Abstract
En viktig utmaning i neurobiologi är att förstå hur neurala kretsar fungerar att styra lämpliga djurbeteenden. Drosophila melanogaster är ett utmärkt modellsystem för sådana undersökningar på grund av dess komplexa beteenden, kraftfulla genetiska tekniker och kompakt nervsystemet. Laboratoriebeteendemässiga analyser har länge använts med Drosophila för att simulera egenskaperna hos den naturliga miljön och studera de neurala mekanismerna bakom motsvarande beteenden (t.ex. phototaxis, kemotaxi, sensorisk inlärning och minne) 1-3. Med den senaste tidens tillgång till stora samlingar av transgena Drosophila rader som märka specifika neurala grupper, har beteendemässiga analyser fått en framträdande roll för att länka nervceller med beteenden 4-11. Mångsidig och reproducerbara paradigm, tillsammans med den underliggande beräkningsrutiner för dataanalys, är oumbärliga för snabba tester av kandidat fluglinor med olika genotypes. Särskilt användbara är inställningar som är flexibla i antalet testade djur, längd experiment och natur presenterade stimuli. Analysen av val bör också generera reproducerbara data som är lätt att förvärva och analysera. Här presenterar vi en detaljerad beskrivning av ett system och protokoll för att analysera beteendemässiga reaktioner av Drosophila flyger i en stor fyra fält arena. Installationen används här för att analysera svaren från flugor till en enda lukt stimulans; emellertid kan samma inställning ändras för att testa flera lukt, visuella eller optogenetic stimuli, eller en kombination av dessa. Den olfaktometem inställning registrerar aktiviteten hos flyga populationer svarar för lukter, och beräknings analysmetoder används för att kvantifiera flyga beteenden. Insamlade data analyseras för att få en snabb avläsning av en experimentell körning, vilket är viktigt för effektiv datainsamling och optimering av experimentella betingelser.
Introduction
Förmågan att anpassa sig och svara på den yttre miljön är avgörande för överlevnaden av alla djur. Ett djur måste undvika faror, söka mat och hitta kompisar, och lära av tidigare erfarenheter. Sensoriska system fungerar för att ta emot en mängd olika stimuli, såsom visuell, kemiska och mechanosensory, och sända dessa signaler till det centrala nervsystemet för att tolkas och avkodas. Hjärnan styr sedan lämpliga motor beteenden baserat på den upplevda miljön, såsom födosök för mat eller fly från ett rovdjur. Att förstå hur sensoriska system upptäcker den yttre världen, och hur hjärnan avkodar och styr beslut, är en stor utmaning i neurobiologi.
Drosophila melanogaster är ett kraftfullt modellsystem för att undersöka hur neurala kretsar styr beteenden. Förutom att vara enkel och billig att underhålla, Drosophila uppvisar många olika och komplexa stereotypa beteenden, men gör det med en compact nervsystemet av cirka 100.000 neuroner. Kraftfulla genetiska tekniker finns för att manipulera Drosophila genomet, och tusentals transgena linjer har genererats som selektivt och reproducerbart märka samma delmängder av nervceller 10-13. Dessa transgena linjer kan användas för att selektivt manipulera aktiviteten hos de märkta neuroner (aktivera eller hämma), och dessa manipulationer kan användas för att undersöka hur neurala funktioner styr beteenden.
Flera beteendemässiga analyser har utvecklats för att studera olika Drosophila beteenden. Drosophila, liksom många djur, använder sitt luktsinne för att styra många beteende val, såsom att hitta mat, att hitta kompisar, och undvika faror. Olfaction är därför en bra sensoriska systemet för att undersöka hur externa stimuli detekteras och tolkas av ett djurs nervsystem för att styra lämpliga val. Som sådan, har ett antal analyser utvecklats för undersökting larv och vuxna lukt beteenden. Traditionellt har lukt beteenden i Drosophila analyseras av ett två-val T-labyrint paradigm, som kan användas för att analysera medfödda och lärde lukt beteenden 3. I denna analys är cirka 50 flugor ges ett val mellan två rör: en tub innehåller doft i fråga och den andra innehåller en styrluktämne (vanligtvis lukten lösningsmedel). Flugorna ges en viss tid att göra ett val, och sedan antalet flugor som finns i de olika kamrarna räknas. Även om T-labyrinten är en enkel analys för många experiment, finns det flera begränsningar. Till exempel är lukt beteenden mäts vid en enda tidpunkt, och olika val som gjorts före denna tidpunkt förkastas. På liknande sätt är de enskilda beteenden av flugorna inom befolkningen försummas. Dessutom kräver T-labyrinten manuell räkning av flugor, som kan införa fel. Slutligen, eftersom det finns endast två uppmätta val, dettaminskar statistisk kraft ofta krävs för att upptäcka subtila beteendeförändringar. Ett alternativ till en två-val T-labyrint är en fyra-kvadranten (fyra fält) olfaktometem 14-18. I denna analys, djur utforska en arena där vart och ett av de fyra hörnen av arenan är fylld med en potentiell källa till luktsatt luft. Arenan har en rynkad stjärnform för att maximera bildandet av fyra experimentellt definierade lukt kvadranter. Om lukten levereras i ett av hörnen så är det endast återfinns i att en kvadrant. De beteenden hos djuren kan spåras när de kommer in och lämnar lukt kvadranten, och enkelt jämfört med deras beteende i de tre kontroll kvadranter. De fyra-kvadranten olfaktometem analys därmed rekord rumsliga och tidsmässiga beteende svar på lukt stimuli över en stor experiment arena.
De fyra-kvadranten olfaktometem utvecklades först av Pettersson et al. 15 och Vet et al. 17 att undersöka olfabriken beteendemässiga reaktioner enskilda parasit Hymenoptera. Faucher et al. 18 och Semmelhack och Wang 16 anpassat setup för att övervaka luktsvar enskilda Drosophila. Den fyra-kvadranten olfaktometer är lika känsliga för attraktiva och repulsiva svar, vilket möjliggör ett brett spektrum av testluktämnen och villkor. Anpassad skrivna fly spårningsprogram, som utvecklats av Alex Katsov 19 och underhålls av Julian Brown (beskrivs i Material), infördes ytterligare fördelar för senare implementeringar av fyra-kvadranten olfaktometem 14,20-23. Det är nu möjligt att analysera upp till 100 flugor samtidigt med hög spatial (27,5 pixlar / cm) och temporala (30 bildrutor per sekund) upplösning, som gör det möjligt att utvinna olika parametrar, såsom position, hastighet och acceleration av flugor vid någon tidpunkt. Detta gör det möjligt för undersökningar av dynamiken i flugor beteende svar på lukt 20 Material tabell), medger samma konfiguration flexibla spårningsperioder och kan användas för att spåra flugor i upp till 24 timmar genom att ta bilder med en lägre bildhastighet. Detta alternativ användes för att studera äggläggande beteenden hos flugor och jämföra deras kroppspositioner med ovipositional preferenser 14. De fyra fält olfaktometem kan också användas för att studera svar till multimodala (t.ex. lukt och visuella) stimuli, eller att kombinera optogenetic 9 eller thermogenetic 21 stimulering med presentationer av sensoriska stimuli. Vidare medger den höga tidsupplösning utvinning av banor for varje enskild fluga i ensemblen datamängden. Därför tillåter metoden utredning lukt guidad befolknings beteenden och även enskilda sociala interaktioner. De data som genereras av denna analys är robusta och mycket reproducerbar, vilket möjliggör användning av fyra fält olfaktometem för beteende skärmar.
Vi beskriver här inställningsanordning för en fyra-kvadranten olfaktometem. Vi visar ytterligare dess användning vid analys lukt attraktion som svar på äppelcidervinäger och repulsion som svar på starkt koncentrerad etylpropionat. Slutligen, vi beskriva och ge exempel kod för analys av de registrerade flyga spårningsdata.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Inställning Montering
- Tillverka stjärnformade arena (19,5 cm x 19,5 cm x 0,7 cm) av polytetrafluoretylen (PTFE) enligt de medföljande ritning (kompletterande material, SupplementalSketch_StarShapedArena.pdf). Arenan kan tillverkas genom en kommersiell eller en anpassad anläggning.
- Förvärvar två glasplattor (20,25 cm gånger 20,25 cm med en tjocklek av 2 mm), och borra ett hål (~ 0,7 cm i diameter) exakt i centrum av en av glasskivorna med hjälp av en diamantbelagd borr.
- Tillverka en ljustät beteende låda för beteende arenan. Tillverkar även en ljustätt kameralådan för den infraröda CCD videokamera enligt de medföljande ritningarna (kompletterande material, SupplementalSketch_LightTightBox.pdf). Lådorna kan tillverkas av en kommersiell eller en anpassad anläggning.
- Montera ventilationsaggregatet på den bakre väggen och LED arrayer på sidoväggarna av beteendet rutan. Placera temperatursondeni beteendet rutan genom ett sidohål för feedback i realtid temperatur och justering (se figur 1 och 2 för detaljer).
- Fäst IR-filter och cirkulär polarisator till kameran, och montera enheten i kameralådan. Beteendet rutan och kameralådan är åtskilda av ett glasfönster för bättre kontroll temperatur av beteendet lådan (se figurerna 1 och 2 för detaljer).
- Anslut IR CCD-kamera till en kamera adapter. Anslut kameran adaptern till en USB-omvandlare. Anslut USB-omvandlare till en USB-port på datorn för datainsamling.
- Installera drivrutinen för video converter på datorn enligt tillverkarens anvisningar. Eventuellt installera bildbehandlingsprogram som tillhandahålls av tillverkaren av USB Video Converter för att få tillgång till ett bredare utbud av kamerainställningar och förvärvsparametrar.
- Anslut luftaggregatet (genom "output"På baksidan av temperaturregulator) och temperatursensorn (genom" termo "på baksidan av temperaturregulatorn) till temperaturreglaget. Placera sonden i beteendet rutan.
Obs: Temperaturen styrsystemet i vår layout är i stånd att bibehålla boxen temperatur mellan 18 ° C och 30 ° C. Högre eller lägre omgivningstemperaturer skulle kunna vara användbara för thermogenetic (dTrpA1, TrpM8 eller shibire ts) experiment för att manipulera neuronal aktivitet eller hämmar synaptisk överföring. För de flesta experimenten, hålles temperaturen vid 25 ° C. - Montera lukt leveranssystem i följande steg (se figur 1B för detaljerade scheman och kopplingsbeslag):
- Använd lufttrycksregulator för att styra lufttillförseln från den centrala luftsystemet. Anslut en kol luftfilter (fylld med träkol) till tryckregulator för att rena luften från den centrala enir-systemet.
- Montera flödesreglersystemet består av flera kanaler som regleras av högupplösta flödesmätaren rör.
- Anslut utgången från kolet luftfiltret till flödesmätaren rören via en förgrening, såsom visas i figur 1B och 2F. Rikta utsignalen från flödesmätaren rör genom elektroniskt styrda 3-vägs magnetventiler för att reglera om ren luft lämnar flödesmätare utvisas i rummet eller ingått skräddarsydda luktkammare 24.
- Installera solenoidventilen regulator enligt tillverkarens manual.
- Montera elektronisk luftflödesmätare genom att ansluta den till ett datainsamlingsenhet (DAQ) och en kraftkälla enligt tillverkarens manual. Installera gränssnitten DAQ att kontrollera lika flödeshastigheter i varje kvadrant av arenan före varje experiment.
2. Olfactory Stimuli Framställning
- Förbereda 5 luktant kammare 24 som består av en yttre plastbehållare, glas inre behållaren, en skräddarsydd PTFE lock insats, original lock behållare med central del bort och två envägsventiler.
Obs: En O-ring runt PTFE lock kan användas för att förhindra luftläckage från lukten kammaren under lukt perfusion. Se figur 1 för schemaritning och Figur 2 för bilder av kamrarna. - Använd fyra lukt kammare för lösningsmedels kontroller och en kammare för ett test luktämne. Fyll glasbehållare med 1000 il lösningsmedel eller luktämnen utspädning (test odörer + lämpliga lösningsmedel, blanda ordentligt innan experiment), placera glasbehållare inne i motsvarande plastkammare (inte spiller ut vätskan i plastkammaren) och dra åt locket . Se till att alltid använda en ren kammare för testluktämnen och lösningsmedel kontroller.
Obs: Lukt attraktion kan utlösas av 1/16 utspädning av äppelcidervinäger (5% surhet) i viktater. I motsats härtill kan olfaktoriska repulsion beteende studeras genom användning av en 10% utspädning av etylpropionat i mineralolja. Kontroll stimuli i dessa fall är lukt kammare med ren mineralolja.
3. Fly Framställning
- Bakre flyger på standard majsmjöl medium. Placera 30 manliga och 30 kvinnliga föräldra flugor i en standardflaska, och låt dem lägga ägg under 5 dagar vid 25 ° C eller rumstemperatur.
- För varje experiment, samla nyligen eclosed (<1 dag gammal) 25 manliga och 25 kvinnliga flyger under korta CO 2 bedövning.
- Håll flugor i en injektionsflaska med standard fluga medium för 2-4 dagar.
- 40-42 timmar före experimentet överföra flugor utan CO 2 bedövning till en flaska med ~ 10 ml 1% agarosgel. Detta kommer att hålla flugorna fuktas utan mat, vilket bidrar till att öka sin rörelseaktivitet.
Obs: Mer än 90% av flugorna ska överleva svält. Vissa genotyper är mindre läkadin och kan inte göra det genom en 40 timmar svält. I dessa fall kortare perioder, såsom 24-28 timmar är acceptabla men bör vara densamma för alla experimentella förhållanden och upprepningar.
4. Beteende Svaren till attraktiva och Repellent Aromer
- Slå på temperaturkontroll och ställa in den till 25 ° C.
- Anslut doft kamrarna (kontroll- och testluktämnen) genom att föra in slangen till utloppet av luktämnen kammare och push-to-connect montering på beteendet rutan.
- Kontrollera flödet i varje kvadrant med luftflödet mätaren för att se till att kontrollen och lukt luftströmmar är lika med 100 ml / min.
- Rengör PTFE flyga arenan och glasplattor med 70% etanol 2-3 gånger och tillåta dem att fullt lufttorka (~ 3-4 min).
- Fäst glasplattorna till arenan med klämmor.
- Transfer flyger utan CO 2 bedövning in på arenan genom hålet i en av glasskivorna. Akterer överföringen placera en cirkulär nät på hålet för att förhindra flugor från att fly.
Obs: CO 2 anestesi har visats påverka Drosophila beteende 25 och bör inte användas inom 24 timmar av en beteendeexperiment. - Placera arenan med flugor i den ljustäta kammaren, anslut fyra kontroll luftströmmar genom att ansluta slangen ansluten till push-to-connect montering på beteendet rutan till arenan hörn, stänga dörren till kammaren och vänta 10- 15 min för att låta flugorna vänja sig vid den nya miljön. Om möjligt, byta belysningen i rummet där experimenten utförs, för att undvika eventuell minimal ljus läcka som kan snedvrida experimentella resultat.
- Köra en 5-10 min kontrollexperiment, där flugor är exponerade för 4 kontroll luftströmmar.
- Analysera data omedelbart (se Dataanalys nedan) för att se till att flugorna är jämnt fördelade i arenan, och sevärdhet index är näratill 0. Detta steg är viktigt, eftersom det bekräftar att det inte finns några okontrollerade källor preferens eller undvikande i arenan (t.ex. lätta läcka från utsidan, ojämn temperaturfördelning, ojämn arena, förorening lukt, etc.). Om flugorna fördelas ojämnt eller deras rörelseaktivitet är låg, kasta flugor, rensa arenan igen (steg 4,4) och använda en ny sats av flugor att upprepa experimentet.
- Anslut testluktämnen kammaren till inställnings genom att slå på de tre-vägsventiler eller åter ansluta anslutningsrören.
- Kör testet experiment för 5-10 minuter och analysera data som diskuteras i avsnitt 5 nedan (se även referens 14 och Figur 3). Inspelningar som är längre än 20 min kan resultera i datafiler som kan vara svåra att beräkningsprocessen. Om längre experimentella inspelningar önskas, snabbt stoppa och starta om programmet för att spåra. Detta resulterar i en ~ 10 sek gap mellan experimentella inspelningar.
- Discard flugor.
- Rena arena och glasskivor med 70% etanol (steg 4,4), och byt ut anslutningsrören i ljustätt hölje. För att påskynda experiment, kan en ny ren arena användas och smutsiga arenan rengöras när de utför experimentella körningar.
- Kör ett annat experiment med en ny sats av flugor, om så erfordras. Om flera experiment körs på samma dag, ta mycket försiktig för att säkerställa att ingen lukt finns kvar i systemet från en tidigare provkörning. Detta är normalt inte ett problem med låga koncentrationer av luktämnen eller med CO2, men för mycket koncentrerade stimuli upp till 24 timmar gap mellan experimentella försök kan behövas. Dessutom kan alla slangar efter flödesrören bytas ut om misstänks luktämnen kontaminering under kontrollexperiment. lämnar alltid den torra luften på mellan försöken att kontinuerligt spola systemet
5. Dataanalys
Obs: Den föreslagna fly spårning förvärv software (beskrivs i Materials), spårar flugor i realtid under förvärv, och sparar tidsstämpel och koordinaterna för alla upptäckta flugor i * .dat-format. Vi har utvecklat en skräddarsydd Matlab rutin att konvertera data till en Matlab-format, och att analysera data. Kodexempel finns i kompletterande material, men detaljerna i genomförandet kommer att bero på den programvara som används för datainsamling.
- Ladda rådata. Skapa en rumslig mask som följer konturerna av arenan och applicera masken på rådata för att ta bort alla datapunkter som faller utanför arenan eftersom de representerar brus (figur 4A, Tilläggskodex MaskSpatialFiltering.m, Score.m, DrawCircularMask. m).
- Ta bort alla datapunkter som rör sig med en hastighet under 0,163 cm / s under längre tid än 3s, eftersom dessa data kommer sannolikt att vara brus eller genereras av icke-rörliga flugor (Figur 4B, Tilläggskodex TemporalFiltering.m).
- Visualisera återstående datapoäng genom att rita ut dem alla på en gång eller som enskilda banor (Figur 3, Tilläggskodex SingleTrajectoryViewer.m).
Obs: Placeringen av lukt gränser i fyra fält beror sannolikt på ett antal faktorer, såsom egenskaperna hos varje luktämnen och luftflöden som används. Till exempel kommer mycket flyktiga doftämnen sannolikt fylla lukt kvadranten mer fullständigt än mindre flyktiga doftämnen. Därför är det troligt att varje lukt kan uppvisa något olika lukt gränser. Användningen av en photoionization detektor för att mäta lukt gränser kan vara problematiskt eftersom den använder ett vakuum för att sampla luft från en viss plats, och så stör luktämnet koncentrationen vid den platsen. Icke desto mindre kan luktgränserna snabbt uppskattas baserat på flyga beteendemässiga data. Till exempel, kan en lukt gräns baserat på ackumulerade flyga spår som svar på olika lukter tydligt observeras i figurerna 3C och 3D. - calberäkna en attraktion index för att bestämma huruvida kontrollexperiment alstrar någon preferens svaret, och också för att få tillgång till svar på ett luktämne (eller optogenetic 9) stimulans. För att beräkna en sevärdhet index (AI), använd de sista 5 min av en kontroll eller provinspelning. För att få ett mått på attraktion som faller mellan ett (absolut attraktion) och -1 (absolut repulsion) är följande formel används för att beräkna AI:
där N-test är antalet datapunkter i test kvadranten, är N-kontroll det genomsnittliga antalet datapunkter i de tre kontroll kvadranter. Denna åtgärd är intuitivt som ingen preferens skulle indikeras av nära nollvärden. Dock inte korrekt indikerar den andel av det totala antalet flugor som finns i luktämnet kvadranten. För att få denna åtgärd, kan en Procent Index (PI) användas:![ekvation 2]("/files/ftp_upload/54346/54346eq2.jpg")
där N-test är antalet datapunkter i test kvadranten, och N totalt är det totala antalet datapunkter i alla fyra kvadranter. Denna formel ger ett mått som ligger mellan 0 och 1, med 0,25 motsvarande ingen beteende preferens (Figur 3E och 4C, Tilläggskodex AttractionIndex.m). - Köra 5-10 upprepningar av varje försöksbetingelse, med hjälp av en ny grupp av flugor för varje upprepning. Jämför attraktion index mellan villkor eller mot kontroller med hjälp av Kolmogorov-Smirnov icke-parametrisk test (figur 3F, kstest2 funktion i Matlab).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De fyra-kvadranten olfaktometem analys register och analyserar walking verksamhet många flugor över ett stort beteende utrymme. Luktämnen kan införas i luftströmmarna som kommer in en, två, tre eller alla fyra kvadranter. I frånvaro av lukt, kommer flugorna fritt röra sig mellan alla fyra kvadranter. Detta beteende är avgörande för att observera eftersom det indikerar att un-avsikt fördomar inte har införts i analysen. Dessa fel kan inkludera ljus, temperaturväxlingar, skillnader i luftflödet, eller luktföroreningar. Figur 3B visar de beteendemässiga reaktioner på fyra-kvadranten olfaktometem av 25 manliga och 25 kvinnliga flugor för torr luft. En enda fluga-spår från de insamlade uppgifterna betonas också i figur 3B, och visar att denna fluga undersökte hela beteende arenan. Attraktionsindexvärde (AI) för alla de analyserade spår över 5 min testperiod är nära 0, indicating en brist på attraktion till lukt kvadranten. På samma sätt är den procentuella index (PI) av experimentet 0,24, vilket indikerar att flugor distribuerades ganska jämn i alla fyra kvadranter under 5-minuters testperioden.
Den fyra-fältet beteendegensvar till en attraktiv luktämne visas i figur 3C. Äppelcidervinäger införs i luftströmmen av överst till vänster lukt kvadranten luftströmmen genom att placera en 6,25% utspädning av äppelcidervinäger i test lukt kammaren. De insamlade flyga spår visas i grått visar att de flesta flugor samlas i denna lukt kvadranten, och inte längre utforska alla fyra kvadranter. En enda färgad fluga spår visar att när en fluga in i äppelcidervinäger lukt kvadranten, tenderar det att förbli i den attraktiva lukt kvadranten. AI av 0,94 för experimentet är nära 1 indikerar en stark attraktion till denna luktämnen. PI av 0,92 indikerar att 92% av flugorna remained i lukt kvadranten under skadeperioden.
Den fyra-fältet beteende svar på en repellerande luktämne visas i fig 3D. En 10% spädning av luktämnet etylpropionat placeras i en luktkammare användes som luktkällan för den övre vänstra luftströmmen. De hopade flyga spår för den analyserade experiment visar undvikande av lukt kvadranten, tyder på lukt guidad repulsion. En enda färgad fluga spår visar att en fluga, då den trädde lukten kvadranten, snabbt vände sig bort för att undvika lukt kvadranten. AI av -0,68 är mindre än 0, vilket tyder på repulsion, och är nära till -1, vilket tyder på en stark motbjudande luktämnen svar. PI av 0,06 för experimentet antyder att endast 6% (jämfört med ~ 25% under de neutrala lukt experiment) av de spårade gylfdatapunkter hittades i lukt kvadranten under loppet av experimentet.
Figur 3E diagram förhållandet mellan AI och PI poäng, och hur dessa siffror hänför sig till attraktiva eller frånstötande beteenden.
fyra fältanalysen resulterar i robusta och reproducerbara lukt beteenden. Detta medger kvantitativa jämförelser mellan kontroll och experimentella betingelser såsom visas i fig 3F, och möjliggör även identifiering av subtila olfactory svar som avviker från neutraliteten.
Dessutom, eftersom data erhålls vid hög rumslig och tidsmässig upplösning, är det möjligt att studera ett stort antal faktorer av beteendereaktioner, såsom banor av enskilda flugor (som visas i figur 3), samt karakterisera olika aktivitets dynamik flugor i en lukt fält (t.ex. förändringar i riktning och hastighet 19,20).
Det kan ofta vara svårt att placera fyra-fältet arenan i exakt samma läge för varje experiment, särskilt eftersom frekvent rengöring av arenan krävs. Den tillhandahållna analyserar skript kompensera för dessa små variationer genom att först anpassning av data som visas i figur 4A. I detta fall är formen på fyra-fältet arenan beräknas, och datapunkter som ligger utanför detta utrymme tas bort. Dessa spårade objekt representerar ofta debris eller reflektioner som felaktigt spåras. Eftersom de inte ligger inom arenan och därmed representerar brus, är det viktigt att dessa datapunkter tas bort för att förhindra felaktig dataanalyser. På samma sätt är det också viktigt att ta bort spårade datapunkter som kan tyda brus eller icke-rörliga flugor inom arenan. För att åstadkomma detta är en analys manus utnyttjas (och ges här) som tar bort datapunkter som i huvudsak inte rör sig (som visas i figur 4B). Dessa datapunkter är vanligtvis i minoritet, men deras bibehållande skulle leda till fel i analyserna.
Index attraktion och preferens indexvärden kan beräknas efter en viss tidsperiod (t.ex. vid slutet av en 5 min experiment som visas i Figur 3). Det bör emellertid noteras, att eftersom flugor spåras med hög rumslig och tidsmässig upplösning, kan liknande analyser utföras genom hela experimentet. Detta ärvisas i figur 4C där sevärdhet Index och Procent Index poäng beräknas i kontinuerlig 10-sek fack under den tidsperiod. En sådan analys ger bättre förståelse av lukt förändringar som kan uppstå under experimentet, såsom tillvänjning till ett luktämne.
Figur 1:. Schematisk bild av de fyra-kvadranten olfaktometem (A) Beteendet installationen består av en lukt leveranssystem, temperaturkontroll (ej schematiskt), bildförvärvssystem (IR LED-lampor och IR-CCD-kamera ansluten till en dator), fyra-kvadranten arena och ljustätt beteende och arena lådor. De röda cirklar utse de motsvarande komponenter som visas i figur 2. (B) Detaljerad utformning av lukt leveranssystem. De gröna tecken representerar anslutning / konverterings storlekar fittings. Rör av 1/16 ID och 1/8 OD är märkta i gult medan de 1/8 ID och 1/4 OD är märkta i rosa. Förkortningar: IR, IR; CF, kompressionskoppling; BF, Taggtråd Fitting, MNPT, Man National Pipe Thread. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2:. Bilder av Olfactory Assay Setup (A) Wide-field syn på kameralådan och beteende box. (B) View inside beteendet rutan. Temperatursonden, anslutningsrören, och IR-LED-arrayer är märkta. (C) Fyra-kvadranten arena. (D) Wide-fältet vy av lukt leveranssystem som är kopplat till beteendet rutan. Kameran lådan har tagits bort för att avslöja den CCD-kamera. (E (F) Exempel på luktrören är anslutna till grenröret. (G) Hög upplösning flödesrör reglera luftflödet. (H) Den lukt slangen och kopplingar nedströms flödesrörets tillsynsmyndigheter. (I) Magnetventilerna reglerar om ren luft får passera genom en luktkammare eller utvisas till rummet. (J) lukten kammare är anslutna till envägsventiler, och innehåller en inre glasbehållare för luktämnen. (K) Beteendet box innehåller utanför push-to-connect beslag som ansluter till lukt slangen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4:. Exempel data som genereras av dataanalysstegen (A) Rumslig filtrering av data, som utförs av MaskSpatialFiltering.m att ta bort datapunkter som faller utanför arenan. Röda cirklar visar utgångslägen i cirklar som används för att definiera gränserna för arenan. Svarta cirklar är de slutliga positionerna, förvärvat genom att montera cirkeln utkast data (grå skuggade området innanför fyra fält). Röda prickar och svarta pilspetsar visar datapunkter som kommer att tas bort från datamängden efter detta filtreringssteg. (B) Temporär filtrering av uppgifter, som utförs av TemporalFiltering.m. Detta filtreringssteg avlägsnar datapunkter som rör sig mycket slowly eller inte alls, eftersom de sannolikt kommer att genereras av icke-rörliga flugor eller smuts / reflektioner från arenan. En röd prick som omges av en streckad röd ruta indikerar positionerna för ~ 6000 datapunkter med identiska koordinater som kommer att tas bort av detta filtreringssteg. (C) sevärdhet index (AI) och Procent index (PI), beräknat på 10 sek fack under de senaste fem minuter av ett experiment av AttractionIndex.m. Temporal profiler av dessa index innehåller information om dynamiken i beteendereaktioner och kan användas för detaljerad analys av beteenden. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De fyra fält olfaktometem beskrivs här är ett mångsidigt beteendesystem för att studera lukt svaren från stora populationer av vild-typ och mutant Drosophila flyger. Varje experiment tar ~ 1 timme (inklusive installation, experimentella körningar, och rengöring), och 4-6 experiment kan rutinmässigt varje dag. En typisk analys med användning av 40-50 flugor i 5 minuter genererar cirka 450.000 banddatapunkter för analys. Den beskrivna konfigurationen kan också användas, med mindre modifieringar, för att övervaka förändringen av andra insekter eller insektslarver som svar på olfaktorisk eller andra sensoriska stimuli över en tidsperiod, som sträcker sig från min till dagar. Den fyra-kvadranten analysen är känslig för effekterna av både attraherande och repulsiva stimuli. De flesta luktämnen genererar attraktion index (AI) mellan -0,9 och 0,9 (ekvation 1). En AI i intervallet 0,5-1 innebär stark attraktion beteende flugorna till stimuli, medan AI i intervallet -0,5 till -1 ärutlöst av starka repellenter. Generellt sett bör en neutral reaktion från kontroll lukter (torr luft, fuktig luft, mineralolja) faller mellan 0,1 och -0,1. AI ändras ofta under hela testet experiment, vilket speglar den tid flugor kräver att gå in i de doft plymer, initial attraktion och ökning av rörelseaktivitet mot en ny stimulans, och den slutliga hyposensibilisering som svar på stimulus. Förtest kontrollförsök är avgörande, och måste utföras noggrant för att säkerställa att flugor jämnt fördelade på arenan i frånvaro av den önskade stimulus.
De vanligaste orsakerna till rumsliga partiskhet flugor i arenan är: ojämna luftströmmar, möjligen på grund av frånkopplad slang eller bristfälligt fastspända glasplattor av stjärnformade arena (i vår erfarenhet, flugor har möjlighet att upptäcka skillnader i luftflödet av så lite som 15 ml / min); ojämn temperaturfördelning i hela arenan, som kan förbättras genom att ställa inluftkonditioneringsenhet för att generera svagare och mer diffus luftflöde och / eller längre före förvärvet perioden (~ 20 min) för att säkerställa jämn temperatur på arenan; minimal ljusläckage genom temperatursonden öppning, som kan sänkas genom att försegla öppningen med svart tejp; resterande lukt i arenan eller i luften leveranssystem, i vilket fall installationen (arenan, flödesrör, beslag av ljustätt hölje, etc) måste rengöras noggrant och får torka i flera dagar eller bytas ut när det är möjligt.
Underhåll av lukt utrustning är viktig för tillförlitliga och konsekventa resultat. Push-to-connect beslag på beteendet rutan och luftintag och innerväggar arenan ska rengöras med etanol efter varje experiment om starka lukter används och får torka helt. Glasplattorna bör tvättas tre gånger med en 70% etanol, som vanligtvis är tillräcklig för att avlägsna kvarvarande lukt och smuts från plattorna, men hexan är användbarvid avlägsnande av organisk förening som deponerats av flugor (t ex feromoner bestående av långa kedjor av kolväte). Tvål rekommenderas generellt inte eftersom det oftast innehåller aromatiska komponenter som kan påverka lukt beteenden. Beteendet box bör vara ansluten till de torra luftintag mellan experiment (t.ex. över natten) för att underlätta avlägsnandet av restlukter från systemet.
Om rörelseaktiviteten av flugorna är låg, kan de generera för få datapunkter, vilket ofta resulterar i en bullrig och rörlig index sevärdhet. Längre svält och inspelningstider kan hjälpa till att lösa detta problem. Däremot om flugorna är sjuka, 24-28 timmar av svält skulle generellt vara tillräcklig för att förbättra rörelseaktivitet så länge det är konsekvent i hela experiment. Det finns en fin balans mellan att upprätthålla ett hälsosamt tillstånd av flugorna och ökande förflyttning. 40 tim svält kan användas som en startpunkt, och senare modifieras såsombehövs baserat på de experimentella resultaten. Attraktion Index kommer att vara något påverkas av varaktigheten av svält, därför är det viktigt att svälta alla försöksdjur för samma tidsperiod för att undvika störande effekter av svält tid. Längre svälttider brukar göra motbjudande svar svagare (närmare 0), och attraktiva svar starkare. Torr luft kontroll luftströmmar tenderar att uttorka flugorna, och bör inte användas under längre tid än 40 minuter.
De fyra-kvadranten olfaktometem kan användas för att studera svar av enstaka 16,18 eller flera flugor till en enda stimulans eller studera val preferens mellan stimuli. Till exempel kan olika lukter användas i vart och ett av de fyra kvadranter. Detta skulle också kunna användas för att bestämma svaren på lukt-blandningar genom att undersöka gränserna för den odör kvadranter. Det bör noteras att även om spårnings systemet tillåter enskilda spår att vara isolerad från de insamlade data, är detmöjligt att enskilda flugor kan bete sig annorlunda när analyseras som en del av en grupp än när de testas ensamma. Till exempel, grupper av flugor uppvisar ökad lukt styrd repulsion på grund av fysiska interaktioner mellan flugor 26. Uppföljningssystemet och layout kan också anpassas för användning i icke-lukt analyser. Ramverket analysen kan lätt rymma en LED-array 9 för optogenetic stimulering, eller en värmeplatta 27 för thermogenetics. Systemet kan även anpassas för att studera beteende val av en tidsskala av många timmar, till exempel för att studera äggläggning beteende 14. I detta fall behöver förvärvet bildfrekvens som ska justeras för att undvika generering av stora datafiler, och en källa till fukt och substrat (1% agarosgel) måste tillhandahållas som äggläggande substrat.
En begränsning av denna inställning är att flugorna spåras som IR-reflekterande föremål i och under Arena om någon del av en optogenetic ellerthermogenetic experiment reflekterar IR, kommer irrelevanta datapunkter måste tas bort vid efterbearbetning. För närvarande är det inte heller möjligt att filma flugor i en rumslig upplösning som gör att olika flugor att kontinuerligt särskiljas, men detta kan förbättras i framtiden genom att använda mer avancerade videokameror. En annan begränsning av det nuvarande systemet är att förflyttningen av flugor är begränsad till två dimensioner för att främja promenader beteenden, och kommer att förhindra lukt-inducerad flyg svar.
Det bör noteras att ytterligare automatiserade analyser har också utvecklats för att undersöka lukt beteenden enda eller grupper av flugor. Den mest liknande design som den analys som beskrivs här är en metod som utvecklats av Beshel och Zhong 28. I denna analys är svaren från ~ 30 flugor övervakas i en liten rund arena (ungefär en fjärdedel området för fyra fält arena) där lukter levereras från en av fyra lukt hamnar längs arenan wall, och avlägsnas genom ett hål i centrum av den cirkulära arenan. Förutom en mindre arena, andra designskillnader omfattar beteenden som utförs under ljusförhållanden, och luktämnen främst koncentrera nära lukt portar (i stället för hela lukt kvadranten enligt anvisningar från de rynkade väggarna i fyra fält arena). Icke desto mindre är den cirkulära arenan en lämplig metod för screening av doftsvar av flugor, och skulle kunna anpassas till flyga spårnings utformning beskrivs här.
Ett alternativt tillvägagångssätt är att samtidigt övervaka aktiviteten hos många ensamstående flugor som svar på lukt. I Flywalk analysen individuella flugor placeras i små rör, och deras svar spåras när doftämnen är perfusion genom röret 29,30. Förändringar i framåt eller bakåt, eller förändringar i hastigheter kan användas för att mäta om ett luktämne är i allmänhet attraktiva eller frånstötande. Denna analys, som de fyra fält analys, spårar automatiskt flyga movements, och så kan användas för att snabbt mäta lukt svar på ett brett utbud av lukter. Emellertid i motsats till fyra-fält, komplexa motordynamik, såsom bana vrida vinklar och potentiella sociala interaktioner, kanske missade i Flywalk assay inspelningen.
Automatisk spårning av enskilda walking flugor har också anpassats till en typ analys T-labyrint 31,32. I denna analys är flugor placeras i små kammare där lukter perfunderade från vardera änden av kammaren, och utresa via en port i mitten av kammaren. Positionerna för flugorna också automatiskt funnen. Detta härmar på en enda fluga skala, ett ramverk T-labyrint. I kombination med optogenetik, har denna analys varit särskilt väl lämpad för analys av neurala kretsar som medierar lukt inlärning och minne, och kan också användas för att mäta de olfaktoriska preferenser enkel flugor. I likhet med Flywalk, det kan inte övervaka komplexa aktivitets dynamik som kan uppstå över större geografiska områden, Såsom de som uppstår under livsmedels söker 14, eller beteenden som förekommer endast i flyga populationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Air delivery system | (Quantity needed) | ||
| Tubing and connectors | |||
| Thermoplastic NPT(F) Manifolds | Cole-Parmer, IL, USA | R-31522-31 | 1 |
| Hex reducing nipple (1/4MNPT->1/8MNPT) | McMaster-Carr, IL, USA | 5232T314 | 1 |
| Tubing (ID:1/8) | McMaster-Carr, IL, USA | 5108K43 | 50 Ft |
| Tubing (ID:1/16) | McMaster-Carr, IL, USA | 52355K41 | 100 Ft |
| Barbed tube fittings | McMaster-Carr, IL, USA | 5117K71 | 1 pack |
| Push-to-connect tube fittings | McMaster-Carr, IL, USA | 5779K102 | 4 |
| Barbed Tube Fittings (1/4MNPT->1/8BF) | McMaster-Carr, IL, USA | 5463K439 | 1 pack (10) |
| Barbed Tube Fittings (1/8MNPT->1/8BF) | McMaster-Carr, IL, USA | 5463K438 | 2 pack (10) |
| Barbed Tube Fittings (1/8MNPT->1/16BF) | McMaster-Carr, IL, USA | 5463K4 | 2 pack (10) |
| Barbed Tube Fittings (1/4MNPT->1/4BF) | McMaster-Carr, IL, USA | 5670K84 | 1 |
| Hex head plug | McMaster-Carr, IL, USA | 48335K152 | 1 |
| Air pressure regulator, air filter and flowmeters | (Quantity needed) | ||
| Labatory gas drying unit | W A HAMMOND DRIERITE CO LTD, OH, USA | Model: L68-NP-303; stock #26840 | 1 |
| Multitube frames for 150 mm flowtubes | Cole-Parmer, IL, USA | R03215-30 | 1 |
| Multitube frames for 150 mm flowtubes | Cole-Parmer, IL, USA | R03215-76 | 1 |
| 150 mm flowtubes | Cole-Parmer, IL, USA | R-03217-15 | 9 |
| Valve Cartridge | Cole-Parmer, IL, USA | R-03218-72 | 9 |
| Precision Air regulator | McMaster-Carr, IL, USA | 6162K13 | 1 |
| Soleniod valves | Automate Scientific, Berkeley, CA | 02-10i | 4 |
| Solenoid valve controller | ValveLink 8.2, Automate Scientific, Berkeley, CA | 01-18 | 1 |
| Electronic flow meter | Honeywell | AWM3100V | 1 |
| DAQ (NI USB-6009, National Instruments) and a | National Instruments | NI USB-6009 | 1 |
| Power supply | Extech Instruments | 382200 | 1 |
| Odor chambers | |||
| Polypropylene Wide Mouth jar 2 oz; 60 ml | Nalgene | 562118-0002 | At least 5 are required per experiment, but a separate chamber is required for each dillution of each odorant. Available at Container Store, part #635114) |
| Glass odor chamber, 0.25 oz | Sunburst Bottle | LB4B | At least 5 are required per experiment |
| "In" valve for odor chamber | Smart Products, Inc., CA, USA | 214224PB-0011S000-4074 | 1 of these parts is used per odor chamber but they need to be replaced frequently |
| "Out" valve for odor chamber | Smart Products, Inc., CA, USA | 224214PB-0011S000-4074 | 1 of these parts is used per odor chamber but they need to be replaced frequently |
| O ring | RT Dygert International, MN, USA | AS568-029 Buna-N O-R | 1 pack (100) |
| Fly arena, camera and behavior boxes | (Quantity needed) | ||
| Behavior and camera box material | Interstate plastics, CA, USA | ABS black extruded (https://www.interstateplastics.com/Abs-Black-Extruded-Sheet-ABSBE~~ST.php) | 1803 sq inch |
| Teflon for fly arena and odor chamber inserts, 3/8" thick, 12" x 12" | McMaster-Carr, IL, USA | 8545K27 | 1 |
| Glass plates, 1/8" Thick, 9" x 9" | McMaster-Carr, IL, USA | 8476K191 | 2 |
| Dual action thermoelectric controller | WAtronix Inc, CA, USA | DA12V-K-0 | 1 |
| IR LED array | Advanced Illumination, Rochester, VT, USA | AL4554-88024, PS24-TL | 2 LED arrays and one power supply |
| Air conditioner Unit | Melcor Store | MAA280T-12 | 1 |
| Imaging system | (Quantity needed) | ||
| Cosmicar/Pentax C21211TH (12.5 mm F/1.4) C-mount Lens | B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA | PEC21211 KP | 1 |
| CCXC-12P05N Interconnect Cable | B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA | SOCCXC12P05N | 1 |
| DC-700 Camera Adapter | B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA | SODC700 | 1 |
| B+W 40,5 093 IR filter | B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA | 65-072442 | 1 |
| TiFFEN 40.5 mm Circular polarizer | Amazon | 1 | |
| IR Videocamera | Industrial Vision Source, FL, USA | Sony XC-EI50 (SY-XC-E150) | 1 |
| USB video converter | The Imagingsource, NC, USA | DFG/USB2-It | 1 |
| iFlySpy2 (fly tracking software) | Julian Brown, Stanford, Calfornia: julianrbrown@gmail.com | iFlySpy2 | 1 |
| IC Capture 2.2 software | The Imagingsource, NC, USA (http://www.theimagingsource.com/en_US/products/software/iccapture/) | ||
| Miscellaneous | (Quantity needed) | ||
| Dremel rotary tool | Dremel, Racine, WI, USA | Dremel 8000-03 | 1 |
| Diamond-coated drill bits for glass cutting | Available from various suppliers; MSC industrial Supply Co, Melville, NY | 90606328 | 1 |
References
- Benzer, S. Behavioral mutants of Drosophila isolated by countercurrent distribution. Proc Natl Acad Sci U S A. 58 (3), 1112-1119 (1967).
- Thorpe, W. H. Further studies on pre-imaginal olfactory conditioning in insects. Proc R Soc B. 127 (848), 424-433 (1939).
- Tully, T., Quinn, W. G. Classical conditioning and retention in normal and mutant Drosophila melanogaster. J Comp Physiol A. 157 (2), 263-277 (1985).
- Anholt, R. R., Mackay, T. F. Quantitative genetic analyses of complex behaviours in Drosophila. Nat Rev Genet. 5 (11), 838-849 (2004).
- Vosshall, L. B. Into the mind of a fly. Nature. 450 (7167), 193-197 (2007).
- Wu, M. N., Koh, K., Yue, Z., Joiner, W. J., Sehgal, A. A genetic screen for sleep and circadian mutants reveals mechanisms underlying regulation of sleep in Drosophila. Sleep. 31 (4), 465-472 (2008).
- Dankert, H., Wang, L., Hoopfer, E. D., Anderson, D. J., Perona, P. Automated monitoring and analysis of social behavior in Drosophila. Nat Methods. 6 (4), 297-303 (2009).
- Branson, K., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. High-throughput ethomics in large groups of Drosophila. Nat Methods. 6 (6), 451-457 (2009).
- Aso, Y., et al. Mushroom body output neurons encode valence and guide memory-based action selection in Drosophila. Elife. 3, e04580 (2014).
- Pfeiffer, B. D., et al. Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (28), 9715-9720 (2008).
- Pfeiffer, B. D., et al. Refinement of tools for targeted gene expression in Drosophila. Genetics. 186 (2), 735-755 (2010).
- Venken, K. J., et al. Genome engineering: Drosophila melanogaster and beyond. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. , (2015).
- Diao, F., et al. Plug-and-play genetic access to drosophila cell types using exchangeable exon cassettes. Cell Rep. 10 (8), 1410-1421 (2015).
- Lin, C. C., Prokop-Prigge, K. A., Preti, G., Potter, C. J. Food odors trigger Drosophila males to deposit a pheromone that guides aggregation and female oviposition decisions. Elife. 4, (2015).
- Pettersson, J. An aphid sex attractant. Insect Systematics & Evolution. 1 (1), 63-73 (1970).
- Semmelhack, J. L., Wang, J. W. Select Drosophila glomeruli mediate innate olfactory attraction and aversion. Nature. 459 (7244), 218-223 (2009).
- Vet, L. E. M., Lenteren, J. C. V., Heymans, M., Meelis, E. An airflow olfactometer for measuring olfactory responses of hymenopterous parasitoids and other small insects. Physiological Entomology. 8 (1), 97-106 (1983).
- Faucher, C., Forstreuter, M., Hilker, M., de Bruyne, M. Behavioral responses of Drosophila to biogenic levels of carbon dioxide depend on life-stage, sex and olfactory context. J Exp Biol. 209 (Pt 14), 2739-2748 (2006).
- Katsov, A. Y., Clandinin, T. R. Motion processing streams in Drosophila are behaviorally specialized. Neuron. 59 (2), 322-335 (2008).
- Gao, X. J., et al. Specific kinematics and motor-related neurons for aversive chemotaxis in Drosophila. Curr Biol. 23 (13), 1163-1172 (2013).
- Gao, X. J., Clandinin, T. R., Luo, L. Extremely sparse olfactory inputs are sufficient to mediate innate aversion in Drosophila. PLoS One. 10 (4), e0125986 (2015).
- Ronderos, D. S., Lin, C. C., Potter, C. J., Smith, D. P. Farnesol-detecting olfactory neurons in Drosophila. J Neurosci. 34 (11), 3959-3968 (2014).
- Riabinina, O., et al. Improved and expanded Q-system reagents for genetic manipulations. Nat Methods. 12 (3), 219-222 (2015).
- Lundstrom, J. N., Gordon, A. R., Alden, E. C., Boesveldt, S., Albrecht, J. Methods for building an inexpensive computer-controlled olfactometer for temporally-precise experiments. Int J Psychophysiol. 78 (2), 179-189 (2010).
- Colinet, H., Renault, D. Metabolic effects of CO2 anaesthesia in Drosophila melanogaster. Biology Letters. 8 (6), 1050-1054 (2012).
- Ramdya, P., et al. Mechanosensory interactions drive collective behaviour in Drosophila. Nature. 519 (7542), 233-236 (2015).
- Ofstad, T. A., Zuker, C. S., Reiser, M. B. Visual place learning in Drosophila melanogaster. Nature. 474 (7350), 204-207 (2011).
- Beshel, J., Zhong, Y. Graded encoding of food odor value in the Drosophila brain. J Neurosci. 33 (40), 15693-15704 (2013).
- Steck, K., et al. A high-throughput behavioral paradigm for Drosophila olfaction - The Flywalk. Sci Rep. 2, 361 (2012).
- Thoma, M., Hansson, B. S., Knaden, M. High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm. J. Vis. Exp. (106), (2015).
- Claridge-Chang, A., et al. Writing memories with light-addressable reinforcement circuitry. Cell. 139 (2), 405-415 (2009).
- Parnas, M., Lin, A. C., Huetteroth, W., Miesenbock, G. Odor discrimination in Drosophila: from neural population codes to behavior. Neuron. 79 (5), 932-944 (2013).
