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Neuroscience

एक microfluidic प्रवाह सेल में सीमित समर्थित bilayers फूट डालना TIRF माइक्रोस्कोपी द्वारा निगरानी के साथ एकल Proteoliposomes के जाल की मध्यस्थता फ्यूजन

Published: August 24, 2016 doi: 10.3791/54349
Automatic Translation
1,2, 1,2,3,4
1Department of Cellular and Molecular Physiology, Yale University School of Medicine, 2Nanobiology Institute, Yale University, 3Department of Molecular Biophysics and Biochemistry, Yale University, 4Laboratoire de Neurophotonique, Université Paris Descartes, Faculté des Sciences Fondamentales et Biomédicales, Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS)

Summary

यहाँ, हम liposomes और microfluidic चैनलों में समर्थित bilayers ध्रुवीकृत TIRFM उपयोग कर के बीच एकल, जाल की मध्यस्थता संलयन घटनाओं, एक अणु संवेदनशीलता और ~ 15 मिसे समय संकल्प के साथ पता लगाने के लिए एक प्रोटोकॉल उपस्थित थे। लिपिड और घुलनशील माल रिहाई एक साथ पता लगाया जा सकता है। Liposome आकार, लिपिड diffusivity, और फ्यूजन ताकना गुण मापा जाता है।

Abstract

झिल्ली संलयन की प्रक्रिया में हर जगह का एक संलयन ताकना के उद्घाटन के दो पूर्व में अलग डिब्बों के बीच पहले कनेक्शन स्थापित करता है। exocytosis के माध्यम से न्यूरोट्रांसमीटर या हार्मोन रिलीज के दौरान, संलयन ताकना क्षणिक खुला और करीब से बार-बार, विनियमन माल रिलीज कैनेटीक्स कर सकते हैं। ताकना गतिशीलता भी पुटिका रीसाइक्लिंग की विधा का निर्धारण; क्षणिक, "चुंबन एंड रन" फ्यूजन में अपरिवर्तनीय resealing परिणाम है, जबकि फैलाव पूर्ण संलयन की ओर जाता है। बेहतर क्या कारकों ताकना गतिशीलता शासन को समझते हैं, हम एक अणु संवेदनशीलता और ~ विट्रो प्रणाली में एक biochemically अच्छी तरह से परिभाषित में 15 मिसे समय संकल्प के साथ ध्रुवीकृत कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति (TIRF) माइक्रोस्कोपी का उपयोग झिल्ली संलयन की निगरानी के लिए एक परख विकसित की है। फ्यूजन के fluorescently छोटे unilamellar एक तलीय bilayer असर टी फन्दे के साथ वी-जाल प्रोटीन (वि एसयूवी) युक्त पुटिकाओं लेबल, एक नरम बहुलक गद्दी पर समर्थित (टी एसबीएल, टी समर्थित bilayer), नजर रखी है। परख microfluidic प्रवाह चैनल है कि कम से कम नमूना खपत सुनिश्चित जबकि एसयूवी की एक निरंतर घनत्व की आपूर्ति का उपयोग करता है। फ्यूजन के दौरान एसबीएल करने के लिए एसयूवी से लिपिड लेबल के हस्तांतरण पर तेजी से संकेत वृद्धि शोषण, लिपिड डाई हस्तांतरण के कैनेटीक्स नजर रखी है। TIRF माइक्रोस्कोपी की संवेदनशीलता को एक फ्लोरोसेंट लिपिड लेबल, जिसमें से लिपिड diffusivity और एसयूवी आकार हर संलयन घटना के लिए deduced जा सकता है पर नज़र रखने की अनुमति देता है। लिपिड डाई रिहाई बार बहुत लंबे समय तक हो सकता है स्थायी रूप से खुले छिद्रों के माध्यम से बेरोक पारित होने के लिए उम्मीद की तुलना में। एक मॉडल है कि मानता लिपिड रिहाई की मंदता चंचल ताकना की वजह से है, एक ताकना "खुलापन", समय के अंश ताकना संलयन के दौरान खुला रहता है का उपयोग करना, अनुमान लगाया जा सकता है। एक घुलनशील मार्कर लिपिड और घुलनशील माल रिहाई के एक साथ निगरानी के लिए एसयूवी में समझाया जा सकता है। इस तरह के मापन से संकेत मिलता है कि कुछ pores घुलनशील माल का एक अंश खोने के बाद reseal सकता है।

Introduction

झिल्ली संलयन एक सार्वभौमिक जैविक प्रक्रिया लिपिड और प्रोटीन, स्राव, निषेचन, विकास के intracellular तस्करी के लिए आवश्यक है, और मेजबान जीवों 1-3 में वायरस प्रवेश छा। Exocytosis के माध्यम से हार्मोन और न्यूरोट्रांसमीटर की रिहाई सहित ज्यादातर intracellular संलयन प्रतिक्रियाओं के लिए, दो लिपिड bilayers फ्यूज करने के लिए ऊर्जा आत्मीय घुलनशील एन ethylmaleimide के प्रति संवेदनशील कारक लगाव प्रोटीन रिसेप्टर (जाल) प्रोटीन के बीच एक चार हेलिक्स बंडल के गठन के द्वारा प्रदान की जाती है, में लंगर डाले पुटिका (वि जाल) और लक्ष्य झिल्ली (टी-जाल) 4, क्रमशः। Synaptic पुटिका exocytosis सबसे कसकर विनियमित संलयन प्रतिक्रिया है और एक संभावित कार्रवाई 1,4,5 के आने के बाद एक millisecond के भीतर होता है। फ्यूजन ताकना, दो fusing डिब्बों के बीच प्रारंभिक कनेक्शन, खुले झिलमिलाहट और resealing या अचल 5-7 विस्तार करने से पहले कई बार बंद कर सकते हैं। पूर्व परिणामक्षणिक में, जबकि दूसरा सुराग पूर्ण विलय के लिए "चुंबन और भागो" संलयन। फ्यूजन के इन दो मोड और ताकना चंचल को विनियमित करने के तंत्र के बीच संतुलन शासी कारक अच्छी तरह से 5,8 समझ नहीं रहे हैं।

SNARE प्रोटीन exocytosis के लिए आवश्यक हैं; synaptic पुटिका संलयन न्यूरोटोक्सिन 9 से फन्दे की दरार पर समाप्त कर दिया है। थोक संलयन छोटे unilamellar पुटिकाओं (एसयूवी) का उपयोग कर प्रयोगों झिल्ली संलयन 10 ड्राइव करने के लिए पर्याप्त पता चला कि फन्दे केवल आवश्यक नहीं कर रहे हैं, लेकिन यह भी। इस थोक परख में, एसयूवी वी के फन्दे (वि एसयूवी) के साथ पुनर्गठन फ्लोरोसेंट फॉस्फोलिपिड (एन साथ डाल दिया गया गया है - (7-नाइट्रो-2-1,3-benzoxadiazol-4-YL) -phosphoethanolamine (NBD पीई) और ( एन -। (lissamine rhodamine बी Sulfonyl) -phosphoethanolamine (एलआर पीई) और युक्त टी फन्दे (टी एसयूवी) वी एसयूवी में NBD पीई के प्रारंभ में प्रतिदीप्ति Förster प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण से बुझती है लेबल हटाया गया पुटिकाओं के साथ मिश्रित (झल्लाहट ) एलआर-पीई के लिए। प्रयोगशाला के रूप मेंeLED वी एसयूवी लेबल हटाया गया टी एसयूवी के साथ फ्यूज, अब संयुक्त झिल्ली में fluorophore सतह घनत्व कम हो जाता है और NBD पीई प्रतिदीप्ति में जिसके परिणामस्वरूप वृद्धि लिपिड मिश्रण 10 की हद तक रिपोर्ट। थोक परख की स्थापना की और विश्लेषण करने के लिए आसान है, यह व्यापक रूप से जाल की मध्यस्थता संलयन 10-14 के तंत्र का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। हालांकि, यह इस तरह के कम संवेदनशीलता और गरीब समय संकल्प के रूप में कई सीमाओं की है। सबसे महत्वपूर्ण बात, एक जोड़ा माप के रूप में, मुश्किल hemifusion मध्यवर्ती की डॉकिंग और फ्यूजन के बीच भेदभाव, साथ ही पता लगाने कर रही सभी घटनाओं पर यह औसत का परिणाम है।

हमारा सहित पिछले एक दशक के कई समूहों, ओवर, एकल पुटिका स्तर 15-27 में संलयन घटनाओं पर नजर रखने के लिए नए assays विकसित किया है। हा और उनके सहयोगियों वी एसयूवी एक सतह पर सीमित इस्तेमाल किया और साथ मुफ्त T-एसयूवी 18,19 उनके संलयन पर नजर रखी। लिपिड मिश्रण लिपिड को बाध्य fluorophores की एक जोड़ी के बीच झल्लाहट का उपयोग करते हुए नजर रखी थी उन्हेंवि और टी-एसयूवी, क्रमशः में पलंगों वाले, कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति (TIRF) माइक्रोस्कोपी 18 का उपयोग कर। बाद में, Brunger की प्रयोगशाला के लिए एक एकल लिपिड लेबल प्रजातियां एक साथ इस्तेमाल किया लिपिड और सामग्री मिश्रण 20,28 के एक साथ पता लगाने के लिए एक सामग्री मार्कर के साथ। दोनों लिपिड और सामग्री मार्कर के उच्च, स्व-शमन सांद्रता में शामिल थे; लेबल हटाया गया एसयूवी के साथ फ्यूजन प्रतिदीप्ति में हुई 20,28 dequenching।

दूसरों टी फन्दे 15-17,21-27,29 साथ पुनर्गठन तलीय bilayers को वी-एसयूवी जुड़े हुए हैं। लक्ष्य (टी-जाल से युक्त) bilayer बेहतर mimics छोटे, एक फ्लैट प्लाज्मा झिल्ली के साथ अत्यधिक घुमावदार पुटिकाओं के शारीरिक संलयन की प्रक्रिया के तलीय ज्यामिति। Steinem समूह T-फन्दे साथ पुनर्गठन ताकना फैले झिल्ली, एक झरझरा सिलिकॉन नाइट्राइड सब्सट्रेट पर निलंबित कार्यरत हैं और लेजर confocal माइक्रोस्कोपी स्कैनिंग 23 का उपयोग कर व्यक्ति वी एसयूवी के साथ फ्यूजन का पता चला। दूसरों चटी फन्दे साथ पुनर्गठन तलीय bilayers करने के लिए खेतों में वी-एसयूवी, एक गिलास सब्सट्रेट 15-17,21,22,24-27,29 पर समर्थन किया। समर्थित bilayers (SBLs) का उपयोग कर के महान लाभ यह है कि TIRF माइक्रोस्कोपी, उत्कृष्ट संकेत करने वाली शोर अनुपात के साथ और से मुक्त V-एसयूवी हस्तक्षेप के बिना डॉकिंग और फ्यूजन की घटनाओं का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, हालांकि microfluidics का उपयोग कर भी उपयोग कर एकल घटना संकल्प प्रदान करता है मानक दूर क्षेत्र epifluorescence माइक्रोस्कोपी 24।

एक प्रमुख चिंता का विषय है कि क्या और कैसे सब्सट्रेट-bilayer बातचीत bilayer गुणवत्ता और संलयन की प्रक्रिया का समर्थन किया प्रभावित करती है। प्रारंभिक काम है कि सीधे एक गिलास या क्वार्ट्ज सब्सट्रेट 15-17 पर समर्थित थे तलीय SBLs का इस्तेमाल किया। ये SBLs सोखना द्वारा किए गए थे, फोड़, प्रसार और सब्सट्रेट पर टी एसयूवी झिल्ली के संलयन। शीघ्र ही यह एहसास हो गया था कि, हालांकि, एक प्रमुख टी SNARE घटक को छोड़ते हुए, SNAP25, इस तरीके से तैयार SBLs से वी-एसयूवी डॉकिंग और फ्यूजन कैनेटीक्स indistinguis में हुईपूरा टी फन्दे 17 का उपयोग कर प्राप्त उन लोगों से Hable। क्योंकि SNAP25 बिल्कुल विवो 30,31 में संलयन के लिए आवश्यक है, इन शुरुआती प्रयासों की शारीरिक प्रासंगिकता सवाल में डाल दिया था। Tamm के समूह बेहतर समर्थित नियंत्रित bilayer गठन 21 का उपयोग करके इस चुनौती overcame। यह प्रोटीन से मुक्त एसबीएल के पहले पत्रक, टी 21 के साथ एसयूवी कि monolayer के विलय के बाद के लिए Langmuir-Blodgett बयान का इस्तेमाल किया। इस SNAP25 निर्भर संलयन में हुई।

एक bilayer सीधे Langmuir-Blodgett तरीकों का उपयोग करने की आवश्यकता के बिना एक गिलास सब्सट्रेट पर समर्थित के साथ जुड़े संभावित कलाकृतियों से बचने के लिए, Karatekin एट अल। शुरू की एक नरम, हाइड्रेटेड पाली (एथिलीन ग्लाइकोल) (खूंटी) bilayer और सब्सट्रेट 24 के बीच तकिया। इस संशोधन भी SNAP25 निर्भर फ्यूजन 24 में हुई। एक नरम बहुलक परत पर तकिये bilayers बेहतर transmembrane संरक्षित करने के लिए ज्ञात किया गया थाप्रोटीन गतिशीलता और समारोह 32, और वायरस के 33 के साथ फ्यूजन अध्ययन में इस्तेमाल किया गया था। इसके अलावा, PEGylated bilayers-चंगा आत्म करने के लिए कुछ करने की क्षमता बनाए रखने के लिए लग रहे हैं और बहुत मजबूत 34,35 हैं। सबसे पहले, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध, लिपिड से जुड़े खूंटी चेन का एक अंश टी एसयूवी झिल्ली में शामिल किए गए हैं। इन टी-एसयूवी फट और एक गिलास सब्सट्रेट पर एक planar bilayer फार्म जब, एक खूंटी ब्रश तलीय bilayer के दोनों पत्रक शामिल किया गया है। क्योंकि तलीय bilayer गठन हाइड्रोफिलिक कांच की सतह पर आसपास के टी-एसयूवी खूंटी चेन के आसंजन द्वारा संचालित है, liposome फोड़ और तलीय bilayer गठन अपेक्षाकृत लिपिड इस्तेमाल किया संरचना करने के लिए असंवेदनशील हैं। हालांकि, जब कोलेस्ट्रॉल की बड़ी मात्रा में शामिल किए गए हैं, एसयूवी के एकजुट गुण बढ़ रही है, एसयूवी अनायास नहीं फट सकता है। यदि यह मामला है, आसमाटिक सदमे या द्विसंयोजक आयनों तलीय bilayer गठन 25 मदद करने के लिए नियोजित किया जा सकता है।

ऊपर उल्लेख किया है, इस एपी के रूप मेंproach एक खूंटी ब्रश तलीय के दोनों पक्षों को शामिल किया गया है, bilayer का समर्थन किया। ब्रश microfluidic प्रवाह चैनल का सामना करना पड़ भेजे वी एसयूवी जो भी आम तौर पर एक खूंटी परत के साथ कवर कर रहे हैं की अविशिष्ट आसंजन को रोकने में मदद करता है। वि और टी-जाल परिसरों के गठन झिल्ली बाहर एन Termini और झिल्ली समीपस्थ डोमेन 36 की ओर चरणों में आय से शुरू होता है। वी-एसयूवी टी एसबीएल, वि और खूंटी ब्रश, जो परख की शर्तों के तहत मामला प्रतीत हो रहा है ऊपर फैलाना टी SNARE एन Termini जरूरत के साथ बातचीत करने के लिए। ब्रश ऊंचाई PEGylated लिपिड का घनत्व और खूंटी श्रृंखला लंबाई 37,38 अलग से फन्दे से अन्य प्रोटीन का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। Fusing bilayers के समीपस्थ सतहों को कवर खूंटी ब्रश का एक अन्य लाभ यह है कि वे जैविक झिल्लियों जो वर्ग माइक्रोन 39 प्रति 30,000-40,000 अभिन्न झिल्ली प्रोटीन के साथ पैक कर रहे हैं के भीड़ भरे वातावरण की नकल है। बस इस परख में खूंटी चेन की तरह, repulsive प्रोटीन की परत जैविक झिल्लियों को कवर करने के लिए एक तरफ संलयन होने के लिए दो फॉस्फोलिपिड bilayers के बीच संपर्क के लिए अनुमति देने के लिए धक्का दिया जा जरूरत है।

Microfluidic प्रवाह चैनल, इस परख में इस्तेमाल के रूप में वे अद्वितीय लाभ की पेशकश कर रहे हैं। सबसे पहले, microfluidic प्रवाह टी एसबीएल फार्म के लिए टी-एसयूवी की अधिक समान बयान प्रसार करने के लिए और फ्यूज सक्षम बनाता है। दूसरा, छोटे चैनल मात्रा (<1 μl) नमूना खपत को कम करता है। तीसरा, छोटे आवश्यक मात्रा पूरे प्रयोग के निरंतर प्रवाह के तहत आयोजित किया जा करने के लिए अनुमति देते हैं। प्रवाह कमजोर निकालता है, शायद गैर-विशेष रूप से, एसबीएल 16 से पालन वी एसयूवी। यह भी टी एसबीएल ऊपर वी एसयूवी, गतिज विश्लेषण 17 को सरल बनाने की एक निरंतर घनत्व को बनाए रखता है। अंत में, डॉक पुटिकाओं आसानी से लोगों को मुफ्त प्रवाह 25 के द्वारा किया जाता से प्रतिष्ठित हैं। चौथा, कई microfluidic चैनलों ही coverslip पर इस्तेमाल किया जा सकता है, प्रत्येक एक अलग हालत की जांच कर रही। यह शर्तों Duri की तुलना की अनुमति देता हैएक ही प्रयोगात्मक रन एनजी। एक समान दृष्टिकोण वैन Oijen समूह द्वारा इस्तेमाल किया गया है इन्फ्लूएंजा वायरस और तकिये SBLs 33 के बीच विलय का अध्ययन करने के लिए।

TIRF माइक्रोस्कोपी में, क्षणभंगुर क्षेत्र का तेजी से क्षय उन अणुओं है कि गिलास बफर इंटरफेस के बहुत करीब निकटता में हैं सीमीत प्रतिदीप्ति उत्तेजना (एक क्षय निरंतर ~ 100 एनएम के साथ)। इस फ्लोरोसेंट अणुओं है कि आगे दूर कर रहे हैं के योगदान को कम करता है, संकेत करने वाली शोर अनुपात बढ़ जाती है, और 10-40 मिसे के फ्रेम जोखिम समय के साथ एक अणु संवेदनशीलता की अनुमति देता है। क्षणभंगुर क्षेत्र भी संलयन पर एक संकेत वृद्धि हो जाती है: एसबीएल में एसयूवी से लेबल लिपिड हस्तांतरण के रूप में, वे खुद को पाते हैं, औसतन, एक मजबूत उत्तेजना क्षेत्र में। प्रतिदीप्ति में यह वृद्धि बड़ा liposomes के लिए मजबूत है।

ध्रुवीकरण प्रकाश क्षणभंगुर क्षेत्र उत्पन्न करने के लिए प्रयोग किया जाता है, तो अतिरिक्त प्रभाव टी पर प्रतिदीप्ति में परिवर्तन करने के लिए योगदानएसबीएल में एसयूवी से लेबल की ransfer। कुछ लिपिड रंगों एक संक्रमण द्विध्रुवीय bilayer जिसमें वे एम्बेडेड रहे हैं करने के लिए सम्मान के साथ एक पसंदीदा मतलब कोण के साथ उन्मुख है। के बाद से ध्रुवीकृत किरण अलग ढंग से दो झिल्लियों में रंगों उत्तेजित होगा यह fluorophores द्वारा उत्सर्जित जब वे एसबीएल बनाम एसयूवी में हैं प्रतिदीप्ति की राशि में एक अंतर पैदा करता है। पूर्व के लिए, उत्तेजना बीम, गोलाकार एसयूवी चारों ओर उन्मुख संक्रमण द्विध्रुव के साथ बातचीत जबकि बाद के लिए, द्विध्रुवीय झुकाव द्वारा फ्लैट एसबीएल ज्यामिति ही सीमित हो जाएगा। उदाहरण के लिए, जब एस ध्रुवीकृत घटना प्रकाश (घटना के विमान को सामान्य ध्रुवीकरण) का इस्तेमाल किया जाता है, उत्तेजना और अधिक कुशल है जब डाई झिल्ली 29,40 करने के लिए एक लिपिड डाई संक्रमण द्विध्रुवीय उन्मुख समानांतर के लिए एसयूवी की तुलना में एसबीएल में है (जैसे DiI की है कि या था 41-43 के रूप में)। एक एसयूवी में इस तरह के एक fluorophore साथ डाल दिया गया मंद प्रकट होता है जब यह एसबीएल (चित्रा 7, REPRESENTAT पर नाव ive परिणाम)। एक संलयन रोमकूप खुल जाता है और एसयूवी और एसबीएल झिल्ली को जोड़ता है के रूप में, फ्लोरोसेंट जांच एसबीएल में फैलाना और अधिक एस ध्रुवीकरण क्षणभंगुर क्षेत्र 25,27,29 से उत्साहित होने की संभावना बन जाते हैं। नतीजतन, प्रतिदीप्ति संलयन साइट के आसपास एकीकृत संकेत एसबीएल 27 (3 चित्रा और चित्रा 7) में एसयूवी से डाई हस्तांतरण के दौरान तेजी से बढ़ जाती है। एक अतिरिक्त कारक है कि परिवर्तन के साथ फ्यूजन फ्लोरोसेंट लेबल के dequenching है के रूप में वे पतला कर रहे हैं जब एसबीएल में स्थानांतरित संकेत करने के लिए योगदान देता है। dequenching के योगदान, परख यहाँ वर्णित में क्षणभंगुर क्षेत्र क्षय और ध्रुवीकरण प्रभाव की तुलना में आम तौर पर नाबालिग है, क्योंकि केवल एक छोटा सा अंश ( 1 समीकरण ) लिपिड के लेबल रहे हैं।

फ्यूजन पर संकेत वृद्धि समय की तुलना द्वारा संलयन ताकना गुण परिणाम निकालना शोषण किया जा सकता है,1 "src =" / files / ftp_upload / 54349 / 54349eq2.jpg "/>, एक लिपिड एक ताकना कि स्वतंत्र रूप से वास्तविक रिलीज के समय के लिए लिपिड के लिए पारगम्य है के माध्यम से बचने के लिए आवश्यक है, 1 समीकरण । दो समय तराजू तुलना कर रहे हैं, तो यह निष्कर्ष निकाला जा सकता है कि ताकना लिपिड प्रवाह करने के लिए थोड़ा प्रतिरोध प्रस्तुत करता है। हालांकि, अगर वास्तविक रिलीज के समय में काफी प्रसार सीमित रिहाई के लिए समय की तुलना में अब है, यह एक प्रक्रिया ऐसी ताकना चंचल के रूप में संकेत होता है, लिपिड रिहाई की गति को धीमा। प्रसार-सीमित रिलीज के समय, 1 समीकरण , Fusing liposome और लिपिड diffusivity के आकार पर निर्भर करता है; अपने आकलन के इन दो मापदंडों मात्रा निर्धारित किया जा करने की आवश्यकता है। परख का एक अणु संवेदनशीलता लिपिड diffusivity हर संलयन घटना 26 के लिए एसबीएल में उनकी रिहाई के बाद कई एकल लिपिड fluorophores पर नज़र रखने से मापा जा करने की अनुमति देता है। हर fusing पुटिका के आकार(i) एक एकल लिपिड डाई की तीव्रता, (ii) एक डॉकिंग स्थल के आसपास की कुल प्रतिदीप्ति में परिवर्तन के बाद सभी fluorophores संलयन पर एसबीएल में स्थानांतरित कर रहे हैं, (iii) में जाना जाता लेबलिंग एसयूवी के घनत्व के संयोजन से 27 अनुमान लगाया जा सकता लिपिड, और (iv) लिपिड प्रति क्षेत्र। कई संलयन घटनाओं के लिए, वास्तविक लिपिड रिलीज के समय के रूप में पहले उल्लेख किया गया था वर्दी एसयूवी आकार 44 संभालने, प्रसार नियंत्रित रिहाई 27 तक होने की उम्मीद की तुलना में धीमी होना पाया गया है। मान लिया जाये कि लिपिड रिहाई की मंदता चंचल ताकना की वजह से है, एक मात्रात्मक मॉडल "ताकना खुलापन" के आकलन की अनुमति देता है, समय के अंश ताकना फ्यूजन 27 के दौरान खुला रहता है।

जब भी व्यावहारिक है, यह दोनों लिपिड और घुलनशील सामग्री लेबल का उपयोग संलयन तंत्र का परीक्षण करने के लिए महत्वपूर्ण है। उदाहरण के लिए, लिपिड रिलीज में इस तरह के जाल प्रोटीन है कि टी चारों ओर से लिपिड प्रसार के प्रतिबंध के रूप में ताकना चंचल के अलावा अन्य प्रक्रियाओं, द्वारा मंद किया जा सकता हैवह ताकना। अगर इस मामले थे, तब, सामग्री की रिहाई लिपिड लेबल की रिहाई के पूर्व में होना होगा प्रदान की ताकना काफी बड़े घुलनशील जांच के पारित होने की अनुमति है। दृष्टिकोण में एक और अधिक मौलिक दोष धारणा एसबीएल लेबल लिपिड का हस्तांतरण एक पुटिका कि मोटे तौर पर अपनी पूर्व संलयन आकार को बरकरार रखा है एसबीएल जोड़ने के लिए एक संकीर्ण संलयन ताकना के माध्यम से होता है कि हो सकता है। एसबीएल में लिपिड हस्तांतरण भी, जैसा कि पहले लिपिड रिलीज डेटा अकेले 29 के आधार पर सुझाव दिया एक सहवर्ती साथ फ्यूजन ताकना, एसबीएल झिल्ली में एसयूवी की बेहद तेजी से पतन का तेजी से फैलाव से हो सकता है। दोनों लिपिड निगरानी और सामग्री को एक साथ रिलीज, यह पाया गया है कि कई pores अपने सभी लिपिड लेबल को जारी करने के बाद resealed, लेकिन उनके घुलनशील माल 27 के कुछ बरकरार रखा। यह इंगित करता है कि कम से कम कुछ liposomes संलयन के बाद एसबीएल में पतन नहीं, और एसबीएल में लिपिड डाई हस्तांतरण एक संलयन ताकना के माध्यम से होता है। इसके अलावा, एलipid और सामग्री जारी एक साथ 27 हुई, यह संभावना नहीं है कि लिपिड रिहाई की मंदता ताकना 45 के आस-पास जाल प्रोटीन द्वारा लिपिड प्रसार की बाधा के कारण किया गया था बना रही है।

एक एसयूवी-एसबीएल संलयन प्रोटोकॉल है कि घुलनशील सामग्री जारी की निगरानी नहीं था कि पहले Karatekin और रोथमान 25 द्वारा प्रकाशित किया गया था। इधर, अधिक हाल के घटनाक्रम शामिल किए गए हैं, लिपिड का अर्थात् एक साथ निगरानी और सामग्री जारी है और एसयूवी, लिपिड, और फ्यूजन ताकना गुण 27 के आकलन। प्रोटोकॉल एक गिलास coverslip 25 के साथ microfluidic कोशिकाओं, एक पाली (डाइमिथाइल siloxane) से संबंध बना (PDMS) elastomer ब्लॉक युक्त खांचे तैयार करने के लिए निर्देश के साथ शुरू होता है। फिर, दोनों लिपिड और सामग्री मार्कर के साथ वी-एसयूवी की तैयारी समझाया गया है। धारा 4 और 5, microfluidic कोशिकाओं कोडांतरण बगल में SBLs बनाने और दोषों और तरलता के लिए जाँच, वी.एस. की शुरूआत के लिए निर्देश प्रदानप्रवाह कोशिकाओं और फ्यूजन की घटनाओं का पता लगाने में यूवी। धारा 6 डेटा विश्लेषण के लिए निर्देश प्रदान करता है।

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Protocol

1. एक PDMS ब्लॉक की तैयारी microfluidic चैनल पर्चा

आकृति 1
चित्रा 1. प्रवाह सेल टेम्पलेट और PDMS ब्लॉक तैयारी के Microfabrication। (ए) एक चार चैनल प्रवाह सेल कि एक 24 x 60 मिमी गिलास coverslip (नीचे) पर फिट बैठता है के डिजाइन। छह समान डिजाइन एक 10 सेमी सिलिकॉन वेफर (ऊपर) पर फिट करने के लिए व्यवस्था कर रहे हैं। (बी) के एक छेद छेदने पर लगभग 5-8 मिमी मोटी PDMS की ब्लॉक बाहर कट। (सी) निवेशन चिमटी की एक जोड़ी का उपयोग छिद्रित छेद में ट्यूबिंग की। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

  1. ऐसे चित्रा 1 ए में एक के रूप में एक प्रवाह सेल टेम्पलेट प्राप्त करते हैं। ठेठ चैनलों 0.3-1 मिमी चौड़ा, 70-100 माइक्रोन उच्च है, और 1-2 सेमी लंबे होते हैं। एक टेम्पलेट हमें बनानाएक cleanroom सुविधा 25 या क्रम में मानक photolithography तकनीक आईएनजी यदि cleanroom पहुँच उपलब्ध नहीं है। वैकल्पिक रूप से, मशीन एक उपयुक्त सामग्री से बड़ा आयामों के साथ एक टेम्पलेट।
    नोट: Cleanroom कर्मचारियों को प्रशिक्षित और अनुभवहीन उपयोगकर्ताओं के डिजाइन और एक मुखौटा, मे सफाई, और फोटोलिथोग्राफी के आदेश में (एक cleanroom सुविधा के लिए उपयोग हमेशा उचित प्रशिक्षण के साथ उन तक ही सीमित है) में मार्गदर्शन कर सकते हैं। एक बार एक टेम्पलेट प्राप्त की है, यह बार बार cleanroom बाहर किया जा सकता है कि यह एक बंद डिश में रखा जाता है और देखभाल धूल बाहर करने के लिए लिया जाता है प्रदान की है।
  2. एक डिस्पोजेबल प्लास्टिक के कप में (सिलिकॉन elastomer आधार) पार linker (इलाज एजेंट) के 10 मिलीलीटर एक ~ 100 मिलीलीटर PDMS के मिश्रण और ~ तैयार करें। और अधिक आसानी से चिपचिपा PDMS को संभालने के लिए एक डिस्पोजेबल पिपेट की नोक बंद तोड़। प्लास्टिक के कप में PDMS वजन के रूप में pipetting सही नहीं है।
  3. मिश्रण अच्छी तरह से हिलाओ। एक निर्वात desiccator में degassing द्वारा कई हवाई बुलबुले निकालें (लगभग 20मिनट)। के रूप में कप वैक्यूम के अंतर्गत रखा गया है, बुलबुले शुरू में आकार में बड़े होते हैं, बहुत मिश्रण की मात्रा में वृद्धि होगी। वैक्यूम कि लागू किया जाता है पर नियंत्रण रखें और सुनिश्चित कप काफी गहरी एक फैल से बचने के लिए करते हैं।
  4. एक गिलास पेट्री डिश (150 मिमी x 20 मिमी) में degassed PDMS मिश्रण की एक बड़ी गिरावट डालो और टेम्पलेट का सामना करना पड़ के साथ PDMS पर वेफर दबाएँ। इस से बचा जाता है बुलबुले वेफर के नीचे फंसाया जा रहा है। फँसा बुलबुले का विस्तार होगा और जब पकवान ओवन में रख दिया गया है वेफर झुकाव सकता है। अब वेफर के शीर्ष पर टेम्पलेट पर degassed PDMS डालना जब तक यह PMDs के बारे में 5-8 मिमी से कवर किया जाता है। एक हवाई बुलबुले धीरे होता है, तो एक विंदुक टिप के साथ इसे हटा दें।
  5. 3 घंटे के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर एक ओवन में PMDs बनाओ। सुनिश्चित करें कि पकवान स्तर है।
  6. एक नए स्केलपेल ब्लेड का प्रयोग एक PDMS ढाला चैनल संरचनाओं से युक्त ब्लॉक को काटने के लिए। ब्लॉक में कटौती से बाहर एक coverslip पर फिट करने की जरूरत है (कदम 4.1.9 देखें)।
  7. डिश से ब्लॉक में कटौती से बाहर बाहर छील और पीएलसाफ एल्यूमीनियम पन्नी के एक टुकड़े पर यह ऐस।
    नोट: पार से जुड़े PMDs ब्लॉकों में कुछ महीनों के लिए रखा जा सकता है। एक भी वेफर पर, वहाँ प्रवाह चैनल (चित्रा 1 ए) के 6 सेट है, तो 6 PDMS ब्लॉकों एक एकल PDMS ढलाई में उत्पादन किया जा सकता है। PDMS ब्लॉक, PDMS की साफ ढीला टुकड़े के सभी 6 काटने के बाहर है, लेकिन अन्यथा डालने के लिये और अगले बैच है, जो केवल पहले बैच के लिए इस्तेमाल किया PDMS बारे में आधे की आवश्यकता होगी पार से जोड़ने से पहले शेष PDMS हटा नहीं है के बाद। एक अच्छा टेम्पलेट में कुछ साल पिछले सकता है।
  8. एक सीधे मोशन (चित्रा 1 बी) में PDMS ब्लॉक के माध्यम से ड्रिल करने के लिए एक छेद छेदने का प्रयोग करें। चैनल खांचे के पक्ष में शुरू करो। PDMS का टुकड़ा बाहर मुक्का मारा दूर करने के लिए सुनिश्चित करें। चार चैनल डिजाइन के सभी आठ छेद के लिए इस दोहराएँ।
  9. PDMS ब्लॉक चैनल की ओर एल्यूमीनियम पन्नी की एक नई और शिकन मुक्त टुकड़े पर नीचे रखें। एक सूखी बॉक्स में कुछ महीने तक के लिए ब्लॉक स्टोर, आदर्श Desiccator में।
  10. चिमटी (चित्रा 1 सी) की एक जोड़ी का उपयोग छिद्रित छेद में एक तिहाई के बारे में ट्यूबिंग (0.25 मिमी आईडी, 0.76 मिमी आयुध डिपो) पुश। ट्यूबिंग आसान प्रविष्टि के लिए slanted कट। नलियों छोड़ दो काफी देर तक एसयूवी जलाशय और सिरिंज पंप, क्रमशः तक पहुँचने के लिए। माइक्रोस्कोप पर इकट्ठे चिप रखने के बाद, यदि वे भी लंबे होते हैं फिर नलियों काटा।
  11. पंप के सीरिंज से कनेक्ट करने के लिए, बड़ा सिलिकॉन टयूबिंग (0.51 मिमी आईडी, 2.1 मिमी आयुध डिपो) के एक छोटे टुकड़े काट रहे हैं और एक पक्ष में पतली ट्यूब डालें। PDMS की यह तैयार करने के लिए उपयोग ब्लॉक में कुछ महीनों के लिए रखा जा सकता है।

2. Coverslip सफाई

  1. प्रोटोकॉल सल्फ्यूरिक एसिड (एच 2 अतः 4) और हाइड्रोजन पेरोक्साइड के एक मजबूत ऑक्सीकरण मिश्रण का उपयोग Karatekin और रोथमान 25 में वर्णित के अनुसार स्वच्छ coverslips (एच 2 ओ 2)। एक cleanroom में इस प्रक्रिया का प्रदर्शन, और उचित सुरक्षा सावधानियों का पालन। वैकल्पिक रूप से, का उपयोग एक cleanroom साफ गoverslip कि व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है (देखें सामग्री सूची)।

दोनों लिपिड और सामग्री लेबल युक्त वी-एसयूवी की 3. तैयारी

चित्र 2
चित्रा 2 एसयूवी तैयारी के योजनाबद्ध। लिपिड एक ग्लास ट्यूब (1) में मिश्रित कर रहे हैं और विलायक एक पानी के स्नान में ट्यूब घूर्णन द्वारा एक लिपिड फिल्म बनाने के लिए सुखाया जाता है (2)। विलायक के शेष निशान उच्च वैक्यूम (3) के तहत हटा दिया जाता है। लिपिड फिल्म डिटर्जेंट और प्रोटीन युक्त पुनर्गठन बफर में हाइड्रेटेड है, जबकि vortexed (4)। सामग्री डाई समझाया जा रहा है, यह इस चरण में के रूप में अच्छी तरह से कमजोर पड़ने कदम (5) में शामिल है। अपनी महत्वपूर्ण मिसेल एकाग्रता नीचे डिटर्जेंट एकाग्रता के कमजोर पड़ने के गठन liposome की ओर जाता है। डिटर्जेंट रात भर दूर dialyzed है (6)। NBD पीई (हरा) सहित एसबीएल गठन के लिए टी-एसयूवी के लिए, पुटिकाओं एक घनत्व ढाल में मंगाई और कम से एकत्र कर रहे हैंदो परतों (7) के बीच इंटरफेस। Encapsulated सामग्री मार्कर मुक्त डाई से नमूना एक आकार अपवर्जन स्तंभ पर चलाने के लिए और 0.5 मिलीलीटर भिन्न (7 बी) में एकत्र किया जाता है के साथ वी-एसयूवी अलग। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

  1. पुनर्गठन बफर के 4 एल, 25 मिमी HEPES-कोह, 140 मिमी KCl, 100 माइक्रोन के EGTA और 1 मिमी डीटीटी, पीएच 7.4 से युक्त तैयार करें। अन्य चरणों के लिए डायलिसिस और 100 मिलीलीटर के लिए बफर का सबसे अधिक उपयोग।
    नोट: अन्य बफ़र्स इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन यह बफर परासारिता प्रयोग भर में लगातार रखने के लिए और जिन परिस्थितियों में प्रोटीन कार्य कर रहे हैं चुनने के लिए महत्वपूर्ण है। केवल लिपिड लेबलों युक्त वी-एसयूवी और टी-एसयूवी की तैयारी के लिए, Karatekin और रोथमान 25 का पालन करें।
  2. लिपिड शेयरों क्लोरोफॉर्म या क्लोरोफॉर्म में -20 डिग्री सेल्सियस पर जमा हो जाती है के रूप में: मेथनॉल (2: 1, वी / वी), शीशियों को खोलने से पहले कमरे के तापमान तक पहुँचनेसंघनन से बचें।
  3. क्लोरोफॉर्म के साथ एक ग्लास ट्यूब कुल्ला क्लोरोफॉर्म और मेथनॉल का एक मिश्रण में 1 μmol की अंतिम राशि के साथ वांछित अनुपात में डिटर्जेंट की मात्रा का पता लगाने को हटाने और लिपिड मिश्रण करने के लिए (2: 1, वी / वी)। केवल कांच सीरिंज / ट्यूब का उपयोग कार्बनिक सॉल्वैंट्स / भंग लिपिड संभालने के लिए।
    नोट: SAPE: DOPS: कोलेस्ट्रॉल: PEG2000-डोप: यहां इस्तेमाल किया लिपिड POPC हैं 15: 12: 10: 4.6: 1 वी जाल युक्त vesicles और POPC के लिए: SAPE: DOPS: कोलेस्ट्रॉल का 57.4 एक दाढ़ अनुपात में किया था : मस्तिष्क पीआई (4,5) पी 2: PEG2000-डोप: NBD-पीई (54.9: 15: 12: 10: 3: 4.6: 0.5) टी-जाल एसयूवी के लिए। जानकारी के लिए सामग्री देखें। अन्य लिपिड रचनाओं में इस्तेमाल किया जा सकता है।
  4. नाइट्रोजन की एक सौम्य धारा के अंतर्गत विलायक लुप्त हो जाना, या एक रोटरी बाष्पीकरण में। एक पानी के स्नान (37 डिग्री सेल्सियस) लिपिड के उच्चतम पिघलने तापमान ऊपर गर्म एक समरूप लिपिड फिल्म उपज के लिए और जब तक विलायक वाष्पन तापमान में बड़े परिवर्तन से बचने के लिए ट्यूब की नोक विसर्जित कर दिया। आसपास वैक्यूम शुरू300 मिलीबार जब तक लिपिड फिल्म बनाई है, तो रोटरी बाष्पीकरण में ~ 2 के लिए मिनट पर उच्चतम संभव वैक्यूम जारी है।
  5. ग्लास ट्यूब निकालें और एल्यूमीनियम पन्नी में लपेट प्रकाश जोखिम से बचने और कम से कम 2 घंटे के लिए उच्च वैक्यूम के अंतर्गत Desiccator में ट्यूब डाल द्वारा विलायक के शेष निशान को दूर करने के लिए। यह कदम भी रात भर चला सकते हैं।
  6. सूखे लिपिड फिल्म rehydrate करने के लिए, एक साबुन की (एन Octyl-β-D-glucopyranoside, ओग) पुनर्गठन बफर में (500 μl अंतिम मात्रा) मिश्रण, प्रोटीन (वि फन्दे), और SRB तैयार करते हैं। महत्वपूर्ण मिसेल एकाग्रता (सीएमसी, ओग के लिए 20-25 मिमी) के ऊपर अंतिम डिटर्जेंट एकाग्रता 2 बार रखें ~ और अंतिम मात्रा समायोजित ऐसी है कि लिपिड अनुपात करने के लिए डिटर्जेंट> 10 है। धीरे समाधान झटकों से 10-50 मिमी SRB के अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए प्रोटीन डिटर्जेंट समाधान में Sulforhodamine बी (एसआरबी) पाउडर भंग। जब सह कम करने से SRB की उच्च सांद्रता जोड़ने पुनर्गठन बफर की osmolarity समायोजित करेंतदनुसार पोटेशियम क्लोराइड की ncentration।
    नोट: टी-फन्दे के लिए लिपिड करने वाली प्रोटीन अनुपात (एलपी) उच्च (। एल.पी. ~ 20,000, ~ प्रति वर्ग 70 टी फन्दे माइक्रोन 25) है। गौरतलब है कि एसबीएल में उच्च टी जाल घनत्व निष्क्रिय प्रोटीन समुच्चय को जन्म दे सकती साथ काफी संलयन दरों 17,24 कम हो। वी के फन्दे के लिए एल.पी. काफी कम (एल.पी. ~ 200, माइक्रोन 2 प्रति 7,000 वी के फन्दे ~), synaptic पुटिकाओं 46,47 पर पाया वी जाल घनत्व के करीब है। पुनः संयोजक अभिव्यक्ति और वि और टी फन्दे की शुद्धि के बाद प्रोटीन समारोह सुनिश्चित करने के लिए यह एक पुटिका संलयन परख के सभी चरणों के माध्यम से जाने से पहले एक सरल थोक संलयन परख 48 प्रदर्शन करने के लिए उपयोगी है।
  7. धीरे सूखे लिपिड फिल्म युक्त जबकि 3.6 कदम से प्रोटीन डिटर्जेंट SRB समाधान जोड़ने पूर्व गर्म ग्लास ट्यूब हिला। बुलबुले बनाने से बचने की कोशिश करें। 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए मंथन करने के लिए आगे बढ़ें।
  8. डिटर्जेंट पुनर्गठन जोड़कर पांचगुना पतलाजबकि तेजी से एकाग्रता ढ़ाल से बचने के लिए vortexing बफर युक्त SRB (2 मिलीलीटर, 2.5 मिलीलीटर अंतिम मात्रा जोड़)। 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए 15 मिनट के लिए मंथन करने के लिए आगे बढ़ें।
    नोट: अब ऊष्मायन वृद्धि प्रोटीन पुनर्गठन दक्षता। तेजी से कमजोर पड़ने सीएमसी नीचे डिटर्जेंट एकाग्रता कम हो जाती है और छोटे liposomes के गठन की ओर जाता है।
  9. परिवेश के तापमान पर 1-2 घंटा और फिर 3 के खिलाफ polystyrene पी लेनेवाला के 4 ग्राम, एक 20,000 MWCO डायलिसिस ट्यूब या कैसेट का उपयोग कर के साथ रात भर पुनर्गठन बफर के एल 4 डिग्री सेल्सियस पर लिए पहली Dialyze पुटिका निलंबन पुनर्गठन बफर के खिलाफ ~ 1 एल। पार संक्रमण को रोकने के साथ और बिना SRB पुटिकाओं के डायलिसिस के लिए अलग बीकर का प्रयोग करें।
  10. पुनर्गठन बफर के साथ एक जेल निस्पंदन स्तंभ संतुलित करना। स्तंभ के माध्यम से पुटिका निलंबन भागो समझाया SRB के साथ वी-एसयूवी से मुक्त SRB अलग करने के लिए। eluent के रूप में SRB बिना पुनर्गठन बफर का प्रयोग एक बार पूरे नमूना हैस्तंभ में प्रवेश किया। 0.5 मिलीलीटर भागों में वी-एसयूवी लीजिए।
  11. पहले और पुटिकाओं 16 के एक विभाज्य करने के लिए डिटर्जेंट के अलावा के बाद SRB प्रतिदीप्ति मापने के द्वारा आत्म-बुझती सांद्रता में सफल SRB encapsulation की जाँच करें। एक प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रोमीटर का प्रयोग, 550 एनएम पर नमूना उत्तेजित और 570 एनएम और 630 एनएम के बीच SRB उत्सर्जन स्कैन। डिटर्जेंट अलावा पर समझाया राशि के आधार पर SRB प्रतिदीप्ति में 4-8 गुना वृद्धि की उम्मीद के रूप में झिल्ली solubilized है और जारी SRB पतला है।
  12. प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रोस्कोपी 24 और एसडीएस पृष्ठ जेल वैद्युतकणसंचलन का उपयोग लिपिड और प्रोटीन वसूली, क्रमशः विशेषताएँ। एक संवेदनशील धुंधला विधि का उपयोग करें, विशेष रूप से उच्च एल.पी. टी एसयूवी नमूने के लिए (देखें सामग्री सूची)। आम तौर पर दोनों लिपिड और प्रोटीन इनपुट के बारे में 50% की तैयारी एक एलपी नाममात्र मूल्य के करीब है, जिसके परिणामस्वरूप के दौरान खो दिया है।
  13. विशेषताएँ एसयूवी आकार गतिशील प्रकाश बिखरने 24 या इलेक्ट्रॉन microsco का उपयोग करPY 48। स्टोर SRB ~ 3-4 दिनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर वी-एसयूवी युक्त अप। स्थिर नहीं है, के रूप में ठंड और विगलन झिल्ली और रिलीज समझाया SRB टूट जाता है।

4. एसयूवी-एसबीएल फ्यूजन परख लिपिड रिलीज केवल मॉनिटर करने के लिए

  1. Microfluidic प्रवाह चैनलों के भीतर सीमित समर्थित bilayer का गठन
    1. प्रयोग करने से पहले कम से कम 20 मिनट के लिए PDMS ब्लॉक (कदम 1.11) उच्च वैक्यूम के तहत जगह भंग गैसों हटा दें। यह बहुत संलयन प्रयोग के दौरान microfluidic चैनलों में हवा के बुलबुले के जोखिम को कम करता है।
    2. माइक्रोस्कोप सेटअप को चालू करें और वांछित तापमान के लिए मंच और नमूना धारक (आंकड़े 3 और 4) गर्मी।
    3. पुनर्गठन 0.45 माइक्रोन या छोटे छेद के आकार के साथ एक फिल्टर के माध्यम से पुटिकाओं को कमजोर करने के लिए इस्तेमाल बफर फ़िल्टर।
    4. पतला ~ NBD पीई के 30 μl लेबल टी एसयूवी या प्रोटीन से मुक्त (पीएफ-एसयूवी) नियंत्रण liposomes (शेयरसमाधान 0.5-1 मिमी लिपिड) बफर के ~ 60 μl के साथ। अंतिम एकाग्रता यहां महत्वपूर्ण नहीं है।
    5. देगास इस मिश्रण को एक 3 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग। खड़ी सिरिंज धारण करते हुए नमूना ऊपर हवा के सबसे बाहर दबाएँ। आयल फिल्म का उपयोग (सुई मुक्त) टिप को सील करने और सवार नीचे खींच कर एक निर्वात पैदा करते हैं। समाधान की degassing तेजी लाने के लिए सिरिंज प्रति बैरल टैप करें। जब तक कोई और अधिक बुलबुले होती है जब वैक्यूम लागू किया जाता है इस प्रक्रिया को दोहराएं एक बार कुछ।
    6. एक व्यास ट्यूबिंग कि PDMS ब्लॉक से जुड़ा हुआ है एक microcentrifuge ट्यूब की टोपी में एक छेद पंच के लिए की तुलना में थोड़ा बड़ा है के साथ एक चमड़े के नीचे सुई का प्रयोग करें। सुनिश्चित करें कि प्लास्टिक का टुकड़ा बाहर मुक्का मारा ट्यूब के अंदर के रूप में यह ट्यूबिंग बाद में microfluidic चैनल इनलेट से जुड़े रोकना शायद नहीं है सुनिश्चित करें।
    7. टोपी में एक छेद होने microcentrifuge ट्यूब में degassed एसयूवी समाधान भरें और खुर्दबीन मंच पर धारक में जगह सेट के तापमान को संतुलित करने के लिए।
    8. Plएक प्लाज्मा क्लीनर में पहले साफ coverslip (खंड 2) ऐस और के बारे में 5 मिनट के लिए हवा प्लाज्मा चलाते हैं। कुछ प्रकार का वृक्ष मुक्त ऊतकों एक तकिया के रूप में सेवारत के शीर्ष पर प्लाज्मा इलाज coverslip (इलाज पक्ष का सामना करना पड़) रखो।
    9. degassed PDMS ब्लॉक से एल्यूमीनियम पन्नी निकालें और coverslip के शीर्ष पर ब्लॉक जगह है। जब पुन: उपयोग PDMS ब्लॉक पर डाल दिया है और चैनल की ओर करने के लिए चिपकने वाला टेप का एक टुकड़ा अलग यह साफ करने के लिए। PDMS नीचे प्रेस coverslip यह छड़ी बनाने के लिए चिमटी की एक जोड़ी का उपयोग करने पर ब्लॉक है, लेकिन बहुत मुश्किल के रूप में कांच टूट सकता प्रेस नहीं है।
    10. खुर्दबीन मंच पर इकट्ठे प्रवाह सेल की जगह और, एसयूवी जलाशय और सिरिंज पंप करने के लिए ट्यूबिंग कनेक्ट क्रमशः। मंच (चित्रा 3 बी) के लिए coverslip टेप।
    11. जब तक समाधान चैनलों पूरी तरह से भर जाता है 3 μl / मिनट में एसयूवी श्वास शुरू (~ 2.25 मिमी / 75 माइक्रोन x 300 माइक्रोन चैनल पार अनुभाग के लिए सेकंड)। जब सभी चैनलों के लिए समाधान वीं तक चलना शुरूबाहर निकलने के पक्ष में ई ट्यूबिंग, 0.5 μl / मिनट के लिए प्रवाह को कम करने और 30-45 मिनट के लिए सेते हैं।
      नोट: प्लाज्मा गिलास स्लाइड के इलाज और चैनल में एसयूवी बहने के बीच समय प्लाज्मा उपचार के प्रभाव के रूप में 10-20 मिनट से अधिक नहीं होनी चाहिए क्षणिक है।
    12. किसी भी रिसाव के लिए चैनल की जाँच करें। NBD पीई टी या पीएफ-एसयूवी युक्त से NBD पीई प्रतिदीप्ति निरीक्षण करने के लिए एक 10-20x हवा उद्देश्य का प्रयोग करें। उत्तेजित NBD 488 एनएम लेजर का उपयोग कर fluorophores। लीक उज्ज्वल क्षेत्र रोशनी का उपयोग कर पता लगाने के लिए मुश्किल हो जाता है।
    13. धारक में degassed पुनर्गठन बफर के साथ एक ट्यूब डाल दिया है और तापमान में तापमान के रूप में तेजी से परिवर्तन संतुलित एसबीएल में दोष उत्पन्न हो सकता है चलो। प्रवाह बंद करो और सुनिश्चित करें कि प्रवाह पूरी तरह से बंद कर दिया है और कोई हवा बुलबुला degassed बफर करने के लिए इनलेट ट्यूबों स्विच करने से पहले ट्यूब में aspirated किया जाएगा बनाने के लिए इंतजार ~ 1 मिनट।
    14. अपार एसयूवी दूर धोने के लिए degassed बफर के साथ सभी चैनलों कुल्ला।
    15. एक highe करने के लिए स्विचआर बढ़ाई TIRF उद्देश्य (60X, तेल, एनए 1.45-1.49) और सत्यापित करें कि bilayer सजातीय लग रहा है और इस तरह के काले धब्बे या एसबीएल से बाहर का विस्तार लिपिड नलिकाओं के रूप में किसी भी स्पष्ट बड़े पैमाने पर दोष से मुक्त है।
  2. Bilayer की तरलता की जाँच करें
    1. एक समर्पित इकाई FRAP उपलब्ध नहीं है, या तो एक FRAP अनुक्रम प्रोग्राम नहीं कर सकते हैं अगर हो, तो गुणात्मक परीक्षण झिल्ली तरलता इस प्रकार है।
      1. एक छोटे आकार (~ 40 माइक्रोन व्यास) के क्षेत्र डायाफ्राम बंद और उजागर में NBD पीई प्रतिदीप्ति ब्लीच करने के लिए सॉफ्टवेयर के माध्यम से 488 एनएम उत्तेजना प्रकाश की तीव्रता को समायोजित (20-80 μW, या 15-60 NW / माइक्रोन 2) क्षेत्र काफी है, लेकिन पूरी तरह से नहीं। एक तरल पदार्थ bilayer के लिए, स्थिर अवस्था में, उजागर क्षेत्र के बीच में प्रतिदीप्ति तीव्रता किनारों पर से कम होना चाहिए, के रूप में बरकरार NBD पीई अणुओं उजागर क्षेत्र में प्रवेश और विरंजन से पहले एक निश्चित दूरी फैलाना। इसके विपरीत, यदि सतह-पालन एसयूवी फट करने में विफल रहा है, या किसी अन्य कारण से समर्थित bilayer तरल पदार्थ नहीं है, उजागर क्षेत्र में सभी fluorophores ब्लीच करना चाहिए।
        नोट: इस और बाद के चरणों में लेजर तीव्रता मूल्यों किसी न किसी प्रारंभिक बिंदु के रूप में दिया जाता है और शर्तों का सेट दिया के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए।
      2. रोशनी बंद करो और स्थिर राज्य माप के परिणामों की पुष्टि करने के लिए इसे फिर से शुरू कुछ ही मिनट बाद
    2. एक और मात्रात्मक माप के लिए एक FRAP अनुक्रम कार्यक्रम है, यदि संभव हो तो। पूरक फ़ाइलें और जानकारी के लिए इसी पौराणिक कथा देखें।
      नोट: कभी कभी एसयूवी कांच coverslip पर पालन करना होगा, लेकिन फट और एक तरल पदार्थ bilayer फार्म के लिए असफल। यदि ऐसा होता है, degassed पुनर्गठन 10 मिमी 2 मिलीग्राम + युक्त समर्थित bilayer गठन में मदद करने के लिए बफर के साथ चैनलों कुल्ला। 4.2 के रूप में bilayer तरलता का आकलन करने के लिए प्रतिदीप्ति विरंजन का प्रयोग करें। एक बार एक तरल पदार्थ bilayer का गठन किया है, 2 + मिलीग्राम के साथ मुक्त सिफारिश कुल्लाnstitution बफर।
  3. Microfluidic प्रवाह चैनलों में वी-एसयूवी का परिचय
    1. देगास बफर और इसका इस्तेमाल वी एसयूवी शेयर एकाग्रता के आधार पर 10 5 के बारे में 10 3 का एक पहलू से वी-एसयूवी शेयर समाधान को कमजोर करने के पुनर्गठन। एक कमजोर पड़ने लगता है कि देखने के क्षेत्र में 60 सेकंड के भीतर 10-100 के बारे में संलयन घटनाओं में परिणाम के लिए निशाना लगाओ।
      नोट: बहुत सारे fusions पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति (एसबीएल में प्रत्येक घटना जमा एलआर पीई के बाद या था लिपिड लेबल) बढ़ाने के लिए और पता लगाने और फ्यूजन की घटनाओं का विश्लेषण कठिन बनाते हैं। इसके विपरीत, एक संलयन दर है कि गरीबों के आँकड़ों में बहुत कम परिणाम या बहुत से अधिक फिल्मों के अधिग्रहण की आवश्यकता है। 0.1 मिमी लिपिड की एक वी एसयूवी एकाग्रता के लिए, 995 μl पुनर्गठन बफर में 5 μl एसयूवी शेयर गिराए द्वारा शुरू करने और फिर 950-995 μl पुनर्गठन बफर में इस बात का 5-50 μl पतला।
    2. तापमान प्रवाह और inser रोक से पहले संतुलित करनाटिंग पतला वी एसयूवी समाधान में प्रवेश ट्यूब।
    3. इस प्रकार के रूप TIRF कोण और ध्रुवीकरण को समायोजित करें।
      1. उत्तेजना बीम घूर्णन द्वारा वांछित ध्रुवीकरण करने के बाद, दर्पण सॉफ्टवेयर के माध्यम से एक stepper मोटर के माध्यम से बीम की स्थिति कमांडिंग के झुकाव को समायोजित। धीरे-धीरे बंद केंद्र एक तरफ वापस फोकल हवाई जहाज़ पर उद्देश्य के केंद्र से लेजर बीम की स्थिति के लिए कदम। उद्देश्य सामने की ओर से उद्देश्य धुरी के संबंध में एक बढ़ती हुई कोण के साथ उभरने के रूप में स्थिति बंद केंद्र आगे ले जाया जाता है से प्रकाश का निरीक्षण करें।
      2. नोट मोटर स्थिति जब बाहर निकलने किरण पहले, उद्देश्य, यानी में गायब हो जाता है जब TIR पहले हासिल की है।
      3. धीरे-धीरे सतह से प्रतिदीप्ति की निगरानी करते हुए बंद केंद्र आगे किरण स्थिति चलते रहो। नोट मोटर स्थिति जब सतह प्रतिदीप्ति गायब हो जाता है जब किरण भी दूर-केंद्र ले जाया गया है।
      4. एक किरण पदों चुनें n दो सीमाओं के बीच ऊपर चुना गया। सबसे अच्छा संकेत करने वाली शोर अनुपात और फ्यूजन पर अधिक संकेत बढ़ाने के लिए, एक उथले प्रवेश गहराई (बीम उद्देश्य के किनारे के करीब स्थिति) है कि अभी भी viewfield की वर्दी रोशनी प्रदान करता है चुनें।
        नोट: यह सबसे अच्छा है के बाद सेटिंग्स अनुकूलित कर रहे हैं सभी प्रयोगों के लिए एक ही TIR किरण स्थिति (एक ही प्रवेश गहराई) रखने के लिए। यकीन है कि ध्रुवीकरण बीम की स्थिति में परिवर्तन में परिणाम नहीं करता घूर्णन बनाओ।
    4. 2 μl / मिनट की एक प्रवाह दर पर चैनल में प्रवाह वी एसयूवी, 75 माइक्रोन x 300 माइक्रोन के एक क्रॉस सेक्शन के लिए ~ 1.5 मिमी / सेकंड औसत रैखिक प्रवाह वेग के लिए इसी। उत्तेजना / उत्सर्जन सेटिंग्स करने के लिए स्विच लिपिड मिश्रण की निगरानी (एलआर या केवल किया था) के लिए।
  4. एकल वी-एसयूवी और एसबीएल के बीच अवलोकन संलयन

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चित्रा 3. प्रयोगात्मक pTIRF सेटअप। (ए) योजनाबद्ध एक गिलास सब्सट्रेट पर एक वी एसयूवी और एक टी एसबीएल का प्रतिनिधित्व। एकल एसयूवी-एसबीएल संलयन घटना की झूठी रंग TIRFM छवियों लिपिड डॉकिंग दिखा (1) और एसबीएल में लिपिड डाई की रिहाई (2) विरंजन और प्रतिदीप्ति तीव्रता की कमी के बाद (3)। कुल प्रतिदीप्ति तीव्रता संकेत (5.3 माइक्रोन x 5.3 माइक्रोन बॉक्स में पिक्सेल मूल्यों का योग) दिखाया गया है। (बी) coverslip PDMS ब्लॉक करने के लिए बंधुआ गर्म मंच पर टेप है। microfluidic चैनलों के लिए इनलेट ट्यूब धातु नमूना धारक (दाएं) सिरिंज पंप (बाएं) से aspirated में ट्यूब से नमूने आकर्षित। नीचे पंप दोहरी उत्सर्जन इकाई है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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चित्रा 4. प्रयोगात्मक स्थापना के योजनाबद्ध। क्षणभंगुर लहर microfluidic चैनल में कांच बफर इंटरफेस में बनाई गई है। एसबीएल कांच पर बनाई है और वी-एसयूवी (ऊपर बाएं) सिरिंज में चैनल के माध्यम से धातु नमूना धारक (शीर्ष सही) से aspirated रहे हैं। एम, दर्पण; डीएम, dichroic दर्पण; एल, लेंस; एफ, फिल्टर; पी, polarizer। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

  1. लगातार उत्तेजित और fluorophore वी एसयूवी में शामिल आधार पर 561 एनएम (एलआर-पीई के लिए) का उपयोग कर वी-एसयूवी प्रतिदीप्ति या 638 एनएम (जो किया उसके लिए) लेजर की निगरानी। वी-एसयूवी एसबीएल साथ प्रवाह चैनल और गोदी पर और फ्यूज तक पहुँचने के रूप में, पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति संकेत जमा करने के लिए शुरू होता है।
  2. लगातार पृष्ठभूमि ब्लीच करने के लिए सॉफ्टवेयर के माध्यम से उत्तेजना लेजर तीव्रता को समायोजित करेंप्रतिदीप्ति ऐसी है कि स्थिर अवस्था नई डॉकिंग और फ्यूजन की घटनाओं पर आसानी से देखा जा सकता है।
    नोट: यदि विरंजन भी धीमी है, पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति भी अधिक हो जाएगा। अगर ब्लीचिंग बहुत तेज है, डॉक एसयूवी से और एसबीएल में जारी fluorophores से संकेत तेजी से हो पाती है, खिड़की के दौरान जो डॉक एसयूवी के विलय या पता लगाया जा सकता है कि एक fluorophore लगाया जा सकता है छोटा होगा। के लिए एलआर पीई 561 एनएम पर उत्साहित, 2.5-7.5 मेगावाट बिजली की एक 190 मीटर व्यास वृत्त (100-250 NW / माइक्रोन 2) रोशन एक उचित मूल्य के लिए शुरू है। किया की 638 एनएम उत्तेजना, एक 190 मीटर व्यास वृत्त (30-60 NW / माइक्रोन 2) पर 0.8-1.6 मेगावाट बिजली के लिए प्रारंभिक परीक्षण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
  3. एक दिया चैनल में विभिन्न पदों पर कई फिल्में मोल। सत्यापित करने के लिए कि एसबीएल इन पदों पर दोष नहीं है NBD पीई प्रतिदीप्ति की जाँच करें। अधिकतम दर (~ 50 फ्रेम / सेक) या उच्च फ्रेम दर पर ब्याज की एक फसली क्षेत्र (अप करने के लिए पूर्ण फ्रेम फिल्में मोल~ 100 हर्ट्ज) 60 सेकंड के लिए।
  4. एक और microfluidic चैनल में ले जाएँ और अन्य स्थितियों के लिए रिकॉर्डिंग दोहराएँ। इस तरह के एक प्रोटीन से मुक्त एसबीएल या एसयूवी, एक अवरोध के रूप में वी-जाल VAMP2 (CDV) के घुलनशील cytoplasmic डोमेन जोड़ सकते हैं या एक या एक से अधिक में टिटनेस न्यूरोटॉक्सिन (37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट) के साथ वी-एसयूवी के इलाज के रूप में नकारात्मक नियंत्रण शामिल एक ही coverslip पर चैनलों की।
  1. साफ और PDMS रीसाइक्लिंग
    1. आदेश PDMS ब्लॉक पुन: उपयोग करने के लिए, 5 μl / मिनट की एक प्रवाह दर पर 70% इथेनॉल के ~ 200 μl के साथ microfluidic चैनलों कुल्ला। अंत में, ट्यूबिंग और चैनलों के माध्यम से हवा aspirate।
    2. अलग PDMS यह थोड़ा फैलाएंगे द्वारा coverslip से धीरे ब्लॉक। यह एल्यूमीनियम पन्नी की एक स्वच्छ टुकड़े पर रखें। एक निर्वात desiccator में स्टोर। यह कई बार पुन: उपयोग किया जा सकता है।
    3. एक और अधिक गहन सफाई के लिए एक साबुन या सोडियम हाइड्रॉक्साइड समाधान 70% इथेनॉल के लिए पहले से चैनलों कुल्ला। वैकल्पिक रूप से, सभी ट्यूबों इधर-उधर हटाने PDMS हूँ और isopropanol में 30 मिनट के लिए ब्लॉक sonicate, सुखाने और नए ट्यूबिंग डालने से पहले।

5. एसयूवी-एसबीएल फ्यूजन परख इसके साथ ही लिपिड और सामग्री जारी की निगरानी के लिए

  1. एक साथ लिपिड और घुलनशील सामग्री जारी, धारा 4 के रूप में ही चरणों का पालन करें, सिवाय इसके उपयोग liposomes के साथ दोनों एक लिपिड (था) लेबल और एक घुलनशील सामग्री (एसआरबी) लेबल, के रूप में खंड में विस्तार से बताया की दोहरी रंग की निगरानी के लिए 3. SRB समझाया है 10 मिमी पर और शुरू में अत्यधिक आत्म-बुझती है।
  2. विन्यास 4 चित्र में दिखाए गए रेखाचित्र के रूप में उपयोग करना, SRB उत्तेजित और प्रतिदीप्ति एक साथ क्रमश: 561 एनएम और 638 एनएम लेजर का उपयोग किया था। एक dichroic दर्पण (640 एनएम) SRB उत्सर्जन में क्रमश: का पता लगाने और था करने के लिए दो मुस्कराते हुए कि एक छोटी (595/50 एनएम) के माध्यम से चलाने के लिए और एक लंबे समय (700/75) एनएम तरंगदैर्ध्य फिल्टर में उत्सर्जन विभाजन। दो उत्सर्जन मुस्कराते हुए ईएम सीसीडी चिप पर पक्ष द्वारा साइड पेश कर रहे हैं।
jove_title "> 6। डेटा विश्लेषण

  1. FRAP डेटा का विश्लेषण
    1. लिपिड प्रसार गुणांक, डी अनुमान लगाने के लिए अनुपूरक सूचना में प्रदान MATLAB प्रोग्राम का उपयोग करें। कार्यक्रम OME-झगड़ा फ़ाइलों 49 की एक सूची पढ़ता प्रक्षालित क्षेत्र का पता लगाता है, समय के एक समारोह के रूप में प्रक्षालित क्षेत्र में मतलब पिक्सेल मूल्यों भूखंडों, और वसूली समय निकालने के लिए Soumpasis 50 से एक मॉडल के लिए जिसके परिणामस्वरूप वसूली वक्र फिट बैठता है, 1 समीकरण , जहां डब्ल्यू प्रक्षालित वृत्त की त्रिज्या है।
      नोट: एक matlab कार्यक्रम निकॉन ND2 फ़ाइलों का उपयोग कर FRAP फिल्मों के विश्लेषण के लिए पहले 25 प्रदान किया गया। मौजूदा कार्यक्रम पढ़ता OME-झगड़ा फ़ाइलें 49, क्योंकि ज्यादातर फ़ाइल स्वरूपों आसानी से OME-झगड़ा करने के लिए परिवर्तित किया जा सकता है। FRAP डेटा का एक मात्रात्मक विश्लेषण के लिए सबसे आसान और सबसे सटीक जब विरंजन तात्कालिक है, bleacHed क्षेत्र एक चक्र है, और पढ़ने के लिए बाहर के दौरान विरंजन है नगण्य है। हालांकि इन मानदंडों का कड़ाई से यहाँ वर्णित सरल FRAP माप में संतुष्ट नहीं हैं, प्रसार गुणांक का एक उचित अनुमान प्राप्त किया जा सकता है। एक और अधिक सटीक अनुमान के लिए, एकल लिपिड रंगों (धारा 6.3) की ट्रैकिंग का उपयोग करें।
  2. डॉकिंग दर, फ्यूजन दर और डॉकिंग के लिए फ्यूजन देरी बार का विश्लेषण
    1. ImageJ का प्रयोग एक फिल्म को खोलने के लिए विश्लेषण और चमक और विपरीत समायोजित करने के लिए स्पष्ट रूप से पुटिका डॉकिंग और fusing घटनाओं की पहचान करने के लिए। SpeckleTrackerJ 26 प्लगइन शुरू करो। उपयोग के लिए निर्देश के लिए SpeckleTrackerJ के लिए स्मिथ एट अल। 26 और ऑनलाइन दस्तावेज़ देखें।
    2. SpeckleTrackerJ में सभी नव डॉक एसयूवी को पहचानें। एसयूवी कि उन है कि एसबीएल दूर उछाल से कसकर गोदी में भेद करने के लिए, कुछ फ्रेम की एक न्यूनतम अवधि डॉकिंग थोपना। पटरियों को बचाने, और सभी फिल्मों के लिए दोहराएँ।
      नोट: डॉक्टर के लिएराजा दर, कि सभी मामलों है जब एक एसयूवी डॉक की पहचान करने के लिए है, इसलिए केवल पहला फ्रेम जिसमें एसयूवी डॉक जरूरतों इन पटरियों में दर्ज किया जा रहा है। पटरियों के बाकी विश्लेषण में खाते में नहीं ले जाया जाएगा। हालांकि, ऑटो ट्रैकिंग प्रत्येक एसयूवी जब तक यह bleaches या फ़्यूज़ मार्क एसयूवी कि पहले से ही ट्रैक किया गया है में मदद करता है।
    3. सभी fusing पुटिकाओं को पहचानें। इन के लिए, पटरियों पहला फ्रेम एक एसयूवी पहला फ्रेम जिसमें फ्यूजन पर नज़र रखी स्थान के प्रतिदीप्ति में अचानक वृद्धि से स्पष्ट है जब तक डॉक से सभी फ्रेम शामिल करना चाहिए। इन पटरियों के durations डॉकिंग के लिए फ्यूजन देरी की गणना करने के लिए उपयोग किया जाता है। सभी पटरियों को बचाओ। सभी फिल्मों के लिए दोहराएँ।
    4. डॉकिंग या संलयन डेटा के बैच के विश्लेषण के लिए, प्रासंगिक फिल्मों से प्रक्षेपवक्र फ़ाइलों की एक सूची संकलन और Karatekin और रोथमान 25 के साथ प्रदान की MATLAB कार्यक्रमों को चलाने के। निर्देश है कि कार्यक्रमों के साथ एक साथ प्रदान की जाती हैं का पालन करें।
      नोट: कार्यक्रमों सह साजिशसमय के एक समारोह, पथ फ़ाइलों से निकाली गई जानकारी के आधार पर के रूप में संचयी डॉकिंग और फ्यूजन की घटनाओं। डॉकिंग और फ्यूजन दरों इन भूखंडों की ढलानों से अनुमान लगाया जाता है। फ्यूजन डेटा के लिए, डॉकिंग के लिए फ्यूजन देरी भी गणना कर रहे हैं और उनके वितरण एक अस्तित्व साजिश, यानी, संभावना है कि संलयन अभी तक डॉकिंग के बाद एक दिया देरी से नहीं हुआ है के रूप में साजिश रची।
  3. लिपिड diffusivity
    1. प्रत्येक संलयन घटना के लिए, एक फ्लोरोसेंट लिपिड ट्रैक के रूप में वे नमूदार हो जाते हैं जब वे पर्याप्त संलयन साइट (चित्रा 6) से दूर दूर तक फैला हुआ है। ट्रैकिंग के लिए SpeckleTrackerJ प्रयोग करें, और MATLAB का उपयोग कर आगे के विश्लेषण के लिए पटरियों को बचाने। fusing पुटिका के आकार पर निर्भर करता है, आम तौर पर 3-30 एकल fluorophores लगाया जा सकता है। क्योंकि अब पटरियों की गणना के लिए वांछनीय हैं 1 समीकरण लंबे समय के रूप एकल अणुओं को ट्रैक करने की कोशिशसंभव के रूप में, प्रक्षेप पथ का मार्गदर्शन सुधार का उपयोग यदि आवश्यक है।
    2. गणना मतलब एकल लिपिड मार्कर प्रक्षेप पथ है कि पिछले> 40-50 फ्रेम (के बारे में ~ 1.5 सेकंड) के लिए विस्थापन (एमएसडी) चुकता। लिपिड प्रसार गुणांक की गणना करने के एमएसडी का प्रयोग करें, 1 समीकरण । स्मिथ एट अल। 26 और स्ट्रैटन एट अल। 27 के लिए विवरण देखें।
  4. एकल लिपिड डाई तीव्रता, एसयूवी-एसबीएल तीव्रता में कमी कारक है, और पुटिका आकार
    1. पहले और एक भी कदम में मार्कर bleaches के बाद एक 3 एक्स 3 पिक्सेल के लिए मार्कर के आसपास (0.8 माइक्रोन x 0.8 माइक्रोन) क्षेत्र में एक लिपिड मार्कर के पिक्सेल मूल्यों की राशि उपाय ~ 15 फ्रेम। घटाएँ पृष्ठभूमि तीव्रता पूर्व ब्लीच तीव्रता से बाद ब्लीच तख्ते पर औसतन पता लगाया लिपिड मार्कर की तीव्रता प्राप्त करने के लिए ब्लीचिंग से पहले औसत। एक दिया के लिए व्यावहारिक रूप में कई मार्करों के लिए माप दोहराएँ चलचित्र।
    2. सिंगल, लिपिड लेबल तीव्रता का वितरण प्लॉट 1 समीकरण , और मतलब अनुमान लगाने के लिए एक गाऊसी फिट बैठते हैं।
    3. के बीच जब संलयन हुआ और जब एक ही लिपिड मार्कर के प्रक्षेपवक्र है कि घटना में जारी एक एकल कदम विरंजन में समाप्त हो गया देरी की गणना। एसबीएल में एक fluorophore के लिए प्राप्त विरंजन समय, 1 समीकरण , एक घातीय करने में देरी के उत्तरजीवी समारोह और फिटिंग साजिश रचने के द्वारा।
      नोट: क्योंकि अधिक एक एसयूवी पर fluorophores को कमजोर ध्रुवीकृत उत्तेजना क्षेत्र जोड़ों, एक एसयूवी की विरंजन समय आम तौर पर बहुत धीमी 27 है।
    4. आकलन 1 समीकरण , एक लिपिड डाई जब जब यह एसबीएल में है, निम्नलिखित स्ट्रैटन 27 एसयूवी रिश्तेदार में तीव्रता में कमी कारक (tp_upload / 54349 / 54349eq8.jpg "/> 1 समीकरण एसयूवी में एक भी डाई) की तीव्रता है।
      नोट: यदि विरंजन नगण्य थे, 1 समीकरण डॉक तीव्रता के बराबर होगा 1 समीकरण (चित्रा 3 ए, सही पैनल में बिंदु (1)), कुल तीव्रता सभी fluorophores के बाद तक पहुँच से विभाजित संलयन पर एसबीएल में जमा कर रहे हैं (धराशायी लाइन लेबल 1 समीकरण चित्रा 3 में)। हालांकि, एसबीएल में तेजी से विरंजन के कारण, 1 समीकरण आम तौर पर पहुँच नहीं है और का सही अनुमान 1 समीकरण एक अभिव्यक्ति 27 कि सहित करने के लिए ढाले रिलीज कैनेटीक्स की आवश्यकता है udes दोनों 1 समीकरण (6.4.3 देखें) और 1 समीकरण । अलग-अलग भाव स्ट्रैटन एट अल में प्रदान की जाती हैं ताकना सीमित और प्रसार सीमित रिलीज कैनेटीक्स के मामलों के लिए 27। सबसे अच्छा फिट मामले घटना (ताकना सीमित कैनेटीक्स के मामले के लिए 6.5.1 देखें) करने के लिए घटना से भिन्न होता है।
    5. 27 से व्यक्ति की घटनाओं के लिए पुटिका क्षेत्र की गणना 1 समीकरण , कहा पे 1 समीकरण डॉक एसयूवी तीव्रता है, 1 समीकरण एसबीएल में एक भी लिपिड डाई की तीव्रता का मतलब है, 1 समीकरण एक लिपिड डाई के लिए तीव्रता में कमी कारक है जब यह जब यह एसबीएल में है एसयूवी रिश्तेदार में है, औरसमझना 1 "src =" / files / ftp_upload / 54349 / 54349eq12.jpg "/> लिपिड रंगों के नाम से जाना जाता Areal घनत्व है।
  5. फ्यूजन ताकना गुण
    1. मान लिया जाये कि रिहाई के ध्यान में लीन होना ही सीमित है, 27 के लिए लिपिड लेबल रिलीज कैनेटीक्स फिट 1 समीकरण , कहा पे 1 समीकरण सिर्फ संलयन से पहले डॉक एसयूवी तीव्रता है और अन्य मानकों पहले परिभाषित कर रहे हैं। के मूल्य का उपयोग 1 समीकरण एक निश्चित पैरामीटर के रूप में 6.4.3 में प्राप्त की, और के लिए सबसे अच्छा फिट अनुमान निकालने 1 समीकरण तथा 1 समीकरण ।
    2. समय के अंश का अनुमान ताकना खुला है, पी 0, लिपिड रिहाई की यह सोचते हैं मंदता 27 चंचल ताकना की वजह से है:60; 1 समीकरण = 1 समीकरण है, जहां एक Ves पुटिका क्षेत्र (धारा 6.4.5) है, ख ताकना ऊंचाई (आमतौर पर ~ 15 एनएम हो लिया), आर पी ≈ है 3 एनएम प्रभावी ताकना त्रिज्या के रूप में diffusing लिपिड लेबल के द्वारा देखा और आधा भी शामिल है bilayer मोटाई (~ 2 एनएम), 1 समीकरण लिपिड diffusivity (6.3 में गणना), और 1 समीकरण समय के लिए लिपिड (6.5.1) से एसबीएल में एसयूवी से जारी किया जा रहा है।
    3. कि एक मामूली पी 0> 1 एक पूरी तरह से खुला ताकना इंगित करता है इस बात की पुष्टि करने के लिए, पी 0 = 1, तीव्रता समय बेशक एक स्थायी रूप से खुला ताकना के लिए स्ट्रैटन एट अल। 27, भविष्यवाणी की कैनेटीक्स के 4 समीकरण के लिए फिट बैठते हैं। इस फिट fittin से बेहतर होना चाहिएजी एक स्थायी रूप से खुला ताकना के लिए 6.5.1 में अभिव्यक्ति।

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Representative Results

एसबीएल गुणवत्ता

यह संलयन प्रयोग करने से पहले गुणवत्ता और एसबीएल की तरलता को सत्यापित करने के लिए महत्वपूर्ण है। एक microfluidic चैनल के नीचे, कांच के पक्ष में प्रतिदीप्ति एक समान होना चाहिए, किसी भी स्पष्ट दोष के बिना। हालांकि चैनल के एक हवाई बुलबुले गुजरता है, यह आमतौर पर एसबीएल पर दिखाई निशान छोड़ देता है। इस तरह के बड़े पैमाने पर निशान / दोष देखते हैं, तो यह है कि चैनल का उपयोग नहीं करते। कभी कभी एसयूवी सब्सट्रेट पालन लेकिन फट और फार्म के लिए एक सतत एसबीएल विफल हो सकता है। यदि यह मामला है, प्रतिदीप्ति अभी भी बहुत वर्दी प्रकट हो सकता है, लेकिन एक छोटे से क्षेत्र विरंजन के बाद ठीक नहीं होगा। परिचय 10 मिमी 2 मिलीग्राम + अक्सर इस मुद्दे को सुलझाने में मदद करता है। अन्य एजेंटों के इस तरह के अन्य द्विसंयोजक फैटायनों 51, एक बहुलक समाधान 52, या आसमाटिक सदमे 25 के रूप में एसयूवी, फोड़ मदद करने के लिए शुरू की जा सकती है।

तापमान परिवर्तन एसबीएल क्षेत्र के परिवर्तन में परिणाम है क्योंकि इसका मतलब क्षेत्र एक लिपिड के कब्जे में तापमान पर निर्भर करता है। 5-10 डिग्री सेल्सियस या अधिक से तापमान बढ़ाने या इसे कम अतिरिक्त क्षेत्र की सतह, या अंधेरे, एसबीएल मुक्त, क्रमश: 53 सतह पर दिखने स्थानों से निकाला ट्यूबों में जाने में परिणाम कर सकते हैं। यह एक न्यूनतम करने के लिए तापमान परिवर्तनों को रखने के लिए महत्वपूर्ण है।

चित्रा 5 में दिखाया गया है।

चित्रा 5
चित्रा 5. FRAP एसबीएल तरलता की जांच करने के लिए। एक प्रबुद्ध क्षेत्र बंद क्षेत्र डायाफ्राम (व्यास 49 माइक्रोन) (पहला फ्रेम) से पहले से और एक मजबूत प्रकाश नाड़ी के साथ ब्लीचिंग के बाद सीमांकित दिखा छवियों का एक दृश्य। क्षेत्र कम प्रकाश जोखिम में imaged है NBD के प्रसार से प्रतिदीप्ति वसूली का पालन करने के लेबल लिपिड। ग्राफ विधि के reproducibility के उच्च स्तर का संकेत विभिन्न coverslips से कई चैनलों के लिए समय के एक समारोह के रूप में सामान्यीकृत प्रतिदीप्ति पता चलता है। SAPE: DOPS: कोलेस्ट्रॉल: मस्तिष्क पीआई (4,5) पी 2: PEG2000-डोप: NBD-पीई (54.9: 15: 12: 10: 3: 4.6: 0.5% तिल टी एसबीएल के लिपिड रचना POPC था ) और एल.पी. = 20,000। ब्लीच क्षेत्र 984.203 μ थाएम 3। वसूली समय और प्रसार गुणांक की गणना एक फिट (6.1 देखें) से τ = 67.3 सेकंड और डी = थे 1.99 माइक्रोन 2 / सेक, क्रमशः। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

डॉकिंग और फ्यूजन घटनाक्रम की एकल रंग का पता लगाने के लिए एक लिपिड लेबल का उपयोग

डॉकिंग और फ्यूजन की घटनाओं के मैनुअल गिनती एक कठिन काम के रूप में शर्त के अनुसार 100-400 घटनाओं अच्छे आँकड़ों के लिए की जरूरत है। एसयूवी fusing से पहले एसबीएल पर स्थानांतरित कर सकते हैं के बाद से, एक ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर की जरूरत है। ImageJ के लिए SpeckleTrackerJ 26 प्लगइन सुविधाओं है कि विशेष रूप से डॉकिंग और फ्यूजन की घटनाओं के विश्लेषण के लिए ट्रैकिंग एसयूवी के लिए विकसित किया गया है। अक्सर केवल डॉक पुटिकाओं का एक अंश fusing के अंत;डॉकिंग दर बहुत ज्यादा है एसयूवी उन है कि फ्यूज या केवल फिल्म के एक हिस्से का विश्लेषण किया है, जब तक की घटनाओं के लिए पर्याप्त संख्या में एक विश्वसनीय आकलन के लिए पता चला रहे हैं की जरूरत से लगाया जा करने की जरूरत है की गणना करने के लिए। मुख्य ध्यान संलयन दर और / या डॉकिंग के लिए फ्यूजन देरी है, तो केवल fusing एसयूवी की पहचान की और पता लगाया जा करने की जरूरत है।

एसबीएल की गुणवत्ता सुनिश्चित करने के बाद, एसयूवी चैनलों में पेश कर रहे हैं और उनके प्रतिदीप्ति एस ध्रुवीकरण प्रकाश का उपयोग कर TIR के तहत लगातार उत्साहित है। प्रारंभिक प्रयोगों के लिए, TIR उत्तेजना बीम की घटना कोण धुन करने के लिए समायोजित किया जाना है जिसके परिणामस्वरूप क्षणभंगुर लहर के प्रवेश गहराई पड़ सकता है। एक प्रतिनिधि एकल एसयूवी डॉकिंग और संलयन घटना चित्रा 6A में दिखाया गया है। पुटिका सीमा के दौरान डॉक डी चिह्नित और फ्यूजन फ्रेम एफ के बारे में 1.3 सेकंड बाद में (फ्रेम एस) में शुरू के रूप में वे संलयन से दूर दूर तक फैला हुआ बैठते ही लिपिड नमूदार हो गयाई। प्रत्येक बॉक्स में कुल प्रतिदीप्ति तीव्रता (पिक्सेल मूल्यों का योग) फ्रेम, जिस पर डॉकिंग और फ्यूजन संकेत दिया हुआ के साथ, चित्रा 6B में समय के एक समारोह के रूप में साजिश रची है। संलयन घटनाओं की संचयी संख्या के रूप में समय के एक समारोह चित्रा 6C में साजिश रची है पाँच अलग अलग टी-जाल का उपयोग फिल्मों के लिए, SBLs (टी एसबीएल, एल.पी. = 20,000 प्रति वर्ग। माइक्रोन के बारे में 70 टी फन्दे) का पुनर्गठन किया। प्रत्येक फिल्म से फ्यूजन दर ढलान के लिए एक रेखीय फिट से गणना की गई। SEM ± यह औसत दर संलयन पैनल डी में एक बार ग्राफ के रूप में दिखाया गया है उदाहरण चित्रा 6A, बी, में दिखाया गया के लिए डॉकिंग के लिए फ्यूजन देरी 0.07 सेकंड था। 158 घटनाओं की कुल के लिए इसी तरह की गणना देरी के वितरण के एक उत्तरजीवी साजिश, यानी, संभावना है कि एक डॉक पुटिका अभी तक एक दिया देरी से जुड़े हुए नहीं है के रूप में चित्रा 6D में दिखाया गया है। के बारे में 1/2 इन पुटिकाओं के 100 मिसे के भीतर जुड़े हुए। कोलेस्ट्रॉल के स्तर में वृद्धि, distrib के साथडॉकिंग के लिए फ्यूजन देरी के संविधान को छोटा है, भले ही लिपिड प्रसार धीमा कर देती है 27।

यह समानांतर में नियंत्रण प्रयोगों को चलाने के लिए महत्वपूर्ण है। एक ही coverslip से चित्रा 6B, डी में डेटा हासिल किया गया, पर नियंत्रण की स्थिति पड़ोसी चैनलों में परीक्षण किया गया। एक चैनल में, एसबीएल किसी भी टी फन्दे शामिल नहीं किया था। स्थायी 60 सेकंड प्रत्येक 5 फिल्मों में से केवल 7 संलयन की घटनाओं की तुलना में 158 दर्ज किया गया जब टी फन्दे शामिल थे (चित्रा 6C)। एक और चैनल में, वी-जाल VAMP2 के घुलनशील cytoplasmic डोमेन (CDV) शामिल किया गया था। CDV एसबीएल पर टी फन्दे बांधता है, पूर्ण लंबाई VAMP2 एसयूवी पर है कि के बंधन को रोकने। पांच फिल्में 60 सेकंड में, कोई संलयन घटनाओं CDV (चित्रा 6C) की उपस्थिति में पता चला रहे थे।

चित्रा 6
चित्रा 6। एसयूवी-एसबीएल डॉकिंग और फ्यूजन की घटनाओं। (ए) एलआर-पे के प्रसार के बाद टी एसबीएल के साथ एक वी एसयूवी संलयन घटना की छवियों pTIRF माइक्रोस्कोपी द्वारा imaged के अनुक्रम। छवियाँ हर 18 मिसे, केवल हर दूसरे फ्रेम में दिखाया गया है लिया जाता है। डी और एफ, डॉकिंग और फ्यूजन की शुरुआत के निशान पर बंद हुए। व्यक्तिगत रूप से पहचाने जाने लिपिड लेबलों के रूप में वे संलयन साइट और एक दूसरे (एस) से दूर फैलाना। फ्रेम आयाम: 16.7 x 16.7 माइक्रोन माइक्रोन। (बी) (ए) में दिखाए संलयन घटना के लिए समय के एक समारोह के रूप में प्रतिदीप्ति तीव्रता। (सी) वी एसयूवी लेबल प्रयोगों का एक और सेट से किया था के साथ के लिए समय के एक समारोह के रूप में संलयन घटनाओं की संचयी संख्या। (डी) सामान्यीकृत संलयन दर (मतलब ± SEM, एसएक्स माइक्रोन 2 एक्स बजे एसयूवी) -1, एसयूवी और (ई) पुटिका की डॉकिंग के बाद एक निश्चित समय के लिए जीवित रहने के संभावना प्रति 2 एक्स 10 4 लिपिड यह सोचते हैं। सभी एस.बी. के लिए रचनाSAPE: DOPS: कोलेस्ट्रॉल: मस्तिष्क पीआई (4,5) पी 2: PEG2000-डोप: NBD-पीई (54.9: 15: 12: 10: 3: 4.6: 0.5 तिल%) और एल.पी. = 20,000 रास POPC थे। वी-एसयूवी POPC से बना रहे थे: SAPE: DOPS: कोलेस्ट्रॉल: PEG2000-डोप: एलआर-पीई (57.4: 15: 12: 10: 4.6: 1 तिल%) और एल.पी. = सीई के लिए ए और बी के लिए 200, वी -SUV रचना, इसी तरह की थी। सिवाय एलआर-पे के बजाय प्रयोग किया था यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

लिपिड diffusivity, पुटिका आकार, और फ्यूजन ताकना गुण

परख के एकल अणु संवेदनशीलता डॉकिंग और फ्यूजन दरों और डॉकिंग के लिए फ्यूजन देरी वितरण के अलावा कई मापदंडों की निकासी की अनुमति देता है। सिंगल, fluorescently लेबल लिपिड नमूदार हो जाते हैं, क्योंकि वे संलयन साइट (चित्रा 6A) से दूर फैलाना। ट्रैकिंग टीhese सीधे, लिपिड diffusivity 26 प्रदान करता है 1 समीकरण और एसबीएल 27 में fluorophores के लिए ब्लीचिंग दर की एक डिजिटल माप। फ्यूजन पर, उनके कमजोर पड़ने के कारण जब एसबीएल में स्थानांतरित (i) लेबल की dequenching: के रूप में परिचय में उल्लेख किया है, लेबल की प्रतिदीप्ति उत्सर्जन एसयूवी में एसबीएल में बनाम अलग है, की वजह से तीन कारक है कि सामान्य रूप से सुलझाना मुश्किल हो जाता है (ii) उत्तेजना बीम के ध्रुवीकरण के लिए सम्मान के साथ TIR द्वारा उत्पन्न क्षणभंगुर क्षेत्र, और (iii) fluorophore संक्रमण द्विध्रुव के उन्मुखीकरण के क्षय के कारण एसबीएल में एक उच्च तीव्रता उत्तेजना। कारक (द्वितीय) की भयावहता क्षणभंगुर क्षेत्र क्षय लंबाई और पुटिका आकार के सापेक्ष आकार पर निर्भर करता है और एसयूवी आकार में dispersity के कारण हर संलयन घटना के लिए अलग है। फैक्टर (iii) fluorophore और इस्तेमाल ध्रुवीकरण पर निर्भर करता है। बल्कि di करने के लिए कोशिश कर रहा से इन प्रभावों sentangle सीधे संलयन से पहले और सभी fluorophores के बाद एक एसयूवी के आसपास के क्षेत्र में कुल पिक्सेल मूल्यों की तुलना द्वारा एक प्रतिदीप्ति परिवर्तन की भयावहता उपाय कर सकते हैं, संलयन (चित्रा 3 ए निम्नलिखित एसबीएल में जमा किया गया है, (1) बनाम ( 2))। पिछले काम 29,44 के विपरीत, इस क्षेत्र में पर्याप्त बड़ी चुना जाना चाहिए ताकि कोई fluorophores बार संलयन के बाद माना के लिए प्रसार के माध्यम से इसे छोड़ दिया होगा। विश्लेषण के लिए एक 30 x 30 पिक्सेल क्षेत्र (8 माइक्रोन एक्स 8 माइक्रोन) संलयन के बाद 1.6 सेकंड तक का चयन आमतौर पर पर्याप्त 27 है। पल के लिए उपेक्षा विरंजन, के अनुपात 1 समीकरण पहले और बाद में संलयन प्रतिदीप्ति तीव्रता में कमी कारक प्रदान करता है, 1 समीकरण । पुटिका आकार अनुमान लगाया जा सकता है (एसबीएल में एक भी लेबल के प्रतिदीप्ति तीव्रता दियाIles / ftp_upload / 54349 / 54349eq6.jpg "/>), कारक है जिसके द्वारा इसकी तीव्रता को कम किया जा सकता है अगर यह एक एसयूवी में थे ( 1 समीकरण ), एसयूवी में लेबल के नाम से जाना जाता घनत्व, और क्षेत्र की एक लिपिड द्वारा कब्जा कर लिया। अभ्यास में, विरंजन आमतौर पर काफी तेजी से उस समय के सभी मार्करों एसबीएल में जमा कर रहे हैं, कुछ पहले से ही प्रक्षालित है। इस कारण से, एक सटीक आकलन के लिए, प्रतिदीप्ति तीव्रता में कमी का कारक है, 1 समीकरण और लिपिड रिलीज के समय, 1 समीकरण , बेस्ट कुल पिक्सेल मूल्यों उस खाते विरंजन 27 में ले जाता है के समय पाठ्यक्रम के लिए एक फिट से निकाले जाते हैं। एसबीएल में लेबल के विरंजन दर स्वतंत्र रूप से, एकल लिपिड डाई ट्रैकिंग से अनुमान लगाया गया है, या कुल तीव्रता प्रोफ़ाइल के लिए एक घातीय फिटिंग द्वारा 1 समीकरण, लंबे समय में (जैसे, शासन (3) में 3 चित्र में)। एक fusing पुटिका के आकार को जानने और लिपिड diffusivity वास्तविक लिपिड रिलीज के समय की तुलना की अनुमति देता है, 1 समीकरण , पुटिका के चारों ओर एक लिपिड का प्रसार करने के लिए समय 1 समीकरण है, जहां एक ves पुटिका क्षेत्र है और 1 समीकरण लिपिड diffusivity है। दो समय तराजू तुलना कर रहे हैं, तो ताकना लिपिड रिलीज करने के लिए थोड़ा प्रतिरोध प्रस्तुत करता है, और रिलीज के प्रसार-सीमित है। इसके विपरीत, यदि 1 समीकरण है, तो ध्यान में लीन होना काफी लिपिड प्रवाह अवरूद्ध। मंदता का एक मात्रात्मक उपाय "ताकना खुलापन", पी 0, अनुपात के बराबर है 1 समीकरण बार एक कारक ओएफ आदेश एकता ज्यामिति 27 ताकना से संबंधित है। एक दो राज्य, खुला / बंद ताकना के लिए, पी 0 खुले राज्य में समय का अंश है। एक चंचल ताकना जिसका आकार लगातार बदलता रहता है के लिए, पी 0 पूरी तरह से खुला त्रिज्या के लिए समय औसतन त्रिज्या रिश्तेदार का प्रतिनिधित्व करता है।

संकेत करने वाली शोर अनुपात एकल लिपिड fluorophores नज़र रखने के लिए पर्याप्त रूप से अच्छा होने की जरूरत है। यह और अधिक आसानी से एकल रंग प्रयोगों में हासिल की है, इस तरह के एलआर-पे के रूप में एक उज्ज्वल मार्कर का उपयोग कर।

लिपिड के साथ पता लगाना और घुलनशील कार्गो रिलीज

एक प्रतिनिधि घटना चित्रा 7 में दिखाया गया है। उच्च encapsulation के लिए इस्तेमाल किया सांद्रता में, SRB प्रतिदीप्ति शुरू में आत्म-बुझती है। इसलिए, सबसे डॉक वी एसयूवी केवल उनके था संकेत 27 से पहचाने जा रहे हैं। एक तेज वृद्धिमें किया था प्रतिदीप्ति लिपिड मिश्रण के निशान, एकल रंग लिपिड लेबल प्रयोगों में के रूप में। लिपिड रिहाई की शुरुआत SRB प्रतिदीप्ति में वृद्धि की शुरुआत के साथ हुई। के रूप में SRB अणुओं बच एसयूवी और शेष SRB आत्म-शमन सांद्रता नीचे पतला था यह वृद्धि SRB dequenching के कारण सबसे अधिक संभावना थी। दिलचस्प बात यह है SRB प्रतिदीप्ति एक स्थिर पठार पर पहुंच गया। अगर फ्यूजन ताकना खुला रहा, एक SRB संकेत dequenching के कारण अधिकतम पृष्ठभूमि करने के लिए एक कमी के बाद करने के लिए बढ़ाने के लिए के रूप में शेष SRB एसयूवी छोड़ दिया है, या अगर एसयूवी एसबीएल में ढह की उम्मीद होगी। स्थिर पठार सबसे अधिक संभावना ताकना सभी लिपिड लेबल और घुलनशील माल का एक अंश जारी करने के बाद resealed इंगित करता है।

कुछ मामलों में, लिपिड रिलीज संकेत किसी भी detectable सामग्री के साथ नहीं था संकेतों जारी। यह या तो क्योंकि pores भी SRB के पारित होने की अनुमति के लिए छोटे थे हो सकता है, या कुछकैसे एसयूवी पहले से ही अपने घुलनशील कार्गो खो दिया था। इन दो संभावनाओं के बीच अंतर करने के लिए, डॉक एसयूवी की ब्लीचिंग का विश्लेषण किया जा सकता है। लिपिड लेबल की ब्लीचिंग था, सेकंड के भीतर अपनी प्रतिदीप्ति संकेत कम कर देता है शुरू में आत्म-बुझती SRB का एक अंश के रूप में SRB संकेत की वृद्धि में SRB परिणामों के विरंजन, जबकि फोटो-परिवर्तित अन्य उत्पादों और आत्म-शमन राहत मिली है करने के लिए कर रहे हैं। जबकि सबसे डॉक एसयूवी (48 58 से बाहर की घटनाओं का विश्लेषण किया) रोशनी की विस्तारित अवधि में SRB प्रतिदीप्ति में वृद्धि की संभावना प्रदर्शित, एक छोटा सा अंश (10/58) सब पर किसी भी एसआरबी संकेतों नहीं दिखा था। इस प्रकार, एसयूवी का एक छोटा सा अंश उनकी तैयारी और प्रयोगों में इस्तेमाल के बीच की अवधि के दौरान उनके घुलनशील सामग्री खो सकते हैं।

घटनाओं का 80% से अधिक (74 से 91) जिसके लिए दोनों SRB था और संकेतों का पालन किया जा सकता है, SRB प्रतिदीप्ति वृद्धि हुई है और एक स्थिर पठार 27 पर बने रहे। टी के ~ 20% मेंhese मामलों शेष SRB प्रतिदीप्ति अचानक बाद में कुछ सेकंड के लिए जारी किया गया था। यह या तो संचित तस्वीर क्षति के कारण 16 ताकना 1-2 फ्रेम (18-36 मिसे) या एसयूवी की एक फोड़ के भीतर तेजी से, पूर्ण रिलीज की अनुमति के लिए एक फिर से खोलने के कारण हो सकता है। जो भी अपने मूल, इस दूसरे, SRB के तेजी से विज्ञप्ति जारी की संभावना है कि आरंभिक रिलीज के बाद अवशिष्ट SRB संकेत SRB एसबीएल और पूर्ण रिलीज के बाद ग्लास सब्सट्रेट के बीच अंतरिक्ष में फँस शेष के कारण हो सकता है नियम। एक ऐसी व्यवस्था पहले के एक अध्ययन जहां एसबीएल कांच पर सीधे समर्थन किया था, दो 16 के बीच छोटी सी जगह के साथ में सुझाव दिया गया था। इसके विपरीत, इस परख में इस्तेमाल PEGylated लिपिड एसबीएल और कांच के 25 के बीच अंतरिक्ष के 4-5 एनएम प्रदान करना चाहिए, SRB संलयन साइट से दूर फैलाना करने की इजाजत दी।

चित्रा 6
चित्रा 7. Simultan ईओयू लिपिड और सामग्री जारी। लिपिड (नीला) और एक एसयूवी-एसबीएल संलयन घटना के लिए सामग्री (लाल) मार्कर से प्रतिदीप्ति संकेतों (विवरण के लिए पाठ देखें)। हर चैनल से फोटो नीचे (4.0 माइक्रोन चौड़ा) पर दिखाया गया है। कार्टून (मध्य) विभिन्न चरणों को दर्शाते हैं। (1) एसयूवी नाव, था प्रतिदीप्ति कम है। (2) फ्यूजन हस्तांतरण की अनुमति देता एसबीएल में किया था और प्रतिदीप्ति बढ़ जाती किया की। के रूप में स्वयं शमन ताकना के माध्यम से SRB के भागने से राहत मिली है SRB संकेत भी बढ़ जाती है। (3) SRB संकेत स्थिर है, जबकि था एसबीएल भीतर फैलाना अणुओं ताकना के एक संभव resealing का संकेत बनी हुई है। (4) SRB संकेतों तेजी से पूर्ण संलयन या liposome फोड़ के कारण बहुत तेजी से कम होती है। वी-एसयूवी की रचना था POPC: SAPE: DOPS: PEG2000-डोप: था (67: 15: 12: 5: 1 तिल%), एल.पी. 200, टी SBLs POPC से बना रहे थे, जबकि: SAPE: DOPS: मस्तिष्क पीआई (4,5) पी 2: PEG2000-डोप: NBD-पीई (64.5: 15: 12: 3: 5: 0.5 तिल%) और एल.पी. = 20,000। = "_blank"> कृपया यहाँ यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।

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Discussion

एसयूवी-एसबीएल संलयन यहाँ वर्णित परख के सफल कार्यान्वयन के ऐसे liposomes में प्रोटीन के कार्यात्मक पुनर्गठन के रूप में कई महत्वपूर्ण कदम है, पर निर्भर करता है, अच्छी गुणवत्ता SBLs प्राप्त करने, और एकल अणुओं का पता लगाने के लिए सही इमेजिंग पैरामीटर चुनने। हालांकि यह सफल होने के लिए कुछ समय और प्रयास ले सकते हैं, एक बार परख सफलतापूर्वक कार्यान्वित किया जाता है, यह परिचय में चर्चा किसी अन्य के लिए इन विट्रो संलयन परख से उपलब्ध नहीं संलयन की प्रक्रिया के बारे में जानकारी का खजाना प्रदान करता है। दरों जिस पर एसयूवी पर और एसबीएल, डॉकिंग के लिए फ्यूजन बार का वितरण, लिपिड diffusivity, हर fusing liposome के आकार के साथ फ्यूज गोदी, और कि क्या एक दिया संलयन घटना के लिए लिपिड रिलीज diffusion- या ताकना नियंत्रित कर सकते है दृढ़ निश्चयी रहें। तो रिलीज के प्रसार से उम्मीद की तुलना में धीमी है, एक मॉडल है कि ताकना चंचल मानता लिपिड रिलीज पैदावार की मंदता, पी 0, समय के अंश underlies ताकना मैंफ्यूजन 27 के दौरान खुला है।

पिछला काम SBLs 15-17,21,22,33,44 डाई अणुओं के बीच झल्लाहट और आत्म-शमन पर भरोसा करने के लिए एकल एसयूवी एसयूवी संलयन 18-20,28 या liposomes और वायरल कणों के विलय की जांच कर रही। इसके विपरीत, हम काफी हद तक एसबीएल में लिपिड लेबल हस्तांतरण के कैनेटीक्स की जांच के लिए दो कारणों के लिए डाई dequenching से बचें। सबसे पहले, झल्लाहट दक्षता लिपिड रिलीज के एक बेहद गैर रेखीय पत्रकार है। झल्लाहट दक्षता में बड़े परिवर्तन में अंतर-डाई दूरी डी परिणाम में छोटे परिवर्तन, लेकिन केवल डी / आर 0 मूल्यों का एक सीमित रेंज, जहां आर 0 फोरस्टर दूरी है। यही कारण है, वास्तविक डाई कमजोर पड़ने और dequenching संकेत में एक मनाया वृद्धि हुई है, तब हो सकता है समय आर 0 के करीब एक मूल्य के लिए ड्रॉप करने के लिए आवश्यक होने के कारण बीच में एक समय अंतराल है। इसी तरह, वहाँ dequenching संकेत में थोड़ा परिवर्तन है एक बार डाई घनत्व लिपिड रिहाई पर पर्याप्त रूप से कम हो जाती है कि इस तरह के 0 से अधिक 1.4, डाई का एक महत्वपूर्ण राशि अभी भी पुटिका में रहता है, भले ही। इन गुणों के संकेत में एक कील प्राप्त संलयन घटनाओं का पता लगाने के लिए है, लेकिन उच्च समय संकल्प का उपयोग लिपिड रिहाई की मात्रात्मक गतिज विश्लेषण जटिल लिए एक अच्छा उपकरण dequenching बनाते हैं। इसके विपरीत, द्विध्रुवीय पुनरभिविन्यास और एसबीएल में एक एसयूवी से एक fluorophore स्थानान्तरण के रूप में क्षणभंगुर क्षेत्र के प्रभाव के कारण तीव्रता में परिवर्तन रैखिक डाई के अंश अभी भी एसयूवी में शेष से संबंधित हैं। दूसरा, लिपिड लेबल की उच्च सांद्रता आत्म-शमन के लिए आवश्यक संलयन की प्रक्रिया ही प्रभावित कर सकता है।

ध्रुवीकृत TIRF उत्तेजना के लिए, चित्रा 4 में के रूप में एक घर में निर्मित सेटअप लागत प्रभावी है और ध्रुवीकरण गुण से अधिक उत्कृष्ट नियंत्रण प्रदान करता है। हालांकि, एक घर में निर्मित सेटअप आवश्यक नहीं है, के रूप में कम से कम कुछ वाणिज्यिक TIRF सूक्ष्मदर्शी ध्रुवीकृत उत्तेजना का उपयोग करें और मुस्तैददो रंग उत्सर्जन बंटवारे मॉड्यूल उपलब्ध हैं। एक वाणिज्यिक माइक्रोस्कोप ध्रुवीकृत उत्तेजना प्रकाश माइक्रोस्कोप में लेजर से उभर जोड़े को एक ध्रुवीकरण को बनाए रखने (प्रधानमंत्री) फाइबर का उपयोग करता है सफलतापूर्वक पहले 25-27 इस्तेमाल किया गया था। इस तरह के एक साधन पर, ध्रुवीकरण माइक्रोस्कोप के TIRF इकाई के लिए प्रधानमंत्री फाइबर इनपुट घूर्णन द्वारा बस घुमाया जा सकता है। इसके विपरीत, कुछ अन्य वाणिज्यिक setups TIRF इकाई में एक ध्रुवीकरण बीम फाड़नेवाला काम कर सकते हैं, ध्रुवीकरण समायोजन और अधिक कठिन या असंभव बना रही है। दुर्भाग्य से, ध्रुवीकरण गुण अक्सर वाणिज्यिक प्रणालियों के लिए निर्दिष्ट नहीं कर रहे हैं। इस प्रकार, यह उपयोगकर्ताओं को, जो एक घर में निर्मित प्रणाली ध्रुवीकरण गुण के बारे में चर्चा करने के लिए और एक विशेष वाणिज्यिक विकल्प में निवेश करने से पहले एक डेमो यूनिट की कोशिश करने का निर्माण करने के लिए नहीं चाहते के लिए महत्वपूर्ण है।

लिपिड और घुलनशील माल की रिलीज के साथ निगरानी संलयन की प्रक्रिया पर आगे की जानकारी प्रदान करता है। कई pores rele के बाद reseal करने लगते हैंasing केवल घुलनशील लेबल के एक अंश के लिए एक एसयूवी 27 में समझाया। आमतौर पर सभी लिपिड लेबल के समय ध्यान में लीन होना reseals द्वारा जारी किया जाता है, तो ताकना resealing अकेले लिपिड रिहाई की निगरानी से पहले संदिग्ध नहीं था। एसबीएल में लेबल लिपिड दरअसल, अकेले लिपिड रिहाई की निगरानी, ​​Kiessling एट अल। 29 का सुझाव दिया था हस्तांतरण एसबीएल में पूरे एसयूवी झिल्ली की बेहद तेजी से पतन के माध्यम से हुई।

बाद सामग्री का आंशिक रिहाई पहले एक liposome सीमित bilayer पैच संलयन परख में मनाया गया संलयन की resealing pores। Rawle एट अल। 54 से तैयार फ्रीस्टैंडिंग bilayer पैच कि ~ 8 एनएम लंबे डीएनए spacers द्वारा एक coverslip पर सीमित कर दिया गया। वे तो liposomes जिसका संलयन bilayer पैच करने के लिए पूरक एकल असहाय डीएनए लिपिड liposome और पैच झिल्ली के लिए लंगर conjugates के संकरण से प्रेरित था की शुरुआत की। सभी घटनाओं का 12% क्षणिक fusions थे, भाग में जिसके परिणामस्वरूपliposome सामग्री की ial रिहाई। Liposome फोड़ की घटनाओं, कुछ पिछले एसयूवी-एसबीएल संलयन assays के 44 में देखा है, बहुत ही दुर्लभ थे। लेखकों ~ 8 एनएम bilayer पैच नीचे अंतरिक्ष का सुझाव दिया, bilayer सब्सट्रेट बातचीत रोकने, bilayer नीचे अंतरिक्ष के लिए liposome सामग्री के गैर टपकाया हस्तांतरण की अनुमति दी हो सकता है। इसके अलावा, जारी घुलनशील लेबल के प्रसार में काफी तलीय bilayer और कांच सब्सट्रेट के बीच अंतरिक्ष में रुकावट नहीं किया गया था। परख यहाँ वर्णित में, तलीय bilayer इसी तरह पाली (एथिलीन ग्लाइकोल) -lipid conjugates की मौजूदगी से ~ 5 एनएम coverslip से दूर रखा जाता है।

घुलनशील और लिपिड माल के दो रंग की निगरानी के द्वारा उपलब्ध कराई गई अतिरिक्त जानकारी कुछ व्यापार-नापसंद के साथ आता है। सबसे पहले, दो लेबल के साथ एसयूवी की तैयारी लिपिड लेबलों अकेले सहित तुलना में कुछ अधिक शामिल है। दूसरा, वहाँ के कुछ अपरिहार्य नुकसान हुआ है संकेत करने वाली शोर जब टी में लिपिड लेबल से संकेतों की निगरानीएकल रंग लिपिड रिलीज प्रयोगों में के रूप में वह एक ही अधिग्रहण की दर (फ्रेम प्रति 15-20 मिसे)। इस नुकसान के कुछ तथ्य यह है कि क्या किया, घुलनशील SRB मार्कर के साथ मिलकर एक लिपिड लेबल के रूप में इस्तेमाल करने के कारण, के रूप में उज्ज्वल के रूप में एलआर पीई एकल रंग प्रयोगों में इस्तेमाल किया नहीं है। अतिरिक्त घाटे उच्च पृष्ठभूमि से एक साथ दो-लेजर उत्तेजना और ऑप्टिकल पथ में अतिरिक्त घटकों (चित्रा 4) की वजह से परिणाम। अब तक, कम संकेत करने वाली शोर एकल के विश्वसनीय ट्रैकिंग से हमें रोका दो रंग प्रयोगों में लेबल किया था। यह बदले में सब जानकारी है कि एकल रंग एलआर पीई माप के साथ हो सकता है निकालने के लिए एक गहन विश्लेषण रोका। यह चुनौती अधिग्रहण की स्थिति में सुधार के अनुकूलन और गुणों के साथ संगत लेबल की अन्य जोड़े के परीक्षण के द्वारा भविष्य में दूर किया जा सकता है।

घुलनशील और लिपिड माल की रिलीज के साथ निगरानी भी hemifusion, एक राज्य में जो समीपस्थ पत्रक जुड़े हुए हैं पता लगा सकते हैं, लेकिन बाहर कापत्रक नहीं है। दरअसल, इस तरह दो रंग प्रयोगों इन विट्रो संलयन assays 18,20 में अन्य में hemifusion की उपस्थिति का केवल निर्णायक आकलन प्रदान कर सकता है। हालांकि, hemifusion मज़बूती एकल रंग एसयूवी-एसबीएल प्रयोगों निगरानी लिपिड अकेले 22,44 विज्ञप्ति में पता लगाया जा सकता है। इस तरह के प्रयोगों में, 1/2 के बारे में एक एसयूवी की प्रारंभिक लिपिड लेबल तीव्रता संलयन स्थान पर बनी हुई है। शेष तीव्रता गायब हो सकता है जब बाहर का पत्रक, बाद में कुछ समय के फ्यूज यदि जगह अभी तक प्रक्षालित नहीं किया है।

लागू करने के लिए PEGylated लिपिड का उपयोग एसबीएल और कांच के समर्थन के बीच एक नरम तकिया exocytosis के SNAP25 आवश्यकता reproducing में महत्वपूर्ण हो गया है। एक खूंटी में प्रोटोकॉल परिणाम एसबीएल कि प्रवाह चैनल के रूप में अच्छी तरह से चेहरे के पक्ष को कवर ब्रश। इस तरह, एसयूवी और एसबीएल के बीच गैर विशिष्ट बातचीत को कम करने के रूप में परिचय में विस्तार से बताया के रूप में कुछ लाभ है। तो प्रोटीन है कि के साथ बातचीत फॉस्फोलिपिडएसबीएल परख में पेश कर रहे हैं, हालांकि, खूंटी ब्रश ऐसी बातचीत के खिलाफ एक steric बाधा पेश करेंगे। इस प्रकार, कुछ अनुप्रयोगों के लिए, यह खूंटी परत asymmetrically शामिल करने के लिए वांछनीय केवल एसबीएल और कांच coverslip के बीच होगा। प्रवाह चैनल का सामना करना पड़ एसबीएल के पक्ष में तो इस तरह के रूप में synaptotagmin फॉस्फोलिपिड बंधनकारी प्रोटीन, के साथ बातचीत करने में सक्षम होगा। यह द्वि-कार्यात्मक खूंटी जंजीरों कि covalently एक छोर पर coverslip करने के लिए जोड़ा जा सकता है का उपयोग कर और दूसरे पर एक लिपिड लंगर ले जाने से पूरा किया जा सकता है। Langmuir-Blodgett तरीकों तो खूंटी परत 55 पर एक लिपिड monolayer जमा करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इसके साथ इस हाइड्रोफोबिक सतह फ्यूज ऊपर पेश किया Liposomes, एक bilayer 56 के गठन। यह आशा की जाती है कि इस दृष्टिकोण भविष्य में microfluidics के साथ संयुक्त हो जाएगा।

यह आशा की जाती है कि एसयूवी-एसबीएल यहाँ प्रस्तुत परख अतिरिक्त प्रोटीन है कि फन्दे के साथ बातचीत की भूमिका का पता लगाने में मददगार होगाऐसे Munc18 / Sec1 परिवार, कैल्शियम सेंसर synaptotagmin-1, और complexin के रूप में।

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Disclosures

लेखकों घोषणा की कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Milli-Q (MQ) water Millipore
KOH J.T. Baker 3040-05
Ethanol 190 Proof Decon
Isopropanol Fisher Chemical A416P4
HEPES AmericanBio AB00892
Sodium Cholride (KCl) AmericanBio AB01915
Dithiothreitol AmericanBio AB00490
N-[2-hydroxyethyl] piperazine-N'-[2-ethanesulfonic acid] (HEPES) AmericanBio AB00892
EGTA Acros Organics 409911000
Buffers
HEPES-KOH buffer (pH 7.4) 25 mM HEPES-KOH, 140 mM KCl, 100 μM EGTA, 1 mM DTT
Solvents
Chloroform  J.T. Baker 9180-01 in glass bottle, CAUTION, wear PPE
Methanol J.T. Baker 9070-03 in glass bottle, CAUTION, wear PPE
Liposome preparation
Gastight Hamilton syringe Hamilton var. sizes only use glass sringe with solents (Chlorophorm/ Methanon, 2:1, v/v)
Glass tubes Pyrex Vista 11 ml, 16x100 mm screw cap culture tube Pyrex  70825-16 clean thoroughly, rinse with chloroform
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 16:0-18:1 PC (POPC) Avanti Polar Lipids 850457 Lipids come dissolved in CHCl3 or as lyphilized powder in sealed vials. Aliquot upon opening. Store extra as dried lipid films under inert atmosphere at -20 °C. Keep stocks in CHCl3/MeOH (2:1, v/v) at -20 °C. let come to RT before opening
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt), 18:1 PS (DOPS) Avanti Polar Lipids 840035 Same as above.
1-stearoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, 18:0-20:4 PE (SAPE) Avanti Polar Lipids 850804 Same as above.
L-α-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate (Brain, Porcine) (ammonium salt), Brain PI(4,5)P2 Avanti Polar Lipids 840046 Same as above.
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl) (ammonium salt), 18:1 NBD PE Avanti Polar Lipids 810145 Same as above.
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt), 18:1 PEG2000 PE Avanti Polar Lipids 880130 Same as above.
cholesterol (ovine wool, >98%) Avanti Polar Lipids 700000 Same as above.
DiD' oil; DiIC18(5) oil (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindodicarbocyanine Perchlorate) Molecular Probes D-307
Rotavapor R-210 Buchi R-210 heat bath above Tm of lipids used
OG n-Octyl-β-D-Glucopyranoside Affymetrix 0311 store at -20 °C, let come to RT before opening
Shaker - Eppendorf Thermomixer R Eppendorf
Slide-A-Lyze Dialysis Cassettes, 20k MWCO, 3 ml life technologies 66003
Bio-Beads SM-2 Adsorbents Bio-Rad 1523920
OptiPrep Density Gradient Medium Sigma-Aldrich D1556
Ultracentrifugation tube, Thinwall, Ultra-Clear, 13.2 ml, 14 x 89 mm Beckman Coulter 41121703
Beckman SW41 Ti rotor
SuflorhodamineB Molecular Probes S-1307
Econo-Column Chromatography Columns, 2.5 × 10 cm Bio-Rad 7372512
Sepharose CL-4B GE Healthcare 17-0150-01
SYPRO Orange Protein Gel Stain Molecular Probes S-6650 5,000x Concentrate in DMSO
PDMS block
Sylgard 184 Silicone elastomer kit, PDMS Dow Corning 3097358-1004
Pyrex glass petri dish, 150 x 20 mm, complete with cover Corning 3160-152
Hole puncher - Reusable Biopsy Punch, 0.75 mm World Precision Instruments 504529
Manual Hole Punching Machine  SYNEO MHPM-UNV
Drill .035 x .026 x 1.5 304 SS TiN coated round punch SYNEO CR0350265N20R4 drill diameter: 0.9 mm, punch bore size: 0.74 mm
Tygon Microbore tubing, 0.25 mm ID, 0.76 mm OD Cole-Parmer 06419-00 0.010" ID, 0.030" OD
Silicone Tubing (0.51 mm ID, 2.1 mm OD Cole-Parmer 95802-00 0.020" ID, 0.083" OD
Cover glass - cleanroom cleaned
Schott Nexterion cover slip glass D Schott 1472305
plasma cleaner Harrick PDC-32G
pTIRF setup and accessories
IX81 microscope body Olympus IX81
EM CCD camera Andor ixon-ultra-897
Thermo Plate, heated microscope stage Tokai Hit MATS-U52RA26
1 ml hamilton glass syringes (4x) Hamilton 81365
syringe pump kd Scientific KDS-230

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 114 झिल्ली संलयन जाल प्रोटीन लिपिड bilayer proteoliposomes समर्थित bilayer एकल पुटिका संलयन फ्यूजन ताकना एक्सोसाइटोसिस एकल अणु प्रतिदीप्ति microfluidics TIRFM बायोफिज़िक्स
एक microfluidic प्रवाह सेल में सीमित समर्थित bilayers फूट डालना TIRF माइक्रोस्कोपी द्वारा निगरानी के साथ एकल Proteoliposomes के जाल की मध्यस्थता फ्यूजन
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Nikolaus, J., Karatekin, E.… More

Nikolaus, J., Karatekin, E. SNARE-mediated Fusion of Single Proteoliposomes with Tethered Supported Bilayers in a Microfluidic Flow Cell Monitored by Polarized TIRF Microscopy. J. Vis. Exp. (114), e54349, doi:10.3791/54349 (2016).

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