Abstract
Een belangrijke uitdaging in de neurobiologie is te begrijpen hoe neurale circuits functioneren passende dier gedrag leiden. Drosophila melanogaster is een uitstekend modelsysteem voor deze onderzoeken als gevolg van de complexe gedragingen, krachtige genetische technieken, en compact zenuwstelsel. Laboratorium behavioral assays zijn lang gebruikt met Drosophila om de eigenschappen van de natuurlijke omgeving te simuleren en bestuderen van de neurale mechanismen die ten grondslag liggen aan de bijbehorende gedrag (bijv phototaxis, chemotaxis, zintuiglijke leren en geheugen) 1-3. Met de recente beschikbaarheid van grote collecties van transgene Drosophila lijnen die specifieke neurale subsets label, hebben gedragsproblemen assays genomen op een prominente rol voor neuronen te koppelen aan gedrag 4-11. Veelzijdig en reproduceerbare paradigma, tezamen met de onderliggende computationele routines voor gegevensanalyse, onontbeerlijk voor snelle tests kandidaat vlieglijnen diverse genotypes. Bijzonder geschikt zijn opstellingen die flexibel in het aantal geteste dieren, duur van experimenten en de aard van de aangeboden stimuli. De test van keuze ook genereren reproduceerbare data die gemakkelijk te verkrijgen en te analyseren. Hier presenteren wij een gedetailleerde beschrijving van een systeem en protocol voor het testen gedragsreacties van Drosophila vliegt in een grote vier-veld arena. De opstelling wordt hier gebruikt om responsen van vliegen naar een olfactorische stimulus testen; echter, de zelfde opstelling worden gewijzigd om meervoudige geur, visuele of optogenetic stimuli of een combinatie van deze testen. De olfactometer setup registreert de activiteit van vliegen bevolking te reageren op geuren, en computationele analysemethoden worden toegepast op fly gedrag te kwantificeren. De verzamelde gegevens worden geanalyseerd om een snelle uitlezing van een experimenteel run, die essentieel is voor een efficiënte verzamelen van gegevens en het optimaliseren van de experimentele omstandigheden te krijgen.
Introduction
Het vermogen zich aan te passen en te reageren op de externe omgeving is van cruciaal belang voor het voortbestaan van alle dieren. Een dier moet gevaren te vermijden, op zoek gaan naar voedsel en vind stuurlieden, en te leren van eerdere ervaringen. Sensorische systemen functioneren van verschillende stimuli, zoals visuele, chemische en mechanosensorische ontvangen en deze signalen naar het centrale zenuwstelsel worden uitgelegd en gedecodeerd. De hersenen stuurt vervolgens de juiste motor gedrag op basis van de waargenomen omgeving, zoals op zoek naar voedsel of ontsnappen uit een roofdier. Begrijpen hoe sensorische systemen detecteren de buitenwereld, en hoe de hersenen decodeert en stuurt beslissingen, is een grote uitdaging in de neurobiologie.
Drosophila melanogaster is een krachtig modelsysteem voor het onderzoeken hoe neurale circuits gids gedrag. Behalve dat eenvoudig en goedkoop te handhaven, Drosophila vertonen veel verschillende, complexe stereotype gedrag, maar doen dit met een compact zenuwstelsel van ongeveer 100.000 neuronen. Krachtige genetische technieken bestaan voor het manipuleren van het Drosophila genoom en duizenden transgene lijnen werden gegenereerd die selectief en reproduceerbaar dezelfde subsets van neuronen 10-13 labelen. Deze transgene lijnen kunnen worden gebruikt om selectief de activiteit van de gelabelde neuronen (activeren of remmen) te manipuleren en deze manipulaties kunnen worden gebruikt om te onderzoeken hoe de neurale helpfuncties gedrag.
Meerdere gedrags assays ontwikkeld voor het bestuderen van verschillende Drosophila gedrag. Drosophila, zoals veel dieren gebruiken hun reukzin voor het geleiden vele gedragskeuzes, zoals het vinden van voedsel, partners vinden, en het vermijden van gevaar. Reukzin is daarom een goede sensorische systeem voor het onderzoeken welke externe stimuli worden gedetecteerd en geïnterpreteerd door het zenuwstelsel van een dier om de juiste keuzes te leiden. Aldus worden een aantal testen ontwikkeld voor ONDERZOEKTing larven en volwassen olfactorische gedrag. Traditioneel, olfactorische gedrag in Drosophila werden bepaald door twee keuze T-doolhof paradigma, dat kan worden gebruikt voor het bepalen aangeboren en aangeleerd gedrag olfactorische 3. In deze assay worden ongeveer 50 vliegen de keuze tussen twee buizen: één buis bevat de betrokken geur en de andere bevat een sturing geurstof (meestal de geur oplosmiddel). De vliegen krijgen een bepaalde tijd om een keuze te maken, en dan is het aantal vliegen die in de verschillende kamers worden geteld. Hoewel de T-doolhof is een eenvoudige test voor veel experimenten, zijn er verschillende beperkingen. Zo worden olfactorische gedrag gemeten op één tijdstip, en andere keuzes vóór dit tijdstip worden verwijderd. Ook de individuele gedrag van de vliegen in de populatie worden verwaarloosd. Bovendien, de T-doolhof vereist handmatige telling van vliegen, die fouten kunnen voeren. Tot slot, aangezien er slechts twee keuzen gemeten, ditvermindert de statistische power vaak nodig om subtiele gedragsveranderingen te detecteren. Een alternatief voor een twee-choice T-doolhof is een vier-kwadrant (vier-veld) olfactometer 14-18. In deze test, dieren verkennen een arena waarin elk van de vier hoeken van de arena is gevuld met een potentiële bron van geodoriseerde lucht. De arena heeft een gebobbeld stervorm om de vorming van vier experimenteel gedefinieerde geur kwadranten te maximaliseren. Indien een geur wordt geleverd in een van de hoeken dan enkel is opgenomen, dat één kwadrant. Het gedrag van de dieren kan worden gevolgd als ze binnenkomen en verlaten van de geur kwadrant, en gemakkelijk in vergelijking met hun gedrag in de drie controle kwadranten. De vier-kwadrant olfactometer assay dus dossiers ruimtelijke en temporele behavioral reactie op de geur stimuli over een groot experimenteel arena.
De vier kwadranten olfactometer werd ontwikkeld door Pettersson et al. 15 en Vet et al. 17 aan de ol onderzoekenfabriek gedragsreacties van individuele parasitaire wespen. Faucher et al. 18 en Semmelhack en Wang 16 aangepast aan de setup van de olfactorische reacties van individuele Drosophila bewaken. De vier-kwadrant olfactometer is even gevoelig voor aantrekkende en afstotende reacties, waardoor een groot aantal testen geurstoffen en condities. -Maat geschreven fly tracking software, ontwikkeld door Alex Katsov 19 en momenteel onderhouden door Julian Brown (beschreven in Materials), introduceerde extra voordelen aan meer recente implementaties van de vier-kwadrant olfactometer 14,20-23. Het is nu mogelijk om te testen op 100 vliegen tegelijkertijd aan hoge spatiale (27,5 pixels / cm) en temporele (30 frames per seconde) resolutie, die toelaat extraheren verschillende parameters, zoals positie, snelheid en versnelling van vliegen op elk tijdstip. Dit maakt onderzoek naar de dynamiek van gedragsreacties de vliegen om geuren 20 tabel Materials), dezelfde configuratie maakt flexibel volgen periodes kunnen worden gebruikt om vliegen spoor tot 24 uur door middel van beelden met een lagere framesnelheid. Deze optie werd gebruikt voor het leggen van eieren gedrag van vliegen te bestuderen en hun lichaamshoudingen vergelijken met ovipositional voorkeuren 14. De vier-veld olfactometer kan ook worden gebruikt om reacties te bestuderen multimodale (bijvoorbeeld geur en visuele) stimuli, of optogenetic 9 of 21 thermogenetische stimulatie combineren met presentaties van sensorische stimuli. Bovendien is de hoge temporele resolutie kan extractie van trajecten for elke individuele fly in het ensemble dataset. Daarom is de methode maakt het mogelijk onderzoek naar olfactorische-begeleide bevolking gedrag en ook de individuele sociale interacties. De opbrengst van deze analysegegevens zijn robuust en zeer reproduceerbaar, waardoor het gebruik van de vier-veld olfactometer gedrags- schermen.
We beschrijven hier de setup assemblage voor een vier-kwadrant olfactometer. We verder het gebruik ervan bij het bepalen olfactorische aantrekkingskracht als reactie op appelazijn en afstoting in reactie op sterk geconcentreerde ethylpropionaat tonen. Tenslotte beschrijven we en geven typisch code voor de analyse van de geregistreerde vlieg trackinggegevens.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Setup Assembly
- Vervaardiging van de stervormige arena (19,5 cm bij 19,5 cm bij 0,7 cm) van polytetrafluorethyleen (PTFE) volgens het tekening (aanvullende materialen, SupplementalSketch_StarShapedArena.pdf). De arena kan worden vervaardigd door een commerciële of een aangepaste installatie.
- Verwerven twee glasplaten (20,25 cm bij 20,25 cm met een dikte van 2 mm) en een gat (~ 0,7 cm in diameter) precies in het midden van één van de glasplaten met een gediamanteerde boor.
- Vervaardiging van een lichtdichte gedrag doos voor de gedrags-arena. Ook de vervaardiging van een lichtdichte camera doos voor de infrarood CCD videocamera volgens de verstrekte tekeningen (aanvullende materialen, SupplementalSketch_LightTightBox.pdf). De boxen kunnen worden vervaardigd door een commerciële of een aangepaste installatie.
- Monteer de airconditioner aan de achterwand en de LED-reeksen aan de zijwanden van de doos gedrag. Plaats de temperatuursensorin de doos gedrag door middel van een kant gat voor real time temperatuur feedback en aanpassing (zie figuren 1 en 2 voor details).
- Bevestig de IR-filter en circulaire polarisator aan de camera, en monteer de montage in het vak camera. Het gedrag doos en camera box worden gescheiden door een glazen venster voor een betere temperatuurregeling van de box gedrag (zie figuren 1 en 2 voor details).
- Sluit de infrarood CCD camera op een camera adapter. Sluit de camera aan op een USB-converter. Sluit de USB-converter aan op een USB-poort van de computer voor data-acquisitie.
- Installeer de driver voor de video-omzetter op de computer volgens de instructies van de fabrikant. Optioneel, installeer image processing software die door de fabrikant van de USB-video-omzetter voor toegang tot een breder scala van camera-instellingen en acquisitie parameters.
- Sluit de airconditioner unit (door middel van "output"Op de rug van temperatuurregelaar) en de temperatuursensor (via" thermokoppel "op de rug van temperatuurregelaar) aan de temperatuurregelaar. Plaats de sonde in de doos gedrag.
Opmerking: De temperatuurregeling in onze inrichting kan worden gehandhaafd geven temperatuur tussen 18 ° C en 30 ° C is. Hogere of lagere omgevingstemperaturen kan nuttig zijn voor thermogenetische (dTrpA1, TRPM8 of shibire ts) zijn experimenten om neuronale activiteit te manipuleren of te remmen synaptische transmissie. Voor de meeste experimenten wordt de temperatuur op 25 ° C. - Monteer de geur levering systeem in de volgende stappen (zie figuur 1B voor gedetailleerde schema's en aansluiting hulpstukken):
- Gebruik de lucht drukregelaar om de lucht input van de centrale lucht systeem te bedienen. Sluit een carbon luchtfilter (gevuld met houtskool) naar de drukregelaar om de lucht te zuiveren van de centrale eenir systeem.
- Monteer de flow control systeem, bestaande uit meerdere kanalen geregeld door een hoge resolutie flowmeter buizen.
- Verbind de uitgang van de koolstof luchtfilter de stroommeter buizen via een verdeler zoals getoond in Figuur 1B en 2F. Richt de uitgang van de stroommeter buizen met elektronisch geregelde 3-weg magneetafsluiters te regelen als schone lucht die de stroommeters in de kamer wordt uitgezet of in maat geur kamers 24 ingevoerd.
- Installeer de solenoïdeklep controller volgens de handleiding van de fabrikant.
- Installeer de elektronische luchtstroom meter door aan te sluiten op een data-acquisitie-inrichting (DAQ) en een voeding volgens de handleiding van de fabrikant. Installeer de DAQ-interface software om gelijke debieten controleren in elk kwadrant van de arena voor elk experiment.
2. Olfactorische Stimuli Voorbereiding
- Bereid 5 geurmier kamers 24 die bestaan uit een plastic buitenste container, glas innerlijke container, een op maat gemaakte PTFE deksel insert, originele verpakking deksel met centrale deel verwijderd, en twee one-way kleppen.
Opmerking: Een O-ring om de PTFE deksel kan worden gebruikt om luchtlekkage vanuit de kamer tijdens geur geur perfusie voorkomen. Zie figuur 1 voor schema en Figuur 2 voor foto's van de kamers. - Gebruik vier geurstof kamers voor oplosmiddelcontroles, en één kamer voor een test geurstof. Vul het glazen recipiënten met 1000 pi oplosmiddel of geurstof verdunning (test geurstoffen + geschikte oplosmiddelen, meng goed voor experimenten), plaatst u de glazen container in de bijbehorende plastic kamer (niet morsen uit de vloeistof in de plastic kamer) en draai het deksel . Zorg ervoor dat u altijd gebruik maken van een schone kamer voor de test geurstof en oplosmiddel controles.
Opmerking: Olfactorische aantrekkelijkheid kan worden veroorzaakt door 1/16 verdunning van appelazijn (5% zuurgraad) in water. Daarentegen kan olfactorische afstoting gedrag bestudeerd door een 10% verdunning van ethylpropionaat in minerale olie. Controle stimuli in deze gevallen zijn geur kamers met zuivere minerale olie.
3. Fly Voorbereiding
- Achter vliegt op standaard maïsmeel medium. Plaats 30 mannelijke en 30 vrouwelijke ouderlijke vliegen in een standaard fles, en laat ze eieren leggen voor 5 dagen bij 25 ° C of kamertemperatuur.
- Voor elk experiment, verzamelt Bijlage In recent (<1 dag oud) 25 mannelijke en 25 vrouwelijke vliegen onder korte CO 2 verdoving.
- Houd vliegen in een flacon met standaard fly medium voor 2-4 dagen.
- 40-42 uur voor het experiment, de overdracht van de vliegen zonder CO 2 verdoving een flesje met ~ 10 ml 1% agarose gel. Dit zal de vliegen bevochtigd zonder voedsel, waardoor hun locomotorische activiteit te verhogen houden.
Opmerking: Meer dan 90% van de vliegen zou de hongerdood te overleven. Sommige genotypes zijn minder te genezenthy en kunnen het niet door een 40 uur honger. In die gevallen kortere periodes, zoals 24-28 uur acceptabel zijn, maar moet voor alle proefomstandigheden en herhalingen worden gehouden.
4. Behavioral Reacties op Aantrekkelijk en Repellent Geuren
- Schakel de temperatuurregelaar en zet deze op 25 ° C.
- Sluit de geurstof kamers (controle en test geurstoffen) door de buis met de uitlaat van odorant kamer en de push-to-connect fitting op de doos gedrag.
- Debiet in elk kwadrant door de luchtstroom meter om te controleren of de controle- en geurstof luchtstromen gelijk aan 100 ml / min.
- Maak de PTFE fly arena en de glasplaten met 70% ethanol 2-3 keer en hen in staat stellen om volledig aan de lucht drogen (~ 3-4 min).
- Bevestig de glasplaten naar de arena met klemmen.
- Transfer vliegen zonder CO 2 verdoving in de arena door het gat in een van de glasplaten. achteruiter de overdracht plaats een cirkelvormige gaas op het gat om vliegen voorkomen ontsnappen.
Noot: CO 2 anesthesie is aangetoond dat Drosophila gedrag 25 beïnvloeden en moeten niet worden gebruikt binnen 24 uur van een gedragsexperiment. - Plaats de arena met vliegen in de lichtdichte kamer, sluit de vier controle luchtstromen door het aansluiten van de slang aan de push-to-connect fitting op het gedrag vak aan de arena hoeken, sluit de deur van de kamer en wacht 10- 15 min te laten de vliegen wennen aan de nieuwe omgeving. Indien mogelijk, schakel de lichten uit in de kamer waar de experimenten worden uitgevoerd, om eventuele minimale licht lekken, dat kan vertekening van de experimentele resultaten te vermijden.
- Voer een 5-10 min controle-experiment, waarbij vliegen worden blootgesteld aan 4 controle luchtstromen.
- Analyseer de gegevens onmiddellijk (zie Data-analyse hieronder) om ervoor te zorgen dat de vliegen gelijkmatig verdeeld zijn in de arena, en de attractie Index is dichtbijop 0. Deze stap is noodzakelijk, omdat het gecontroleerd of er geen ongecontroleerde bronnen van voorkeur of vermijding in de arena (bijvoorbeeld lekkende licht van buitenaf, ongelijkmatige temperatuurverdeling, ongelijke arena, geurcontaminatie, etc.). Als de vliegen ongelijk verdeeld zijn of hun bewegingsactiviteit laag is, gooi de vliegen, weer schoon de arena (Stap 4.4) en het gebruik van een nieuwe partij van vliegen om het experiment te herhalen.
- Sluit de test geurstof kamer naar de setup door het inschakelen van de 3-weg kleppen of opnieuw aansluiten van de connector buizen.
- Run-test experiment gedurende 5-10 min en analyseren van de gegevens zoals besproken in paragraaf 5 hieronder (zie ook referentie 14 en figuur 3). Opnamen langer dan 20 min kan leiden tot gegevensbestanden die moeilijk berekenings proces kan zijn. Als langer experimentele opnamen gewenst zijn, snel stoppen en opnieuw beginnen met het volgen programma. Dit leidt tot een ~ 10 sec verschil tussen experimentele opnamen.
- Discard vliegen.
- Clean arena en glazen platen met 70% ethanol (stap 4.4), en vervang connector buizen binnen de lichtdichte behuizing. Om experimenten te versnellen, kan een nieuwe schone arena worden gebruikt, en de vuile arena schoongemaakt, terwijl het uitvoeren van experimentele runs.
- Run ander experiment met een nieuwe partij van vliegen, indien nodig. Als er meerdere experimenten worden uitgevoerd op dezelfde dag, neem uiterste zorg om ervoor te zorgen dat er geen geurstof wordt achtergelaten in het systeem van een vorige test. Dit is meestal geen probleem met lage concentraties van geurstoffen of CO 2, maar hooggeconcentreerde stimuli tot 24 uur spleet tussen experimentele runs nodig zijn. Bovendien kunnen alle buizen na de stroomsnelheid buizen worden vervangen als geurstof worden vermoed bij controle-experimenten. Laat altijd de droge lucht op tussen de experimenten om continu te spoelen van het systeem
5. Data Analysis
Opmerking: De voorgestelde vlieg volgen overname software (beschreven in Materials), tracks vliegen in real time tijdens de overname, en slaat de tijdstempel en de coördinaten van alle gedetecteerde vliegen in * .dat formaat. We hebben een op maat gemaakte Matlab routine om de gegevens om te zetten in een Matlab-formaat, en om de gegevens te analyseren ontwikkeld. Code voorbeelden worden in aanvullende materialen, maar de details van de uitvoering zal afhangen van de gebruikte software voor data-acquisitie.
- Laad de ruwe data. Maak een ruimtelijk masker dat de contouren van de arena volgt en het masker van toepassing op de ruwe gegevens om alle gegevens punten die buiten de arena dalen als zij vertegenwoordigen ruis (figuur 4A, Aanvullende Code MaskSpatialFiltering.m, Score.m, DrawCircularMask verwijderen. m).
- Verwijder alle gegevens punten die bewegen met een snelheid onder de 0,163 cm / s voor langer dan 3 seconden, omdat deze gegevens is waarschijnlijk ruis of gegenereerd door niet-bewegende vliegen (figuur 4B, Aanvullende Code TemporalFiltering.m) zijn.
- Visualiseer resterende gegevenspunten door ze uit te plotten in een keer of als enkele trajecten (Figuur 3, Aanvullende Code SingleTrajectoryViewer.m).
Opmerking: De locatie van geur grenzen vier-veld waarschijnlijk afhankelijk van een aantal factoren, zoals de kenmerken van iedere geurstof en de luchtdebieten gebruikt. Zo zal zeer vluchtige geurstoffen waarschijnlijk vul de geur kwadrant vollediger dan minder volatiel geurstoffen. Het is dus waarschijnlijk dat iedere geurstof iets andere geur grenzen kunnen vertonen. Het gebruik van een foto-ionisatie detector geur grenzen meten kan problematisch zijn als het gebruik van een vacuüm om lucht monster van een bepaalde plek, en dus verstoort de geurstof concentratie op die plek. Toch kan de geur grenzen snel worden geschat op basis van fly behavioural data. Bijvoorbeeld kan een geur grens gebaseerd op gecumuleerd fly tracks in reactie op verschillende geuren duidelijk worden waargenomen in figuren 3C en 3D. - Calkeningen een attractie index om te bepalen of controle-experimenten te genereren geen voorkeur respons, en ook om toegang te krijgen tot de reactie op een geurstof (of optogenetic 9) stimulus. Om een attractie Index (AI) te berekenen, gebruikt u de laatste 5 minuten van een controle- of testopname. Een maatregel aantrekkingskracht die tussen 1 (absolute attractie) en -1 (absolute afstoting) te verkrijgen, wordt de volgende formule gebruikt om de AI berekenen:
waarbij N test het aantal gegevenspunten in de test kwadrant, N besturing is het gemiddelde aantal gegevenspunten in de drie controlegroepen kwadranten. Deze maatregel is intuïtief als geen voorkeur door bijna nul waarden zouden worden vermeld. Dit betekent echter niet correct aan de verhouding van het totale aantal vliegen die zich in het kwadrant geurstof. Om deze maatregel te verkrijgen, kan een percentage index (PI) worden gebruikt:![vergelijking 2]("/files/ftp_upload/54346/54346eq2.jpg")
waarbij N test het aantal gegevenspunten in de test kwadrant en N totaal is het aantal datapunten in alle vier kwadranten. Deze formule levert een maat die tussen 0 en 1, met 0,25 overeenkomt met onbestaande gedragsmatige voorkeur (figuur 3E en 4C, aanvullende code AttractionIndex.m). - Run 5-10 herhalingen van elke experimentele conditie, met behulp van een nieuwe groep van vliegen voor elke herhaling. Vergelijk de aantrekkingskracht indexen tussen voorwaarden of tegen controles door het gebruik van de Kolmogorov-Smirnov niet-parametrische testen (figuur 3F, kstest2 functie in Matlab).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De vier-kwadrant olfactometer assay registreert en analyseert de lopende activiteiten van veel vliegen over een groot behavioral ruimte. Geurstoffen kunnen worden ingebracht in de lucht-stromen die één, twee, drie of alle vier kwadranten voeren. Aangezien geuren, zal de vliegen vrij bewegen tussen de vier kwadranten. Dit gedrag is van cruciaal belang om te observeren omdat het aangeeft dat de VN-opzettelijke vertekeningen zijn niet opgenomen in de test. Deze vooroordelen kunnen omvatten licht, temperatuur schommelingen, verschillen in luchtstroom, of geur verontreinigingen. Figuur 3B toont de gedragsreacties in de vier-kwadrant olfactometer van 25 mannelijke en 25 vrouwelijke vliegt aan de lucht drogen. Een enkele fly-track van de verzamelde gegevens wordt ook benadrukt in Figuur 3B, en toont aan dat deze vlieg is het verkennen van de hele behavioral arena. De aantrekkingskracht index score (AI) voor alle geanalyseerde tracks over de 5-min testperiode dicht bij 0, indicating een gebrek aan aantrekkingskracht uit op de geur kwadrant. Ook het percentage index (PI) van het experiment is 0,24, wat aangeeft dat vliegen vrij zelfs in alle vier kwadranten in de 5 min testperiode werden verspreid.
De vier-veld gedragsreactie een aantrekkelijke geurstof wordt getoond in figuur 3C. Appelciderazijn wordt in de luchtstroom van linksboven geur kwadrant luchtstroom door het plaatsen van een 6,25% verdunning van appelazijn in de test geur kamer. De verzamelde fly tracks grijs weergegeven tonen aan dat de meeste vliegen verzamelen in dit kwadrant geur, en niet langer alle vier kwadranten te verkennen. Een enkele gekleurde vlieg spoor toont aan dat zodra een vlieg komt in de appelazijn geur-kwadrant, neigt in de aantrekkelijke geur kwadrant te blijven. De AI van 0,94 voor het experiment is bijna 1 aangeeft sterke aantrekkingskracht van deze geurstof. De PI van 0,92 geeft aan dat 92% van de vliegen remained in de geur kwadrant tijdens de onderzochte periode.
De vier-veld gedragsreactie een insectenwerend geurstof wordt getoond in figuur 3D. Een 10% verdunning van de geurstof ethylpropionaat geplaatst in een geur kamer werd gebruikt als geurbron de luchtstroom linksboven. De massale fly tracks voor de geanalyseerde experiment aantonen vermijden van de geur kwadrant, suggestief van geur geleide afstoting. Een enkele gekleurde vlieg spoor toont aan dat een vlieg, als het ging de geur kwadrant snel draaide zich om de geur kwadrant voorkomen. De AI van -0,68 lager is dan 0, wat aangeeft afstoting, en ligt dicht bij -1, indicatief voor een sterke weerzinwekkende geurstof reactie. De PI van 0,06 voor het experiment suggereert dat slechts 6% (vergeleken met ~ 25% in de neutrale geur experimenten) van het gevolgde vlieg gegevenspunten werden gevonden in het kwadrant geur in de loop van het experiment.
Figuur 3E schema de relatie tussen AI en PI scores, en hoe deze getallen betrekking aantrekkelijk of afstotend gedrag.
De vier-veld assay levert robuuste en reproduceerbare olfactorische gedrag. Dit maakt kwantitatieve vergelijkingen tussen controle en experimentele omstandigheden zoals getoond in figuur 3F, en ook maakt de identificatie van subtiele olfactory reacties die afwijken van neutraliteit.
Zoals de gegevens verkregen bij een hoge ruimtelijke en temporele resolutie, is het mogelijk een groot aantal factoren gedragsreacties, zoals trajecten van enkele vliegen bestuderen (zie figuur 3), en kenmerkend verschillende dynamiek activiteit van de vliegen in een geur veld (bijvoorbeeld, veranderingen in richting en snelheid 19,20).
Het kan vaak moeilijk zijn de vier-veld arena positie in exact dezelfde locatie voor elk experiment, vooral omdat frequent reinigen van de arena vereist. Het ontvangen analyses scripts compensatie van deze kleine variaties door eerst de data fitting zoals getoond in figuur 4A. In dit geval wordt de vorm van de vier-veld arena berekend en gegevenspunten die buiten deze ruimte liggen verwijderd. Deze bijgehouden objecten vertegenwoordigen vaak debris of reflecties die ten onrechte worden bijgehouden. Aangezien zij niet in de arena liggen en dus ruis vertegenwoordigt, is het belangrijk dat deze punten worden verwijderd om te voorkomen foutieve gegevens analyseert. Evenzo is het ook belangrijk om tracked gegevenspunten die kunnen vertegenwoordigen ruis of stilstaande vliegen in de arena verwijderen. Hiervoor wordt een analyse script gebruikt (en hier aanwezig) die gegevenspunten die in hoofdzaak niet bewegen (zie figuur 4B) verwijdert. Deze gegevens bevinden zich gewoonlijk in de minderheid, maar hun retentie leidt tot fouten bij analyses.
Aantrekkingskracht index en preferente index scores worden berekend na een bepaalde periode (bijvoorbeeld aan het einde van een 5 min experiment zie figuur 3). Er zij opgemerkt dat, aangezien vliegen worden gevolgd met een hoge ruimtelijke en temporele resolutie, kunnen soortgelijke analyses worden uitgevoerd gedurende het experiment. Dit isfiguur 4C waarin de attractie Index Percentage Index scores worden berekend continue 10-seconden bakken over de periode. Een dergelijke analyse maakt een betere beoordeling van olfactorische veranderingen die optreden gedurende het experiment, zoals gewenning aan een geurstof.
Figuur 1:. Schema van de vier-kwadrant olfactometer (A) Het gedrag opstelling bestaat uit een geur afgiftesysteem verwarmingselement (niet in diagramvorm getoond), beeldverkrijgingstelsel (IR LED en IR CCD-camera verbonden met een computer), vier-kwadrant arena en lichtdichte gedrag en arena dozen. De rode cirkels duiden de corresponderende componenten uit figuur 2 (B) Gedetailleerd ontwerp van de geur afgiftesysteem. De groene letters vertegenwoordigen de verbinding / conversie maten fittings. Buizen van 1/16 ID en 1/8 OD worden gelabeld in het geel terwijl die van 1/8 en 1/4 ID OD worden gelabeld in het roze. Afkortingen: IR, infrarood; CF, Compression Montage; BF, Barbed Fitting, MNPT, Man National Pipe Thread. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2:. Foto's van de Olfactorische Assay Setup (A) Wide-field view camera doos en gedrag box. (B) Mening binnen de doos gedrag. De temperatuursonde, verbindingsbuizen en IR LED arrays aangeduid. (C) Vier-kwadrant arena. (D) groothoek Gezien de geur afgiftesysteem verbonden met de doos gedrag. De camera box is verwijderd om de CCD camera te onthullen. (E (F) Voorbeeld van de geur buizen aangesloten op het verdeelstuk. (G) met een hoge resolutie stromingsbuizen reguleren van de luchtstroom. (H) De geur levering buis en aansluitingen stroomafwaarts van de meetbuis toezichthouders. (I) De magneetventielen regelen als schone lucht door een geur kamer wordt doorgegeven of verdreven naar de kamer. (J) De geur kamers worden verbonden eenrichtingskleppen en een binnenste glazen container voor de geurstof bevatten. (K) Het gedrag doos bevat buiten de push-to-connect armaturen die verbinding maken met de geur levering buis. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4:. Voorbeeld gegevens die door de gegevensanalyse Stappen (A) Ruimtelijke filtering van de gegevens, uitgevoerd door MaskSpatialFiltering.m gegevenspunten die buiten de arena vallen te verwijderen. Rode cirkels tonen uitgangsposities van de cirkels die worden gebruikt om de grenzen van de arena definiëren. Zwarte cirkels zijn de laatste posities, verworven door het aanbrengen van de cirkel schetst om de gegevens (grijs gearceerde gebied binnen de vier-veld). Rode stippen en zwarte pijlpunten geven datapunten uit de dataset na deze filtratiestap worden verwijderd. (B) Tijdelijke filtering van gegevens, uitgevoerd door TemporalFiltering.m. Dit filter verwijdert de stap van data punten die bewegen heel sloWLY of helemaal niet, omdat ze waarschijnlijk worden gegenereerd door niet-bewegende vliegen of door vuil / reflecties van de arena. Een rode stip, omringd door een gestippelde rode vakje geeft posities van ~ 6000 datapunten met identieke coördinaten die zullen worden verwijderd door deze filtering stap. (C) attractie Index (AI) en Percentage Index (PI), berekend op de 10-sec bakken over de laatste 5 minuten van een experiment van AttractionIndex.m. Tijdelijke profielen van deze indices bevatten informatie over de dynamiek van gedragsreacties en kan worden gebruikt voor een gedetailleerde analyse van gedragingen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De vier-veld olfactometer beschreven is een veelzijdig gedragssysteem voor het bestuderen van de olfactorische reactie van grote populaties van wildtype en mutante Drosophila vliegt. Elk experiment duurt ~ 1 uur (inclusief setup, experimentele runs en schoonmaak), en 4-6 experimenten kunnen routinematig elke dag worden uitgevoerd. Een typische test met behulp 40-50 vliegen gedurende 5 minuten genereert ongeveer 450.000 bijgehouden gegevenspunten voor analyse. De beschreven configuratie kan ook worden gebruikt, mits kleine, ontwikkeling van andere insecten of insectenlarven bewaken in reactie op olfactorische of andere zintuiglijke prikkels gedurende een tijdsperiode variërend van minuten tot dagen. De vier-kwadrant test is gevoelig voor de effecten van zowel aantrekkende en afstotende stimuli. De meeste geurstoffen genereren aantrekkingskracht indexen (AI) tussen -0,9 en 0,9 (vergelijking 1). Een AI in het traject van 0,5-1 betekent aantrekkingskracht gedrag van de vliegen op de stimuli, terwijl AI in het bereik van -0,5 tot -1veroorzaakt door sterke insectenwerende middelen. In het algemeen moet een neutrale reactie van controle geuren (droge lucht, vochtige lucht, minerale olie) tussen 0,1 en -0,1 vallen. De AI vaak verandert in de loop van de test experiment, als gevolg van de tijd vliegt nodig hebben om te lopen in de geurstof pluimen, initiële aantrekking en toename van de bewegingsactiviteit in de richting van een nieuwe impuls, en de uiteindelijke desensibilisatie in reactie op de stimulus. Pretest controleproeven essentieel, en moet voorzichtig worden uitgevoerd om te waarborgen dat vliegen gelijkmatig in de arena verspreid in afwezigheid van de gewenste stimulus.
Meest voorkomende oorzaken van de ruimtelijke vooringenomenheid van vliegen in de arena zijn: ongelijk luchtstromen, mogelijk als gevolg van verbroken slang of onvoldoende geklemd glasplaten van de stervormige arena (in onze ervaring, vliegen kunnen verschillen van de luchtstroom van slechts sporen 15 ml / min); ongelijke temperatuurdistributie langs de arena, die kunnen worden verbeterd door deair conditioner eenheid zwakker en diffuse luchtstroom en / of langere periode vóór de overname (~ 20 min) te genereren om de temperatuur van de arena te verzekeren zelfs; minimale licht lekkage door de temperatuursensor opening, die kan worden verminderd door het afdichten van de opening met zwarte tape; residuele geur in de arena of het luchttoevoersysteem, waarbij de opstelling (arena, meetbuizen, bekleding van de lichtdichte behuizing, etc.) moeten grondig gereinigd en drogen gedurende enkele dagen of vervangen indien mogelijk.
Onderhoud van de olfactorische materiaal is belangrijk voor een betrouwbare en consistente resultaten. Push-to-connect armaturen op de doos gedrag en de luchtinlaten en de binnenwanden van de arena moet worden schoongemaakt met ethanol na elk experiment als sterke geuren worden gebruikt en mag volledig drogen. De glasplaten dient driemaal gewassen met 70% ethanol, wat meestal voldoende residuele geur en vervuiling van de platen te verwijderen, maar hexaan bruikbaarbij het verwijderen van organische verbinding afgezet door vliegen (bijvoorbeeld feromonen die bestaat uit lange koolwaterstofketens). Zeep is over het algemeen niet aan te raden, omdat het meestal bevat aromatische componenten, die van invloed zou zijn olfactorische gedrag. Het gedrag box moet aangesloten blijven op de droge luchtinlaten tussen experimenten (bijvoorbeeld 's nachts) om verwijdering van de resterende geuren uit het systeem te vergemakkelijken.
Als de bewegingsactiviteit van de vliegen laag is, kunnen zij te weinig datapunten, wat vaak resulteert in een lawaaierige en variabele attractie Index genereren. Langere honger en opnametijd kan helpen dit probleem op te lossen. Als daarentegen de vliegen ziek, 24-28 h honger zou in het algemeen voldoende voor het verhogen van voortbeweging activiteit zolang het consistent experimenten. Er is een goede balans tussen het behoud van een gezonde toestand van de vliegen en het verhogen van de motoriek. 40 uur verhongering kan worden gebruikt als uitgangspunt, en later gemodificeerdnodig op basis van de experimentele resultaten. Aantrekkelijkheid Indexes zal enigszins worden beïnvloed door de duur van de honger, dus is het essentieel om alle proefdieren voor dezelfde periode van tijd om de verstorende gevolgen van de honger tijd voorkomen verhongeren. Langere verhongering tijden meestal weerzinwekkend reacties zwakker (dichter bij 0), en aantrekkelijke reacties sterker. Droge lucht control luchtstromen neiging om de vliegen uitdrogen, en mag niet worden gebruikt langer dan 40 min.
De vier-kwadrant olfactometer kan worden gebruikt om responsen van één of meerdere 16,18 vliegt bestuderen om een stimulus of de keuze voorkeur tussen stimuli bestuderen. Zo kunnen verschillende geuren worden gebruikt in elk van de vier kwadranten. Dit kan ook worden gebruikt om de reacties op geur-mengsels bepaald door onderzoek van de grenzen van de geur-kwadranten. Opgemerkt wordt dat hoewel het volgsysteem kunnen afzonderlijke sporen te isoleren uit de verzamelde gegevens, ismogelijk dat individuele vliegen kunnen verschillend gedragen wanneer getest als onderdeel van een groep dan wanneer ze alleen worden getest. Zo vertonen groepen vliegen verhoogde geur geleid afstoting door fysieke interactie tussen 26 vliegen. Het volgsysteem en inrichting kan ook worden aangepast voor gebruik in niet-olfactorische assays. De test raamwerk kan gemakkelijk geschikt voor een LED-array 9 voor optogenetic stimulatie, of een thermische plaat 27 voor thermogenetics. Het systeem kan ook worden aangepast om gedragskeuzes een tijdschaal van vele hr bestuderen, bijvoorbeeld om eierleggende gedrag 14 bestuderen. In dit geval, de verwerving framesnelheid moet worden aangepast aan het genereren van grote gegevensbestanden, en een bron van vocht en het substraat (1% agarose gel) voorkomen moet worden verschaft als eierleggende substraat.
Een beperking van deze opstelling is dat de vliegen worden bijgehouden als IR-reflecterende objecten in en onder de Arena-als een element van een optogenetic ofthermogenetische experiment weerspiegelt IR, de irrelevante gegevens punten nodig heeft tijdens post-processing te worden verwijderd. Momenteel is het ook niet mogelijk om vliegen filmen met een ruimtelijke resolutie waarmee verschillende vliegen continu onderscheiden, maar dit kan in de toekomst worden verbeterd door meer geavanceerde videocamera's. Een andere beperking van het huidige systeem is dat de beweging van vliegen wordt beperkt tot twee dimensies te wandelen gedrag te bevorderen, en wordt voorkomen dat olfactorische-geïnduceerde vlucht reacties.
Opgemerkt wordt dat aanvullende geautomatiseerde assays zijn ontwikkeld om de olfactorische gedrag van enkele of groepen van vliegen onderzoeken. De meest soortgelijk ontwerp als de hier beschreven test is een methode ontwikkeld door Beshel en Zhong 28. In deze assay worden de reacties van ~ 30 vliegen gecontroleerd een kleine cirkelvormige arena (ongeveer een kwart het gebied van de vier-veld arena) waarin geuren worden vanuit 1 van 4 geur poorten langs de arena wall en verwijderd door een gat in het midden van de cirkelvormige arena. Naast een kleinere arena, andere design verschillen omvatten gedrag wordt uitgevoerd onder lichte omstandigheden, en geurstoffen vooral concentreren in de buurt van de geur poorten (in plaats van de hele geurstof kwadrant zoals aangegeven door de gebobbeld muren van de vier-veld arena). Niettemin, de cirkelarena een geschikte werkwijze voor het screenen olfactorische reacties van vliegen en kan worden aangepast aan de hier beschreven vlieg bijhouden ontwerp.
Een alternatieve benadering is om tegelijkertijd de activiteit van veel alleenstaande vliegen bewaken in reactie op geuren. In de Flywalk test worden afzonderlijke vliegen geplaatst in kleine buisjes en hun reacties gevolgd als geurstoffen worden geperfuseerd door de buis 29,30. Veranderingen in voorwaartse of achterwaartse richting, of veranderingen in de snelheden kan worden gebruikt om te meten of een geurstof in het algemeen aantrekkelijk of afstotende. Deze test, net als de vier-veld test, volgt automatisch fly movements, en dus kan worden gebruikt om snel meten olfactorische reacties op een breed scala van geuren. Anders dan het vier-veld, complexe motorische dynamiek, zoals traject draaihoeken en mogelijke sociale interacties, misschien missen in de Flywalk opname assay.
Automatisch volgen van enkele lopen vliegen is ook aangepast aan een T-doolhof het type assay 31,32. In deze test worden vliegen geplaatst in kleine kamers waar geuren worden doorbloed van beide uiteinden van de kamer, en uitgang via een haven in het midden van de kamer. De posities van de vliegen worden ook automatisch bijgehouden. Deze bootst, op een enkele vlieg schaal, een T-doolhof kader. In combinatie met optogenetics is deze test is bijzonder geschikt voor het analyseren van neurale circuits bemiddelen olfactorische leren en geheugen, en kan ook worden gebruikt om de olfactorische voorkeuren van afzonderlijke vliegen meten. Soortgelijke Flywalk, kan niet controleren complexe dynamiek activiteit die optreden over grotere ruimtelijke gebiedenZoals die welke optreden gedurende levensmiddelen die 14 of gedragingen die alleen voorkomen in vliegenpopulatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Air delivery system | (Quantity needed) | ||
| Tubing and connectors | |||
| Thermoplastic NPT(F) Manifolds | Cole-Parmer, IL, USA | R-31522-31 | 1 |
| Hex reducing nipple (1/4MNPT->1/8MNPT) | McMaster-Carr, IL, USA | 5232T314 | 1 |
| Tubing (ID:1/8) | McMaster-Carr, IL, USA | 5108K43 | 50 Ft |
| Tubing (ID:1/16) | McMaster-Carr, IL, USA | 52355K41 | 100 Ft |
| Barbed tube fittings | McMaster-Carr, IL, USA | 5117K71 | 1 pack |
| Push-to-connect tube fittings | McMaster-Carr, IL, USA | 5779K102 | 4 |
| Barbed Tube Fittings (1/4MNPT->1/8BF) | McMaster-Carr, IL, USA | 5463K439 | 1 pack (10) |
| Barbed Tube Fittings (1/8MNPT->1/8BF) | McMaster-Carr, IL, USA | 5463K438 | 2 pack (10) |
| Barbed Tube Fittings (1/8MNPT->1/16BF) | McMaster-Carr, IL, USA | 5463K4 | 2 pack (10) |
| Barbed Tube Fittings (1/4MNPT->1/4BF) | McMaster-Carr, IL, USA | 5670K84 | 1 |
| Hex head plug | McMaster-Carr, IL, USA | 48335K152 | 1 |
| Air pressure regulator, air filter and flowmeters | (Quantity needed) | ||
| Labatory gas drying unit | W A HAMMOND DRIERITE CO LTD, OH, USA | Model: L68-NP-303; stock #26840 | 1 |
| Multitube frames for 150 mm flowtubes | Cole-Parmer, IL, USA | R03215-30 | 1 |
| Multitube frames for 150 mm flowtubes | Cole-Parmer, IL, USA | R03215-76 | 1 |
| 150 mm flowtubes | Cole-Parmer, IL, USA | R-03217-15 | 9 |
| Valve Cartridge | Cole-Parmer, IL, USA | R-03218-72 | 9 |
| Precision Air regulator | McMaster-Carr, IL, USA | 6162K13 | 1 |
| Soleniod valves | Automate Scientific, Berkeley, CA | 02-10i | 4 |
| Solenoid valve controller | ValveLink 8.2, Automate Scientific, Berkeley, CA | 01-18 | 1 |
| Electronic flow meter | Honeywell | AWM3100V | 1 |
| DAQ (NI USB-6009, National Instruments) and a | National Instruments | NI USB-6009 | 1 |
| Power supply | Extech Instruments | 382200 | 1 |
| Odor chambers | |||
| Polypropylene Wide Mouth jar 2 oz; 60 ml | Nalgene | 562118-0002 | At least 5 are required per experiment, but a separate chamber is required for each dillution of each odorant. Available at Container Store, part #635114) |
| Glass odor chamber, 0.25 oz | Sunburst Bottle | LB4B | At least 5 are required per experiment |
| "In" valve for odor chamber | Smart Products, Inc., CA, USA | 214224PB-0011S000-4074 | 1 of these parts is used per odor chamber but they need to be replaced frequently |
| "Out" valve for odor chamber | Smart Products, Inc., CA, USA | 224214PB-0011S000-4074 | 1 of these parts is used per odor chamber but they need to be replaced frequently |
| O ring | RT Dygert International, MN, USA | AS568-029 Buna-N O-R | 1 pack (100) |
| Fly arena, camera and behavior boxes | (Quantity needed) | ||
| Behavior and camera box material | Interstate plastics, CA, USA | ABS black extruded (https://www.interstateplastics.com/Abs-Black-Extruded-Sheet-ABSBE~~ST.php) | 1803 sq inch |
| Teflon for fly arena and odor chamber inserts, 3/8" thick, 12" x 12" | McMaster-Carr, IL, USA | 8545K27 | 1 |
| Glass plates, 1/8" Thick, 9" x 9" | McMaster-Carr, IL, USA | 8476K191 | 2 |
| Dual action thermoelectric controller | WAtronix Inc, CA, USA | DA12V-K-0 | 1 |
| IR LED array | Advanced Illumination, Rochester, VT, USA | AL4554-88024, PS24-TL | 2 LED arrays and one power supply |
| Air conditioner Unit | Melcor Store | MAA280T-12 | 1 |
| Imaging system | (Quantity needed) | ||
| Cosmicar/Pentax C21211TH (12.5 mm F/1.4) C-mount Lens | B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA | PEC21211 KP | 1 |
| CCXC-12P05N Interconnect Cable | B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA | SOCCXC12P05N | 1 |
| DC-700 Camera Adapter | B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA | SODC700 | 1 |
| B+W 40,5 093 IR filter | B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA | 65-072442 | 1 |
| TiFFEN 40.5 mm Circular polarizer | Amazon | 1 | |
| IR Videocamera | Industrial Vision Source, FL, USA | Sony XC-EI50 (SY-XC-E150) | 1 |
| USB video converter | The Imagingsource, NC, USA | DFG/USB2-It | 1 |
| iFlySpy2 (fly tracking software) | Julian Brown, Stanford, Calfornia: julianrbrown@gmail.com | iFlySpy2 | 1 |
| IC Capture 2.2 software | The Imagingsource, NC, USA (http://www.theimagingsource.com/en_US/products/software/iccapture/) | ||
| Miscellaneous | (Quantity needed) | ||
| Dremel rotary tool | Dremel, Racine, WI, USA | Dremel 8000-03 | 1 |
| Diamond-coated drill bits for glass cutting | Available from various suppliers; MSC industrial Supply Co, Melville, NY | 90606328 | 1 |
References
- Benzer, S. Behavioral mutants of Drosophila isolated by countercurrent distribution. Proc Natl Acad Sci U S A. 58 (3), 1112-1119 (1967).
- Thorpe, W. H. Further studies on pre-imaginal olfactory conditioning in insects. Proc R Soc B. 127 (848), 424-433 (1939).
- Tully, T., Quinn, W. G. Classical conditioning and retention in normal and mutant Drosophila melanogaster. J Comp Physiol A. 157 (2), 263-277 (1985).
- Anholt, R. R., Mackay, T. F. Quantitative genetic analyses of complex behaviours in Drosophila. Nat Rev Genet. 5 (11), 838-849 (2004).
- Vosshall, L. B. Into the mind of a fly. Nature. 450 (7167), 193-197 (2007).
- Wu, M. N., Koh, K., Yue, Z., Joiner, W. J., Sehgal, A. A genetic screen for sleep and circadian mutants reveals mechanisms underlying regulation of sleep in Drosophila. Sleep. 31 (4), 465-472 (2008).
- Dankert, H., Wang, L., Hoopfer, E. D., Anderson, D. J., Perona, P. Automated monitoring and analysis of social behavior in Drosophila. Nat Methods. 6 (4), 297-303 (2009).
- Branson, K., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. High-throughput ethomics in large groups of Drosophila. Nat Methods. 6 (6), 451-457 (2009).
- Aso, Y., et al. Mushroom body output neurons encode valence and guide memory-based action selection in Drosophila. Elife. 3, e04580 (2014).
- Pfeiffer, B. D., et al. Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (28), 9715-9720 (2008).
- Pfeiffer, B. D., et al. Refinement of tools for targeted gene expression in Drosophila. Genetics. 186 (2), 735-755 (2010).
- Venken, K. J., et al. Genome engineering: Drosophila melanogaster and beyond. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. , (2015).
- Diao, F., et al. Plug-and-play genetic access to drosophila cell types using exchangeable exon cassettes. Cell Rep. 10 (8), 1410-1421 (2015).
- Lin, C. C., Prokop-Prigge, K. A., Preti, G., Potter, C. J. Food odors trigger Drosophila males to deposit a pheromone that guides aggregation and female oviposition decisions. Elife. 4, (2015).
- Pettersson, J. An aphid sex attractant. Insect Systematics & Evolution. 1 (1), 63-73 (1970).
- Semmelhack, J. L., Wang, J. W. Select Drosophila glomeruli mediate innate olfactory attraction and aversion. Nature. 459 (7244), 218-223 (2009).
- Vet, L. E. M., Lenteren, J. C. V., Heymans, M., Meelis, E. An airflow olfactometer for measuring olfactory responses of hymenopterous parasitoids and other small insects. Physiological Entomology. 8 (1), 97-106 (1983).
- Faucher, C., Forstreuter, M., Hilker, M., de Bruyne, M. Behavioral responses of Drosophila to biogenic levels of carbon dioxide depend on life-stage, sex and olfactory context. J Exp Biol. 209 (Pt 14), 2739-2748 (2006).
- Katsov, A. Y., Clandinin, T. R. Motion processing streams in Drosophila are behaviorally specialized. Neuron. 59 (2), 322-335 (2008).
- Gao, X. J., et al. Specific kinematics and motor-related neurons for aversive chemotaxis in Drosophila. Curr Biol. 23 (13), 1163-1172 (2013).
- Gao, X. J., Clandinin, T. R., Luo, L. Extremely sparse olfactory inputs are sufficient to mediate innate aversion in Drosophila. PLoS One. 10 (4), e0125986 (2015).
- Ronderos, D. S., Lin, C. C., Potter, C. J., Smith, D. P. Farnesol-detecting olfactory neurons in Drosophila. J Neurosci. 34 (11), 3959-3968 (2014).
- Riabinina, O., et al. Improved and expanded Q-system reagents for genetic manipulations. Nat Methods. 12 (3), 219-222 (2015).
- Lundstrom, J. N., Gordon, A. R., Alden, E. C., Boesveldt, S., Albrecht, J. Methods for building an inexpensive computer-controlled olfactometer for temporally-precise experiments. Int J Psychophysiol. 78 (2), 179-189 (2010).
- Colinet, H., Renault, D. Metabolic effects of CO2 anaesthesia in Drosophila melanogaster. Biology Letters. 8 (6), 1050-1054 (2012).
- Ramdya, P., et al. Mechanosensory interactions drive collective behaviour in Drosophila. Nature. 519 (7542), 233-236 (2015).
- Ofstad, T. A., Zuker, C. S., Reiser, M. B. Visual place learning in Drosophila melanogaster. Nature. 474 (7350), 204-207 (2011).
- Beshel, J., Zhong, Y. Graded encoding of food odor value in the Drosophila brain. J Neurosci. 33 (40), 15693-15704 (2013).
- Steck, K., et al. A high-throughput behavioral paradigm for Drosophila olfaction - The Flywalk. Sci Rep. 2, 361 (2012).
- Thoma, M., Hansson, B. S., Knaden, M. High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm. J. Vis. Exp. (106), (2015).
- Claridge-Chang, A., et al. Writing memories with light-addressable reinforcement circuitry. Cell. 139 (2), 405-415 (2009).
- Parnas, M., Lin, A. C., Huetteroth, W., Miesenbock, G. Odor discrimination in Drosophila: from neural population codes to behavior. Neuron. 79 (5), 932-944 (2013).
