesvolle transplantatie waar de donor HSC-show verminderde functie in vergelijking met concurrent cellen. Deze verminderde bijdrage kan te wijten zijn aanverschillende factoren en de verdere analyse nodig (zie bespreking). (C) Niet succesvolle transplantatie met lage frequenties van zowel concurrent en donorcellen en een groot deel van de resterende gastheercellen. Dit type resultaat suggereert een lager dan verwachte dosis bestraling, mislukte injectie (verminderde levensvatbaarheid van de cellen, verminderde volume van de injectie, injectie buiten de ader staart), of een combinatie hiervan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De hier beschreven protocol is bedoeld om de relatieve geschiktheid van de donor (test) HSCs tegen bekende concurrent HSCs evalueren. De situatie van concurrentie verhoogt de relatieve gevoeligheid van de assay (eerder bescheiden afname van stamcellen fitness detecteren) en geeft een interne gekeurd voor de effectiviteit van bestraling en injectie. Er moet echter niet als een absolute maat voor HSC geschiktheid; een daling van de concurrerende reconstructie betekent niet automatisch dat de HSC niet goed zou presteren in de afwezigheid van concurrentie. Hoewel kan worden aangevoerd dat een concurrerende omgeving is het beter uitgangspunt, omdat de concurrent cellen defecte HSC functie en alle ontvangende muizen zal redden zal overleven, moet men voorzichtig zijn met de interpretatie van de resultaten. Bevestiging van de resultaten in een niet-competitieve omgeving zal de conclusies stollen.

De experimentele opzet hier gepresenteerde maakt gebruik van HSC gelijkwaardig quantities totaal beenmergcellen plaats van zuivere populaties van flowcytometrie gesorteerde HSCs. Het is belangrijk om het aantal HSCs gelijk in alle bestudeerde populaties (verschillende donoren, concurrent) variabiliteit tussen verschillende donoren heffen en worden verschillen in fenotypische HSC frequentie niet wordt geïnterpreteerd als veranderingen in functie HSC 14. De voordelen van de hier beschreven benadering via gezuiverde HSC's: verbeterde cellevensvatbaarheid door kortere verwerkingstijden en gebrek aan externe druk tijdens het sorteren; en verbeterde homing de ontvanger beenmerg (de aanwezigheid van antilichamen op gesorteerde cellen kunnen interfereren met hun implantatie in het beenmerg 15). Omgekeerd, het grootste nadeel is de bijdrage van niet-HSC populaties de transplantatieresultaten bijzonder de rol van kortstondige progenitorcellen op vroege tijdstippen na transplantatie. Indien daarenboven behandeling of genetische modificatie wijzigt de expressie van oppervlae merkers voor de selectie van HSCs 16, kan er een aanzienlijk aantal zijn HSCs 'vermomd' in één monster maar niet in een ander, die zal vertekening van de resultaten. Kan echter hetzelfde probleem ook optreden bij het gebruik van gezuiverd HSCs en is inherent aan de transplantatie assay.

De verkregen met behulp van het huidige protocol resultaten zijn alleen kwalitatief op populatieniveau. Met andere woorden, kan een verminderde bijdrage van donorcellen na transplantatie door; een lagere aantal functionele HSCs in de uitgangspopulatie; een verminderd vermogen van het individu HSC te vestigen in het beenmerg en uit te breiden in de eerste dagen en weken na de transplantatie; of problemen met differentiatie en groei tot rijpe cellen die worden gebruikt voor detectie in de periferie. Het is dus belangrijk om niet de resultaten te gebruiken van een competitieve transplantatie geïsoleerd, maar deze aan te vullen assays die celproliferatie, overleving en differentiatie van H meetSC circulerende bloedcellen. Het is ook belangrijk om te vergelijken donorcel bijdrage in perifeer bloed (figuur 3) en beenmerg (figuur 4) Aanwezigheid van donor afgeleide HSCs in het beenmerg in combinatie met de afwezigheid van donorcellen in het perifere bloed zou wijzen op een differentiatie blok . Hoewel niet in het getoonde voorbeeld, is het ook mogelijk om erytroïde reconstitutie beoordelen op basis van verschillende isovormen van Gpi1 17. Gezien de grote aantallen erytrocyten in het bloed, vormen ze een zeer gevoelige detectiemethode voor donor-afgeleide cellen, die bijzonder nuttig kunnen zijn bij het transplanteren lage aantallen HSCs of na hun productie gedurende lange tijd. Aan het andere uiteinde van het spectrum, myeloïde cellen vaak de eersten die niet gedetecteerd, deels vanwege hun lage frequentie in het perifere bloed en deels vanwege de korte halfwaardetijd.

Het is mogelijk om th aanpassene herbevolking competitieve assay voor kwantificering van HSCs mogelijk met de beperkende verdunning assay (of LDA). donorcellen, hetzij gesorteerde of ongesorteerde zoals hierboven beschreven zal een veel groter aantal ontvangende muizen verdeeld in meerdere groepen en elke groep krijgt een andere verhouding van concurrent nodig. Aangezien het aantal donorcellen afneemt, zullen er meer muizen waarin het aandeel van donor afgeleide cellen niet de vooraf bepaalde drempelwaarde bereiken in een of meerdere lijnen. Het is dan mogelijk om de frequentie van "negatieve" muizen per groep op het aantal getransplanteerde donorcellen plot en bepalen de frequentie van HSCs uit de volgende grafiek 18,19.

De voorgestelde duur van post-transplantatie follow-up varieert in de literatuur. Vroeger waren er zekere consensus wanneer de periode van 16 weken na transplantatie werd voldoende geacht om de uitgang van langdurige HSCs weerspiegelen zijn. Echter, recente rapporten van de "intermediate "HSC's waarvan de functie daalt kort na 16 weken de noodzaak hebben onderstreept voor nog strengere evaluatie van HSC functie 17. Het is zeker mogelijk om de follow-up van de transplantatie ontvangers voorbij de 16 week tijdstip om deze problemen te voldoen. Een alternatieve optie, eens te meer met een aantoonbaar hogere gevoeligheid, is de secundaire transplantatie (Figuur 1B), waarbij beenmergcellen hersteld van de eerste transplantatie ontvangers worden geïnjecteerd in bestraald secundaire ontvangers. de tweede transplantatie brengt extra proliferatieve druk op de HSC, waardoor hun exit van latentie en waarbij alleen cellen met robuuste zelfvernieuwing hun produktie te handhaven. soms is het wenselijk om gesorteerde donorcellen om HSC getallen tussen verschillende monsters beter passen voor de secundaire transplantaties. Ook is het mogelijk om een ​​geschatte verhouding van donor vaststellen : concurrent HSCs uit de primaire beenmerg (bijv, 10.

Zoals hierboven vermeld, zijn er een aantal redenen waarom een ​​bepaalde populatie van donor HSCs kan blijken verminderd vermogen voor de lange termijn reconstitutie. Een van die redenen is het vermogen van HSCs te migreren naar het beenmerg na transplantatie (ook wel homing) en vestigen zich in het beenmerg niche. Het is mogelijk om het protocol hier gepresenteerde onderzoeken beenmerg homing en kortdurende expansie passen. Het is noodzakelijk om het aantal getransplanteerde cellen (het equivalent van 5.000-10.000 HSC te verhogenhoming assays en 1000-2000 HSC voor analyse binnen de eerste week na de transplantatie). In de homing assay worden ontvangende muizen gedood binnen de eerste 16-24 uur na transplantatie en het aantal donor HSCs dat het beenmerg bereikt wordt bepaald zoals uiteengezet in het onderhavige protocol. Om hun functie verder te evalueren, kunnen beenmergcellen gewonnen uit de korte termijn ontvangers worden getransplanteerd in secundaire ontvangers zoals beschreven in Figuur 1B. Het aandeel van donor afgeleide cellen in de secundaire ontvanger kan vervolgens worden gebruikt om het vermogen van de donor HSCs te migreren en zich te vestigen in de ontvanger beenmerg evalueren.

De grote problemen met de concurrerende beenmergtransplantaties voortvloeien uit bestraling en injectie en presenteren zich als gebruiker kiezen tussen meer na de transplantatie sterfte of verminderde reconstitutie efficiëntie. Split-stralingsdosis, zoals hier wordt gepresenteerd, wordt meestal geassocieerd met efficiëntere myeloablatie enminder toxiciteit in vergelijking met enkele dosis 20. Met de hier aanbevolen dosis (twee keer 450 rad), worden de myeloïde en B lymfoïde populaties efficiënt verwijderd maar resterende T-lymfocyten overblijven (figuur 3). Als er een reden is om afstoting van het transplantaat (donor en ontvanger muizen uit verschillende genetische achtergronden), een hogere dosis bestraling (twee doses van 550-600 rad) en een kortere termijn tussen de twee doses (4 uur in plaats van de volgende dag vermoedt ) voorkomt de resterende T-lymfocyten en de mogelijkheid van falen van transplantatie afstoting door verlagen. Onjuiste injectie of injectie in de perivasculaire ruimte in plaats van de staartader, zullen problemen donor cellevensvatbaarheid of donorcellen vervuiling door onachtzaamheid tijdens de voorbehandeling ook toenemen transplantaatfalen en post-transplantatie mortaliteit. Inefficiënte bestraling (door technische problemen, bijvoorbeeld) zal resulteren in een verminderde reconstitutie efficiëntie maar mag niet mo toenemenrtality. In al deze gevallen, de aanwezigheid van concurrerende cellen in de test helpt technische problemen dissociëren (zoals hier beschreven) van een bona fide daling donor HSC functie als de concurrent cellen altijd moet kunnen de bestraalde ontvanger reconstitueren. Immunodeficiënte gastheren kunnen ook worden gebruikt, bijvoorbeeld, de noodzaak van bestraling en / of het risico van transplantaatafstoting verminderen en de functie van humane HSCs 21-23 evalueren.

Concluderend geven we hier een competitieve transplantatie protocol dat kan worden aangepast voor verschillende toepassingen zoals beschreven in de discussie. Onze benadering gebruikt HSC equivalenten, die verwerkingstijden afneemt en tegelijkertijd verbetert cellevensvatbaarheid in het transplantaat ten opzichte van celsortering. Het is ook een praktische oplossing wanneer de toegang tot een cel sorter beperkt en vereist minder muizen in vergelijking met de kwantitatieve assay LDA, waardoor het een aantrekkelijk uitgangspunt voor de analyse van HSC functie. </ P>

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

We zijn dankbaar voor Roxann Hétu-Arbour voor hulp met de figuur ontwerp en de demonstratie van de procedures. Onderzoek in het lab werd ondersteund door een overgang onderscheiding van de Cole Foundation, Discovery verlenen geen. 419226-2012 van het Natural Sciences and Engineering Research Council van Canada (NSERC) en de Canadese Stichting voor Innovatie (CFI Leaders Fund verlenen nr. 31377). KMH is een Chercheur-Boursier Junior voor het Fonds de recherche du Québec - Santé (FRQS).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Microtainer tubes with K2EDTA BD Biosciences 365974
20 G needle BD Syringe For blood sampling from the mandibular vein
LabQuake Shaker rotisserie Thermo  Scientific C415110
Purified anti-mouse CD16/CD32 (clone 2.4G2, Fc Block) BD Biosciences 553142 2.50 μg/ml
Pe-Cy7-conjugated anti-mouse CD3e (clone 145-2C11) eBioscience 25-0031 0.25 μg/ml
PE-conjugated anti-mouse CD19 (clone 1D3) eBioscience 12-0193 0.25 μg/ml
APC-eFluor780 (APC-Cy7 equivalent)-conjugated anti-mouse GR1 (clone RB6-8C5) eBioscience 47-5931 0.25 μg/ml
FITC-conjugate anti-mouse CD45.1 (clone A20) eBioscience 11-0453 2.50 μg/ml
eFluor450-conjugated anti-mouse CD45.2 (clone 104) eBioscience 48-0454 1.00 μg/ml
Biotinylated anti-human/mouse CD45R (B220) (clone RA3-6B2) eBioscience 13-0452 1.25 μg/ml
Biotinylated anti-mouse CD3e (clone 145-2C11) eBioscience 13-0031 1.25 μg/ml
Biotinylated anti-mouse CD11b (clone M1/70) eBioscience 13-0112 1.25 μg/ml
Biotinylated anti-mouse GR1 (clone RB6-8C5) eBioscience 13-5931 1.25 μg/ml
Biotinylated anti-mouse TER119 (clone TER119) eBioscience 13-5921 0.625 μg/ml
V500 streptavidin BD Biosciences 56149 0.5 μg/ml
PE-conjugated anti-mouse CD117 (clone 2B8) BD Biosciences 553355 0.25 μg/ml
PE-Cy7-conjugated anti-mouse Ly6A/E (Sca1) (clone D7) BD Biosciences 558162 0.25 μg/ml
PerCP-eFluor710-conjugated anti-mouse CD135 (clone A2F10) eBioscience 46-1351 0.5 μg/ml
Alexa fluor 647-conjugated anti-mouse CD150 (clone TC15-12F12.2) Biolegend 115918 0.625 μg/ml BD Biosciences and eBioscience do not carry the same clone
1 ml tuberculin syringe with 27 G needle BD Syringe 309623
1 ml tuberculin syringe with 25 G needle BD Syringe 309626
70 μm cell strainer BD Falcon 352350

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Li, H. W., Sykes, M. Emerging concepts in haematopoietic cell transplantation. Nat Rev Immunol. 12 (6), 403-416 (2012).
  2. Kiel, M. J., Yilmaz, O. H., Iwashita, T., Terhorst, C., Morrison, S. J. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).
  3. Kim, I., He, S., Yilmaz, O. H., Kiel, M. J., Morrison, S. J. Enhanced purification of fetal liver hematopoietic stem cells using SLAM family receptors. Blood. 108 (2), 737-744 (2006).
  4. Mayle, A., Luo, M., Jeong, M., Goodell, M. A. Flow cytometry analysis of murine hematopoietic stem cells. Cytometry A. 83 (1), 27-37 (2013).
  5. Rossi, L., et al. Less Is More: Unveiling the Functional Core of Hematopoietic Stem Cells through Knockout Mice. Cell Stem Cell. 11 (3), 302-317 (2012).
  6. Till, J. E., McCulloch, E. A direct measurement of the radiation sensitivity of normal mouse bone marrow cells. Radiat Res. 14, 213-222 (1961).
  7. Shen, F. W., et al. Cloning of Ly-5 cDNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 82 (21), 7360-7363 (1985).
  8. Identification of GM mice. Laboratory Animals. 37 (suppl 1), 33-35 (2003).
  9. Rundberg Nilsson, A., Bryder, D., Pronk, C. J. H. Frequency determination of rare populations by flow cytometry: A hematopoietic stem cell perspective. Cytometry Part A. 83A (8), 721-727 (2013).
  10. Abidin, B. M., Owusu Kwarteng, E., Heinonen, K. M. Frizzled-6 Regulates Hematopoietic Stem/Progenitor Cell Survival and Self-Renewal. J Immunol. 195 (5), 2168-2176 (2015).
  11. Heinonen, K. M., Vanegas, J. R., Lew, D., Krosl, J., Perreault, C. Wnt4 enhances murine hematopoietic progenitor cell expansion through a planar cell polarity-like pathway. PLoS One. 6 (4), e19279 (2011).
  12. Oguro, H., Ding, L., Morrison, S. J. SLAM family markers resolve functionally distinct subpopulations of hematopoietic stem cells and multipotent progenitors. Cell Stem Cell. 13 (1), 102-116 (2013).
  13. Golde, W. T., Gollobin, P., Rodriguez, L. L. A rapid, simple, and humane method for submandibular bleeding of mice using a lancet. Lab Anim (NY). 34 (9), 39-43 (2005).
  14. Santaguida, M., et al. JunB protects against myeloid malignancies by limiting hematopoietic stem cell proliferation and differentiation without affecting self-renewal. Cancer Cell. 15 (4), 341-352 (2009).
  15. Czechowicz, A., Kraft, D., Weissman, I. L., Bhattacharya, D. Efficient transplantation via antibody-based clearance of hematopoietic stem cell niches. Science. 318 (5854), 1296-1299 (2007).
  16. Zhang, C. C., Lodish, H. F. Murine hematopoietic stem cells change their surface phenotype during ex vivo expansion. Blood. 105 (11), 4314-4320 (2005).
  17. Benveniste, P., et al. Intermediate-Term Hematopoietic Stem Cells with Extended but Time-Limited Reconstitution Potential. Cell Stem Cell. 6 (1), 48-58 (2010).
  18. Fazekasde St Groth, B. The evaluation of limiting dilution assays. J Immunol Methods. 49 (2), R11-R23 (1982).
  19. Louis, I., Heinonen, K. M., Chagraoui, J., Vainio, S., Sauvageau, G., Perreault, C. The signaling protein Wnt4 enhances thymopoiesis and expands multipotent hematopoietic progenitors through beta-catenin-independent signaling. Immunity. 29 (1), 57-67 (2008).
  20. Cui, Y. Z., et al. Optimal protocol for total body irradiation for allogeneic bone marrow transplantation in mice. Bone Marrow Transplant. 30 (12), 843-849 (2002).
  21. Benz, C., et al. Hematopoietic Stem Cell Subtypes Expand Differentially during Development and Display Distinct Lymphopoietic Programs. Cell Stem Cell. 10 (3), 273-283 (2012).
  22. Eppert, K., et al. Stem cell gene expression programs influence clinical outcome in human leukemia. Nat Med. 17 (9), 1086-1093 (2011).
  23. McIntosh, B. E., et al. Nonirradiated NOD,B6.SCID Il2rgamma-/- Kit(W41/W41) (NBSGW) mice support multilineage engraftment of human hematopoietic cells. Stem Cell Reports. 4 (2), 171-180 (2015).

Tags

Developmental Biology hematopoietische stamcellen beenmergtransplantatie total body bestraling flowcytometrie bloedafname muismodel concurrerende reconstructie eenheid
Concurrerende Transplantaties om hematopoietische stamcellen Fitness Evalueer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kwarteng, E. O., Heinonen, K. M.More

Kwarteng, E. O., Heinonen, K. M. Competitive Transplants to Evaluate Hematopoietic Stem Cell Fitness. J. Vis. Exp. (114), e54345, doi:10.3791/54345 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter