Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Olfactory Behaviors analysert av Computer sporing av Published: August 20, 2016 doi: 10.3791/54346
Automatic Translation
1, 2, 1
1The Solomon H. Snyder Department of Neuroscience, Center for Sensory Biology, Johns Hopkins University School of Medicine, 2MRC Clinical Sciences Center, Imperial College London

Abstract

En sentral utfordring i nevrobiologi er å forstå hvordan nevrale kretser fungere å veilede aktuelle dyreatferd. Drosophila melanogaster er et utmerket modellsystem for slike undersøkelser på grunn av sin komplekse atferd, kraftige genetiske teknikker og kompakt nervesystemet. Laboratorieatferdsanalyser har lenge vært brukt med Drosophila å simulere egenskapene til det naturlige miljøet og studere nevrale mekanismene bak de tilsvarende atferd (f.eks phototaxis, chemotaxis, sensoriske læring og hukommelse) 1-3. Med den nylige tilgjengelighet av store samlinger av transgene Drosophila linjer som merke spesifikke nevrale undergrupper, har atferdsanalyser tatt på en fremtredende rolle for å knytte nevroner med atferd 4-11. Allsidige og reproduserbare paradigmer, sammen med de underliggende beregnings rutiner for dataanalyse, er uunnværlig for raske tester av kandidat snører med ulike genotypes. Spesielt nyttig er oppsett som er fleksible i det antall dyr som ble testet, varighet av forsøk og arten av presentert stimuli. Analysen av valget bør også generere reproduserbare data som er lett å skaffe og analysere. Her presenterer vi en detaljert beskrivelse av et system og protokoll for å analysere atferdsmessige reaksjoner av Drosophila fluer i en stor firefeltarena. Oppsettet er brukt her for å analysere svarene av fluer til en enkelt lukte stimulus; imidlertid, kan det samme oppsett bli modifisert for å teste flere olfaktorisk, visuelle eller optogenetic stimuli, eller en kombinasjon av disse. Den olfactometer oppsett registrerer aktiviteten til flue populasjoner reagerer på lukt, og beregnings analytiske metoder brukes for å kvantifisere flue atferd. De innsamlede dataene blir analysert for å få en rask utlesning av en forsøkskjøring, noe som er en forutsetning for effektiv datainnsamling og optimalisering av eksperimentelle betingelser.

Introduction

Evnen til å tilpasse seg og svare på det ytre miljø er avgjørende for overlevelsen av alle dyr. Et dyr må unngå farer, oppsøke mat og finne kamerater, og lære av tidligere erfaringer. Sensoriske systemer fungere for å motta en rekke stimuli, slik som visuell, kjemisk og mechanosensory, og sender disse signalene til sentralnervesystemet til å bli tolket og dekodet. Hjernen styrer deretter passende motor atferd basert på det som oppfattes som miljø, for eksempel i henhold til mat eller rømmer fra et rovdyr. Forstå hvordan sensoriske systemene oppdager den ytre verden, og hvordan hjernen dekoder og dirigerer beslutninger, er en stor utfordring i nevrobiologi.

Drosophila melanogaster er et kraftig modellsystem for å undersøke hvordan nevrale kretser guide atferd. Foruten å være enkel og billig å vedlikeholde, Drosophila oppviser mange varierte og komplekse stereotyp oppførsel, men likevel gjør det med et kompakt nervesystemet på om lag 100.000 neuroner. Kraftige genetiske teknikker finnes for å manipulere Drosophila genomet, og tusenvis av transgene linjer har blitt generert som selektivt og reproduserbart merke de samme undergrupper av nerveceller 10-13. Disse transgene linjer kan benyttes for selektivt å manipulere aktiviteten til de merkede nevroner (aktivere eller inhibere), og disse manipulasjoner kan bli brukt til å undersøke hvordan neurale funksjoner førings atferd.

Flere atferdsanalyser har blitt utviklet for å studere ulike Drosophila atferd. Drosophila, i likhet med mange dyr, bruke luktesansen for å styre mange atferdsmessige valg, for eksempel å finne mat, finne kamerater, og unngå farer. Luktesans er derfor en god sensorisk system for å undersøke hvordan ytre stimuli blir oppdaget og tolket av et dyrs nervesystemet til å veilede riktige valg. Som sådan, har en rekke analyser er utviklet for undersokelserting larve og voksen olfactory atferd. Tradisjonelt ble olfactory atferd hos Drosophila analysert ved en to-valg T-labyrint paradigme, som kan brukes for analyse av medfødt og lært olfactory atferd 3. I denne analysen er omtrent 50 fluer gitt et valg mellom to rør: en tube inneholder lukt aktuelle og den andre inneholder en styre odorant (vanligvis den luktende løsningsmiddel). Fluene er gitt en viss periode av tid til å gjøre et valg, og deretter antall fluer som er i de forskjellige kamrene telles. Selv om T-labyrint er en enkel analyse for mange forsøk, er det flere begrensninger. For eksempel er olfactory oppførsel måles ved bare ett tidspunkt, og forskjellige valg som er gjort før dette tidspunkt blir forkastet. Tilsvarende er de individuelle atferd av fluene i befolkningen neglisjert. I tillegg krever den T-labyrint manuell telling av fluer, som kan introdusere feil. Til slutt, siden det er bare to målte valg, dennereduserer den statistiske kraften ofte nødvendig for å oppdage subtile atferdsendringer. Et alternativ til et to-valg T-labyrint er en fire-kvadrant (fire-felt) olfactometer 14-18. I denne analysen, dyr utforske en arena hvor hver av de fire hjørnene av arenaen er fylt med en potensiell kilde til tilsatt luft. Arenaen har en rynket stjerneform for å maksimere dannelsen av fire eksperimentelt definerte lukt kvadranter. Hvis lukt tilføres i ett av hjørnene, så den inneholdt bare i at en kvadrant. Atferd av dyrene kan spores som de kommer inn og la lukt kvadranten, og lett i forhold til deres oppførsel i de tre kontroll kvadranter. De fire-kvadranten olfactometer analyse dermed poster romlig og tidsmessig atferds reaksjon på lukt stimuli enn en stor eksperimentell arena.

De fire-kvadranten olfactometer ble først utviklet av Pettersson et al. 15 og Vet et al. 17 for å undersøke olfabrikkatferdsmessige reaksjoner av enkelte parasittiske Hymenoptera. Faucher et al. 18 og Semmelhack og Wang 16 tilpasset oppsett for å overvåke olfactory svarene av individuell Drosophila. De fire-kvadrant olfactometer er like følsom for attraktive og frastøtende responser, noe som åpner for et bredt utvalg av test odoranter og tilstander. Skredder skrevet fly sporing programvare, utviklet av Alex Katsov 19 og for tiden vedlikeholdt av Julian Brown (beskrevet i Materials), innført ytterligere fordeler til nyere implementeringer av de fire-kvadranten olfactometer 14,20-23. Det er nå mulig å analysere opp til 100 fluer samtidig ved høy romlig (27,5 piksler / cm) og temporale (30 rammer per sekund) oppløsning, noe som gjør det mulig å ekstrahere ulike parametre, slik som posisjon, hastighet og akselerasjon av fluer som helst punkt. Dette gjør undersøkelser i dynamikken i de flyr "atferdsmessige reaksjoner på lukt 20 Materialer tabell), gjør det samme konfigurasjon fleksible sporing perioder, og kan brukes til å spore fluer i opptil 24 timer ved å ta bilder med en lavere bildefrekvens. Dette alternativet ble brukt til å studere egg-legging atferd av fluer og sammenligne sine kroppsstillinger med ovipositional preferanser 14. De fire felt olfactometer kan også brukes til å studere reaksjoner på multimodal (f.eks olfactory og visuelle) stimuli, eller å kombinere optogenetic 9 eller thermogenetic 21 stimulering med presentasjoner av sensoriske stimuli. Videre gir den høye tidsoppløsningen til utvinning av baner for hver enkelt flue i ensemblet datasettet. Derfor kan metoden etterforskningen luktstyrt befolknings atferd og også individuelle sosiale interaksjoner. De data som genereres av denne analysen er robust og svært reproduserbar, slik at for bruk av fire felt olfactometer for atferdsSkjermer.

Vi beskriver her oppsettet forsamlingen for en fire-kvadranten olfactometer. Vi viser videre bruk i analyse av lukte tiltrekning som svar på eple cider eddik og frastøtning som svar på svært konsentrert etylpropionat. Til slutt beskriver vi og gi eksempel kode for analyse av de registrerte flue sporingsdata.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Oppsett Assembly

  1. Produksjon den stjerneformede arena (19,5 cm x 19,5 cm x 0,7 cm) av polytetrafluoretylen (PTFE) i henhold til de angitte tegning (supplerende materiale, SupplementalSketch_StarShapedArena.pdf). Arenaen kan fremstilles ved en kommersielt eller et tilpasset anlegg.
  2. Erverve to glassplater (20,25 cm x 20,25 cm med tykkelse på 2 mm), og bore et hull (~ 0,7 cm i diameter) nøyaktig i midten av en av glassplatene ved hjelp av en diamantbelagt borkronen.
  3. Produserer et lystett oppførsel boksen for atferds arena. Produserer også en lystett kameraesken for det infrarøde CCD videokamera i henhold til de angitte tegninger (supplerende materiale, SupplementalSketch_LightTightBox.pdf). Boksene kan fremstilles ved en kommersielt eller et tilpasset anlegg.
  4. Monter klimaanlegg enheten på den bakre vegg og LED-matriser på sideveggene i boksen oppførsel. Plasser temperatursondei oppførselen boksen gjennom et sidehull for sanntids tilbakemelding temperatur og justering (se figur 1 og 2 for detaljer).
  5. Fest IR-filter og sirkulært polarisasjonsfilter til kameraet, og monter forsamlingen inn i kameraet boksen. Oppførselen boksen og kamera boks er atskilt med et glassvindu for bedre temperaturkontroll av oppførselen boksen (se figur 1 og 2 for detaljer).
  6. Koble infrarød CCD kamera til kamera adapter. Koble kameraet adapteren til en USB converter. Koble USB converter til en USB-port på datamaskinen for datainnsamling.
  7. Installer driveren for video converter på datamaskinen i henhold til produsentens instruksjoner. Eventuelt installere bildebehandling levert av produsenten av USB-video converter for å få tilgang til et bredere spekter av kamerainnstillinger og oppkjøps parametere.
  8. Koble klimaanlegg enheten (gjennom "output"På baksiden av temperaturregulatoren) og temperaturføler (gjennom" termoelement "på baksiden av temperaturregulatoren) til temperaturregulatoren. Plasser sonde inn i virkemåten boksen.
    Merk: temperaturkontrollsystem i vårt utformingen er i stand til å opprettholde temperaturen boksen mellom 18 ° C og 30 ° C. Høyere eller lavere temperaturer kan være nyttig for thermogenetic (dTrpA1, TrpM8 eller shibire ts) eksperimenter for å manipulere neuronal aktivitet eller hemmer synaptisk overføring. For de fleste eksperimenter, blir temperaturen opprettholdt ved 25 ° C.
  9. Monter lukt leveringssystemet i følgende trinn (se figur 1B for detaljerte skjemaer og tilkoblings beslag):
    1. Bruk lufttrykkregulatoren for å styre luftinngang fra den sentrale luftsystemet. Koble et karbonluftfilter (fylt med trekull) til trykkregulatoren for å rense luften fra den sentrale enir system.
    2. Montere strømningsreguleringssystem som består av flere kanaler som er regulert av strømningsmåler rør med høy oppløsning.
    3. Koble utgangen fra karbonluftfilteret til strømningsmåler rørene via en manifold som vist i figur 1B og 2F. Direkte utgang strømningsmåler rør gjennom elektronisk kontrollerte 3-veis magnetventiler for å regulere om ren luft forlater mengdemålere er utvist i rommet eller inngått skreddersydde lukt kamre 24.
    4. Monter magnetventil kontrolleren i henhold til produsentens manual.
  10. Installer elektronisk luft flow meter ved å koble den til en datainnsamlingsenhet (DAQ) og en strømforsyning i henhold til produsentens manual. Installer DAQ grensesnitt programvare for å kontrollere lik strømningshastighet i hver kvadrant av arenaen før hvert eksperiment.

2. Olfactory Stimuli Forberedelse

  1. Forbered fem luktmaur kamre 24 som består av en plast ytre beholder, glass innerbeholder, en skreddersydd PTFE lokk innsats, originalemballasje lokk med sentral del fjernet, og to enveisventiler.
    Merk: En O-ring rundt PTFE lokket kunne brukes for å hindre luftlekkasje fra kammeret under lukt lukt perfusjon. Se figur 1 for skjematisk og figur 2 for bilder av kamrene.
  2. Bruke fire odorant-kamre for løsningsmiddelkontrollprøver, og ett kammer for en test odorant. Fyll glassbeholdere med 1000 mL av løsemiddel eller odorant fortynning (test dufter + egnede løsemidler, bland godt før forsøkene), plasser glassbeholder inne i tilsvarende plastkammer (ikke søler ut væsken i plast kammer) og stram lokket . Sørg for å alltid bruke en ren kammer for testen odorant og løsemiddel kontroller.
    Merk: Olfactory tiltrekning kan utløses av 1/16 fortynning av eple cider eddik (5% surhet) i water. I motsetning til dette, kan olfactory frastøting oppførsel bli studert ved anvendelse av en 10% fortynning av etylpropionat i mineralolje. Kontroll stimuli i disse tilfellene er lukt kamre med ren mineralolje.

3. Fly Forberedelse

  1. Bakre flyr på standard cornmeal medium. Plasser 30 mannlige og 30 kvinnelige foreldre fluer i en standard flaske, og la dem legge egg i 5 dager ved 25 ° C eller romtemperatur.
  2. For hvert forsøk, samle nylig eclosed (<1 dag gammel) 25 mannlige og 25 kvinnelige fluer etter kort CO 2 anestesi.
  3. Hold fluer i et hetteglass med standard flue medium for 2-4 dager.
  4. 40-42 timer før forsøket, overføre fluene uten CO 2 anestesi   til en ampulle med ~ 10 ml 1% agarosegel. Dette vil holde fluene fuktede uten mat, noe som bidrar til å øke deres bevegelsesaktivitet.
    Merk: Mer enn 90% av fluene skal overleve sult. Noen genotyper er mindre helbrededin og kan ikke gjøre det gjennom et 40 timers sult. I slike tilfeller kortere perioder for eksempel 24-28 timer er akseptable, men bør holdes den samme for alle eksperimentelle betingelser og gjentar.

4. Behavioral Responses to Attraktiv og Repellent Dufter

  1. Slå på temperaturregulator og sett den til 25 ° C.
  2. Koble Odoranten kamre (kontroll og testluktstoffer) ved å sette inn slangen til utløpet av odorant kammer og push-to-connect montering på oppførselen boksen.
  3. Sjekk strømningshastigheten i hver kvadrant ved hjelp av luftstrømmen meter for å være sikker på at kontrollen og odorant airstreams er lik 100 ml / min.
  4. Rengjør PTFE fly arena og glassplater med 70% etanol 2-3 ganger og la dem fullt lufttørke (~ 3-4 min).
  5. Fest glassplatene til arenaen med klemmer.
  6. Overføring fluer uten CO2-anestesi inn i arenaen gjennom hullet i en av glassplatene. After overføringen, plassere en sirkulær mesh på hullet for å forhindre fluer fra å rømme.
    Merk: CO 2 anestesi har vist seg å påvirke Drosophila adferd 25 og bør ikke brukes i løpet av 24 timer av en atferdsmessig eksperiment.
  7. Plasser arena med flyr inn i lystett kammer, kobler de fire kontrollluftstrømmene ved å koble slangen festet til push-to-connect montering på oppførselen boksen til arena hjørner, lukk døren av kammeret og vente 10- 15 min å la fluene akklimatisere seg det nye miljøet. Hvis det er mulig, slå av lysene i rommet der forsøkene utføres, for å unngå mulig minimal lys lekkasje som kan skjevhet den eksperimentelle utfallet.
  8. Kjøre en 5-10 min kontrollforsøk, der fluene er utsatt for fire styreluftstrømmer.
  9. Analysere dataene umiddelbart (se data analyse nedenfor) for å sørge for at fluene er fordelt jevnt i arenaen, og den attraksjonen indeksen er nærttil 0. Dette trinn er viktig, da det bekrefter at det ikke finnes noen ukontrollerte kilder preferanse eller unngåelse innenfor arenaen (for eksempel lys som lekker fra utsiden, ujevn temperaturfordeling, ujevn arena, lukt forurensning, etc.). Hvis fluene er fordelt ulikt eller deres bevegelsesaktivitet er lav, kast fluene, rengjør arenaen igjen (trinn 4.4) og bruk en ny gruppe med fluer å gjenta eksperimentet.
  10. Koble test odoranten kammeret til oppsettet ved å bytte på 3-veis ventiler eller re-koble kontakten rør.
  11. Kjør test eksperiment for 5-10 min og analysere dataene som omtalt i punkt 5 nedenfor (se også Reference 14 og figur 3). Opptak lengre enn 20 minutter kan resultere i datafiler som kan være vanskelig å beregningsprosessen. Hvis lengre eksperimentelle opptak er ønsket, raskt stoppe opp og re-starte sporing program. Dette resulterer i en ~ 10 sek gap mellom eksperimentelle opptak.
  12. Discard fluer.
  13. Rene arena og glassplater med 70% etanol (trinn 4.4), og erstatte kontakten rør i lystett kabinett. For å påskynde eksperimenter, kan en ny ren arena brukes, og den skitne arena rengjort mens du utfører eksperimentelle går.
  14. Kjør et annet eksperiment med en ny gruppe med fluer, om nødvendig. Hvis flere eksperimenter blir drevet på samme dag, ta ekstrem forsiktighet for å sikre at ingen odoranten er igjen i systemet fra en tidligere testkjøring. Dette er vanligvis ikke et problem med lave konsentrasjoner av odoranter eller med CO 2, men for sterkt konsentrerte stimuli opp til en 24-timers mellomrom mellom eksperimentkjøringer kan være nødvendig. I tillegg kan alle slangen etter at strømningsrørene skiftes ut dersom odoranten forurensning er mistanke om kontrollforsøk. La alltid tørr luft på mellom eksperimenter for å kontinuerlig spyle systemet

5. Data Analysis

Merk: Den foreslåtte fly sporing oppkjøpet software (beskrevet i Materials), sporer fluer i sanntid under oppkjøpet, og sparer tid stempel og koordinatene til alle oppdagede fluer i * .dat format. Vi har utviklet en skreddersydd Matlab rutine å konvertere dataene til en Matlab-format, og å analysere dataene. Kode eksempler er gitt i supplerende materiale, men detaljene for gjennomføring vil være avhengig av programvare som brukes for datainnsamling.

  1. Last rådata. Lag en romlig maske som følger konturene av arenaen og bruke masken til rådata for å fjerne alle datapunkter som faller utenfor arenaen som de representerer støy (figur 4A, tilleggskode MaskSpatialFiltering.m, Score.m, DrawCircularMask. m).
  2. Fjern alle datapunkter som beveger seg med en hastighet under 0,163 cm / s i mer enn 3 sek, siden disse dataene er sannsynlig å være støy eller generert av ikke-bevegelige fluer (figur 4B, tilleggskode TemporalFiltering.m).
  3. Visualiser dataene som er igjenpoeng ved å plotte dem alle på en gang eller som enkelt baner (figur 3, tilleggskode SingleTrajectoryViewer.m).
    Merk: Plasseringen av lukt grenser i de fire felt sannsynligvis er avhengig av en rekke faktorer, slik som egenskapene til hver odorant og den luftmengde som brukes. For eksempel vil svært flyktige dufter sannsynlig fylle lukt kvadranten mer fullstendig enn mindre flyktige dufter. Således er det sannsynlig at hver odorant kan oppvise noe forskjellige lukt grenser. Bruken av en photoionization detektor for å måle lukt grenser kan være problematisk fordi det benytter et vakuum for å prøve luft fra et bestemt sted, og så forstyrrer odoranten konsentrasjon ved det punktet. Likevel kan lukt grensene raskt estimert basert på flueadferdsdata. For eksempel kan en lukt grense basert på kumulerte flue spor som respons på forskjellige lukt observeres tydelig på figurene 3C og 3D.
  4. Calformet, en attraksjon indeksen for å bestemme hvorvidt kontrollforsøk generere ingen preferanse respons, og også for å få tilgang til svar på en odorant (eller optogenetic 9) stimulus. For å beregne en attraksjon Index (AI), bruk siste 5 min av en kontroll eller test opptak. For å få et mål på attraksjon som faller mellom 1 (absolutt attraksjon) og -1 (absolutt frastøting), er følgende formel brukes til å beregne AI:
    ligning 1
    hvor N test er antallet datapunkter i testen kvadrant, er N kontroll det gjennomsnittlige antall datapunkter i de tre kontroll kvadranter. Dette tiltaket er intuitivt som ingen preferanse ville bli indikert med nær null verdier. Imidlertid, den ikke på riktig måte indikere hvor stor andel av det totale antall fluer som er plassert i odoranten kvadrant. For å oppnå dette målet, kan en Prosentvis Index (PI) brukes:
    ligning 2 hvor N test er antallet datapunkter i testen kvadrant, og N totale er det totale antall datapunkter i alle fire kvadranter. Denne formelen gir et tiltak som faller mellom 0 og 1, med 0,25 som tilsvarer ingen atferds preferanse (Figur 3E og 4C, tilleggskode AttractionIndex.m).
  5. Kjør 5-10 repetisjoner av hver eksperimentell tilstand, ved hjelp av en ny gruppe av fluer for hver rapport. Sammenlign tiltrekning indeksene mellom forhold eller mot kontrollene ved hjelp av Kolmogorov-Smirnov ikke-parametrisk test (figur 3F, kstest2 funksjon i Matlab).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De fire-kvadrant olfactometer analyse poster og analyserer walking aktiviteter av mange fluer over et stort atferds plass. Luktstoffer kan innføres i de luftstrømmer som går inn i en, to, tre eller alle fire kvadranter. I fravær av lukt, vil fluene fritt bevege seg mellom alle fire kvadranter. Denne virkemåten er viktig å observere som indikerer det at un-tilsiktet skjevheter ikke er blitt innført i analysen. Disse skjevheter kan omfatte lys, temperatursvingninger, forskjeller i luftstrømmen, eller lukt forurensninger. 3B viser de atferdsmessige responser i firekvadrant olfactometer av 25 mannlige og 25 kvinnelige flyr til tørr luft. En enkelt fly-spor fra de innsamlede dataene er også fremhevet i Figur 3B, og viser at denne flua var å utforske hele atferds arena. Tiltrekningen index score (AI) for alle de analyserte sporene over 5-min testperioden er nær 0, indikasjong en mangel på tiltrekning til lukt kvadrant. Likeledes, den prosentvise indeksen (PI) av forsøket er 0,24, noe som indikerer at fluer ble fordelt ganske jevn i alle fire kvadranter i løpet av 5-minutters testperioden.

De fire felt adferdsrespons til et attraktivt odorant er vist i figur 3C. Eplecider eddik innføres i luftstrømmen i   øverst til venstre lukt kvadranten luftstrømmen ved å plassere en 6,25% utvanning av eple cider eddik i testen lukt kammeret. De innsamlede fly spor vist i grått viser at de fleste fluer samle seg i denne lukt kvadrant, og ikke lenger utforske alle fire kvadranter. En ensfarget flue spor viser at når et fly kommer inn i eple cider eddik lukt-kvadranten, det har en tendens til å forbli i den attraktive lukt kvadrant. AI på 0,94 for forsøket er nær en som indikerer sterk tiltrekning til denne odorant. PI på 0,92 indikerer at 92% av fluene remained i lukt kvadrant i løpet av analyseperioden.

De fire felt adferdsrespons til et frastøtningsmiddel odorant er vist i Figur 3D. En 10% fortynning av odoranten etylpropionat plassert i et kammer lukt ble anvendt som kilde for lukt øvre venstre luftstrøm. De samlet seg flue spor for den analyserte eksperimentet demonstrerer unngå lukt kvadrant, som tyder på lukt-guidet frastøting. En ensfarget flue spor viser at en flue, da det gikk lukt kvadranten, snudde raskt unna for å unngå lukt kvadrant. Den kunstige intelligensen til -0,68 er mindre enn 0, som indikerer frastøting, og er nær -1, som indikerer en sterk frastøtende odorant respons. PI på 0,06 for forsøket tyder på at bare 6% (i forhold til ~ 25% i de nøytrale lukt eksperimentene) av de sporede fluedatapunktene ble funnet i den kvadrant lukt i løpet av forsøket.

Figur 3E diagrammer forholdet mellom AI og PI score, og hvordan disse tallene forholder seg til attraktive eller frastøtende atferd.

De fire-feltet analysen resulterer i robuste og reproduserbare olfactory atferd. Dette gjør det mulig for kvantitative sammenligninger mellom kontroll og eksperimentelle betingelser som vist i figur 3F, og også muliggjør identifisering av subtile olfactory svar som avviker fra nøytralitet.

Videre, ettersom dataene blir oppnådd ved høy romlig og tidsmessig oppløsning, er det mulig å studere en rekke faktorer av atferdsmessige responser, så som baner av enkelt fluer (som vist i figur 3), samt karakterisere ulike aktivitets dynamikken fluene i en lukt felt (for eksempel endringer i retning og hastighet 19,20).

Det kan ofte være vanskelig å plassere fire felt arena i nøyaktig samme sted i hvert eksperiment, spesielt siden hyppig rengjøring av arenaen er nødvendig. Den angitte analyser skript kompensere for disse små variasjoner ved først å tilpasse dataene som er vist i figur 4A. I dette tilfelle blir formen på fire-feltet arena beregnes, og datapunkter som ligger utenfor dette rom fjernes. Disse belte objektene representerer ofte debris eller refleksjoner som er feilaktig spores. Ettersom de ikke ligger innenfor arenaen, og således representerer støy, er det viktig at disse datapunkter er fjernet for å forhindre feilaktige dataanalyser. Tilsvarende er det også viktig å fjerne beltedrevne datapunkter som kan representere støy eller ikke-bevegelige fluer innenfor arenaen. For å oppnå dette, er en analyse script anvendt (og forutsatt her) som fjerner datapunkter som i hovedsak ikke beveger seg (som vist i figur 4B). Disse datapunkter er vanligvis i mindretall, men deres oppbevaring ville føre til feil i analysene.

Type indeks og preferanse indekspoengsummer kan beregnes etter en gitt tidsperiode (for eksempel ved slutten av en 5 min eksperiment som er vist på figur 3). Det bør imidlertid bemerkes at siden fluer er sporet med høy romlig og tidsmessig oppløsning, kunne lignende analyser bli utført gjennom hele eksperimentet. Dette ervist i figur 4C der attraksjon Oversikt og Prosentvis Index score er beregnet på kontinuerlig 10-sec binger over tidsperioden. En slik analyse gir bedre forståelse av olfactory endringer som kan oppstå gjennom hele forsøket, som tilvenning til en odorant.

Figur 1
Figur 1:. Skjematisk av de fire-kvadranten olfactometer (A) Oppførselen oppsett består av en lukt levering system, temperaturkontroll system (ikke vist på tegningen), image oppkjøpet system (IR LED lys og IR CCD kamera koblet til en datamaskin), fire-kvadranten arena og lystett atferd og arena bokser. De røde sirkler betegner de tilsvarende komponenter er vist i figur 2. (B) Detaljert utforming av luktavgivelsessystemet. De grønne tegn representerer forbindelse / konverterings størrelser av fittings. Rør av 1/16 ID og 1/8 OD er ​​merket med gult, mens de av 1/8 ID og 1/4 OD er ​​merket i rosa. Forkortelser: IR infrarød; CF, Compression Fitting; BF, Barbed Montering, MNPT, Male National Pipe Thread. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2:. Bilder av Olfactory analysen Setup (A) Wide-field visning av kameraesken og atferd boks. (B) Se inne atferden boksen. Temperaturen sonde, kontakt rør, og IR LED arrays er merket. (C) Fire-kvadranten arena. (D) Wide-field visning av lukt levering system koblet til atferden boksen. Kameraet boksen har blitt fjernet for å avdekke den CCD-kamera. (E (F) Eksempel på lukt rørene som er koblet til manifolden. (G) strømningsrørene Høyoppløselige regulere luftstrømmen. (H) Lukten levering rør og kontakter nedstrøms strømningsrørspolene regulatorer. (I) Magnetventilene regulere om ren luft føres gjennom et kammer eller lukt som slippes ut i rommet. (J) lukt kammerne er forbundet med en-veis ventiler, og inneholder en indre glassbeholder for odoranten. (K) Oppførselen boksen inneholder utenfor Push-to-connect beslag som kobles til lukt levering slangen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Eksempel data generert ved hjelp av en fire-felt Olfactory analyse (A) Skjematisk av firefeltarena.. (B) Nøytrale respons er observert når alle de fire kvadrantene inneholder kun tørr luft perfusjon. (C) Attraksjon svar på en 6,25% utvanning av eple cider eddik dynket fra venstre øvre kvadrant. (D) frastøtning atferd utløses av 10% etyl-propionat. I figur 2B-2D, er en enkelt bane fra det oppkjøpte data plottet. En farge gradient brukes til å betegne den tiden løpet av innspillingen, med blå og røde farger å være starten og slutten av opptakene, henholdsvis. (E) Sammenligning av Type Index (AI) og andelen Index (PI). (F) Gjennomsnittlig AIs av 3- 6 eksperimenter med ingen lukt (kontroll), Apple Cider eddik (ACV) og 10% etylpropionat (EP). Feilfelt indikerer SEM. Statistisk forskjell ble evaluert av Kolmogorov-Smirnov test. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4:. Eksempel data generert av dataanalysen Steps (A) Romlig filtrering av data, utført av MaskSpatialFiltering.m å fjerne datapunkter som faller utenfor arenaen. Røde sirkler viser utgangsstillinger av sirklene som brukes til å definere grensene til arenaen. Svarte sirkler er de endelige posisjoner, ervervet ved å montere sirkelen skisserer til dataene (grå skraverte området innenfor de fire-feltet). Røde prikker og svarte pilspisser indikerer datapunkter som vil bli fjernet fra datasettet etter dette filtrering trinn. (B) Temporal filtrering av data, utført av TemporalFiltering.m. Denne filtre trinnet fjerner datapunkter som beveger seg svært sloWLY eller ikke i det hele tatt, som de sannsynligvis vil bli generert av ikke-bevegelige fluer eller skitt / refleksjoner fra arenaen. En rød prikk omgitt av en stiplet rød boks indikerer stillinger ~ 6000 datapunkter med identiske koordinater som vil bli fjernet av denne filtrering trinn. (C) Type Index (AI) og Prosentvis Index (PI), beregnet i 10-sec kasser i løpet av de siste 5 min av et eksperiment ved AttractionIndex.m. Temporale profiler av disse indeksene inneholder informasjon om dynamikken i atferdsmessige reaksjoner, og kan brukes for detaljert analyse av atferd. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De fire-feltet olfactometer beskrevet her er et allsidig atferdssystem for å studere olfactory svarene av store bestander av villtype og mutant Drosophila fluer. Hvert eksperiment tar ~ 1 time (inkludert oppsett, eksperimentelle går, og rengjøring), og 4-6 eksperimenter kan rutinemessig utført hver dag. En typisk analyse ved bruk av 40-50 fluer i 5 minutter genererer tilnærmet 450000 sporet datapunkter for analyse. Den beskrevne konfigurasjon, kan også anvendes, med mindre modifikasjoner, for å overvåke bevegelsene til andre insekter eller insektlarver som reaksjon på olfaktorisk eller andre sensoriske stimuli i løpet av en tidsperiode, fra minutter til dager. De fire-kvadrant-analysen er følsomme for virkningene av både attraktive og frastøtende stimuli. De fleste odorants generere tiltrekning indekser (AI) mellom -0,9 og 0,9 (ligning 1). En AI i området fra 0,5 til 1 betegner sterk tiltrekning oppførsel av fluene til stimuli, mens AI i området fra -0,5 til -1 erutløst av sterke midler. Generelt sett bør en nøytral respons ved kontroll lukt (tørr luft, luftfuktighet, mineralolje) faller mellom 0,1 og -0,1. AI endres ofte i løpet av testen eksperiment, som gjenspeiler tiden flyr trenger for å gå inn i odorant fjær, innledende tiltrekning og økning på bevegelsesaktivitet mot en ny stimulans, og den endelige desensitization svar på stimulans. Pre-test kontroll kjører er viktig, og må utføres nøye for å sikre at fluene ble fordelt jevnt i arenaen i fravær av ønsket stimulus.

De hyppigste årsakene til romlig skjevhet av fluer i arenaen er: ujevn luftstrømmer, muligens på grunn av koblet slangen eller utilstrekkelig klampglassplater av den stjerneformede arena (i vår erfaring, fluer er i stand til å oppdage forskjeller i luftstrømmen fra så lite som 15 ml / min); ujevn temperaturfordeling over arenaen, som kan bli forbedret ved å setteklimaanlegget enhet for å generere svakere og mer diffuse luftstrøm og / eller lengre pre-oppkjøpet periode (~ 20 min) for å sikre jevn temperatur på arenaen; minimalt lys lekkasje gjennom temperatursonden åpning, som kan reduseres ved å forsegle åpningen med svart bånd; rest lukt i arenaen eller i luften levering system, i hvilket tilfelle oppsett (arena, strømningsrør, beslag av lystett kabinett, etc) må rengjøres grundig og lov til å tørke i flere dager eller erstattet der det er mulig.

Vedlikehold av lukte utstyr er viktig for pålitelig og konsistente resultater. Push-to-connect beslag på atferden boksen og luftinntakene og innervegger av arenaen bør rengjøres med etanol etter hvert eksperiment om sterk lukt blir brukt, og lov til å tørke helt. Glassplatene skal vaskes tre ganger med 70% etanol, noe som vanligvis er tilstrekkelig til å fjerne gjenværende lukt og skitt fra platene, men heksan er nyttigi å fjerne organisk forbindelse avsatt av fluer (f.eks feromoner som består av lange hydrokarbonkjeder). Såpe er generelt ikke anbefalt fordi det vanligvis inneholder aromatiske komponenter, noe som vil påvirke lukte atferd. Oppførselen boksen skal være koblet til de tørre luftinntakene mellom eksperimenter (f.eks over natten) for å lette fjerning av de gjenværende lukt fra systemet.

Dersom bevegelsesaktivitet av fluene er lav, kan de generere for få datapunkter, som ofte resulterer i en støyende og variabel Type Index. Lengre sult og opptakstider kan bidra til å løse dette problemet. I motsetning til dette, hvis fluene er syke, 24-28 h sult generelt vil være tilstrekkelig for å forsterke bevegelse aktivitet så lenge det er konsekvent gjennom eksperimenter. Det er en fin balanse mellom å opprettholde en sunn tilstand av fluer og økende bevegelse. 40 timers sulte kan brukes som et utgangspunkt, og senere modifisert sombehov basert på de eksperimentelle resultatene. Attraksjon avskriftene vil bli noe påvirket av varigheten av sult, og dermed er det viktig å sulte alle forsøksdyr for samme periode for å unngå konfunderende effekter av sult tid. Lengre sult ganger vanligvis gjør frastøtende svar svakere (nærmere 0), og attraktive svar sterkere. Tørr luft styreluftstrømmer har en tendens til å tørke ut fluer, og bør ikke brukes lenger enn 40 min.

De fire-kvadrant olfactometer kan anvendes for å studere reaksjoner av single 16,18 eller flere fluer til en enkelt stimulus eller for å studere valg preferanse mellom stimuli. For eksempel kan forskjellige lukter brukes i hver av de fire kvadranter. Dette kan også brukes til å bestemme reaksjonene på lukt-blandinger ved å undersøke grensene for den lukt kvadranter. Det skal bemerkes at selv om sporingssystemet gjør det mulig for individuelle spor for å bli isolert fra de innsamlede data, er detmulig at enkelte fluer kan oppføre seg forskjellig når analysert som en del av en gruppe enn når de blir testet alene. For eksempel, utviser grupper av fluer økt lukt guidet frastøting grunn av fysiske interaksjoner mellom fluer 26. System for sporing og layout kan også tilpasses for bruk i ikke-lukt analyser. Analysen rammeverket kan lett romme en LED-matrise 9 for optogenetic stimulering, eller en varmeplate 27 for thermogenetics. Systemet kan også være innrettet til å studere atferdsmessige valg av en tidsskala på mange timer, for eksempel for å studere eggleggingen oppførsel 14. I dette tilfellet, ervervet bildefrekvens må justeres for å unngå dannelse av store datafiler, og en kilde for fuktighet og substrat (1% agarosegel) må være anordnet som eggleggingen substrat.

En begrensning av dette oppsettet er at fluene er sporet som IR-reflekterende gjenstander i og under Arena hvis noe element av et optogenetic ellerthermogenetic eksperiment reflekterer IR, vil irrelevante datapunkter må fjernes i løpet av etterbehandling. Foreløpig er det heller ikke mulig å filme fluer i en romlig oppløsning som gjør at ulike fluer å være kontinuerlig skilles, men dette kan bli bedre i fremtiden ved å bruke mer avanserte videokameraer. En annen begrensning av dagens system er at bevegelsen av fluer er begrenset til to dimensjoner for å fremme gang atferd, og vil hindre lukte-indusert flight svar.

Det bør bemerkes at ytterligere automatiserte analyser har også blitt utviklet for å undersøke olfactory atferd av enkelt eller grupper av fluer. Den mest lik design til analysen beskrevet her er en metode utviklet av Beshel og Zhong 28. I denne analysen blir responsene til ~ 30 fluer overvåket i en liten sirkulær arena (omtrent en fjerdedel av arealet av fire felt arena) i hvilken lukt leveres fra en av fire lukt havner langs arenaen wall, og fjernes gjennom et hull i midten av den sirkulære arenaen. I tillegg til en mindre arena, andre design forskjeller inkluderer atferd blir utført i henhold til lysforhold, og dufter i hovedsak konsentrere seg nær lukt porter (i stedet for hele odorant kvadrant som anvist av de rynket veggene av firefeltarena). Ikke desto mindre er den sirkulære arena en egnet metode for screening av olfaktoriske respons av fluer, og kan være innrettet til å fly sporings utformingen som er beskrevet her.

En alternativ tilnærming er å samtidig overvåke aktiviteten til mange enkle fluer som svar på lukt. I Flywalk analysen, er individuelle fluer plasseres i små rør, og deres respons sporet når odoranter blir perfusert gjennom røret 29,30. Endringer i forover eller bakover, eller endringer i hastigheter, kan brukes til å måle om en odorant er generelt attraktive eller frastøtende. Denne analysen, som den fire-feltet assay, følger automatisk fly movements, og så kan brukes til raskt å måle lukt svar på et bredt spekter av lukt. Men i motsetning til fire felt, komplekse motor dynamikk, for eksempel bane snu vinkler og potensielle sosiale interaksjoner, kanskje savnet i analysen opptak Flywalk.

Automatisk sporing av enkelt walking fluer har også blitt tilpasset til en T-labyrint typen analyse 31,32. I denne analysen blir fluer plasseres i små kammere i hvilke lukt er perfuserte fra hver ende av kammeret, og ut via en åpning i midten av kammeret. Posisjonene av fluene er også automatisk spores. Dette etterligner, på en enkel flue skala, et T-labyrint rammeverk. I kombinasjon med optogenetics, har denne analysen er spesielt godt egnet for analyse av nevrale kretser som medierer olfaktorisk læring og hukommelse, og kan også brukes til å måle olfactory preferansene av enkelt fluer. I likhet med Flywalk, det kan ikke overvåke komplekse aktivitet dynamikk som kan oppstå over større romlige områder, Slik som de som oppstår i løpet av mat-søker 14, eller atferd som bare forekommer i flue populasjoner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Air delivery system  (Quantity needed)
Tubing and connectors
Thermoplastic NPT(F) Manifolds Cole-Parmer, IL, USA R-31522-31 1
Hex reducing  nipple (1/4MNPT->1/8MNPT) McMaster-Carr, IL, USA 5232T314 1
Tubing (ID:1/8) McMaster-Carr, IL, USA 5108K43 50 Ft
Tubing (ID:1/16) McMaster-Carr, IL, USA 52355K41 100 Ft
Barbed tube fittings McMaster-Carr, IL, USA 5117K71 1 pack
Push-to-connect tube fittings McMaster-Carr, IL, USA 5779K102 4
Barbed Tube Fittings (1/4MNPT->1/8BF) McMaster-Carr, IL, USA 5463K439 1 pack (10)
Barbed Tube Fittings (1/8MNPT->1/8BF) McMaster-Carr, IL, USA 5463K438 2 pack (10) 
Barbed Tube Fittings (1/8MNPT->1/16BF) McMaster-Carr, IL, USA 5463K4 2 pack (10) 
Barbed Tube Fittings (1/4MNPT->1/4BF) McMaster-Carr, IL, USA   5670K84 1
Hex head plug McMaster-Carr, IL, USA 48335K152 1
Air pressure regulator, air filter and flowmeters (Quantity needed)
Labatory gas drying unit W A HAMMOND DRIERITE CO LTD, OH, USA Model: L68-NP-303; stock #26840 1
Multitube frames for 150 mm flowtubes Cole-Parmer, IL, USA R03215-30 1
Multitube frames for 150 mm flowtubes Cole-Parmer, IL, USA R03215-76 1
150 mm flowtubes Cole-Parmer, IL, USA R-03217-15 9
Valve Cartridge Cole-Parmer, IL, USA R-03218-72 9
Precision Air regulator McMaster-Carr, IL, USA 6162K13 1
Soleniod valves Automate Scientific, Berkeley, CA 02-10i 4
Solenoid valve controller ValveLink 8.2, Automate Scientific, Berkeley, CA 01-18 1
Electronic flow meter Honeywell AWM3100V 1
DAQ (NI USB-6009, National Instruments) and a  National Instruments NI USB-6009 1
Power supply Extech Instruments 382200 1
Odor chambers
Polypropylene Wide Mouth jar 2 oz; 60 ml Nalgene 562118-0002 At least 5 are required per experiment, but a separate chamber is required for each dillution of each odorant. Available at Container Store, part #635114)
Glass odor chamber, 0.25 oz Sunburst Bottle LB4B At least 5 are required per experiment 
"In" valve for odor chamber Smart Products, Inc., CA, USA 214224PB-0011S000-4074 1 of these parts is used per odor chamber but they need to be replaced frequently
"Out" valve for odor chamber Smart Products, Inc., CA, USA 224214PB-0011S000-4074 1 of these parts is used per odor chamber but they need to be replaced frequently
O ring RT Dygert International, MN, USA AS568-029 Buna-N O-R 1 pack (100)
Fly arena, camera and behavior boxes (Quantity needed)
Behavior and camera box material Interstate plastics, CA, USA ABS black extruded (https://www.interstateplastics.com/Abs-Black-Extruded-Sheet-ABSBE~~ST.php) 1803 sq inch
Teflon for fly arena and odor chamber inserts, 3/8" thick, 12" x 12" McMaster-Carr, IL, USA 8545K27  1
Glass plates, 1/8" Thick, 9" x 9" McMaster-Carr, IL, USA 8476K191  2
Dual action thermoelectric controller WAtronix Inc, CA, USA DA12V-K-0 1
IR LED array Advanced Illumination, Rochester, VT, USA AL4554-88024, PS24-TL 2 LED arrays and one power supply
Air conditioner Unit Melcor Store  MAA280T-12 1
Imaging system (Quantity needed)
Cosmicar/Pentax C21211TH (12.5 mm F/1.4) C-mount Lens B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA PEC21211 KP 1
CCXC-12P05N Interconnect Cable B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA SOCCXC12P05N 1
DC-700 Camera Adapter B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA SODC700 1
B+W 40,5 093 IR filter B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA 65-072442 1
TiFFEN 40.5 mm Circular polarizer Amazon 1
IR Videocamera Industrial Vision Source, FL, USA Sony XC-EI50 (SY-XC-E150) 1
USB video converter The Imagingsource, NC, USA DFG/USB2-It 1
iFlySpy2 (fly tracking software) Julian Brown, Stanford, Calfornia: julianrbrown@gmail.com iFlySpy2 1
IC Capture 2.2 software The Imagingsource, NC, USA (http://www.theimagingsource.com/en_US/products/software/iccapture/)
Miscellaneous (Quantity needed)
Dremel rotary tool Dremel, Racine, WI, USA Dremel 8000-03  1
Diamond-coated drill bits for glass cutting Available from various suppliers; MSC industrial Supply Co, Melville, NY 90606328 1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Benzer, S. Behavioral mutants of Drosophila isolated by countercurrent distribution. Proc Natl Acad Sci U S A. 58 (3), 1112-1119 (1967).
  2. Thorpe, W. H. Further studies on pre-imaginal olfactory conditioning in insects. Proc R Soc B. 127 (848), 424-433 (1939).
  3. Tully, T., Quinn, W. G. Classical conditioning and retention in normal and mutant Drosophila melanogaster. J Comp Physiol A. 157 (2), 263-277 (1985).
  4. Anholt, R. R., Mackay, T. F. Quantitative genetic analyses of complex behaviours in Drosophila. Nat Rev Genet. 5 (11), 838-849 (2004).
  5. Vosshall, L. B. Into the mind of a fly. Nature. 450 (7167), 193-197 (2007).
  6. Wu, M. N., Koh, K., Yue, Z., Joiner, W. J., Sehgal, A. A genetic screen for sleep and circadian mutants reveals mechanisms underlying regulation of sleep in Drosophila. Sleep. 31 (4), 465-472 (2008).
  7. Dankert, H., Wang, L., Hoopfer, E. D., Anderson, D. J., Perona, P. Automated monitoring and analysis of social behavior in Drosophila. Nat Methods. 6 (4), 297-303 (2009).
  8. Branson, K., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. High-throughput ethomics in large groups of Drosophila. Nat Methods. 6 (6), 451-457 (2009).
  9. Aso, Y., et al. Mushroom body output neurons encode valence and guide memory-based action selection in Drosophila. Elife. 3, e04580 (2014).
  10. Pfeiffer, B. D., et al. Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (28), 9715-9720 (2008).
  11. Pfeiffer, B. D., et al. Refinement of tools for targeted gene expression in Drosophila. Genetics. 186 (2), 735-755 (2010).
  12. Venken, K. J., et al. Genome engineering: Drosophila melanogaster and beyond. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. , (2015).
  13. Diao, F., et al. Plug-and-play genetic access to drosophila cell types using exchangeable exon cassettes. Cell Rep. 10 (8), 1410-1421 (2015).
  14. Lin, C. C., Prokop-Prigge, K. A., Preti, G., Potter, C. J. Food odors trigger Drosophila males to deposit a pheromone that guides aggregation and female oviposition decisions. Elife. 4, (2015).
  15. Pettersson, J. An aphid sex attractant. Insect Systematics & Evolution. 1 (1), 63-73 (1970).
  16. Semmelhack, J. L., Wang, J. W. Select Drosophila glomeruli mediate innate olfactory attraction and aversion. Nature. 459 (7244), 218-223 (2009).
  17. Vet, L. E. M., Lenteren, J. C. V., Heymans, M., Meelis, E. An airflow olfactometer for measuring olfactory responses of hymenopterous parasitoids and other small insects. Physiological Entomology. 8 (1), 97-106 (1983).
  18. Faucher, C., Forstreuter, M., Hilker, M., de Bruyne, M. Behavioral responses of Drosophila to biogenic levels of carbon dioxide depend on life-stage, sex and olfactory context. J Exp Biol. 209 (Pt 14), 2739-2748 (2006).
  19. Katsov, A. Y., Clandinin, T. R. Motion processing streams in Drosophila are behaviorally specialized. Neuron. 59 (2), 322-335 (2008).
  20. Gao, X. J., et al. Specific kinematics and motor-related neurons for aversive chemotaxis in Drosophila. Curr Biol. 23 (13), 1163-1172 (2013).
  21. Gao, X. J., Clandinin, T. R., Luo, L. Extremely sparse olfactory inputs are sufficient to mediate innate aversion in Drosophila. PLoS One. 10 (4), e0125986 (2015).
  22. Ronderos, D. S., Lin, C. C., Potter, C. J., Smith, D. P. Farnesol-detecting olfactory neurons in Drosophila. J Neurosci. 34 (11), 3959-3968 (2014).
  23. Riabinina, O., et al. Improved and expanded Q-system reagents for genetic manipulations. Nat Methods. 12 (3), 219-222 (2015).
  24. Lundstrom, J. N., Gordon, A. R., Alden, E. C., Boesveldt, S., Albrecht, J. Methods for building an inexpensive computer-controlled olfactometer for temporally-precise experiments. Int J Psychophysiol. 78 (2), 179-189 (2010).
  25. Colinet, H., Renault, D. Metabolic effects of CO2 anaesthesia in Drosophila melanogaster. Biology Letters. 8 (6), 1050-1054 (2012).
  26. Ramdya, P., et al. Mechanosensory interactions drive collective behaviour in Drosophila. Nature. 519 (7542), 233-236 (2015).
  27. Ofstad, T. A., Zuker, C. S., Reiser, M. B. Visual place learning in Drosophila melanogaster. Nature. 474 (7350), 204-207 (2011).
  28. Beshel, J., Zhong, Y. Graded encoding of food odor value in the Drosophila brain. J Neurosci. 33 (40), 15693-15704 (2013).
  29. Steck, K., et al. A high-throughput behavioral paradigm for Drosophila olfaction - The Flywalk. Sci Rep. 2, 361 (2012).
  30. Thoma, M., Hansson, B. S., Knaden, M. High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm. J. Vis. Exp. (106), (2015).
  31. Claridge-Chang, A., et al. Writing memories with light-addressable reinforcement circuitry. Cell. 139 (2), 405-415 (2009).
  32. Parnas, M., Lin, A. C., Huetteroth, W., Miesenbock, G. Odor discrimination in Drosophila: from neural population codes to behavior. Neuron. 79 (5), 932-944 (2013).

Tags

Neuroscience nevrobiologi sansebiologi odorants feromoner lukt atferd analysen Matlab dataanalyse eddik fly bevegelsessporing fire-felt olfactometer
Olfactory Behaviors analysert av Computer sporing av<em&gt; Drosophila</em&gt; I en fire-kvadranten olfactometer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lin, C. C., Riabinina, O., Potter,… More

Lin, C. C., Riabinina, O., Potter, C. J. Olfactory Behaviors Assayed by Computer Tracking Of Drosophila in a Four-quadrant Olfactometer. J. Vis. Exp. (114), e54346, doi:10.3791/54346 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter