Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Fastställande dämpa immunförsvaret mot CNS skydd för farmakologisk intervention i autoimmun Demyelinisering

Published: September 12, 2016 doi: 10.3791/54348
* These authors contributed equally

Introduction

Multipel skleros (MS) kännetecknas av inflammatoriska lesioner, främst vita substans regioner i hjärnan tidigt i sjukdomen. Efter långvarig progression, är grå substans atrofi detekteras genom MRI imaging och markerar den neurodegenerativa fasen av sjukdomen. Reaktiv glios, demyelinering och axonal skada i den vita substansen tillskrivs CNS-infiltrerande immunceller. Ingen av de behandlingar som för närvarande används i MS bakåt eller direkt förhindra neurodegeneration i CNS - i stället, de minskar inflammation genom att dämpa T-cellsaktivering och / eller infiltration i CNS. Eftersom det inte finns något botemedel för MS och patienter som använder nuvarande behandlingar fortsätter att uppleva sjukdomsprogression, upptäckter av läkemedel som förhindrar demyelinisering och neuronal förlust är av avgörande betydelse. Däremot kan skilja mellan effekter på immunceller och de på CNS vara svårt experimentellt, eftersom resultatet - det vill säga, minskad skada på CNS - ser same oavsett de mekanismer genom vilka det förekommer. Därför måste bedömningen av CNS skydd samarbetar med bedömningar av CNS-infiltrerande immunceller och förökning av immunceller i periferin för att avgöra hur farmakologiska medel påverkar sjukdomsmekanismer.

Experimentell autoimmun encefalomyelit (EAE) är en väletablerad djurmodell av autoimmuna inflammatoriska sjukdomar som var direkt ansvarig för upptäckten av läkemedel som för närvarande används för behandling av MS 1-4. Möss används ofta för EAE, med C57BL / 6-möss är en populär stam baserat på tillgängligheten av genetiska varianter. C57BL / 6-möss inducerade med EAE uppvisar kronisk sjukdomsprogression med uppkomsten runt dag 10 efter induktion. Infiltration av ryggmärgen parenkymet och lillhjärnan är kännetecknande för histopatologi av dessa djur, med frånvaro av infiltration i kortikala parenkymet 5. Dessutom, kortikala lesioner och demyelinisering i bregn är kännetecken på sjukdomen 6-9, som är relativt frånvarande i C57BL / 6 möss. Därför kan det vara att föredra när det är möjligt att använda SJL-möss, som har skovvis förlöpande sjukdom och skador som finns i både hjärnan och ryggmärgen som visas liknar dem i MS 10.

Behandlingen kan inte klassificeras som neuroprotektiva om immunceller når aldrig CNS. Därför utgör denna protokoll användning av flödescytometrisk analys av hjärnor, ryggmärg, och mjältar från EAE-möss för att bestämma effekten av behandling på immuncellinfiltration i CNS och proliferation av immunceller i periferin, såsom tidigare visats 11. Immunohistokemiska analyser av CNS-vävnad för att bestämma omfattningen och arten av neuroprotektion beskrivs också. Genom att kombinera dessa metoder gör det möjligt att avgöra huruvida immunceller aktiverades och frodats i periferin, om immunceller in i CNS, och huruvida CNS var protected från inflammation eller skada. Om neuroprotektiva effekter misstänks trots effekter på immunsystemet, kan praktiker ändra behandlingen starttider efter immunceller infiltration i CNS har inträffat.

Här presenterar vi ett protokoll med hjälp av två olika modeller av aktiv EAE, en cellmedierad djurmodell T MS, och flödescytometrianalys kombination med immunohistokemi vid olika tidpunkter under sjukdomen för att fastställa effekten av experimentella behandlingar på olika aspekter av MS patogenes. Denna metod kommer att hjälpa forskare att skilja mellan effekter på immuncelltillväxt och infiltration mot CNS skydd, vilket gör det lättare att begränsa hur läkemedel verkar på sjukdoms patogenes.

Protocol

Experimentella procedurer involverande möss måste överensstämma med relevanta institutioner och statliga regleringar. För den aktuella studien, möss inrymt och behandlas i enlighet med National Institutes of Health och University of Alabama i Birmingham Institutional Animal Care och användning kommittén riktlinjer.

1. EAE Induktion och Scoring

  1. Inducerar EAE hos C57BL / 6-möss 11-13 eller SJL-möss 10,11 såsom beskrivits tidigare 13.
    OBS: Praktiker bör välja en modell idealisk för sin forskning fråga (se diskussion för ytterligare detaljer).
  2. Skiv poäng dagligen som tidigare beskrivits 11 för varje mus med början på dag 7 efter induktion. Jämför genomsnittliga dagliga poäng över tid mellan behandlingsgrupperna.

2. Behandling

  1. Behandla EAE-möss innan sjukdomen bryter ut för att avgöra om behandlingen påverkar immuncellinfiltration eller proliferation.
    1. Välj en behandling, migThOD leverans och behandlingsfrekvens samtidigt med tanke på läkemedlets blod-hjärnbarriären permeabilitet, halveringstid och dosering.
      OBS: EAE ökar blod-hjämbarriären och kan tillåta läkemedel att nå CNS som annars inte skulle kunna hos friska djur. Utför experiment för dos-responskurvor tittar på EAE kliniska poäng får hjälp att välja en lämplig dos av läkemedel. Fordonskontroller bör utföras parallellt med läkemedelsbehandling. Alternativt kan villkorknockoutmöss användas med syskon som kontroller.
    2. Använd SJL eller C57BL / 6 möss för detta experiment. Behandla möss tidigt efter EAE-induktion (dag 7), före symtomdebuten som använder den valda metoden för leverans.
    3. Offra och dissekera möss vid toppen av sjukdom (ca dag 15), som i steg 3,1 och dess understeg, som bygger på den högsta kliniska poängen genomsnitt över tiden.
    4. Beteende flödescytometri på mus ryggmärg (som i steg 3,2) för att bestämma immunceller infiltratipå i CNS, och på mjältar (såsom i steg 3,3) för att bestämma immuncellproliferation i periferin. På separata möss, till beteende immunohistokemi (som i steg 4) kvantifiera astrocyter och mikroglia och bevarande av myelin.
  2. Behandla EAE-möss efter sjukdomsdebuten för att avgöra om behandling skyddar CNS efter immuncellinfiltration har inträffat.
    1. Upprepa steg 2.1.1.
    2. Använd SJL möss för detta experiment, eftersom dessa möss har mätbara remission sjukdomar. Behandla möss under den första toppen i sjukdom (eller, om så önskas, på toppen av en följande återfall) mätt som genomsnittligt kliniska poängen.
    3. Offra möss vid en önskad tidpunkt efter EAE-induktion. Eftersom infiltrering redan har inträffat, kan det inte vara nyttigt att mäta infiltration genom FACS-analys. Men ta ryggmärgen att kvantifiera reaktiv glios och myelin för att avgöra om det finns CNS skydd trots immuncellinfiltration.

3. flödescytometrianalys

  1. Dissektion
    1. Etikett tre 15 ml koniska rör (en för hjärnan, en för ryggmärgen, och en för mjälte) per djur med djurets ID och typ av vävnad innehöll. Håll alla vävnader i separata rör för hela förfarandet på is.
    2. För FACS-analys av mjältar, offra möss vid toppen av sjukdom (~ dag 15 post-EAE-induktion) med användning av koldioxid med en flödeshastighet av ca 15% container volym per minut till 2 - 3 min. Bekräfta dödshjälp av bristande andning. Efter avlivning på varje mus, avlägsna mjälten 14 och placera i en individ, märkta 15 ml koniska rör (från steg 3.1.1) innehållande iskall RPMI kompletterat med 2% FCS, 100 lU penicillin och 100 | ig / ml streptomycin ( kallad "media" i hela protokollet).
    3. För FACS-analys av hjärnan och ryggmärgen, utför hjärtperfusion genom att skära musens högra förmaket med kirurgisk sax för att frigöra circulating blod och piercing den vänstra ventrikeln med en nål ansluten till en spruta fylld med 10 ml iskall PBS. Långsamt injicera 10 ml PBS.
    4. Skär av musens huvud och göra en skära upp mittlinje hårbotten med kirurgisk sax. Peel huden tillbaka för hand eller med pincett och göra en skära upp mittlinjen av skallen med kirurgisk sax, med hjälp av ingångspunkten av ryggmärgen som en startpunkt.
    5. Skala bort skallen med mikro pincett och använda en skopa för att frigöra hjärnan. Placera hjärnan i märkta 15 ml koniska rör (från steg 3.1.1) som innehåller media.
    6. Ta musens hud med pincett och kirurgisk sax, och rensning musen med kirurgisk sax. Skär av armar och ben, svans, revben och alla omgivande muskler med kirurgiska sax för att frigöra ryggraden.
    7. Skär ryggraden i ca 5 ungefär lika stora bitar med kirurgisk sax och pressa den ena änden av ett stycke med en hemostat, och sedan använda en annan hemostat to fortsätta klämma, som rör sig längs stycket tills ryggmärgen tränger ut ur toppen. Upprepa detta för varje del av ryggraden och placera kablarna i individuella, märkta 15 ml koniska rör (från steg 3.1.1) innehållande media.
  2. Bedömning av immuncellinfiltration i hjärnan och ryggmärgen
    1. Skär hjärna och ryggmärg i mindre bitar med hjälp av steril sax. Krossa med kolven från ett 3 ml spruta under en 70 ìm cell sil i en ny 50 ml tub medan skölja silen med media. Föra varje rör till en 50 ml volym med medium. Centrifugera vid 453 xg under 5 minuter för att pelletera cellerna.
    2. Aspirera supernatanten och återsuspendera pelleten i 4 ml 40% densitetsgradient media. Noggrant överlagra densitetsgradienten 40% innehållande celler på toppen av 2 ml 70% densitetsgradient i ett nytt 15 ml koniskt rör-pipett mycket långsamt på väggen i det koniska röret för att säkerställa korrekt skiktning av gradienten. Snurra vid 796 xg under 20 min vid RT medut en broms.
    3. Försiktigt bort det övre myelinskiktet från gradienten med en 1 ml överföringspipett, ta bort livsdugliga celler vid gränsytan med en 1 ml pipett och förflyttas till en ny 15 ml koniska rör. Bringa röret till 15 ml med medium och centrifugera vid 448 xg under 10 min.
    4. Återsuspendera pelleten i 200 | il medium och placera i en brunn i en 96-brunnars rundbottnad platta (varje prov från varje djur kommer att gå in i dess egen brunn). Centrifugera plattan vid 410 xg under 5 min.
    5. Flick bort supernatanten och återsuspendera pelleten i 200 | il av återstimulering media (RPMI kompletterat med 10% FCS, 100 lU / ml penicillin, 100 | ig / ml streptomycin, 2 mM L-glutamin, 1 x icke-essentiella aminosyror, 1 mM natriumpyruvat , och 55 ^ M β-merkaptoetanol, plus 50 ng / ml forbolmyristatacetat (PMA), 750 ng / ml jonomycin och proteintransport hämmaren Brefeldin A). Placera plattan i en inkubator vid 37 ° C i 4 h.
      OBS: PMA och ionomycin återstimulering resulterar i aktivering av alla T-lymfocyter-oavsett deras antigenspecificitet för att kunna bedöma det totala antalet av varje T-cellunderuppsättning i viss vävnad. Emellertid kan antigenspecifika cellsvar effektor-T-bedömas på olika sätt, inklusive restimulating celler med MOG-peptid i närvaro av Brefeldin A 15,16.
    6. Bedömning av CNS CD4 + T-cell-fenotyper
      1. Efter inkubation, centrifugera 96-brunnars rundbottnad platta (från steg 3.2.5), vid 410 xg under 5 min och flick bort supernatanten. Alla följande färgningssteg utförs i denna platta.
      2. Tvätta celler i 200 pl PBS med 2% FCS och centrifugera vid 410 xg under 5 min. Flick bort supernatanten och inkubera celler med 200 pl PBS innehållande 2% FCS med Fc Block (klon 2.4G2) under 10 - 15 min på is.
      3. Att påbörja den extracellulära fläcken, centrifugera celler vid 410 xg under 5 min, flick off supernatanten och återsuspendera pelleten i 50 &# 956; l från ytan fläck cocktail innehållande fluoroformärkt antikroppar mot CD4 (1: 200, 1 | ig / ml), TCRβ (1: 200, 1 | ig / ml), och livskraft färgämne (1: 500) utspädd i PBS under 15 min på is. Centrifugera cellerna vid 410 xg under 5 minuter och flick off supernatant. Tvätta cellerna 2x i 200 pl PBS centrifugera sedan vid 410 xg under 5 min.
      4. Efter avlägsnande av extracellulära fläcken, initiera den intracellulära färgningsproceduren genom fixering / permeabilization följt av intracellulär färgning.
        1. Till att börja, flick off supernatanten och fixera / permeabilize celler med foxp3 transkriptionsfaktorfärgningsreagens 17 (enligt tillverkarens instruktioner, se Material List) under 30 minuter till över natten vid 4 ° C
        2. Tvätta celler i 150 | il permeabilization buffert ur satsen och centrifugera plattan vid 410 xg under 5 min. Flick bort supernatanten och fläck celler i 50 ^ permeabilization buffert med fluoroformärkt-antikroppar mot IL-17A (1: 200, 1 | ig / ml), IFN-γ (1: 200, 1 | ig / ml), och Foxp3 (1: 200, 2,5 | ig / ml) spädd i PBS under 30 min på is.
        3. Centrifugera cellerna vid 410 xg under 5 minuter och flick off supernatant. Att avlägsna överskott av antikroppar tvätta 3x i 200 | il permeabilization buffert centrifugera sedan vid 410 xg under 5 min. Flick bort supernatanten och återsuspendera i 200 pl PBS.
        4. Analysera celler genom flödescytometri, gating på levande CD4 + TCRβ + celler som tidigare beskrivits 11 för att bedöma andelen celler som uttrycker varje molekyl. Räkna cellerna med användning av en hemocytometer 18 eller annan validerad metod för att bestämma antalet celler per mus med var och en av cellfenotyper CD4 + T.
        5. Med användning av de erhållna data, beräkna procentandel och antal CD4 + T-celler infiltrerar hjärnan och ryggmärgen från varje mus, med särskilt fokus på dessa populationer vilka spelar kritiska roller vid EAE patogenes och skydd19: IL-17A + IFN-γ -, IL-17A + IFN-γ +, IL-17A - IFN-γ +, Foxp3 +.
  3. Uppskatta yttre T-cellproliferation och aktivering
    1. Krossa mjälte med frostade glasskivor i en 60 x 15 mm odlingsskål. Placera cellsuspensionen i ett 15 ml koniskt rör med hjälp av media för att suspendera celler. Fyll röret till 15 ml med medier och centrifugera celler vid 448 xg under 5 min.
    2. Aspirera media och återsuspendera pelleten i 2 ml ACK lyseringsbuffert vid RT för att lysera röda blodkroppar för cirka 3 minuter.
    3. Bringa röret till 15 ml volym med medium och stam över en 70 | im cellfilter in i ett nytt rör. Centrifugera cellerna vid 448 xg under 5 min, aspirera supernatanten och återsuspendera i 2 ml medium.
    4. Bedömning av perifera CD4 + T-cell proliferation av Ki-67-färgning
      1. Placera en liten portion (typiskt 200 pl) av equivalent antal splenocyter från 3.3.3 i enskilda brunnar (en per prov) i en 96-brunnars rundbottnad platta.
      2. Centrifugera vid 410 xg under 5 minuter och flick off supernatant. Återsuspendera i 200 | al PBS innehållande 2% FCS och upprepa centrifugering. Flick off supernatanten och återsuspendera cellerna med PBS innehållande 2% FCS med Fc Block (klon 2.4G2) och inkubera under 10 - 15 min på is. För extracellulärt fläck upprepa steg 3.2.6.3.
      3. Efter avlägsnande av extracellulära fläcken, initiera den intracellulära färgningsproceduren genom fixering / permeabilization följt av intracellulär färgning.
        1. Upprepa steg 3.2.6.4.1.
        2. Centrifugera cellerna vid 410 xg under 5 minuter och flick off supernatant. Tvätta cellerna 1x i 200 | il permeabilization buffert ur satsen och centrifugera vid 410 xg under 5 min. Flick off supernatanten och fläck celler i 50 | il permeabilization buffert med anti-Ki-67-antikropp (1: 200, 1 | ig / ml) under 30 min.
        3. Centrifugera cellerna vid 410 xg for 5 min och flick off supernatant. Tvätta cellerna 2x i 200 | il permeabilization buffert ur satsen och centrifugera vid 410 xg under 5 min.
        4. Flick off supernatant och tvätta cellerna 1x i 200 pl PBS och centrifugera vid 410 xg under 5 min. Analysera celler genom flödescytometri, gating på levande CD4 + TCRβ + celler som tidigare beskrivits 11, sedan bedöma procent Ki-67 + celler.
    5. Bedömning av perifera CD4 + T-cell-fenotyper
      1. Placera 200 | il av celler (från steg 3.3.3) i en 96-brunnars rundbottnad platta (en brunn per prov) och centrifugera vid 410 xg under 5 min och åter stimulera såsom i 3.2.5.
      2. Placera plattan i en inkubator vid 37 ° C i 4 h. Utför samma färgningsproceduren som i steg 3.2.6 och dess understeg. Analysera cellerna genom flödescytometri som i 3.2.6.4.4-3.2.6.5.5.

4. Immunohistokemi end Kvantifiering

  1. vävnads~~POS=TRUNC
    1. Offra EAE-möss i ett separat experiment från de som används i steg 3 och dess understeg vid någon punkt efter EAE-induktion (ofta ~ dag 30, under den kroniska fasen av sjukdomen för C57BL / 6-möss eller under en topp i genomsnitt kliniska poängen för SJL möss) följa stegen nedan för att avgöra omfattningen av reaktiv glios och demyelinisering.
    2. Söva möss med 2,5% isofluran och 97,5% syre och bekräfta lämpligt djup anestesi med en mild tå nypa med hjälp av pincett, letar efter en bristande respons. Utför transkardial perfusion som beskrivs i steg 3.1.3. Efter injektion PBS i vänster kammare, använd en ny spruta för att injicera 10 ml av 4% paraformaldehyd i PBS. VARNING: Paraformaldehyd är en hud och lungirritant, kan orsaka allvarliga ögonskador, och misstänks orsaka cancer. Undvik inandning, förtäring och kontakt med hud och ögon. Perfusion ska utföras i ett dragskåp. Ta bort hjärnan och ryggraden som beskrivs i steg 3.1.4 - 3.1.6. Tie ryggraden till pinnar med snöre för att säkerställa rak inriktning av ryggmärgen.
    3. Sätt hjärnor i scintillationsflaskor märkta med djurets ID med ca 20 ml av 4% paraformaldehyd i PBS och ryggmärg i 50 ml koniska rör märkta med djurets ID med ca 50 ml 4% paraformaldehyd i PBS för att efter åtgärda natten.
    4. Att cryoprotect hjärnor, skölj 3 gånger i 1x PBS och förvara vid 4 ° C i 30% sackaros i 1x PBS. Tillåta hjärnorna att sjunka till botten av sina behållare (cirka 3 dagar).
    5. Ta kalcium från ryggraden genom att skölja det 3 gånger i 1 x PBS och placera den i en stor volym (ca 50 ml för en mus ryggmärg) av 0,5 M EDTA i 1x PBS (start-pH blir ~ 10; pH till ~ 7,8 med 6 N HCI) för 2 - 3 veckor tills benet är inte längre stel. Cryoprotect ryggraden genom att följa steg 4.1.5.
    6. Bädda hjärnor ochryggraden i oktober efter under stegen nedan så snart de sjunka till botten av deras behållare.
      1. Göra en blandning av en del 30% sackaros i 1 x PBS och 2 delar oktober (till exempel, tillsätt 15 ml 30% sackaros i 1 x PBS till 30 ml oktober).
      2. Lägg till oktober / sackaros blandningen till inbäddning formen (22 x 22 x 20 mm för hjärnor och 22 x 30 x 20 mm för ryggmärg) tills den är ca ½ full.
      3. Skär kotpelare i 6 lika stora bitar med hjälp av ett rakblad och placera i en 22 x 30 x 20 mm inbäddning mögel vänd framåt för koronala ryggmärgs sektioner. Placera hela hjärnor i 22 x 22 x 20 mm formar vända framåt.
      4. Lägg till oktober / sackaros blandning för att täcka vävnaden och låt det sitta i en timme. så bubblor kan fly. Under denna timme, tillsätt 2-metylbutan till en maträtt som kan hålla bädda formar för flash-frysning. Placera skålen på torris och täcker pre-cool.
      5. Flash-frysa formen i två-metylbutan på torris och förvara vid -80 ° C inne i AContainer att förhindra uttorkning.
    7. När du är klar, vävnadssnittet på 16 um med en kryostat och montera på elektrostatiskt laddade bilder. Sätt var 10: e avsnittet på en bild varje för hjärna och ryggmärg (till exempel genom att dra ett måste avsnitten 1, 11 och 21, och skjut 2 kommer att ha sektioner 2, 12 och 22, och så vidare). Store glider vid -80 ° C eller använda direkt för färgning.
  2. Färgning för reaktiv glios och myelin
    1. När du är redo för färgning, välja en bild vardera för hjärna och ryggmärg per fläck för varje djur i samma (eller så lika som möjligt) region. För hjärnan, välja objektglas som visar corpus callosum och cingulum bunt.
    2. Placera objektglasen med vävnad på ett värmeblock vid 70 ° C under 7 min. Efter 7 minuter att stänga av värmeblocket och låt glasen svalna på värmeblock under ytterligare 10 - 15 min. Detta kommer att förhindra vävnadssnitt från att falla av objektglasen under färgningsproceduren.
    3. Tvätta objektglasen 3 gånger vardera i 1 x PBS med 0,1% icke-jonisk detergent (för intracellulära antigener) eller 1 x PBS (för antikroppar riktade mot ytantigener) under 5 min.
      OBS: Eftersom antikroppar som används i detta protokoll är intracellulära kommer nonjoniska tvättmedel användas i efterföljande steg. Låt aldrig diabilder torka helt efter detta steg.
    4. Placera objektglasen i en behållare och täck med citratbuffert pH 3,0. Att göra citratbuffert, tillsätt 0,192 g vattenfri citronsyra till en slutlig volym av 100 ml i vatten. Justera pH med ättiksyra om över pH 3,0 eller NaOH om nedan.
    5. Inkubera objektglasen vid 37 ° C i 30 minuter och tvätta 3 gånger i 1 x PBS med 0,1% icke-jonisk detergent under 5 min.
    6. Cirkel ett område runt vävnaden med en hydrofob barriär penna och placera objektglasen i en fuktkammare (till exempel en glidlåda innehållande våta pappershanddukar). Lägg blockerande buffert till vävnaden. Inkubera under 30 min vid RT.
      OBS: Blockeringsbuffert består av 1 x PBSplus 0,3% nonjonisk detergent och den lämpliga serum (5%) baserat på värden av den sekundära antikroppen, dvs, hästserum för basiskt myelinprotein (MBP) och glia fibrillärt surt protein (GFAP) och getserum för Iba1.
    7. Flick blockerande buffert av objektglasen och tillsätt primära antikroppen (1: 1000 eller 0,2 | j, g / ml get-anti-myelinbasprotein för oligodendrocyter, 1: 1000 eller 1 | ig / ml till 3 | j, g / ml mus-anti-GFAP för astrocyter, eller en : 750 eller 0,67 mikrogram / ml kanin-anti-Iba1 för mikroglia) utspädd i lämplig blockerande buffert (se steg 4.2.6) till det inringade området. Lämna vid 4 ° C över natten i fuktig kammare.
    8. Flick antikropp i blockerande buffert av objektglasen och tvätta objektglasen 3 gånger i 1 x PBS med 0,1% icke-jonisk detergent under 5 min.
    9. Lägg sekundär antikropp (1: 200 eller 7,5 | j, g / ml biotinylerad häst anti-mus för MBP och GFAP, eller biotinylerad get-anti-kanin för Iba1) utspädd i lämplig blockerande buffert (se step 4.2.6) till den inringade området och lämna glasen inkubera i fuktig kammare under 1 h vid RT.
    10. Flick antikropp i blockerande buffert av objektglasen och tvätta objektglasen 3 gånger i 1 x PBS med 0,1% icke-jonisk detergent under 5 min.
    11. Förbered avidin-biotin-peroxidas-komplex (ABC) i immunoperoxidas (se material lista) 30 minuter före användning och skaka på en shaker tills det behövs i 4.2.12. Lägg 0,3% H2O 2 i metanol till det inringade området i 10 min för att släcka endogen peroxidasaktivitet.
    12. Flick lösning av objektglasen och tvätta i 2 gånger i 1 x PBS eller 1 x PBS med 0,1% icke-jonisk detergent under 5 min, sedan en gång i 1 x PBS. Lägga ABC reagens till det inringade området i 30 min.
    13. Flick lösnings utanför objektglasen och tvätta 3 gånger i 1 x PBS under 5 min, sedan 2 gånger i vatten under 5 min. Gör 3,3'-diaminobensidin (DAB) lösning (se Material List) och lägga den till att omfatta sektionerna.
      OBS: Detta steg kräver ett mikroskop för att observera optimal detekteraion tid för färgning och måste göras för samma mängd tid för diabilder som ska jämföras.
    14. Tvätta objektglasen 3 gånger i vatten under 5 min vardera. Dehydratisera vävnaden genom att placera i följande lösningar under 2 minuter vardera: 70% etanol i vatten, 95% etanol i vatten, 100% etanol i vatten, 50% xylener och 50% etanol, 100% xylener. Täta en täck på bilden med en hartsmonteringsmedium.
    15. Alternativt, utföra immunofluorescerande färgning som tidigare beskrivits 11 för att bedöma reaktiv glios användning av antikroppar mot Iba-1 och GFAP.
    16. Ta bilder av varje ryggmärgen sektion (färgade med respektive antikroppar med DAB) med en 4X, 0,13 NA objektiv och spara bilderna som tiff. Alternativt kan du ta bilder av corpus callosum och cingulum bunt i den vänstra eller högra hjärnhalvan med hjälp av en 20X, 0,50 NA objektiv och spara bilderna som tiff. För en mer omfattande bestämning av lesioner i hjärnan, är det fördelaktigt att inkludera både hemispheres i analyser.
  3. Mätning medel fraktion område för reaktiv glios (Iba1 och GFAP färgning)
    1. Hämta NIH ImageJ (http://imagej.nih.gov/ij/) och öppen på en dator. På ImageJ programvara, använd menyn sträng Arkiv> Öppna och välj en bild från steg 4.2.16. Rita ett område med hjälp av "Polygon val" verktyget på menyraden. För ryggmärg, spåra hela avsnittet; för hjärnor, corpus callosum och cingulum bunt. Konvertera bilden till 16-bitars genom att gå till Bild> Typ och klicka på "16-bitars."
    2. De brus bilden genom att gå till Process> Subtrahera Bakgrund och ställ in "rullande boll radie" till åtminstone storleken på den största objekt som inte är en del av bakgrunden (se ImageJ manual på http: //rsbweb.nih .gov / ij / docs / guide / 146-29.html).
      OBS: För en 4X bild av Iba-1 färgning använder vi 4,0 och GFAP vi använder 50,0, men dessa siffror kan variera beroende på bildförstoring och färgning intensity.
    3. Kontrollera "Sliding paraboloid" och klicka på "OK". Gå till Bild> Justera> Tröskel ... och ställ in lägre tröskelnivån (det översta fältet) med hjälp av glidskenorna. Inkludera endast färgning som är cellulär och vara konsekvent över bilder. För bilder med mörk bakgrund (gäller endast fluorescerande infärgning), se till att "Mörk bakgrund" är markerad.
    4. Gå Analysera> Ställ Mätningar ... och välj "Area fraktion" (ger procent av tröskel område inom regionen av intresse). Se till att "Gräns ​​för tröskel" är okontrollerat och "Display label" är markerad. Klicka på "OK" när du är klar.
    5. För att erhålla mätningar, gå Analysera> Mät. A "resultat" popup-ruta kommer att visas och dessa data kan sparas som är eller kopieras till ett annat program. För analys, jämföra "areafraktion" -värden mellan behandlingsgrupperna.
  4. Kvantifiering av MBP färgning av optical densitet
    1. Öppna bilden och rita ett område av intresse som beskrivs i steg 4.3.1. Gå Analysera> Ställ Mätningar ... och välj "Mean gråvärde" (summan av gråvärden i markeringen dividerat med antalet pixlar). Se till att "Gräns ​​för tröskel" är okontrollerat och "Display label" är markerad. Klicka på "OK" när du är klar.
    2. För att erhålla mätningar, gå Analysera> Mät. Observera en "resultat" popup-ruta. Kopiera dessa data och spara som är eller kopiera till ett annat program.
    3. För analys, kopiera och klistra in värden i ett annat program. Konvertera medelvärdet gråvärde i optisk densitet (OD) med formeln: OD = log 10 (255 / betyda gråvärde).

Representative Results

Här har vi använt två modeller av EAE att förstå om ett farmakologiskt medel ger CNS skydd genom att antingen dämpa CNS-infiltrerande T-celler eller förhindra myelin och axonal skada under angrepp av inflammatoriska immunceller infiltration. För att bestämma om ett terapeutiskt medel förhindrar immuncellinfiltration in i ryggmärgen, är musmodellen av kronisk EAE C57BL / 6 användas där immuncellinfiltration och sjukdomspatologi är övervägande belägna i ryggmärgen (Figur 1A). För att avgöra om ett terapeutiskt läkemedel ger CNS-skydd under intrång av immunceller i CNS, djurmodellen SJL av relapserande remitter EAE används, som visar sjukdom patologi i både hjärnan och ryggmärgen (Figur 1B).

kliniska bedömningar

Relevanta kliniska bedömningar görs i enlighet med följande rubrik för typiska (Figur 1C) eller atypiska (figur 1D) EAE. För typisk klinisk sjukdom, är en poäng 0 inget onormalt beteende. När plockas upp av svansroten, kan svansen rotera snabbt (ungefär som en helikopter rotor) och bakbenen kommer isär. En klinisk poäng av 1 är en delvis slapp svans, som kan bestämmas genom att lyfta musen genom basen av svansen. Den normala helikopterliknande roterande kan försvagas eller frånvarande, och en del av svansen kan vara helt slak. Ett bra sätt att avgöra omfattningen av svansförlamning är att köra ett finger upp längden på svansen, som en unparalyzed svans vanligtvis krypa runt fingret medan en delvis förlamad svans kommer att kunna göra det. En klinisk poäng på 2 representerar en helt förlamad svans. Ingen rörelse av svansen inträffar alls när plocka musen upp vid basen av svansen. En klinisk poäng på tre representerar partiell bakbensförlamning. Bestämning av denna värdering kräver att musen kunna röra sig fritt på en flat yta. Om en bakbenet släpar som musen rör sig framåt, eller om en eller båda bakbenen verkar vara delvis förlamad, kan en poäng på 3 att ges. En klinisk poäng av 4 representerar fullständig bakbensförlamning. Med denna värdering, kommer en mus inte kan flytta sina bakben och kommer att dra fram själv med hjälp av sina frambenen. En klinisk poäng av 5 representerar en döende mus eller en mus med svårigheter att röra sig över sin bur eller andas. Om en mus inte kan dra sig längs botten av buren eller om dess andning ansträngd, bör musen vara humant avlivas. En klinisk poäng av 6 representerar en mus hittades död i sin bur. En poäng på sex är ovanlig och orsakerna till andra än EAE död bör utredas.

Atypisk klinisk sjukdom kan eller inte kan åtföljas av förlamning. Det kan vara nödvändigt att inkludera två separata poängsystem om en mus uppvisar atypiska sjukdom plus typiska symtom. En poäng på 0 är inget onormalt beteende, ens med den typiska poängsystem. En klinisk poäng på en representerar en liten huvud sväng eller luta medan musen går. Detta kan bestämmas genom att låta musen för att gå framåt och observera en konstant vänster eller höger riktnings till dess rörelse. En klinisk poäng på 2 representerar en mer uttalad huvud tur och dålig rätande förmåga. Som med ett atypiskt poäng en, har musen rikt till sin rörelse och kan ha viss svårighet med balans. En klinisk poäng av 3 representerar en oförmåga att gå i en rak linje. Musen kommer att ha svårt att balansera och kan använda sidan av buren för att hjälpa höger sig som det går. En klinisk poäng av 4 representerar en mus som lägger på sin sida, oförmögen att gå på grund av balanseringsproblem. Musen kan ha möjlighet att dra sig längs botten av buren men kan ha riktverkan till dess rörelse. En klinisk poäng av 5 representerar kontinuerlig rullning utan stöd. En mus som når den punkten bör humant avlivas. En klinikal poäng 6 representerar en mus hittades död i sin bur. En poäng på sex är ovanlig och orsakerna till andra än EAE död bör utredas.

Det kan vara nödvändigt att göra det möjligt för "in-between" poäng, t.ex., tillsats av 0,5 till en värdering om en mus tillstånd förändras något eller om valet mellan två ställningar är svårt. Till exempel, för en mus som börjar röra sig långsammare än sina normala motsvarigheter men visar ingen förlamning, eller en mus som knäpper sina bakfötter med sin främre stället för splaying sina ben när plockas upp av svansen kan ges en poäng av 0,5 . En mus som endast kan dra sig längs botten av buren och är bara kunna rycka sina bakbenen med jämna mellanrum eller vid beröring kan ges en poäng av 3,5.

Bedöma en reduktion i immunceller Infiltration

Efter induktion av EAE i C57BL / 6 musmodell (Figur 1A, dag 0), antigen presentatipå och proliferation av T-celler i mjälten inträffa på dagarna 1 - 5, följt av immuncellinfiltration i CNS omkring dag 7. Cirka 3 till 5 dagar efter de initiala immuncellinfiltration möss närvarande med kliniska poäng. Att bedöma om ett terapeutiskt medel blockerar immuncellinfiltration in i ryggmärgen, är droger eller vehikel infördes på dag 7 efter antigenpresentation och proliferation i mjältarna men innan immunceller börjar att infiltrera in i ryggmärgen. Om immuncellinfiltration har dämpats, bör det kliniska sjukdomsförloppet återspeglar förbättrade kliniska poäng under den stigande fasen av sjukdomen från dagar 10 till 15 (Figur 2).

En minskning av immuncellinfiltration skulle också resultera i minskad neuroinflammation. Reaktiv astrocytosis och microgliosis anses viktiga kännetecken för neuroinflammationen. Färgning för astrocyter med GFAP och mikroglia med Iba-1 kan sedan användas för att bedöma changes i medelareafraktion färgning att kvantifiera neuroinflammation (Figur 3).

För att bestämma om immuncellinfiltration reduceras, är ryggmärgen avlägsnades och bearbetades för flödescytometrianalys på toppen av sjukdomen (Figur 1A, ungefär dag 18). Detta säkerställer att det största antalet immunceller har kommit in i ryggmärgen. Ingången av T-celler in i CNS anses vara den initierande inflammatorisk händelse och både Th1 och Th17 celler finns i djurmodeller av EAE samt MS-patienter. Sammantaget bör flödescytometrisk analys omfatta bedömning av båda typerna av patogena T-celler. Vidare tregs är väl karakteriserade suppressor-T-celler som dämpar sjukdom. Därför måste den procentuella andelen av tregs av totalt CD4 + populationen utvärderas jämfört med den procentandel av effektor-T-cellpopulationer. Detta kommer att avslöja om en total minskning av T-cellinfiltration har skett eller om finse är en snedställning av T-cell fenotyper i CNS. Representativa punktdiagram (figur 4A) visar en minskning av totala antalet CD4 + infiltrerande T-celler i ryggmärgen från läkemedelsbehandlade möss jämfört med ryggmärgen från vehikelbehandlade möss (siffrorna i det övre högra kvadranter). För att utvärdera Th1, Th17, och Treg celler följande signatur proteinerna utvärderas: IFN-γ +, IL-17 +, och Foxp3 +, respektive och bör reduceras (Figur 4A). Statistisk analys bör utföras på CD4 +, IFN-γ +, IL-17 +, och Foxp3 + cellantal för att visa en signifikant reduktion (Figur 4B). Att utesluta en snedställning av T-cellundergrupper, statistisk utvärdering av andelen av IFN-γ + IL-17 +, IFN-γ + IL-17 -, IL-17 + IFN-γ -, och Foxp3 + -celler utförs ( figur 4C).

Att eliminera möjligheten att en minskning av CNS-infiltrerande T-celler är en följd av att inhibera proliferation, aktivering och differentiering i periferin, antalet aktivt prolifererande T-celler i tillägg till den andel av T-cellundertyper behöver utvärderas. Ingen förändring av andelen CD4 +, IFN-γ +, IL-17 +, eller Foxp3 + bör finnas om aktivering och differentiering är opåverkade (Figur 5A). Dessutom bör ingen förändring i Ki67 + CD4 + celler hittas om spridning är opåverkad (Figur 5B). Läkemedelsbehandlingar introduceras på dag 7 eller senare för att undvika att förändra inledande antigenpresentation och T-cellsaktivering i periferin. Men i genetiska modeller proteiner ofta bort konstitutivt under embryogenes eller inducerad före induktion av EAE gör splenocyter assessment av stor betydelse.

Bedöma CNS Protection

För att visa om en viss terapeutiskt medel modulerar sjukdom patologi i CNS efter immuncellinfiltration, bör narkotikainsatser ges under den första toppen i klinisk sjukdom poäng. SJL modell av EAE är fördelaktig för dessa experiment eftersom dessa möss uppvisar en skovvis förlöpande fenotyp. Om en läkemedelsbehandling förhindrar myelin Axon degeneration, kommer en förbättring av kliniska poäng observeras (Figur 6). Patologisk utvärdering av myelin måste bekräfta en minskning av myelin skada förenlig med förbättrade kliniska poängen. För att kvantitativt utvärdera myelin integritet, DAB-färgning av basiskt myelinprotein (MBP) utförs, följt av statistisk analys av den optiska densiteten för detta färgning (figur 7). För att ytterligare underbygga att neuroinflammation upprätthålls eller minskas genom therapeUTIC insatser kan bedömas reaktiv glios genom att mäta medel fraktion område för reaktiv glios som beskrivits ovan (Figur 3). Att bekräfta att en terapeutisk intervention är direkt skydda CNS utan immunmodulerande effekter, måste dämpning av immunceller infiltration i CNS och spridning i mjälte diskonteras. Ta itu med detta, bör metoder för hjärnan och ryggmärgen bedömning av immuncellinfiltration och bedömning av perifer T-cellsproliferation och aktivering utföras såsom beskrivits ovan (fig 4 och 5). Sammantaget terapeutiska medel som blockerar cellskada i CNS utan tecken på en minskning av CNS-infiltrerande T-celler eller proliferation av T-celler i periferin är CNS-skyddande behandlingar.

Figur 1
Figur 1. Representant Results av kliniska poäng från EAE i C57BL / 6 och SJL-möss. (A) Kliniska poäng (medelvärde ± SEM) av C57BL / 6-möss (n = 10) inducerades med MOG 35-55 för att producera EAE med kronisk sjukdom. (B) Kliniska poäng (medelvärde ± SEM) av SJL-möss (n = 3) inducerade med PLP 139-151 för att producera EAE med skovvis förlöpande sjukdom. (C) Den kliniska bedömningsmatris som används för att spåra typiska sjukdomsprogression i EAE-möss. (D) Den kliniska bedömningsmatris som används för att spåra atypisk sjukdomsprogression i EAE-möss. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 1
Figur 2. Farmakologisk behandling före Immune cellinfiltration i C57BL / 6 möss med EAE. 35-55. Data är från tre poolade oberoende experiment. Statistisk skillnad bestämdes med användning av en icke-parametrisk två-tailed Mann-Whitney U-test, * p <0,05. Re-print med tillstånd från (11).

Figur 1
Figur 3. immunofluorescerande färgning och kvantifiering av reaktiva Glios i ryggmärgen kontroll, EAE, och behandlade C57BL / 6 möss. (A) fluorescensmärkning för GFAP (astrocyter) och IBA-1 (mikroglia) i ryggmärgen kontroll (icke-immuniserad ) möss (vänster paneler) och EAE-möss som behandlats med PBS (mitten paneler) eller SAS (höger sida). Skalstreck = 100 | j, m. Kvantifiering av färgning bestämdes med användning av areafraktion teknik för att mäta procent immunopositive område för GFAP (B) och Iba-1 (C). Medelvärde ± SEM, n = 3 kontroll, n = 3 SAS-behandlade, eller n = 4 PBS-behandlade möss, 6 sektioner per mus. Statistiska skillnader bestämdes med användning av en envägs ANOVA, * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001. Re-print med tillstånd från (11). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 1
Figur 4. FACS-analys av EAE-C57BL / 6-mus ryggmärg demonstrerar Reducerad T-cell Infiltration i behandlade möss. C57BL / 6-möss behandlades med SAS eller PBS, med början 7 d postinduction av EAE. Ryggmärg erhölls på dag 15. (A) Representativa punktdiagram visar Th1 (IFN-γ + / IL-17 -) och Th17 (IFN-γ- / IL-17 +) celler i CD4 + grind (övre paneler) och T regulatoriska celler (Foxp3 +) (lägre paneler). Punktdiagram visar procenttal i övre högra kvadranten. (B) det absoluta antalet CD4 + -celler samt IFN-γ +, IL-17A + och Foxp3 + -celler analyserades statistiskt. (C) Förändringen i procent av T-cellpopulationer mellan SAS- och PBS-behandlade EAE-möss undersöktes också. Medelvärde ± SEM, n = 10 för PBS-behandlade, och n = 9 för SAS behandlas från två oberoende experiment. Tvåsidiga t-test användes för alla stapeldiagram. ** P <0,01. Re-print med tillstånd från (11). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 1
Figur 5. FACAnalys av EAE C57BL / 6 mus Mjältar Demonstration Motsvarande T-cells Expression Profiler och spridning i behandlade och obehandlade möss. Mjältar från PBS och SAS-behandlade möss analyserades 15 d postinduction av EAE. (A) Den procentuella andelen CD4 + T-celler, Th1 (IFN-γ + / IL-17 -), Th17 (IFN-y - / IL-17 +), och T-reglerande celler (Foxp3 +) i mjälte från PBS behandlade (n = 10) och SAS-behandlade (n = 9) möss från två oberoende experiment. (B, vänstra panelen) Andelen Ki-67 + celler i CD4 + befolkningen från naiva mjältar (n = 4) samt från PBS (n = 5) och SAS-behandlade möss (n = 5) inducerade med EAE. En envägs ANOVA testet visade statistisk signifikans mellan andelen Ki-67 + celler från naiva mjälte jämfört med antingen PBS eller SAS-behandlade EAE mjälte. Ingen betydelse observerades mellan PBS och SAS-behandlade EAE mjälte. (B, högra panelen) Representativa punktdiagram; siffrorna anger andelen spridning. Punktdiagram visar procentsatser. Stapeldiagram representerar tvåsidiga t-test, *** p <0,001. Re-print med tillstånd från (11). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 1
Figur 6. Farmakologisk behandling efter Immune cellinfiltration i SJL möss med EAE. Kliniska poäng (medelvärde ± SEM) av SJL möss som behandlats med PBS (n = 8) eller SAS (n = 8) från dag 24 efter immunisering (streckad linje) med PLP 139-151. Data är medelvärde ± SEM för kliniska poäng. Statistisk skillnad bestämdes med användning av en icke-parametrisk två-tailed Mann-Whitney U test, *** p <0,001. Översta raden representerar värden som används för statistiskanalys. Re-print med tillstånd från (11).

Figur 1
Figur 7. Kvantifiering av MBP Färgning med optisk densitet. (A) representant färgning av MBP i bröst ryggmärg från en ospecificerad genetisk knockout-mus jämfört med kull kontroll C57BL / 6 mus inducerad med EAE. Konsol visar representativa område med reducerad MBP färgning indikerar demyelinisering. (B) MBP färgning av bröst ryggmärg från en ospecificerad genetisk knockout C57BL / 6-mus. (C) Ospecificerade genetiska knockoutmöss inducerade med EAE (KO; n = 6 möss, 2-4 länd- och bröstkorg sektioner per djur) uppvisar en högre optisk densitet (OD) av MBP-färgning i ryggmärgen än vildtyp (WT; n = 3 möss, 2-4 ländryggen och bröstkorg sektioner per djur) möss inducerade med EAE. Statistiskt analyseras USIng ett två-tailed t-test, * p <0,05. Felstaplar representerar SEM. Skalstock 100 um.

Discussion

Patienter med MS fortsätter att uppleva sjukdom återfall samtidigt som läkemedel som dämpar T-cellaktivering och / eller infiltration i CNS, motiverar utvecklingen av behandlingsalternativ som direkt skyddar CNS. EAE har klassiskt använts för att modellera symtomen vid MS och kan vara ett kraftfullt verktyg när man studerar vilken typ av interaktion mellan immunsystemet och CNS in vivo. Använda tidpunkten för behandling överväganden i EAE, t.ex., före eller efter initiering av sjukdom, i samband med att undersöka immuncellinfiltration i CNS och spridning och aktivering i periferin, är det möjligt att beskriva effekterna av behandlingar på både immunförsvaret och CNS.

Medan EAE i C57BL / 6 mus är mer allmänt används, kan EAE i SJL musen vara mer representativ för de flesta MS-fall, eftersom dessa möss har en skovvis förlöpande fenotyp och infiltration av immunceller i parenkymetav hjärnan 10. SJL-möss har tydlig återhämtning under remission också, vilket gör det möjligt att påbörja behandling efter det att sjukdomen har presenterat men under tider av minskad inflammation. Det är viktigt att tänka på att SJL möss inte alltid återfall och återför synkront, vilket resulterar i potentiellt stora variationer när resultaten slås samman. Därför kan vissa forskare välja att visa representativa resultat för kliniska poäng från ett djur samtidigt som möss för FACS-analys och histologi på individuella punkter i sjukdomsförloppet.

Överväga när manipulationer görs till EAE-möss kan hjälpa till vid bestämningen av hur en behandling påverkar immunsystemet eller CNS. Det finns många alternativ för när behandlingen påbörjas, var och en med sin egen klang för om immunceller har kommit in i CNS och hur de kan interagera med CNS. Behandling före symtomdebuten innebär att immunceller ännu inte har trätt eller orsakat skada på CNS.Behandling efter symtomdebut innebär att immunceller har kommit in i CNS och har orsakat en del skador. Med hjälp av SJL-möss, kan behandlingen också påbörjas under ett återfall, där immunceller aktivt infiltrera och orsakar inflammation, eller under remission, där immunceller kan vara mindre utbredd i CNS med mindre inflammation. Inledande hypoteser om hur behandlingar påverkar CNS och immunsystemet kan göras när man överväger där immunceller är i den patologiska processen under behandlingen.

Det finns ett antal sätt på vilka behandlingar kan påverka immunceller och CNS, var och en med slutresultatet att minska svårighetsgraden av EAE-symptom. Därför är det nödvändigt att använda flödescytometrisk analys och immunohistokemi för att titta på hur immunceller påverkas i periferin och CNS, om immunceller har kommit in i CNS, och hur CNS reagerar på behandlingen. Medan flödescytometrisk analys av ryggmärgen kan bestämma hur många celler have in CNS vid en given tidpunkt, kan man inte bestämma att denna effekt beror på minskad immunceller människohandel inte proliferation av immunceller är opåverkad i mjälten. Det är därför nödvändigt att analysera både perifera och CNS-vävnad och avgöra vad resultaten betyder mekanistiskt när båda vävnader jämförs. Det är också möjligt för immuncellaktivitetsprofiler som skall förändras genom behandling, exempelvis med en omkopplare i en patogen hjälpar-T-cell-tung-profil till en reglerande T-cell-tung-profil. Om man tittar på markörer för olika celltyper och jämföra procent uttryck mellan behandlade och obehandlade djur är därför också en viktig faktor. En framväxande koncept i MS forskning tyder på att B-celler spelar en viktig roll vid autoimmun demyelinisering. Detta grundar sig på studier som visar att B-celler är nödvändiga för reaktivering av T-celler 20. Detta koncept stöds av framgången av behandlingar såsom rituximab, en antikropp mot CD20 extrycks på ytan av B-celler 21,22. Som framgår av framgången med den monoklonala antikroppen ocrelizumab i kliniska prövningar kan läkemedel inriktade på olika epitoper av CD20 förbättra effektiviteten av B-cell-riktade läkemedel 23.

En begränsning av de tekniker som presenteras här är att det är möjligt för immunceller att komma in i centrala nervsystemet men var oförmögen att resa i parenkymet. Immunohistokemi kan användas för att detektera perivaskulär ansamling av inflammatoriska celler av immunceller och utvärdera tillryggalagda sträckan i parenkymet mellan behandlade och obehandlade djur. En annan potentiell begränsning innebär effekterna av microbiome på EAE patogenes. Kommentarmfloran kan kraftigt påverka sjukdomen patogenes 24; Därför, möss inrymt i olika kolonier och även i olika burar kan ha stora skillnader i sjukdomens svårighetsgrad. Följaktligen är det alltid att föredra när det är möjligt att använda kull kontroller som tas upp i samma bur förexperiment med EAE. En sista anmärkning är att om det är experimentellt önskvärt att eliminera effekterna av immun cellproliferativa förändringar i periferin, kan det vara möjligt att göra det med hjälp av passiv överföring induktion snarare än den aktiva induktions beskrivs i detta protokoll.

Ytterligare bekräftelse för neuroskydd kan åstadkommas med användning av en sam-odlingssystemet 11 för att testa specifika mekanismer för celldöd eller genom användning av villkorliga knockout-möss som möjliggör radering av proteiner selektivt på en celltyp. Vidare att utvidga utforskningen av farmakologiska medel som är neuroprotektiva bör markörer för axonal tran och nervcellsdöd ingå. Ett annat viktigt område är remyelinisering. Skadade axoner inte kan remyelinate utlåning ytterligare stöd som neuroprotektiva terapier bör vara en viktig del av remyelinisering terapier. Dessutom omyeliniserade axoner är mer sårbara för skador än myelinated axoner. Detta tyder på att när en axon blir demyelinerade terapeutiska ingrepp som främjar snabb remyelinisering förhindrar axonal skada. För att undersöka dessa möjligheter, kan andra in vivo-modeller för demyelinering och remyelinisering användas (dvs cuprizone och lysolecitin). Den metod som beskrivs här inriktad på att bedöma neuroprotektion genom att kvantifiera myelin förlust. För utvärderingen av remyelinisering antalet stamceller liksom deras förmåga att föröka sig och mogna skulle också vara viktigt att undersöka. Med omnämnandet av dessa alternativa modeller, måste man också överväga olika modeller av encefalit som viralt förmedlas. Det finns två väl karakteriserade RNA virala modeller som producerar myelin förlust: en är Theiler s mus encefalomyelit, en icke-hölje Picornaviridae virus, och den andra är musen hepatitvirus, en medlem av Coronaviridae virusfamiljen 25,26.

EAE är ett värdefullt verktyg för studies av hur manipulationer eller behandlingar påverka immunsystemet och CNS in vivo. Protokollet som beskrivs här kan hjälpa till att avgöra där behandlingar påverkar sjukdomsprocessen, vare sig det är i periferin, vid blod-hjärnbarriären, eller i CNS. Inga pågående behandlingar för MS bota sjukdomen och patienter ofta upplever nedgång över tiden. På samma sätt, andra sjukdomar som involverar immunceller infiltration i CNS och nedbrytning av myelin, inklusive akut disseminerad encefalomyelit, transversell myelit och neuromyelitis optica, saknar behandlingar som skyddar CNS eftersom det är direkt under attack av infiltrerande immunceller. Med hänsyn till tidpunkten för behandling och användning av flödescytometrisk analys av mjälten och ryggmärgen i samband med immunohistokemi i CNS för att bedöma inflammation och skador kommer att möjliggöra mekanistiska bestäm göras angående behandlingar.

Disclosures

Författarna har ingenting att lämna ut.

Acknowledgments

Detta arbete har finansierats av NINDS P30-NS069324, The National Multiple Sclerosis SocietyRG 4587-A-1, Den Civitan International Research Foundation, Mike L. Jezdimir transversell myelit Foundation, University of Alabama Health Services Foundation - General Endowment Fund, The National Science Foundation 1355183, och T32 AI007051 från National Institute of Allergy och Infectious Diseases, National Institutes of Health.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
22 x 22 x 20 mm embedding mold Fisher Scientific NC9719245
22 x 30 x 20 mm embedding mold Fisher Scientific NC9531194
2-Mercaptoethanol (55 mM) Thermo Fisher Scientific  21985-023
2-Methylbutane Fisher Scientific O3551-4
30 x 22 x 20 mm embedding mold Fisher Scientific 18-30
ACK Lysing Buffer Quality Biological 118-156-101
anti-CD4 PE-Cy7 BD Biosciences 552775 0.2 mg/ml stock concentration
anti-Foxp3-FITC eBioscience 11-5773-82 0.5 mg/ml stock concentration
anti-GFAP (Cocktail) Biolegend 835301 1 - 3 mg/ml stock concentration
anti-Iba-1 Polyclonal Antibody (50 µg) Wako 019-19741 0.5 mg/ml stock concentration
anti-IFN-γ APC eBioscience 17-7311-82 0.2 mg/ml stock concentration
anti-IL-17A PerCP-Cy5.5 eBioscience 45-7177-82 0.2 mg/ml stock concentration
anti-Ki-67 PE eBioscience 12-5698-82 0.2 mg/ml stock concentration
anti-MBP (D-18) Santa Cruz Biotechnology sc-13912 0.2 mg/ml stock concentration
anti-TCRβ FITC eBioscience 11-5961-85 0.5 mg/ml stock concentration
anti-TCRβ PE eBioscience 12-5961-83 0.2 mg/ml stock concentration
Biotinylated Goat Anti-Rabbit IgG Vector Labs BA-1000 1.5 mg/ml stock concentration
Biotinylated Horse Anti-Mouse IgG Vector Labs BA-2000  1.5 mg/ml stock concentration
Citric Acid, Anhydrous, 99.5% Fisher Scientific AC42356-5000
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), tetrasodium salt dihydrate, 99% Fisher Scientific AC446085000
Fetal Bovine Serum HyClone SH30071.03
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides, case of 10 Fisher Scientific 12-550-15
Golgi Plug BD Biosciences 555029 protein transport inhibitor
Immedge Hydrophobic Barrier Pen Fisher Scientific NC9545623
Ionomycin EMD Millipore 407952-5mg
L-Glutamine, 100x Corning 25-005-Cl
MEM Nonessential Amino Acids Corning 25-025-Cl
Near IR Live/Dead Staining Kit Life Technologies L10119 viability dye
Normal goat serum Vector Labs S-1000
Normal horse serum Vector Labs S-2000
Paraformaldehyde, 96% Fisher Scientific AC416785000
Penicillin-Streptomycin Solution, 100x Corning 30-002-Cl
Percoll GE Healthcare 17-0891-01 density gradient
Permount Fisher Scientific SP15-500 resinous mounting medium
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) Sigma P1585-1mg
Purified anti-Myelin Basic Protein Antibody BioLegend 808401
RPMI 1640 Corning 10-040-CM
Sodium Pyruvate Corning 25-000-Cl
Tissue-Tek CRYO-OCT Compound Fisher Scientific 14-373-65
Triton X-100 Sigma-Aldrich T9284 nonionic detergent
Vectastain Elite ABC Kit (Standard) Fisher Scientific NC9206402 avidin-biotin-peroxidase complex (ABC) in immunoperoxidase 
Vector Laboratories Peroxidase Substrate Kit (DAB) Fisher Scientific NC9276270 DAB solution

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Teitelbaum, D., Meshorer, A., Hirshfeld, T., Arnon, R., Sela, M. Suppression of experimental allergic encephalomyelitis by a synthetic polypeptide. Eur J Immunol. 1, 242-248 (1971).
  2. Yednock, T. A., et al. Prevention of experimental autoimmune encephalomyelitis by antibodies against alpha 4 beta 1 integrin. Nature. 356, 63-66 (1992).
  3. Ridge, S. C., et al. Suppression of experimental allergic encephalomyelitis by mitoxantrone. Clinical immunology and immunopathology. 35, 35-42 (1985).
  4. Steinman, L., Zamvil, S. S. How to successfully apply animal studies in experimental allergic encephalomyelitis to research on multiple sclerosis. Annals of Neurology. 60, 12-21 (2006).
  5. Kuerten, S., et al. MP4- and MOG:35-55-induced EAE in C57BL/6 mice differentially targets brain, spinal cord and cerebellum. J Neuroimmunol. 189, 31-40 (2007).
  6. Brownell, B., Hughes, J. T. The distribution of plaques in the cerebrum in multiple sclerosis. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 25, 315-320 (1962).
  7. Kidd, D., et al. Cortical lesions in multiple sclerosis. Brain. 122 (Pt 1), 17-26 (1999).
  8. Kutzelnigg, A., Lassmann, H. Cortical lesions and brain atrophy in MS. Journal of the neurological sciences. 233, 55-59 (2005).
  9. Geurts, J. J., et al. Cortical lesions in multiple sclerosis: combined postmortem MR imaging and histopathology. AJNR Am J Neuroradiol. 26, 572-577 (2005).
  10. Rasmussen, S., et al. Persistent activation of microglia is associated with neuronal dysfunction of callosal projecting pathways and multiple sclerosis-like lesions in relapsing--remitting experimental autoimmune encephalomyelitis. Brain. 130, 2816-2829 (2007).
  11. Evonuk, K. S., et al. Inhibition of System Xc(-) Transporter Attenuates Autoimmune Inflammatory Demyelination. J Immunol. 195, 450-463 (2015).
  12. Rowse, A. L., et al. Lithium controls central nervous system autoimmunity through modulation of IFN-gamma signaling. PloS one. 7, e52658 (2012).
  13. Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice. J Vis Exp. , (2014).
  14. Flaherty, S., Reynolds, J. M. Mouse Naive CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets. J Vis Exp. , (2015).
  15. McWilliams, I. L., Rajbhandari, R., Nozell, S., Benveniste, E., Harrington, L. E. STAT4 controls GM-CSF production by both Th1 and Th17 cells during EAE. J Neuroinflammation. 12, 128 (2015).
  16. Legoux, F. P., Moon, J. J. Peptide:MHC tetramer-based enrichment of epitope-specific T cells. J. Vis. Exp. , (2012).
  17. Law, J. P., et al. The importance of Foxp3 antibody and fixation/permeabilization buffer combinations in identifying CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cells. Cytometry Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 75, 1040-1050 (2009).
  18. Strober, W., et al. Monitoring cell growth. Current protocols in immunology. Appendix 3, Appendix 3A (2001).
  19. Korn, T., et al. Myelin-specific regulatory T cells accumulate in the CNS but fail to control autoimmune inflammation. Nature medicine. 13, 423-431 (2007).
  20. Pierson, E. R., Stromnes, I. M., Goverman, J. M. B cells promote induction of experimental autoimmune encephalomyelitis by facilitating reactivation of T cells in the central nervous system. Journal of immunology. 192, 929-939 (2014).
  21. Hauser, S. L., et al. B-cell depletion with rituximab in relapsing-remitting multiple sclerosis. The New England journal of medicine. 358, 676-688 (2008).
  22. Bar-Or, A., et al. Rituximab in relapsing-remitting multiple sclerosis: a 72-week, open-label, phase I trial. Ann Neurol. 63, 395-400 (2008).
  23. Kappos, L., et al. Ocrelizumab in relapsing-remitting multiple sclerosis: a phase 2, randomised, placebo-controlled, multicentre trial. Lancet. 378, 1779-1787 (2011).
  24. Berer, K., et al. Commensal microbiota and myelin autoantigen cooperate to trigger autoimmune demyelination. Nature. 479, 538-541 (2011).
  25. Bergmann, C. C., Lane, T. E., Stohlman, S. A. Coronavirus infection of the central nervous system: host-virus stand-off. Nat Rev Microbiol. 4, 121-132 (2006).
  26. Anghelina, D., Pewe, L., Perlman, S. Pathogenic role for virus-specific CD4 T cells in mice with coronavirus-induced acute encephalitis. The American Journal of Pathology. 169, 209-222 (2006).

Tags

Immunologi neuroprotektion centrala skydd nervsystemet autoimmun demyelinisering experimentell autoimmun encefalomyelit T-cell oligodendrocyt myelin multipel skleros
Fastställande dämpa immunförsvaret mot CNS skydd för farmakologisk intervention i autoimmun Demyelinisering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Evonuk, K. S., Moseley, C. E.,More

Evonuk, K. S., Moseley, C. E., Doyle, R. E., Weaver, C. T., DeSilva, T. M. Determining Immune System Suppression versus CNS Protection for Pharmacological Interventions in Autoimmune Demyelination. J. Vis. Exp. (115), e54348, doi:10.3791/54348 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter