Summary
여기, 우리는 단일 분자 감도와 ~ 15 밀리 초 시간 해상도와 편광 TIRFM를 사용하여 리포좀과 미세 유체 채널에 지원 이중층 사이에 하나의 SNARE 매개 융합 이벤트를 감지하는 프로토콜을 제시한다. 지질 용해성화물 분리를 동시에 검출 할 수있다. 리포좀의 크기, 지질 확산과 융합 기공 특성을 측정한다.
Abstract
막 융합의 유비쿼터스 과정에서 융합 기공의 개방이 이전에 별도의 구획 사이의 첫 번째 연결을 설정합니다. 세포 외 유출을 통해 신경 전달 물질이나 호르몬 방출 동안, 융합 기공은 일시적으로 개폐 반복, 조절화물 방출 동역학 수 있습니다. 기공 역학은 소포 재생 모드를 결정하고; 과도, '키스 앤 실행 "을 융합 돌이킬 재 밀봉 결과, 반면 팽창 전체 융합에 연결됩니다. 더 나은 기공 역학을 지배하는 어떤 요인을 이해하기 위해, 우리는 단일 분자 감도와 ~ 생화학 생체 시스템에서 잘 정의 된 15 밀리 초 시간 해상도와 편광 총 내부 반사 형광 (TIRF) 현미경을 사용하여 막 융합을 모니터링 할 수있는 분석법을 개발했다. 퓨전의 형광 평면 이중층 베어링 t-올무와 V-SNARE 단백질 (V-포드 SUV)를 포함하는 작은 단일 층 소포를 표시, 부드러운 폴리머 쿠션에서 지원 (t-SBL, t 지원 이중층), 감시된다. 상기 분석은 SUV 차량의 일정한 밀도를 제공하면서 최소의 샘플 소비되도록 마이크로 유체 유동 채널을 사용한다. 융합 동안 SBL에 SUV에서 지질 라벨의 전송시 빠른 신호 향상을 악용, 지질 염료 전송의 반응 속도가 모니터됩니다. TIRF 현미경의 감도는 지질 확산 및 SUV 크기마다 융합 이벤트 추론 될 수있는 하나의 지질 형광 라벨을 추적 할 수 있습니다. 지질 염료 해제 시간은 영구적으로 열린 모공을 통해 방해받지 않고 통과를 위해 예상보다 훨씬 더 오래 할 수 있습니다. 지질 방출 위상차 플리커 기공에 기인 세공 "개방"세공 융합 동안 열려있는 시간의 일부를지지하는 모델을 사용하여 추정 될 수있다. 가용성 마커는 지질 및 가용성화물 릴리스의 동시 모니터링을위한 SUV 차량에 캡슐화 할 수 있습니다. 이러한 측정은 약간의 구멍이 용해화물의 일부를 잃은 후 다시 봉인 할 수 있습니다 나타냅니다.
Introduction
막 융합 지질과 단백질, 분비, 수정, 개발의 세포 내 인신 매매에 필요한 보편적 인 생물학적 과정 및 호스트 생물 1-3로 바이러스 항목을 포위. 세포 외 유출을 통해 호르몬과 신경 전달 물질의 방출을 포함한 대부분의 세포 융합 반응의 경우,이 지질 이중층을 융합 할 수있는 에너지에 정박, 동족 가용성 N-에틸 말레이 미드 민감한 요소 첨부 단백질 수용체 (SNARE) 단백질 사이의 네 나선 번들 형성에 의해 제공됩니다 소포 (V-SNARE) 각각 대상 막 (t-SNARE) 4. 시냅스 소포 세포 외 유출이 가장 엄격하게 규제 융합 반응이며 활동 전위 1,4,5의 도착 후 밀리 초 내에 발생한다. 융합 기공, 두 융합 구획 사이의 초기 연결을 열고 깜빡하고 재 밀봉 또는 비가 역적 5-7 확장하기 전에 여러 차례 폐쇄 할 수 있습니다. 전 결과순간에, 후자의 리드하면서 전체 융합, 융합 "키스 및 실행". 이 두 가지 융합 모드와 기공 깜박임을 조절하는 메커니즘 사이의 균형을 지배하는 요인은 잘 5,8 이해되지 않습니다.
SNARE 단백질은 세포 외 유출에 필요한; 시냅스 소포의 융합은 신경독 (9)에 의해 함정의 절단에 폐지된다. 작은 단일 층 소포 (포드 SUV)을 사용하여 대량 융합 실험도 막 융합 (10)를 구동하기에 충분한 덫은 필요하지 않은 것으로 나타났다하지만. 이 벌크 분석에서, SUV 차량은 V-스네어 (V-SUV)로 재구성 형광 인지질 (N 도핑 된 - (7- 니트로 2-1,3-benzoxadiazol -4- 일) -phosphoethanolamine (NBD-PE) 및 ( N -. (리사 민 로다 민 B의 설 포닐) -phosphoethanolamine (LR-PE) 및 v-포드 SUV의 NBD-PE의 초기 형광 포스터 공명 에너지 전달에 의해 급냉 t-덫 (t-SUV)를 포함하는 레이블이없는 소포와 혼합 (FRET ) LR-PE에. 실험실로eled V-SUV와 비 표지 t-SUV 차량과 융합, 지금은 결합 막 중의 형광 물질의 표면 밀도는 감소되고, NBD-PE 형광의 결과 증가 된 지질 10의 혼합의 범위를보고한다. 대량 분석을 설정하고 분석하기 쉬운, 널리 SNARE 매개 융합 10-14의 메커니즘을 연구하는 데 사용되었습니다. 그러나, 낮은 감도와 가난한 시간 해상도와 같은 몇 가지 제한이 있습니다. 가장 중요한 것은, 앙상블 측정으로, 어려운 hemifusion 중간체의 도킹과 융합 사이의 차별뿐만 아니라 탐지를 만드는 모든 이벤트를 통해 그 평균 결과.
우리를 포함하여 지난 십 몇 개의 그룹, 동안, 하나의 소포 레벨 15-27에서 융합 이벤트를 모니터링 할 수있는 새로운 분석법을 개발했다. 하 연구진은 표면에 닿는 V-SUV 차량을 사용하고 무료 t-포드 SUV (18, 19)과의 융합을 모니터링. 지질 혼합 지질 결합 된 형광체 한 쌍의 FRET를 사용하여 측정 하였다 그들전반사 형광 (TIRF) 현미경 (18)을 이용하여 각각 V- 및 t-SUV 차량에 침대. 나중에 Brunger의 연구소는 지질과 내용이 20,28 혼합의 동시 검출을위한 내용 마커와 함께 하나의 지질 라벨 종을 사용했다. 지질 내용물 마커 모두 높은 자기 농도 켄칭 하였다; 레이블이없는 포드 SUV와 융합 20,28을 dequenching 형광 결과.
다른 사람은 t-덫 15-17,21-27,29으로 재구성 평면 이중층에 V-포드 SUV를 융합했다. 타겟 (t-SNARE 함유) 이중층 잘 모방 평면 세포막 작은 고도로 곡선 소포 융합의 생리적 과정의 평면 형상. 스타이 기는 다공성 실리콘 질화물 기판 상에 현탁 t-덫으로 재구성 기공 걸쳐 막을 채용 및 공 초점 레이저 주사 현미경 (23)을 사용하여 각각의 V-SUV 차량과 융합 검출. 기타 Ft-덫으로 재구성 평면 이중층에 사용 된 V-포드 SUV는 유리 기판 15-17,21,22,24-27,29 지원. 지원 이중층 (SBLs)를 사용할 때의 큰 장점은 마이크로 유체를 사용하는 것이 아니라 사용하는 단일 이벤트 해상도를 제공하지만 TIRF 현미경는 우수한 신호대 잡음비와 자유 V-SUV의 간섭없이 도킹 및 융합 이벤트를 검출하는데 사용될 수 있다는 표준 원거리 표면 형광 현미경 (24).
주된 관심사는 기판 이중층 상호 작용 이중층 품질 및 융합 과정을 지원하는지 여부에 영향을주는 방법이다. 초기 작품은 직접 유리 또는 석영 기판 15-17에서 지원 된 평면 SBLs 사용했다. 이 SBLs은 확산과 기판에 T-SUV 세포막의 융합, 파열, 흡착에 의해 만들어졌다. 이는 곧 키 t-SNARE 성분을 생략 SNAP25가이 방식으로 제조 SBLs에서 V-SUV 도킹 및 융합 동력학 indistinguis 결과 있다는 것이 실현전체 t-덫 (17)를 사용하여 얻은 것과 hable. SNAP25 절대적 생체 (30, 31)의 융합이 필요하기 때문에, 이러한 초기 시도의 생리 학적 관련성이 질문에 넣었다. Tamm의 그룹은 더 나은 지원하여 제어 이중층 형성 (21)를 사용하여이 문제를 극복했다. 또한 t-SUV 차량 (21)이 단일 층의 융합이어서 SBL의 무 단백질 제 전단 대한 랭 뮤어 - 블로 젯 증착법을 사용 하였다. 이 SNAP25에 의존 융합의 결과.
직접 랭 뮤어 - 블로 젯 방법을 사용하지 않고, 유리 기판 상에지지 된 이중층과 관련된 잠재적 인 아티팩트를 방지하려면 Karatekin는 외. 이중층과 기판 (24) 사이의 부드러운 수화 된 폴리 (에틸렌 글리콜) (PEG) 쿠션을 도입했다. 이 수정은 SNAP25에 의존 융합 (24) 결과. 연질 중합체 층에 쿠션 이중층은 더 트랜스를 유지하는 것으로 알려져 있었다단백질의 이동과 기능 (32), 그리고 바이러스 33 핵융합 연구에 사용되었다. 또한, PEG 화 이중층은 자기 치유 일부 능력을 유지하는 것 및 (34, 35)이 매우 강하다. 먼저, 시판 지질 결합 PEG 사슬의 일부가 t-SUV 막에 포함된다. 이러한 t-SUV의 버스트와 유리 기판 상에 평면 이중층을 형성 할 때, PEG 브러시 판 이중층 모두 전단을 커버한다. 평면 이중층 형성이 친수성 유리 표면에 t-SUV 차량 주변의 PEG 사슬의 부착에 의해 구동되기 때문에, 리포솜 파열 평면 이중층 형성에 사용되는 지질 조성물에 비교적 둔감하다. 콜레스테롤이 다량 포함되어있는 경우에는, 상기 SUV 차량의 응집성을 증가 SUV의 자발적 버스트 수 없다. 이 경우, 삼투압 충격 또는 가의 이온 평면 이중층의 형성 (25)를 돕기 위해 사용될 수있다.
이 AP에 상술 한 바와 같이,PEG의 브러시 평면의 양측을 커버 proach 이중층 지원. 마이크로 유체 유동 채널을 향하는 브러시는 일반적으로 PEG 층으로 피복되어 들어오는 V-SUV 차량의 비특이적 부착을 방지 할 수 있습니다. V-와 t-SNARE 복합체의 형성은 막 인접 영역 (36)을 향해 단계에서 막 원심 N 말단 진행됩니다. V 자 포드 SUV는 t-SBL의 V- 및 분석의 조건 하에서 경우듯한 PEG 브러쉬, 위에 돌출하는 t-SNARE N 말단의 필요성과 상호 작용을 위해. 브러시 높이 PEG 화 지질 농도와 PEG 사슬 길이를 변화시킴으로써 37,38 스네어 이외의 단백질을 연구하기 위해 적응 될 수있다. 융착 이중층의 근위 표면을 덮고있는 PEG 브러쉬의 또 다른 이점은 평방 미크론 (39) 당 30,000-40,000 통합 막 단백질로 포장 생체막의 혼잡 한 환경을 모방한다는 것입니다. 다만이 분석에서 PEG 사슬처럼, 어 Repu생물 세포막을 덮고 lsive 단백질 층은 융합이 발생 할 두 인지질 이중층 사이의 접촉을 허용하도록 밀려 될 필요가있다.
그들 고유의 이점을 제공하는 미세 유체 유로는 상기 분석에 사용된다. 먼저, 미세 유체 흐름은 t-SBL을 형성하도록보다 균일 한 확산 t-SUV의 석출 및 용해를 가능하게한다. 둘째, 작은 채널 볼륨 (<1 μL)를 샘플 소비를 최소화한다. 셋째, 필요한 소량 전체 실험 일정한 흐름 하에서 실시 할 수있다. 흐름 약하게 제거 아마도 비 즉, SBL 16 접착 V-SUV 차량. 또한 운동 분석 (17)을 단순화 t-SBL 위의 V-SUV 차량의 일정한 밀도를 유지한다. 마지막으로, 도킹 소체 쉽게 유동 (25)에 의해지지없는 것과는 구별된다. 넷째, 여러 미세 유체 채널은 각각 다른 조건을 프로빙 동일한 커버 슬립에 사용될 수있다. 이 조건 두리의 비교를 허용같은 실험 실행 ng를. 유사한 접근 방식은 인플루엔자 바이러스와 쿠션 SBLs (33) 사이의 융합을 연구하기 위해 밴 Oijen 그룹에 의해 사용되었다.
TIRF 현미경 유리 버퍼 인터페이스의 아주 가까이에있는 이러한 분자 경계 형광 여기 (감쇠 상수 ~ 100 nm의 제공) 산장의 붕괴 지수. 이것은 멀리있는 형광 분자의 기여를 최소화하는 신호 대 잡음비를 증가시키고, 10 내지 40 밀리 초 프레임의 노출 시간이 단일 분자 감도를 허용한다. 에바 네 센트 필드는 용융시에 신호의 증가에 이르게 다음 SBL로 SUV에서 표지 지질 전송, 그들은 찾아내는 평균적 강한 자극 필드. 형광의 증가는 더 큰 리포좀위한 강하다.
편광 소멸 필드를 생성하는 데 사용되는 경우, 부가적인 효과가 t에 따라, 형광의 변화에 기여SBL에 SUV에서 레이블를 ransfer. 일부 지질 염료가 포함 된 이중층에 대하여 바람직한 평균 각도 배향 전이 쌍극자를 갖는다. 편광 빔이 다른 두 개의 막에 염료를 여기하기 때문에 이것은 그들이 SBL 대 SUV에있을 때 형광 물질에 의해 방출 된 형광의 양의 차이를 만든다. 후자 다이폴 방위는 평탄한 SBL 형상으로 한정된다 반면, 전자의 경우, 여기 빔은 구면 SUV 주위 배향 전이 쌍극자와 상호 작용할 것이다. 염료는 멤브레인 29,40에 지질 염료 전이 쌍극자 평행하게 배향 용 SUV에 비해 SBL에있을 때, 예를 들면, s 편광 (입사면에 수직으로 편광 된) 입사 광이 이용되는 경우, 여기에서는보다 효율적인 (예 : DII의 또는 DID 41-43 등). 이러한 형광 도핑 된 SUV는 어둡게 나타날 때 SBL (그림 7, Representat 위에 그것을 부두 ) 결과 필자. 융합 기공이 열리고 SUV와 SBL 세포막을 연결하는 바와 같이, 형광 프로브는 SBL로 확산하고 s 편광 소멸 필드 25,27,29에 의해 여기 될 가능성이됩니다. 따라서, 융합 사이트 주위에 통합 된 형광 신호는 SBL (27) (그림 3과 그림 7)에 SUV에서 염료 전송하는 동안 급격하게 증가한다. SBL로 전송하는 경우가 희석으로 융합 형광 레이블 dequenching되어 함께 변경 신호에 기여 추가적인 요인. dequenching의 기여로 인해 작은 부분 (여기 기재된 분석에서 산장 붕괴 및 편광 효과에 비해 일반적으로 경미 
) 지질의가 표시되어 있습니다.
융합시 신호의 증가는 시간과 비교하여 융합 세공 특성을 추론하도록 이용 될 수있다,1 "SRC ="/ 파일 / ftp_upload / 54349 / 54349eq2.jpg "/>, 지질이 실제 해제 시간에 지질 자유롭게 투과 구멍을 통해 탈출에 필요한, 
. 두 시간 스케일 비교할 경우, 세공 지질 흐름에 작은 저항을 제공한다는 결론을 내릴 수있다. 실제 박리 시간이 길어 확산 한정 릴리스 시간보다 크게된다면, 이것은 지질 방출을 지연, 예컨대 세공 플리커 등의 처리를 나타내는 것이다. 확산 제한 해제 시간, 
상기 정착 리포솜 및 지질 확산의 크기에 의존한다; 그 추정은이 두 가지 매개 변수를 정량화되어야합니다. 분석의 단일 분자 감도는 지질 확산이 모든 융합 이벤트 (26)에 대한 SBL에 자신의 출시 후 몇 번의 지질 형광을 추적하여 측정 할 수 있습니다. 모든 융합 소포의 크기(i) 단일의 지질 염색의 강도, SUV의 (ⅱ) 모든 형광체 융합시 SBL로 이송 된 후 도킹 부위 주위 총 형광의 변화, (ⅲ) 종래의 라벨 밀도를 조합하여 27을 추정 할 수있다 지질 및 (ⅳ) 지질 당 지역. 균일 SUV 크기 (44)를 가정하면 앞서 언급 한 바와 같이 많은 융합 이벤트의 실제 지질 방출 시간, 확산 조절 된 방출 (27)에 의해 기대되는 것보다 훨씬 더 느린 것으로 나타났다. 지질 출시의 지연을 가정하면 깜박임 기공 할 예정이다, 정량적 모델은 "기공 개방"의 추정을 할 수 있습니다, 시간의 비율 기공은 융합 27 일 동안 열려 있습니다.
마다 실용적는 지질 용해성 컨텐츠 라벨을 모두 사용하여 융합 메커니즘을 시험하는 것이 중요하다. 예를 들어, 지질 자료는 같은 SNARE 단백질 서라운드 t에 의해 지질 확산의 제한으로 기공 깜박임이 아닌 다른 프로세스에 의해 지체 될 수있다그는 기공. 이러한 경우라면, 그 후, 지질 라벨 분리에 선행 할 내용물의 방출 구멍 용해 프로브의 통과를 허용하기에 충분히 큰 제공된다. 접근 방식에서보다 근본적인 결함은 SBL에 표시된 지질의 전송이 대부분의 사전 융합 형태를 유지 한 소포에 SBL을 연결하는 좁은 융합 기공을 통해 발생하는 가정에있을 수 있습니다. 이전에 지질 자료 데이터 형 (29)을 기준으로 제안했다으로 SBL에 지질 전송도 수반와 융합 기공의 SBL 막에 SUV의 매우 빠른 붕괴의 급속한 팽창에서 발생할 수 있습니다. 모두 지질 모니터링과 내용을 동시에 출시, 많은 구멍이 모든 지질 레이블을 해제 한 후 재 밀봉 것을 발견, 그러나 그들의 가용성화물 (27)의 일부를 유지했다. 이것은 적어도 일부 리포좀은 SBL에 지질 염료 전송이 융합 기공을 통해 발생하는 융합 후 SBL로 축소하고,하지 않는 것을 나타냅니다. 또한, LIPID과 내용 릴리스는 지질 출시 지연은 기공 (45)을 둘러싼 SNARE 단백질에 의해 지질 확산의 방해하기 때문이라고이 가능성이있어 동시에 27 발생했습니다.
수용성 내용 자료를 모니터링하지 않은 SUV-SBL 융합 프로토콜은 이전에 Karatekin와 로스 (25)에 의해 출판되었다. 여기에, 최근 개발이 포함 지질, 즉 동시 모니터링 및 내용을 해제하고 SUV, 지질 및 융합 기공 특성 (27)의 추정됩니다. 프로토콜은 유리 커버 슬립 (25) 폴리 (디메틸 실록산)을 접합하여 이루어지는 미세 유체 세포 (PDMS) 엘라스토머 블록을 포함하는 홈을 제조하기위한 명령으로 시작한다. 다음에, 지질 및 콘텐츠 마커 모두 V-SUV 차량의 제조를 설명한다. 섹션 4 및도 5는, 주 대 도입은 미세 셀 조립 현장에서 SBLs을 형성하고, 결함 및 유동성을 검사하기위한 명령을 제공 할유동 세포 융합 이벤트의 검출에 UV를. 제 6 절은 데이터 분석에 대한 지침을 제공합니다.
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Protocol
미세 유체 채널을 형성하도록 PDMS 블록의 제조 1
플로우 셀 템플릿과 PDMS 블록의 준비도 1 마이크로. (A) 24 X 60mm 유리 커버 슬립 (아래)에 적합한 4 채널 플로우 셀 디자인. 여섯 동일한 디자인은 10cm의 실리콘 웨이퍼 (위)에 맞도록 배치된다. (B)는 홀 펀칭기에 약 5-8mm 두께의 PDMS의 블록을 잘라. (C) 삽입은 핀셋을 사용하여 펀치 구멍에 튜브로. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- 같은 그림 1A의 하나로서 흐름 셀 서식을 얻습니다. 일반 채널은 0.3-1 mm, 폭 70 ~ 100 μm의 높이와 1-2cm 길이. 템플릿 우리를 제조클린 룸 시설 25 위해 표준 포토 리소그래피 기술을 보내고은 클린 룸 액세스를 사용할 수없는 경우. 또한, 기계 적절한 재료에서 더 큰 크기로 템플릿입니다.
참고 : 클린 룸 직원은 훈련과 미경 사용자에게 마스크, 웨이퍼 세정, 포토 리소그래피의 설계 및 순서에서 (항상 적절한 교육을 사용자로 제한되는 클린 룸 시설에 대한 액세스)을 안내 할 수 있습니다. 템플릿이 획득되면, 그것은 반복 청정 외부에서 사용이 폐쇄 접시에 유지 및 관리가 먼지를 제외 촬영 제공 될 수있다. - 일회용 플라스틱 컵에 ~ 100 ㎖의 PDMS의 혼합물 (실리콘 엘라스토머베이스)와 ~ 가교제 (경화제) 10 ㎖를 준비합니다. 쉽게 점착성 PDMS를 처리하기 위해 일회용 피펫 팁을 끊어. 피펫이 정확하지으로 플라스틱 컵에 PDMS의 무게를.
- 잘 혼합 교반한다. (20, 진공 데시 케이 터 내에서 탈기하여 많은 기포를 제거분). 컵 진공하에 위치함에 따라, 기포는 크게 초기 혼합물의 부피를 증가 크기가 증가한다. 적용되는 진공을 제어하고 컵 유출을 피하기 위해 충분히 깊은 있는지 확인합니다.
- 유리 페트리 접시 (150mm X 20mm)로 탈기 된 PDMS 혼합물의 큰 방울을 붓고 템플릿이 위를 향와 PDMS에 웨이퍼를 누릅니다. 이 거품은 웨이퍼 아래에 갇혀 피할 수 있습니다. 포획 된 기포가 확대되고 접시는 오븐에 위치 될 때 상기 웨이퍼를 기울일 수있다. 이 PMD가 약 5-8mm에 의해 커버 될 때까지 이제 웨이퍼의 상단에있는 템플릿 상에 가스가 제거 된 PDMS를 붓는다. 공기 거품이 부드럽게 발생하면 피펫 팁을 제거합니다.
- 3 시간 동안 60 ° C의 오븐에서 PMD가 굽는다. 요리 레벨인지 확인하십시오.
- 성형 채널 구조를 포함하는 PDMS 블록을 잘라 새로운 메스 블레이드를 사용합니다. 컷 아웃 블록은 커버 슬립에 맞게해야한다 (단계 4.1.9 참조).
- PL 접시에서 잘라 블록을 껍질과깨끗한 알루미늄 호일의 조각에 그것을 에이스.
주 : 가교 PMD가 블록이 몇 달 동안 계속 될 수있다. 단일 웨이퍼 상에 있으므로 6 PDMS 블록은 단일 PDMS 성형으로 제조 될 수 유동 채널 (도 1a) 6 세트가있다. 쏟아져 첫 번째 배치에 사용되는 약 절반 PDMS가 필요합니다 다음 배치를, 가교 전에 남아있는 PDMS를 제거하지 마십시오, 그렇지 않으면 PDMS 블록, PDMS의 깨끗한 느슨한 조각 6 개를 절단하지만, 후. 좋은 템플릿은 몇 년 동안 지속될 수 있습니다. - 하나의 직선 운동 (그림 1B)의 PDMS 블록을 통해 드릴 구멍 구멍을 뚫는을 사용합니다. 상기 채널 홈의 측면에서 시작한다. PDMS의 펀칭 조각을 제거해야합니다. 네 개의 채널 디자인의 모든 여덟 구멍에 대해이 작업을 반복합니다.
- 알루미늄 호일의 새로운 주름이없는 부분에 아래 PDMS 블록 채널 측면을 놓습니다. 이상적으로 데시 케이 터에서 건조 박스에서 몇 달까지의 블록을 저장합니다.
- 핀셋 (도 1C)의 쌍을 이용하여 펀칭 구멍에 1/3에 대해 튜브 (0.25 mm의 ID, 0.76 mm의 OD)를 누른다. 쉽게 삽입 기울어 튜브를 잘라. 각각 SUV 저수지와 주사기 펌프에 도달하기 위해 충분히 튜브를 남겨주세요. 현미경에 조립 된 칩을 배치 한 후, 그들은 너무 긴 경우 다시 튜브를 잘라.
- 펌프의 주사기에 연결하려면, 더 큰 실리콘 튜브 (0.51 mm의 ID, 2.1 mm의 OD)의 짧은 조각을 잘라 한쪽면에 얇은 튜브를 삽입합니다. PDMS이 즉시 사용 가능한 블록이 몇 달 동안 계속 될 수있다.
2. 커버 슬립 청소
- 황산 (H 2 SO 4)과 과산화수소의 강력한 산화 혼합물을 사용 Karatekin 및 로스 (25)에 기술 된 프로토콜에 따른 면도 된 커버 (H 2 O 2). 클린 룸에서이 절차를 수행하고 적절한 안전주의 사항을 준수하십시오. 대안 적으로, 클린 세정 C를 사용하여즉 시판되고 overslip (자료 목록 참조).
지질 및 콘텐츠 라벨 모두를 포함하는 V-포드 SUV 3. 준비
SUV 준비도 2 회로도. 지질 유리관 (1)에서 혼합하고, 용매를 수욕 튜브의 회전에 의해 지질 막을 형성 증발 (2). 용매의 남은 흔적은 고진공 (3)에서 제거된다. 지질 막을 세제 및 단백질을 함유하는 재구성 버퍼 수화 동안 볼 텍싱 (4). 콘텐츠 염료 캡슐화 할 경우,이 단계에서뿐만 아니라 희석 단계 (5)에 포함된다. 임계 미셀 농도 이하 세제 농도의 희석을 리포솜 형성하는 리드. 세제 밤새 얻어 투석 (6). NBD-PE (녹색)을 포함 SBL 형성을위한 t-SUV 차량의 경우, 소포는 밀도 기울기에 떠내려와 징수됩니다두 개의 층 (7A) 사이의 인터페이스를 제공합니다. 샘플 크기 - 배제 컬럼을 통해 실행하고 0.5 ml의 분수 (7B)에 수집 무료 염료에서 캡슐화 된 콘텐츠 마커 V-SUV 차량을 분리 할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- 25 mM의 HEPES-KOH, 140 밀리미터의 KCl, 100 μM EGTA 및 1 mM의 DTT, pH가 7.4를 포함하는 재구성 버퍼의 4 L를 준비합니다. 다른 단계에 대한 투석 및 100 ㎖의 버퍼의 대부분을 사용합니다.
다른 버퍼가 이용 될 수 있지만, 실험 전반에 걸쳐 일관된 버퍼 삼투압을 유지 및 단백질 기능하는 조건을 선택하는 것이 중요 참고. 단지 지질 라벨을 포함하는 V-포드 SUV와 t-SUV의 제조, Karatekin와 로스 (25)을 따릅니다. - 지질 주식 클로로포름 또는 클로로포름 -20 ° C에 저장되기 때문에 : 메탄올 (2 : 1, V는 / v)로, 유리 병은을 열기 전에 실내 온도에 도달 할 수결로를 방지.
- 클로로포름과 메탄올의 혼합물에 1 μmol의 최종 양을 원하는 비율로 세제 미량을 제거하고, 지질을 혼합하여 클로로포름으로 유리관 린스 (2 : 1, V / V). 만 유기 용제 / 용해 지질을 처리하기 위해 유리 주사기 / 튜브를 사용합니다.
참고 : SAPE : DOPS : 콜레스테롤 : PEG2000-DOPE : 여기에 사용되는 지질은 POPC입니다 15 : 10 : 4.6 : SAPE : DOPS : V-SNARE 들어있는 소포와 POPC 1 12 콜레스테롤 57.4의 몰 비율로 않았다 : 뇌 PI (4,5) P 2 : PEG2000-DOPE : NBD-PE (54.9 : 15 : 12 : 10 : 3 : 4.6 : 0.5) t-SNARE 포드 SUV합니다. 자세한 내용은 자료를 참조하십시오. 다른 지질 조성물을 사용할 수있다. - 부드러운 질소 스트림하에 용매를 증발 또는 회전 증발기이다. 균질 지질 필름을 수득하고, 용매를 증발하면서 온도의 큰 변화를 피할 수 지질의 높은 용융 온도 이상으로 가열하여 수조 (37 ° C)의 관의 끝을 담가. 주위에서 진공을 시작합니다지질 막이 형성 될 때까지 300 밀리바 다음, 회전식 증발기에서 2 ~ 분간 가장 높은 진공을 계속한다.
- 유리관을 제거하고, 노광을 방지하고, 적어도 2 시간 동안 고 진공하에 데시 케이 터에서 튜브를 배치하여 용매의 잔류 미량을 제거하기 위해 알루미늄 호일로 싸서. 이 단계는 하룻밤 실행할 수 있습니다.
- 건조 된 지질 막을 재수, 재구성 버퍼 세제 혼합물 (n- 옥틸 β-D-D- 글루 코피 라노 시드, OG), 단백질 (V-스네어) 및 SRB (500 ㎕의 최종 부피)을 준비한다. 임계 미셀 농도 (CMC, OG 20-25 mM)을 상기 1 ~ 2 회 최종 세제 농도를 유지하고 지질 비율 세제가> 10가되도록 최종 부피를 조절한다. 가볍게 흔들어 용액을 10-50 mM의 SRB의 최종 농도를 얻기 위해 단백질 세제 용액 Sulforhodamine B (SRB) 분말을 녹인다. 공동을 줄여 SRB 고농도 추가시 재구성 버퍼의 삼투압을 조절따라서 염화칼륨 ncentration.
주 : t-올무에 대한 지질에 단백질 비율 (LP하는) (., ~ 평방 미터당 70t-덫 미크론 (25) LP ~ 20,000) 높다. 크게 융합 요금 17,24 감소에 크게 SBL 높은 t-SNARE 밀도는 비활성 단백질 응집체가 발생할 수 있습니다. V-올무에 대한 LP는 (~ μm의 2 당 7,000 V-덫 LP ~ 200) 시냅스 소포 (46, 47)에있는 V-SNARE 밀도에 가까운 훨씬 낮다. 재조합 발현 및 V-와 t-덫의 정제 후 단백질의 기능을 보장하기 위해 하나의 소포 융합 분석의 모든 단계를 진행하기 전에 간단한 대량 융합 분석 (48)을 수행하는 데 유용합니다. - 부드럽게 단계 3.6에서 단백질 세제 SRB 용액을 첨가 동안 건조한 지질 필름을 함유하는 예열 된 유리관을 흔들어. 거품을 생성하지 않도록하십시오. 37 ° C에서 15 분 동안 흔들어 계속합니다.
- 재구성을 추가 오배 세제 희석빠르게 농도 구배를 방지하기 위해 볼 텍싱하면서 버퍼 함유 SRB (2 ㎖, 2.5 ㎖의 최종 부피를 추가). 37 ° C에서 1 시간 15 분 동안 흔들어 계속합니다.
참고 : 긴 배양 증가 단백질 재구성 효율을. 빠른 희석은 CMC 아래의 세제 농도를 저하와 작은 리포솜의 형성을 이끈다. - 상온에서 1 ~ 2 시간과 20,000 MWCO 투석 튜브 또는 카세트를 사용하여 폴리스티렌 흡착제의 4g, 4 ° C에서 하룻밤 재구성 버퍼의 다음 3에 대한 L 먼저 재구성 버퍼의 1 ~에 대해 L을 소포 현탁액을 투석. 교차 오염을 방지하기 위해와 SRB가없는 소포의 투석에 대해 서로 다른 비커를 사용합니다.
- 재구성 버퍼 겔 여과 컬럼을 평형화. 캡슐화 된 SRB와 V-SUV 차량에서 무료로 SRB을 분리 컬럼을 통해 소포 정지를 실행합니다. 전체 샘플이 일단 리제로 SRB없이 재구성 버퍼를 사용하여열을 입력. 0.5 ml의 분수에서 V-포드 SUV를 수집합니다.
- 전 소체 (16)의 분취 액에 세제를 첨가 한 후 SRB 형광을 측정하여 자기 켄칭 농도 성공적인 SRB 캡슐화를 확인한다. 형광 분광기를 사용하여 550 nm에서 샘플을 여기 및 570 nm 내지 630 nm의 사이 SRB 방출 주사. 막이 용해하고 해제 SRB 희석대로 세제 첨가시 캡슐화 된 양에 따라 SRB 형광의 4-8 배 증가가 예상된다.
- 각각 형광 분광기 (24) 및 SDS-PAGE 겔 전기 영동을 사용하여 회수 된 지질 및 단백질을 특성화. 특히 높은 LP t-SUV 샘플에 대해 민감한 염색 방법을 사용합니다 (자료 목록 참조). 일반적으로 모두 지질과 단백질 입력의 약 50 %가 공칭 값에 가까운 LP의 결과로 준비하는 동안 손실됩니다.
- (24) 또는 전자 microsco 산란 동적 광을 이용하여 SUV 크기의 특성을평 48. ~ 3-4일까지 4 ° C에서 V-포드 SUV를 포함하는 저장소 SRB. 동결 융해가 막 해제 캡슐화 SRB을 나누기로 동결하지 마십시오.
4. SUV-SBL 퓨전 분석은 지질 자료 만 모니터링합니다
- 미세 유체 흐름 채널 내 곁에 지원 이중층의 형성
- 용해 된 가스를 제거하기 전에 실험에 적어도 20 분 동안 고 진공하에 PDMS 블록 (단계 1.11)를 놓는다. 이것은 크게 융합 실험 동안 미세 유체 채널의 기포의 위험을 감소시킨다.
- 현미경 설정을 켜고 원하는 온도로 무대와 샘플 홀더 (그림 3, 4)를 가열한다.
- 0.45 ㎛ 이하의 기공 크기를 갖는 필터를 통해 소포를 희석하는 데 사용되는 재구성 버퍼 필터.
- (주 ~ 다 NBD-PE 30 μL은 t-포드 SUV 또는 단백질 무료 (PF-포드 SUV) 제어 리포좀을 표시 희석버퍼 ~ 60 μL와 솔루션 0.5 mM의 지질). 최종 농도는 여기에서 중요하지 않다.
- 드가 3 mL를 주사기를 사용하여이 혼합물을 포함한다. 수직으로 주사기를 누른 상태에서 샘플 위의 공기의 대부분을 누릅니다. 파라핀 필름을 사용하여 (바늘 무료) 끝을 밀봉하고 플런저를 잡아 당겨 진공을 만들 수 있습니다. 용액의 탈을 가속화하기 위해 주사기 배럴을 누릅니다. 진공이 적용될 때 더 이상 거품이 발생하지 않을 때까지이 과정을 몇 번 반복합니다.
- 미세 원심 튜브의 뚜껑에 구멍을 펀칭하기 위해 PDMS 블록에 부착되어있는 튜브보다 약간 큰 직경의 피하 주사 바늘을 사용한다. 나중에 미세 유체 채널 입구에 연결된 튜브를 방해 할 수 있습니다로 플라스틱의 펀칭 조각 튜브 내부에 있지 않은지 확인합니다.
- 뚜껑에 구멍을 갖는 microcentrifuge 관에 탈기 SUV 솔루션을 입력하고 설정 온도에 평형을 현미경 무대에 홀더에 넣습니다.
- 경기 수플라즈마 클리너에 이전에 청소 커버 슬립 (섹션 2) 에이스 약 5 분 동안 공기 플라즈마를 실행합니다. 쿠션 역할을하는 몇 보풀이없는 조직의 상부에 플라즈마 처리 된 커버 슬립을 (처리 된면이 위를 향하게) 넣습니다.
- 탈기 된 PDMS 블록에서 알루미늄 호일을 제거하고 커버 슬립 위에 블록을 배치합니다. 재사용하면 PDMS 블록에두고 청소하기 위해 채널 측에 접착 테이프의 조각을 분리. PDMS의 아래로 눌러 그것을 충실하게 핀셋을 사용하여 커버 슬립에 차단하지만, 너무 열심히 유리가 파손될 수로 누르지 마십시오.
- 현미경 스테이지로 조립 흐름 세포를 놓고 각각 SUV 저수지와 주사기 펌프에 튜브를 연결합니다. 단계 (그림 3B)에 커버 슬립을 테이프.
- 이 솔루션은 완전히 채널을 채울 때까지 3 μL / 분에서 SUV 차량을 흡입 시작 (~ 2.25 mm / 75 μm의 X 300 μm의 채널 단면에 대한 초). 모든 채널에 대한 솔루션은 일을 이동 시작할 때출구 측 배관 E 0.5 μL / 분의 흐름을 감소시키고 30 내지 45 분 동안 배양한다.
주 : 플라즈마 유리 슬라이드를 처리하고, 채널에 흐르는 SUV의 사이의 시간은 플라즈마 처리의 효과 10-20 분을 초과하지 않아야하는 것은 과도하다. - 어떤 누출에 대한 채널을 선택합니다. T- 또는 PF-포드 SUV가 포함 된 NBD-PE에서 NBD-PE의 형광을 관찰하기 위해 10-20X 공기 목표를 사용합니다. 익사이트 NBD는 488 nm의 레이저를 사용하여 형광 물질. 누출은 명 시야 조명을 사용하여 검출하기 어렵다.
- 홀더에 탈기 재구성 버퍼 튜브를 넣고 온도가 SBL에 결함이 발생할 수 있습니다 온도에서 빠른 변화를 평형 수 있습니다. 흐름을 중지하고 있는지 흐름이 완전히 정지하고 공기 거품이 탈기 버퍼에 유입 튜브를 전환하기 전에 튜브로 흡입되지 않습니다 만들기 위해 ~ 1 분을 기다립니다.
- 언 바운드 SUV 차량을 씻어 탈기 버퍼 모든 채널을 씻어.
- highe로 전환R 확대 TIRF 목표 (60X, 기름, NA 1.45-1.49) 및 이중층이 균일 한 모양과 같은 어두운 패치 또는 SBL로부터 연장 지방 세관으로 명백한 대규모 결함이 있는지 확인합니다.
- 이중층의 유동성을 확인
- FRAP 전용 장치를 사용할 수없는 경우, 또는 다음과 같이 FRAP 시퀀스는 다음 시험 성적 막 유동성을 프로그래밍 할 수없는 경우.
- 작은 크기 (~ 40 μm의 직경)에 필드 조리개를 닫고 노출에 NBD-PE의 형광을 표백하기 위해 소프트웨어를 통해 (20-80 μW, 또는 15-60 NW / μm의 2) 488 nm의 여기 광 강도를 조정 영역 크게 아니라 완전히. 그대로 NBD-PE 분자는 노출 된 영역을 선택하고 표백 전에 소정의 거리를 확산로 유체 이중층 들어, 정상 상태에서, 노출 영역의 중앙의 형광 강도는 가장자리보다 낮아야한다. 한편, 접착면 S하다면UV를 버스트에 실패하거나 지원 이중층 유체 아닌 다른 이유로, 노출 된 지역의 모든 형광 표백제한다.
주 :이 이후 단계에서 레이저 강도 값이 대략 시작점으로 주어진 조건의 주어진 세트에 대해 최적화되어야한다. - 조명을 중단하고 안정 상태의 측정 결과를 확인하기 위해 몇 분 후에 다시 시작
- 작은 크기 (~ 40 μm의 직경)에 필드 조리개를 닫고 노출에 NBD-PE의 형광을 표백하기 위해 소프트웨어를 통해 (20-80 μW, 또는 15-60 NW / μm의 2) 488 nm의 여기 광 강도를 조정 영역 크게 아니라 완전히. 그대로 NBD-PE 분자는 노출 된 영역을 선택하고 표백 전에 소정의 거리를 확산로 유체 이중층 들어, 정상 상태에서, 노출 영역의 중앙의 형광 강도는 가장자리보다 낮아야한다. 한편, 접착면 S하다면UV를 버스트에 실패하거나 지원 이중층 유체 아닌 다른 이유로, 노출 된 지역의 모든 형광 표백제한다.
- 가능하면 더 정량적 측정을위한 FRAP 시퀀스를 프로그래밍합니다. 추가 파일 및 자세한 내용은 해당 범례를 참조하십시오.
참고 : 때때로 포드 SUV는 유리 커버 슬립에 부착하지만, 버스트 및 유체 이중층을 형성 할 수 없게됩니다. 이 경우, 지원 이중층의 형성을 돕기 위해 10 mM의 Mg를 함유 2+ 탈기 재구성 완충액 채널을 헹군다. 4.2에서와 같이 이중층 유동성을 평가하기 위해 형광 표백을 사용합니다. 유체 이중층이 형성되면 -free RECO 2+ Mg를 씻어nstitution 버퍼입니다.
- FRAP 전용 장치를 사용할 수없는 경우, 또는 다음과 같이 FRAP 시퀀스는 다음 시험 성적 막 유동성을 프로그래밍 할 수없는 경우.
- 미세 유체 흐름 채널로 V-SUV 차량을 소개합니다
- 탈기는 버퍼와 V-SUV 스톡 농도에 따라 105 내지 약 103의 계수로 V-SUV 원액을 희석하여 사용 재구성. 보기의 분야에서 60 초 이내에 약 10 ~ 100 퓨전 이벤트 결과 희석을 목표로.
참고 : 너무 많은 융합이 (각 이벤트 예금 LR-PE 이후 또는 DID 지질 라벨을 SBL에) 배경 형광을 증가시키고 융합 이벤트의 검출 및 분석을 어렵게한다. 대조적으로, 가난한 통계에 너무 낮은 결과 또는 더 많은 영화의 획득을 필요로하는 융합 속도. 0.1 mM의 지질의 V-SUV 농도를 들어, 995 μL의 재구성 버퍼에 5 μL의 SUV 주식을 희석하여 시작하고 950-995 μL의 재구성 버퍼에이의 5 ~ 50 μl를 희석. - 온도가 inser 흐름을 멈추기 전에 평형화하자팅 희석 된 V-SUV 솔루션으로 도입 관.
- 다음과 같이 TIRF 각도와 편광을 조정합니다.
- 상기 여기 빔을 회전시켜 원하는 편광을 설정 한 후,이 소프트웨어를 통해 스텝 모터를 통해 상기 빔의 위치를 명령하는 거울의 기울기를 조정한다. 천천히 중심 한쪽 초점면에서 대물 렌즈의 중심에서 상기 레이저 빔의 위치를 이동한다. 위치가 중심에서 벗어나 이동할 때 상기 대물 축에 대하여 증가 각도 등장 전방 측에서 대물으로부터의 광을 관찰한다.
- TIR 먼저 달성 될 때 나오는 빔은 먼저, 즉 목적으로 사라지면 모터 위치를 참고.
- 천천히 표면에서 형광을 모니터링하면서 중심을 벗어난 더 빔 위치를 이동 유지한다. 빔이 너무 멀리 떨어져 중앙으로 이동했을 때 표면 형광가 사라질 때 모터의 위치를합니다.
- 빔하여 위치 될 선택 n은 두 한계 사이에 위의 결정. 융합시 최상의 신호 대 잡음비 등의 신호 강조 용 여전히 viewfield의 균일 한 조명을 제공하는 얕은 침투 깊이 (근접한 대물의 가장자리 빔 위치)를 선택한다.
참고 : 설정을 최적화 한 후 모든 실험에 대해 동일한 TIR 빔 위치 (같은 침투 깊이)을 유지하는 것이 가장 좋습니다. 빔 위치의 변화가 발생하지 않는 편광을 회전해야합니다.
- 75 ㎛의 X 300 ㎛의 단면 1.5 mm / 초 ~ 평균 선형 유속에 대응하여, 2 μL / 분의 유속으로 상기 채널에 V-SUV의 흐름. 여기 / 방출 설정으로 전환 지질 혼합 모니터 (LR 또는 전용 DID)합니다.
- 탈기는 버퍼와 V-SUV 스톡 농도에 따라 105 내지 약 103의 계수로 V-SUV 원액을 희석하여 사용 재구성. 보기의 분야에서 60 초 이내에 약 10 ~ 100 퓨전 이벤트 결과 희석을 목표로.
- 단일 V-포드 SUV와 SBL 사이에 관찰 융합
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도 3 실험 pTIRF 설정. 유리 기판의 V-SUV 및 t-SBL의 (A)을 나타낸 그림. 지질 도킹을 나타내는 단일 SUV-SBL 융합 이벤트 거짓 색 TIRFM 영상 (1) 및 SBL로 지질 염료의 방출 (2) 표백 형광 강도의 감소 하였다 (3). 총 형광 강도 신호 (5.3 μm의 X 5.3 ㎛의 상자의 화소 값의 합)을 나타낸다. (B)에 PDMS 블록에 결합 된 커버 슬립은 가열 단계에 녹화된다. 미세 유체 채널 입구 관은 주사기 펌프 (왼쪽)에 의해 흡입 금속 샘플 홀더 (오른쪽)에 튜브에서 샘플을 그립니다. 펌프가 이중 방출 단위 아래에. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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실험 장치의 그림 4 도식은. 소멸 파가 미세 유체 채널에 유리 버퍼 인터페이스에서 생성됩니다. SBL 유리에 형성되고, V-SUV (왼쪽 위) 주사기에 채널을 통해 금속 샘플 홀더 (오른쪽 위)에서 흡입된다. M, 거울; DM, 다이크로 익 미러; L 렌즈; F, 필터; P는, 편광판. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- 지속적으로 자극과 v 포드 SUV에 포함 된 형광에 따라 V-SUV의 (LR-PE 용) 561 nm의를 사용하여 형광 또는 (DID 용) 638 nm의 레이저를 모니터링 할 수 있습니다. V-SUV 차량이 SBL로 유동 채널 및 독 상 및 용해에 도달 할 때, 배경 형광 신호를 축적하기 시작한다.
- 연속 배경 표백제 소프트웨어를 통해 여기 레이저 강도를 조정정상 상태 새로운 도킹 및 융합 이벤트에서 쉽게 관찰 할 수 있도록 형광.
주 : 백화가 너무 느리면, 배경 형광이 너무 높을 것이다. 표백제가 너무 빠르다면, 도킹 SUV 차량에서와 SBL로 방출 형광체로부터의 신호는 도킹 SUV의 융합이 검출 될 수있다 또는 형광을 추적 할 수있는 동안 윈도우를 단축 빠르게 사라질 것이다. LR-PE는 561 nm에서 여기를 들어, 2.5-7.5 mW의 전력이 190 μm의 직경의 원 (100-250 NW / μm의 2)를 조명하기 시작하는 합리적인 값입니다. DID의 638 nm의 여기, 190 μm의 직경의 원 (30 ~ 60 NW / μm의 2)를 통해 0.8-1.6 mW의 전력에 대한 초기 테스트에 사용할 수 있습니다. - 주어진 채널에서 서로 다른 위치에 여러 개의 영화를 획득. SBL이 위치에 결함이 없음을 확인 NBD-PE의 형광을 확인합니다. 최대 속도 (~ 50 프레임 / 초) 또는 최대 높은 프레임 속도로 관심 자른 영역 (에서 풀 프레임 동영상을 획득~ 100 Hz에서) 60 초 동안.
- 또 다른 미세 유체 채널로 이동 및 기타 조건에 대한 녹음을 반복합니다. 이러한 단백질이없는 SBL 또는 포드 SUV, 억제제로 V-SNARE VAMP2 (CDV)의 용해성 세포질 도메인을 추가하거나 하나 이상의 파상풍 신경독 (37 ° C에서 30 분)와 V-SUV 치료 부정적인 컨트롤을 포함 동일한 커버 슬립상의 채널.
- 및 PDMS 재활용 정리
- PDMS의 블록을 재사용하기 위해, 5 μL / 분의 유속으로 70 % 에탄올 200 μL ~와 미세 유체 채널을 헹군다. 마지막으로, 배관 및 채널을 통해 공기를 흡인.
- PDMS의 약간을 압박하여 커버 슬립에서 부드럽게 차단 분리합니다. 알루미늄 호일의 깨끗한 부분에 놓습니다. 진공 데시 케이 터에 보관합니다. 그것은 여러 번 재사용 될 수있다.
- 보다 철저한 세정을 위해 70 % 에탄올에 앞서 세제 또는 수산화 나트륨 용액으로 채널을 헹군다. 또한, 이리저리 모든 튜브를 제거 PDMS의를 해요 건조하고 새로운 튜브를 삽입하기 전에, 이소프로판올에서 30 분 동안 블록을 초음파 처리.
5. SUV-SBL 퓨전 분석을 동시에 지질 및 콘텐츠 릴리스를 모니터링하려면
- 동시에 지질 및 가용성 내용 섹션에 설명 된대로 사용 모두 지질 (DID)로 표지 된 리포좀 및 가용성 내용 (SRB) 레이블을 제외하고, 섹션 4와 동일한 단계를 수행 해제의 듀얼 컬러 모니터링을위한 3 SRB는 캡슐화 10 mM의에서 초기에 높은자가 침묵하고있다.
- 그림 4에 개략적으로 나타낸 구성을 사용하여, SRB를 여기 형광 동시에 각각 561 nm 내지 638 nm의 레이저를 사용했다. 다이크로 익 미러 (640 나노 미터)을 각각 배출을 SRB를 감지하고 DID 두 개의 짧은 (50분의 595 ㎚)를 통해 실행 빔 긴 (75분의 700 ㎚) 파장 필터로 방출을 분할합니다. 두 방출 빔은 EM-CCD 칩에 나란히 예상된다.
- FRAP 데이터 분석
- 지질 확산 계수, D를 추정 할 수있는 보조 정보에서 제공하는 MATLAB 프로그램을 사용하십시오. 이 프로그램은, OME-TIFF 파일 (49)의 목록을 읽어 표백 영역을 검출하고, 시간의 함수로서 표백 영역의 평균 화소 값을 나타내는, 상기 복구 시간을 추출 Soumpasis 50 모델에 생성 회복 곡선 적합
, w는 표백 원의 반경이다.
참고 : MATLAB 프로그램은 니콘 ND2 파일을 사용 FRAP 영화의 분석을 위해 이전 25 제공되었다. 대부분의 파일 형식을 용이 OME-TIFF로 변환 될 수 있으므로 현재 프로그램, OME-49 TIFF 파일을 판독한다. FRAP 데이터의 정량 분석이 쉽고 표백 할 때 가장 정확이 순간이다는 bleac을 Hed 영역을 판독하는 동안 원, 표백입니다 무시할 수있다. 이러한 기준은 엄격 여기서 설명하는 간단한 FRAP 측정에 만족하지 않지만, 확산 계수의 적절한 추정치를 얻을 수있다. 더 정확한 추정치를 들어, 하나의 지질 염료 (6.3 절)의 추적을 사용합니다.
- 지질 확산 계수, D를 추정 할 수있는 보조 정보에서 제공하는 MATLAB 프로그램을 사용하십시오. 이 프로그램은, OME-TIFF 파일 (49)의 목록을 읽어 표백 영역을 검출하고, 시간의 함수로서 표백 영역의 평균 화소 값을 나타내는, 상기 복구 시간을 추출 Soumpasis 50 모델에 생성 회복 곡선 적합
- 도킹 레이트, 융착 율 도킹에 융합 지연 시간 분석
- 명확하게 소포 도킹 및 융합 이벤트를 식별하기 위해 밝기와 대비를 분석하고 조정하는 동영상을 엽니 다 ImageJ에 사용합니다. SpeckleTrackerJ (26) 플러그인을 시작합니다. 사용에 대한 지침은 SpeckleTrackerJ에 대한 스미스 등. (26) 및 온라인 설명서를 참조하십시오.
- SpeckleTrackerJ에 새로 도킹 SUV 차량을 확인합니다. SBL 튕겨 것과는 단단히 고정 SUVs를 구별하기 위해, 몇 프레임의 최소 지속 기간 도킹을 부과. 트랙을 저장 한 모든 영화를 반복합니다.
참고 : 문서의 경우킹 레이트는 모든 문제는 SUV 도킹되면, SUV 차량이 트랙에 기록 될 필요가 도킹되는하므로 첫 번째 프레임을 식별하는 것이다. 트랙의 나머지 부분은 분석에서 고려되지 않는다. 그러나, 자동 추적이 표백 또는 퓨즈 때까지 각 SUV는 이미 추적 된 마크 포드 SUV를하는 데 도움이됩니다. - 모든 융합 소포를 확인합니다. 이러한 경우, 트랙은 SUV는 융합 추적 스폿의 형광의 갑작스런 증가에 의해 알 수있다 상기 제 1 프레임에 고정 할 때까지 첫 번째 프레임에서 모든 프레임을 포함하여야한다. 이러한 트랙의 지속 기간은 도킹 간 융합 지연을 계산하기 위해 사용된다. 모든 트랙을 저장합니다. 모든 영화에 대해 반복합니다.
- 도킹 또는 융합 데이터 배치 분석을 위해 해당 영화의 궤도 파일 목록을 컴파일 Karatekin 및 로스 (25)가 제공하는 MATLAB 프로그램을 실행. 프로그램과 함께 제공되는 지침을 따르십시오.
참고 :이 프로그램은 정액 음모궤도 파일로부터 추출 된 정보에 기초하여 시간의 함수로서 ulative 도킹 및 융합 이벤트. 도킹 및 융합 속도는 이러한 플롯의 경사면에서 추정된다. 융합 데이터 도킹 간 융합 지연은 계산되고, 그 분포, 즉 생존 플롯 융합 아직 도킹 후 소정의 지연에 의해 발생하지 않은 확률로서 플롯.
- 지질 확산
- 그들은 충분히 멀리 융합 사이트 (그림 6)에서 확산 한 경우가 식별 될 각 융합 이벤트의 경우, 하나의 형광 지질을 추적 할 수 있습니다. 추적 SpeckleTrackerJ를 사용하여 MATLAB을 사용하여 추가 분석을 위해 트랙을 저장합니다. 정착 소포의 크기에 따라, 일반적으로 3-30 단일 형광을 추적 할 수있다. 이상 트랙을 계산하는 것이 바람직하기 때문에
긴으로 단일 분자를 추적하려고필요한 경우 가능한 한, 궤도의 수동 보정을 사용. - 평균 (약 ~ 1.5 초)> 40 ~ 50 프레임을 마지막으로 하나의 지질 마커 궤적에 대한 변위 (MSD)를 제곱 계산합니다. 지질 확산 계수를 계산 MSD를 사용 . 스미스 외. (26)와 스트래튼 등. (27)에 대한 세부 사항을 참조하십시오.
- 그들은 충분히 멀리 융합 사이트 (그림 6)에서 확산 한 경우가 식별 될 각 융합 이벤트의 경우, 하나의 형광 지질을 추적 할 수 있습니다. 추적 SpeckleTrackerJ를 사용하여 MATLAB을 사용하여 추가 분석을 위해 트랙을 저장합니다. 정착 소포의 크기에 따라, 일반적으로 3-30 단일 형광을 추적 할 수있다. 이상 트랙을 계산하는 것이 바람직하기 때문에
- 단일 지질 염색 강도 SUV-SBL 강도 감소 계수 및 소포 크기
- 전에 한 번의 공정에서 마커 표백제 후 ~ 대한 마커 주변의 3 × 3 화소 (0.8 μm의 X 0.8 μm의) 영역에 15 프레임을 지질 마커의 화소 값의 총합을 측정한다. 백그라운드 강도가 추적 지질 마커의 강도를 얻기 위해 평균 표백 전에 미리 표백제 강도로부터 사후 표백제 프레임에 걸쳐 평균화 뺀다. 주어진 실용적 많은 마커의 측정을 반복 영화.
- 단일 라벨 지질 농도의 분포를 플롯
및 평균을 측정하는 가우스를 장착한다. - 해당 이벤트에 발표 한 지질 마커의 궤도는 하나의 단계 표백에 끝난 융합이 발생한 때 사이의 지연을 계산합니다. SBL에서 형광의 표백 시간을 가져,
, 지수에 생존자 지연의 기능과 피팅을 플로팅하여.
참고 : 더 약하게 SUV의 형광 물질에 편광 여기 필드 커플하는 SUV의 표백 시간은 27 일반적으로 훨씬 느린이기 때문입니다. - 견적
, 때 27 스트라 이어 SBL 인 경우에 SUV 상대적으로 지질 염료 강도 저감 계수 (tp_upload / 54349 / 54349eq8.jpg "/> SUV를 단일 염료)의 강도입니다.
참고 : 표백을 무시할 수 있다면, 도킹 강도와 동일 할 것이다 
모든 형광체에 도달 한 후에 전체 강도로 나눈 값 (그림 3A, 오른쪽 패널의 요점 (1)), 융합시 SBL에 증착 (점선 표시 
그림 3). 그러나, SBL의 급속한 표백에 의한, 일반적으로 도달하고 정확하게 추정되지 식 (27)이 포함에 릴리스 역학 피팅이 필요합니다 UDES 모두 (6.4.3 참조) . 별도의 표정은 스트래튼 등 제공된다 기공 제한 및 확산 제한 해제 동역학의 경우 27.; 가장 적합한 경우는 이벤트 (기공 제한 동역학의 경우에 6.5.1 참조) 이벤트에 따라 다릅니다. - (27)에서 개별 이벤트에 대한 소포 면적을 계산
여기서 도킹 SUV 강도이며 가 SBL 단일 지질 염료의 강도를 의미하고, 그것에는 SBL 인 경우에 대하여 SUV에있을 때 지질 염료 강도 저감 계수이고,ATION 1 "SRC ="/ 파일 / ftp_upload / 54349 / 54349eq12.jpg "/> 지질 염료 공지 면적 밀도이다.
- 퓨전 기공 특성
- 릴리스를 가정하면, 기공 한정으로 27 지질 라벨 릴리스 반응 속도에 맞게
여기서 
막 융합 전에 도킹 SUV 강도이고, 다른 변수는 앞에서 정의 된 바와 같다. 의 값을 사용 고정 된 매개 변수로 6.4.3에서 얻은, 그리고에 대한 최적 추정치를 추출 과 
. - P는 0, 지질되던 가정 위상차 27 플리커 기공에 기인 기공이 열려있는 시간의 비율을 추정 :(60);
= 
VES는 소포 영역 (섹션 6.4.5가)이고, B는 3 nm의 확산 지질 라벨 볼 반을 포함하기 때문에 유효 기공 반경 (일반적으로 ~ 15 nm 인으로 간주) 기공 높이, R P는 ≈이다 이중층 두께 (~ 2 ㎚), (6.3에서 계산 된) 지질의 확산도이고, 지질이 (6.5.1에서)에 SBL에 SUV에서 출시 할 때입니다. - 공칭 P 0> 1은 완전 개방 기공을 나타냅니다 확인하려면 = 1 P 0, 영구적으로 개방 기공에 대한 스트래튼 등. (27), 예측 반응 속도의 4 식에 강도의 시간 코스에 맞게. 이 맞는 fittin보다 더해야한다g 영구적으로 개방 기공에 대한 6.5.1의 식입니다.
- 릴리스를 가정하면, 기공 한정으로 27 지질 라벨 릴리스 반응 속도에 맞게
, w는 표백 원의 반경이다. 
, 지수에 생존자 지연의 기능과 피팅을 플로팅하여. 
모든 형광체에 도달 한 후에 전체 강도로 나눈 값 (그림 3A, 오른쪽 패널의 요점 (1)), 융합시 SBL에 증착 (점선 표시 
그림 3). 그러나, SBL의 급속한 표백에 의한, 
여기서 
여기서 
막 융합 전에 도킹 SUV 강도이고, 다른 변수는 앞에서 정의 된 바와 같다. 의 값을 사용 
= 
VES는 소포 영역 (섹션 6.4.5가)이고, B는 3 nm의 확산 지질 라벨 볼 반을 포함하기 때문에 유효 기공 반경 (일반적으로 ~ 15 nm 인으로 간주) 기공 높이, R P는 ≈이다 이중층 두께 (~ 2 ㎚), Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
SBL 품질
이 융합 실험 전에 SBL의 품질과 유동성을 확인하는 것이 중요하다. 미세 유체 채널의 바닥 유리 측의 형광 명백한 결함없이 균일해야한다. 기포가 채널에 통전하면, 일반적 SBL에 보이는 상처를 남긴다. 이러한 대규모 흉터 / 결함이있는 경우, 해당 채널을 사용하지 않는다. 때때로 포드 SUV는 기판에 부착하지만 연속 SBL 버스트 및 형성 실패 할 수 있습니다. 그 경우에는, 형광은 여전히 매우 균일하게 보일 수 있지만, 소 영역 표백 후 복원하지 않을 것이다. 10 밀리미터의 Mg 2+ 소개 자주이 문제를 해결하는 데 도움이됩니다. 다른 제제는 기타 가의 양이온 (51), 고분자 용액 (52), 또는 삼투압 충격 (25)와 포드 SUV를 분출 있도록 도입 될 수있다.
지질이 차지하는 평균 면적은 온도에 의존하기 때문에, 온도 변화가 SBL 영역의 변화를 초래한다. 50-10 °의 C 이상으로 온도를 증가 또는 감소하는 잉여 영역이 표면 또는 각각 53면에 게재 어두운 SBL 프리 반점로부터 압출 튜브로 전환 될 수있다. 이 최소 온도 변화를 유지하는 것이 중요하다.
그림 5에 표시됩니다.
그림 5. FRAP은 SBL의 유동성을 검사합니다. (첫 번째 프레임) 전에 폐쇄 필드 다이아 프램 (직경 49 μm의)에 의해 강한 빛 펄스로 표백 후 구분 조명 영역을 보여주는 이미지의 순서를. 이 지역은 지질을 표시 NBD의 확산에 의한 형광 복구를 수행하기 위해 낮은 조명 노출에 결상된다. 그래프에있어서의 재현성의 높은 레벨을 나타내는 다른 커버 슬립에서 여러 채널들에 대한 시간의 함수로서 표준화 된 형광을 나타낸다. SAPE : DOPS : 콜레스테롤 : 뇌 PI (4,5) P 2 : PEG2000-DOPE : NBD-PE (54.9 : 15 : 12 : 10 : 3 : 4.6 : 0.5 몰 %에있는 t- SBL의 지질 조성물은 POPC했다 ) 및 LP = 20,000. 표백 면적은 984.203 μ이었다m 3. 복구 시간과 맞는 (6.1 참조)에서 계산 된 확산 계수는 τ = 67.3 초와 D =이었다 1.99 μm의 2 / 초, 각각. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
지질 라벨을 사용하여 도킹 및 퓨전 이벤트의 단일 색상 검출
조건 당 100-400 이벤트가 좋은 통계에 필요한으로 도킹 및 융합 이벤트의 수동 계산은 지루한 작업이다. SUV 차량이 정착 전에 SBL 이동할 수 있기 때문에, 트래킹 소프트웨어가 필요하다. ImageJ에 대한 SpeckleTrackerJ 26 플러그인은 특히 도킹 및 융합 이벤트의 분석을 위해 SUV 차량을 추적하기 위해 개발 된 기능을 가지고 있습니다. 종종 도킹 된 소포의 일부는 정착을 끝;많은 SUV의 퓨즈 또는 영화의 일부만 이벤트 충분한 수의 신뢰성 평가에 대해 검출 될 때까지 해석 할 필요가 있다는 것보다 추적해야 도킹 속도를 산출한다. 주요 초점은 용융 속도 및 / 또는 도킹 간 융합 지연 경우에만 융착 SUVs를 식별하고 추적 할 필요가있다.
SBL의 품질을 확인한 후, SUV 차량은 채널 내로 도입 및 형광의 편광을 이용 TIR하에 연속적으로 여기된다. 초기 실험은 TIR 여기 빔의 입사 각도가 조정 결과 소멸 파의 침투 깊이를 조절할 필요가있다. 대표적인 단일 SUV 도킹 및 융합 이벤트도 6a에 도시되어있다. 프레임 동안 도킹 소포는 D를 표시하고 융합은 앉아 멀리 융합의 확산으로 단일 지질이 식별 된 프레임 F. 약 1.3 초 이상 (프레임 S)에서 시작이자형. 각 박스의 총 형광 강도 (화소 값의 합)를 도킹 및 융합 나타낸 발생한 프레임으로,도 6b에 시간의 함수로서 도시된다. 시간의 함수는 t-SNARE를 사용하여 다섯 가지 영화, 그림 6c에 플롯으로 융합 이벤트의 누적 수는 SBLs (t-SBL, LP = 20,000 평방. 마이크론 당 약 70 t-덫을) 재구성. 각 영화의 융합 속도는 경사에 선형 피팅 산출 하였다. 이 평균 ± SEM 융합 속도가 패널 D.에서 막대 그래프로 도시되고도 6A, B에 도시 된 예를 들어, 도킹 간 융합 지연은 0.07 초였다. 이벤트 (158)의 총 마찬가지로 계산 지연 분포 즉 생존 곡선, 도킹 소포가 아직 소정의 지연에 의해 용융되지 않은 확률로서도 6D에 도시되어있다. 약 1/2이 소포의 100 밀리 초 내에 융합. 콜레스테롤을 증가와 DISTRIB도킹 간 융합 지연의 ution 지질 확산 27 둔화에도 불구하고, 단축.
병렬 제어 실험을 실행하는 것이 중요하다. 도 6b, D의 데이터가 획득 된 동일한 커버 슬립에서 제어 조건은 인접 채널에서 시험 하였다. 하나의 채널에서, SBL은 t-덫을 포함하지 않았다. 에있는 t- 올무가 (그림 6C)가 포함 된 경우 60 초마다 지속 (5) 영화 중 만 7 퓨전 이벤트 (158)에 비해 기록 하였다. 다른 채널에서, V-SNARE VAMP2의 가용성 세포질 도메인 (CDV)이 포함되었다. CDV는 SUV 차량에 전장 VAMP2의 결합을 방지 SBL에 t-스네어를 결합한다. 다섯 60 초 영화에서 더 퓨전 이벤트는 CDV (그림 6C)의 존재 검출되지 않았다.
그림 6. SUV-SBL 도킹 및 융합 이벤트.하여 LR-PE의 확산을 다음 pTIRF 현미경으로 이미징 t-SBL와 V-SUV 융합 이벤트의 이미지 (A) 순서. 이미지는 매 18 밀리 초, 매 두 번째 프레임이 표시됩니다를 가져옵니다. D와 F는 각각 도킹 및 융합의 발병을 표시합니다. 이들이 융합 부위와 서로 (S)으로부터 멀리 확산 개별 지질 라벨이 식별된다. 프레임 크기 : 16.7 μm의 X 16.7 μm의. (A)에 도시 된 융합 이벤트에 대한 시간의 함수로서 (B) 형광 강도. (C) 다른 세트의 실험에서 DID 표지 V-SUV 차량에 대한 시간의 함수로서 용융 사건의 누적. (D) SUV 및 (E) 소포의 도킹 후 소정 시간 동안 생존 확률 당 2 × 104 지질 가정 정규화 융합 레이트 -1 (± SEM, SX의 ㎛의 2 × pM의 SUV 의미). 모든 SB 용 조성물SAPE : DOPS : 콜레스테롤 : 뇌 PI (4,5) P 2 : PEG2000-DOPE : NBD-PE (54.9 : 15 : 12 : 10 : 3 : 4.6 : 0.5 몰 %) 및 LP = 20,000 LS는 POPC이었다. V-SUV 차량이 POPC으로 구성되었다 : SAPE : DOPS을 : 콜레스테롤 : PEG2000-DOPE을 : LR-PE를 (57.4 : 15 : 10 : 12 4.6 : 1 몰 %)과 CE를 들어 A와 B에 대한 LP = (200), V LR-PE 대신에 사용 된 DID를 제외하고 -SUV 조성물은 비슷했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
지질 확산율, 소포의 크기 및 퓨전 기공 등록
분석의 단일 분자 감도는 도킹 및 융합 요금과 도킹 간 융합 지연 분포뿐만 아니라 여러 매개 변수를 추출 할 수 있습니다. 그들이 융합 사이트 (그림 6A)에서 멀리 확산으로 단일, 형광 표지 된 지질 식별된다. 추적 tHESE 직접, 지질 확산 (26)을 제공 
및 SBL 27 형광 표백을위한 속도의 디지털 측정. 서론에서 언급 한 바와 같이, 라벨의 형광 방출은 SBL에 대 SUV에서 일반적으로 풀기 어려운 인해 세 가지 요소를 다른 : 레이블 (ⅰ) dequenching을 융합에 따라, 그들의 희석에 SBL으로 전송하는 경우 (II)에 의한 여기 빔의 편광에 대하여 TIR 생성 소멸 필드 및 형광 전이 쌍극자 (Ⅲ) 방향의 붕괴에 SBL에서 높은 여진 강도. (ⅱ) 요소의 크기는 소 산장 감쇠 길이 소포 크기의 상대적 크기에 의존 인해 SUV 크기의 분산마다 융합 이벤트 다르다. 팩터 (III) 및 형광 편광 사용에 의존한다. 오히려 디에하는 것보다 직접 융합 전에 모든 형광체 후 SUV를 둘러싸는 영역에서의 총 화소 값을 비교 한 형광의 변화의 크기를 측정 할 수 있고, 이러한 효과를 sentangle하는 융합 (도 3a 다음 SBL로 증착되어, (1) 대 ( 2)). 더 형광 융합 후 고려 시대에 대한 확산을 통해 그것을 남아 있지 않은 않도록 이전 작업 29,44 달리,이 지역은 충분히 큰 선택해야합니다. 융합 후 1.6 초에 분석을 위해 30 X 30 픽셀 영역 (8 μm의 × 8 μm의)를 선택하면 일반적으로 적절한 (27)이다. 순간에 대한 무시 표백의 비율 
이전과 융합 형광 강도 저감 계수를 제공 한 후, 
. 소포 크기합니다 (SBL 단일 라벨의 형광 강도를 부여하여 추정 될 수있다그것은 SUV 이었다면 세틸 / ftp_upload / 54349 / 54349eq6.jpg "/>)의 인자하는 그 강도 (환원 될 )는 SUV에 라벨 공지 밀도 및 지질의 점유 면적. 실제로, 표백은 일반적으로 충분히 빨리 모든 마커가 SBL에 입금되는 시간에, 일부는 이미 표백 한 것입니다. 이 때문에, 정확한 추정, 형광 강도의 감소 계수 및 지질 해제 시간, 
가장 계정 블리치 (27)에 걸리는 전체 화소 값의 시간 경과에 맞는로부터 추출된다. SBL에서 라벨의 표백 속도는 독립적으로, 또는 전체 강도 프로파일에 지수 피팅에 의해 하나의 지질 염료 추적로부터 추정 
긴 시간에 (예를 들어, 정권 (3) 그림 3). 정착 소포의 크기를 아는 지질 확산 실제 지질 해제 시간의 비교를 허용 상기 소포 주위 지질 확산 시간 
A는 VES 곳 소포 지역이며, 지질 확산이다. 두 시간 규모가 비교할 경우, 기공 지질 자료에 약간의 저항을 제공하고, 릴리스 확산 제한입니다. 반대로, 만약 
다음 세공 크게 지질 광속을 지연시킨다. 위상차 정량적 측정 비율과 동일하게 「기공 개방성 "P 0 인 
회 인자 Of를 위해 단결 지오메트리 (27) 기공 관련. 두 상태, 개방 / 폐쇄 기공를 들어, P 0은 열린 상태에서 시간의 비율입니다. 크기가 연속적으로 변화하는 점멸 기공를 들어, P 0은 완전 개방 반경 시간 평균 반경 상대를 나타냅니다.
신호대 잡음비는 단일 지질 형광을 추적하기위한 충분히 양호한 할 필요가있다. 이것은 더 쉽게 LR-PE로서 밝은 마커를 사용하여 단색 실험에서 달성된다.
지질의 동시 탐지 및 가용성화물 출시
대표적인 이벤트는도 7에 도시되어있다. 캡슐화에 사용되는 고농도의 SRB 형광 처음 셀프 켄칭. 따라서 대부분의 도킹 V-포드 SUV는 않았다 신호 (27)에 의해서만 감지 할 수 있습니다. 날카로운 증가의 형광 단일 색상 지질 라벨 실험에서와 같이, 지질 혼합을 표시했다. 지질되던 발병 SRB 형광의 증가의 시작과 일치한다. SRB 분자가 SUV 나머지 SRB 자기 담금질 농도 이하로 희석 탈출로 인해 증가는 SRB의 dequenching에 대부분이었다. 흥미롭게도, SRB 형광 안정적인 고원에 도달했습니다. 융합 기공이 열려 남아있는 경우, 하나는 나머지 SRB가 나 SUV가 SBL에 무너 경우 SUV를 왼쪽으로 SRB 신호를 배경으로 감소 하였다 인해 dequenching에 최대로 증가 할 것으로 예상된다. 안정 고원은 대부분 모든 지질 라벨 및 가용성화물의 일부를 해제 한 후 재 밀봉 기공을 나타냅니다.
어떤 경우에는, 지질 해제 신호가 검출 가능한 컨텐츠를 수반하지 않은 신호가 해제. 이것은 모공이 SRB의 통과를 허용하기에 너무 작다고 하나 때문에, 또는 어떤 수어떻게 SUV는 이미 가용화물을 잃었습니다. 이러한 두 가지 가능성을 구별하는 도킹 SUV의 표백은 분석 될 수있다. 지질 라벨 표백 광 변환의 다른 제품과 자기 소광이 완화로되는 SRB의 일부로서 SRB 신호의 상승의 초기에 셀프 켄칭 SRB 결과 표백 반면 초 내에서 형광 신호가 감소했다. 대부분의 도킹 포드 SUV (48 (58) 중 이벤트를 분석) 조명의 연장 된 기간 동안 SRB 형광의 예상 증가를 표시하지만, 작은 부분 (58분의 10)는 전혀 SRB 신호를 보이지 않았다. 따라서, 포드 SUV의 작은 부분은 실험에서 이들의 제조 및 사용 사이의 기간 동안 자신의 가용성 내용이 손실 될 수 있습니다.
사건의 80 % 이상 (74 91 점 만점) SRB 및 DID 신호 모두가 따라 할 수있는에서, SRB 형광이 증가하고 안정적인 고원 (27)에 남아 있었다. t의 ~ 20 %에서HESE의 경우는 나머지 SRB 형광 갑자기 나중에 몇 초까지 출시되었습니다. 이는 축적 된 사진 손상 (16)에 1 ~ 2 프레임 (18-36 밀리 초) 또는 SUV의 붕괴 내에서 신속, 전체 해제를 허용 기공의 재개로 인해 수 있습니다 중 하나. 무엇이든 그 기원, 두 번째는, SRB의 빠른 릴리스는 초기 릴리스 후 잔류 SRB 신호 인해 SRB가 SBL 및 전체 출시 된 이후 유리 기판 사이의 공간에 갇힌 나머지에있을 가능성을 배제. 이러한 메커니즘은 SBL 두 (16) 사이의 작은 공간, 유리에 직접 지원 이전 연구에서 제안되었다. 대조적으로, 이러한 분석에 사용되는 PEG 화 지질은 SRB 멀리 융합 사이트에서 확산 될 수 있도록 상기 SBL 유리 (25) 사이의 공간 내지 4-5를 제공한다.
그림 7. Simultan eous 지질 및 콘텐츠 릴리스. SUV-SBL 융합 이벤트에 대한 지질 (파란색)과 내용 (적색) 마커에서 형광 신호 (자세한 내용은 텍스트를 참조). 각 채널에서 스냅 샷은 하단 (4.0 μm의 폭)에 표시됩니다. 만화 (가운데)은 여러 단계를 보여줍니다. (1) SUV 부두, DID 형광이 낮습니다. SBL로했고, 형광이 증가했다 (2)의 퓨전 전송을 할 수 있습니다. 자기 담금질이 기공을 통해 SRB의 탈출에 의해 완화로 SRB 신호도 증가한다. (3) SRB 신호 세공의 가능한 재 밀봉을 나타내는 SBL 내에 확산하면서 안정된 않았다 분자 남아있다. (4) SRB 신호는 급격한 전체 융합 또는 리포좀 파열로, 매우 빠르게 감소한다. SAPE : DOPS : PEG2000-DOPE : DID (67 : 15 : 12 : 5 : 1 몰 %), LP (200), t-SBLs는 POPC 구성하는 동안 : SAPE : DOPS : 뇌 PI V-SUV 차량의 조성은 POPC했다 (4,5) P 2 : PEG2000-DOPE : NBD-PE (64.5 : 15 : 12 : 3 : 5 : 0.5 몰 %) 및 LP = 20,000. = "_ 빈">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
FRAP_instructions.pdf -. FRAP 순서를 설정하기위한 지침 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
ReadMe_FRAP.txt -. 제공되는 MATLAB 코드를 사용하여 FRAP 복구 데이터를 분석하는 절차를 설명하는 텍스트 파일 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
EK_FRAPbatch.m -에 MATLAB 파일 photobleaching에 후 형광 복구를 배치-분석 할 수 있습니다. 이 파일은 MATLAB 서브 루틴의 EK_getFRAPvals.m 및 EK_SoumpassisFit.m를 호출합니다."_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
EK_getFRAPvals.m -. MATLAB 파일, EK_FRAPbatch.m에 의해 호출 서브 루틴 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
EK_SoumpassisFit.m -. MATLAB 파일, EK_FRAPbatch.m에 의해 호출 서브 루틴 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
JN150923c1_FRAP_list.txt -. 배치 분석의 주요 MATLAB 스크립트 EK_FRAPbatch.m가 될 파일 이름 목록의 예는 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
그만큼다음 파일은 TIF 스택과 EK_FRAPbatch.m을 실행하고 파일 목록을 선택하라는 메시지가 표시 될 때 JN150923c1_FRAP_list.txt 파일을 선택하여 분석 할 수 FRAP 시퀀스의 오 예에 해당하는 텍스트 파일입니다.
JN150923c1_F1_MMStack_Pos0.ome.tif -. FRAP 이미지 스택 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
JN150923c1_F1_MMStack_Pos0_metadata.txt -. 메타 데이터 텍스트 파일을 해당 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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JN150923c1_F4_MMStack_Pos0.ome.tif - FRAP 이미지 스택입니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기에 설명 된 SUV-SBL 융합 분석의 성공적인 구현은 좋은 품질의 SBLs를 획득, 단일 분자를 검출 할 수있는 권리 이미징 매개 변수를 선택, 같은 리포좀으로 단백질의 기능 재구성과 같은 몇 가지 주요 단계에 결정적으로 의존한다. 이 성공하는 데 시간과 노력이 걸릴 수 있지만 분석이 성공적으로 실행되면, 그것은 소개에서 논의 된 다른 체외 융합 분석에서 사용할 수 없습니다 융합 프로세스에 대한 풍부한 정보를 제공한다. 요금은있는 SUV 차량은 SBL, 도킹 간 융합 시대의 분포, 지질 확산, 모든 융합 리포좀의 크기에 퓨즈 도킹, 주어진 융합 이벤트에 대한 지질 자료는 diffusion- 또는 기공 제어 캔 여부 결정. 릴리스 확산에서 예상보다 훨씬 느린 경우, 기공 깜박임을지지 모델은 지질 분리 수율의 지연, P 0, 시간의 분율을 기초가되는 구멍 난융합 27 일 동안 열려이야.
염료 분자 사이의 FRET과 자기 담금질에 의존 15-17,21,22,33,44 SBLs에 단일 SUV-SUV 융합 18-20,28 또는 리포좀과 바이러스 입자의 융합을 프로빙 이전 작품. 반면에, 우리는 주로 두 가지 이유는 SBL로 지질 라벨 전달 동력학을 프로빙 염료 dequenching을 피한다. 먼저, FRET 효율성 지질 방출 고도로 비선형 리포터이다. FRET 효율에 큰 변화 간 염료 거리 (d)의 결과에 작은 변화 만 R 0은 포스터 거리 인 D / R 0 값의 제한된 범위에 대한. 즉, 실제 염색 희석 의한 R 0에 가까운 값으로 떨어질 때까지 필요한 시간에 발생할 수 dequenching 신호에서 관찰 된 증가 사이의 지연 시간이다. 색소 밀도 지질 릴리스에 충분히 감소되면 마찬가지로 dequenching 신호에서 작은 변화가되도록 
1.4 염료 상당량 여전히 소포에 남아 있더라도. 이러한 속성은 융합 이벤트를 감지 신호에 스파이크를 얻을 수 있지만, 높은 시간 해상도를 사용하여 지질 자료의 양적 운동 분석을 복잡하게하는 좋은 도구를 dequenching합니다. 대조적으로 인해 다이폴 재배 향과 SBL로 SUV에서 형광 전송 등 소멸 전계 효과 강도의 변화는 선형 여전히 SUV에 잔존 염료의 비율에 관련된다. 둘째, 자기 소광 필요한 지질 라벨 고농도 융합 과정 자체에 영향을 미칠 수있다.
편광 TIRF 여기를 들어, 그림 4와 같이 집에 내장 설치 비용 효율적이며, 편광 특성을 통해 우수한 제어를 제공합니다. 그러나, 집에 내장 설치가 적어도 일부 상업 TIRF 현미경은 편광 여기를 사용할 때, 필요하지 않으며 상용 전원두 색 발광 분할 모듈을 사용할 수 있습니다. 부부 현미경으로 레이저로부터 나오는 편광 된 여기 광을 편광 유지 (PM) 파이버를 사용하는 상용 현미경은 이전에 성공적으로 사용되었다 (25-27). 이러한 장비에서, 분극 현미경의 TIRF 유닛에 PM 파이버 입력 회전시킴으로써 간단하게 회전 할 수있다. 대조적으로, 다른 상업용 설정 편파의 조정이 더 어렵거나 불가능하게 만드는 TIRF 부에 편광 빔 스플리터를 채용 할 수있다. 불행하게도, 편광 특성은 종종 상용 시스템에 대해 지정되지 않습니다. 따라서, 가정 내장 시스템 편광 특성을 논의하기 위해 특정 상업 옵션에 투자하기 전에 데모 유닛을 시도를 구성하지 않으려는 사용자를위한 중요합니다.
지질 및 가용성화물 릴리스의 동시 모니터링은 융합 과정에 대한 자세한 정보를 제공합니다. 많은 기공은 rele 후 다시 봉인하는 것가용성 라벨의 asing 일부만는 SUV (27)에 캡슐화. 일반적으로 모든 지질 레이블은 기공이 재 밀봉 시간이 발표되기 때문에 기공 재 밀봉 혼자 지질 자료를 모니터링에서 이전에 의심하지 않았다. SBL에 표시 지질의 사실, 혼자 지질 자료를 모니터링, 키슬링 등. (29)는 제안했다 전송은 SBL로 전체 SUV 막의 매우 빠른 붕괴를 통해 발생했습니다.
콘텐츠의 부분 분리 이전 리포솜 연결형 이중층 패치 융합 분석에서 관찰 한 후 융합 재 밀봉 모공. Rawle 등. ~ 8 nm의 긴 DNA 스페이서에 의해 커버 슬립에 닿는 된 54 준비 자립 이중층 패치. 그런 다음 그 융합 이중층 패치에 리포좀 및 패치 막에 고정 보완적인 단일 가닥 DNA 지질 복합체의 하이브리드에 의해 구동 된 리포좀을 소개했다. 모든 이벤트의 12 %는 일부의 결과로, 과도 융합했다리포좀 내용의 IAL 릴리스. 일부 이전 SUV-SBL 융합 분석 (44)에서 볼 리포좀 파열 사건은 매우 드물었다. 저자들은 이중층 기판의 상호 작용을 방지 이중층 패치 아래 ~ 8 nm의 공간을 제안 이중층 아래 공간에 리포솜 내용물의 비 - 누설 전송을 허용 할 수있다. 또한, 방출 수용성 라벨 확산 크게 평면 이중층과 유리 기판 사이의 공간을 방해하지 않았다. 여기에 기재된 분석에서, 평면 이중층 마찬가지로 폴리 (에틸렌 글리콜) -lipid 콘쥬 게이트의 존재는 5nm ~ 떨어져 커버 슬립에서 유지된다.
가용성 및 지질화물의 2 색 모니터링에 의해 제공되는 추가 정보에는 트레이드 오프 (trade-off)와 함께 제공됩니다. 첫째, 두 개의 레이블과 포드 SUV의 준비는 혼자 지질 라벨을 포함하는보다 약간 더 복잡하다. 둘째, 일부 불가피한 손실이 신호대 t에서 지질 라벨로부터 신호를 모니터링단일 색상 지질 분리 실험에서와 같이 그는 같은 수집 속도 (프레임 당 15 ~ 20 밀리 초). 이 손실의 일부 인해 가용성 SRB 마커와 함께 지질 레이블로 사용했던 사실에, LR-PE는 단색 실험에 사용 된 것과 같은 밝은되지 않습니다이다. 추가 손실은 더 높은 배경에서 기인 동시에 두 개의 레이저 여기 및 광학 경로에 추가 구성 요소 (그림 4)을 초래한다. 지금까지, 낮은 신호 대 잡음이 하나의 신뢰할 수있는 추적에서 우리를 방지 DID 2 색 실험에서 레이블. 이것은 차례로 단색 LR-PE로 측정 할 수있는 모든 정보를 추출하기위한 철저한 분석을 막았다. 이러한 문제는 획득 조건을 최적화하고 개선 된 특성과 호환 라벨 다른 쌍을 테스트함으로써 미래에 극복 될 수있다.
또한 동시 hemifusion, 근위 전단지 융합 한 상태를 감지 할 수있는 수용성 및 지질화물 방출 모니터링하지만, 원위전단지는하지 않았습니다. 실제로, 이러한 2 색 실험 관내 융합 분석법 (18,20)의 다른 hemifusion의 존재 만 결정적인 평가를 제공 할 수있다. 그러나 hemifusion 확실 단독 22,44 단색 SUV-SBL 실험 감시 지질 릴리스를 검출 할 수있다. 이러한 실험에서, SUV의 약 1/2 초기 지질 라벨 강도 융합 지점에 남아있다. 그 자리가 아직 표백하지 않은 경우 말초 전단지, 나중에 시간이 융합 할 때 나머지 강도가 사라질 수 있습니다.
PEG 화 지질의 사용은 SBL 및 유리 지지체 사이에 부드러운 쿠션 세포 외 유출의 SNAP25 요구 재생 키왔다 소개. PEG의 프로토콜의 결과뿐만 아니라 유로 마주 SBL의 측면을 덮는 브러시. 이는 서론에서 설명한 바와 같이, 포드 SUV와 SBL 사이의 비특이적 상호 작용을 줄이고 일부 장점을 가지고 있습니다. 만약의 인지질과 상호 작용하는 단백질SBL이 분석에 도입하지만, PEG 브러쉬는 상호 작용에 대해 입체적 장벽을 제공한다. 따라서, 몇몇 애플리케이션의 경우, 단지 SBL, 유리 커버 슬립 사이에 비대칭 PEG 층을 포함하는 것이 바람직하다. 유로 대향 SBL의 측면 그러한 synaptotagmin 같은 인지질 결합 단백질과 상호 작용할 수있을 것이다. 이는 공유 일단 커버 슬립에 연결될 수 이관 능성 PEG 체인을 사용하고, 다른 지질에 앵커를 수행함으로써 달성 될 수있다. 랭 뮤어 - 블로 젯 방식이어서 PEG 층 (55) 상 지질 단층을 증착하는데 사용될 수있다. 이중층 (56)를 형성하는 것이이 소수성 표면 위에 퓨즈 도입 리포솜. 이 방법은 나중에 미세 유체와 조합 될 것으로 기대된다.
또, 여기에 제시된 SUV-SBL 분석은 스네어 상호 작용 단백질을 추가 역할을 탐색하는데 도움이 될 것으로 기대된다같은 Munc18 / Sec1과 가족, 칼슘 센서 synaptotagmin-1 및 complexin있다.
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Disclosures
저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Milli-Q (MQ) water | Millipore | ||
| KOH | J.T. Baker | 3040-05 | |
| Ethanol 190 Proof | Decon | ||
| Isopropanol | Fisher Chemical | A416P4 | |
| HEPES | AmericanBio | AB00892 | |
| Sodium Cholride (KCl) | AmericanBio | AB01915 | |
| Dithiothreitol | AmericanBio | AB00490 | |
| N-[2-hydroxyethyl] piperazine-N'-[2-ethanesulfonic acid] (HEPES) | AmericanBio | AB00892 | |
| EGTA | Acros Organics | 409911000 | |
| Buffers | |||
| HEPES-KOH buffer (pH 7.4) | 25 mM HEPES-KOH, 140 mM KCl, 100 μM EGTA, 1 mM DTT | ||
| Solvents | |||
| Chloroform | J.T. Baker | 9180-01 | in glass bottle, CAUTION, wear PPE |
| Methanol | J.T. Baker | 9070-03 | in glass bottle, CAUTION, wear PPE |
| Liposome preparation | |||
| Gastight Hamilton syringe | Hamilton | var. sizes | only use glass sringe with solents (Chlorophorm/ Methanon, 2:1, v/v) |
| Glass tubes Pyrex Vista 11 ml, 16x100 mm screw cap culture tube | Pyrex | 70825-16 | clean thoroughly, rinse with chloroform |
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 16:0-18:1 PC (POPC) | Avanti Polar Lipids | 850457 | Lipids come dissolved in CHCl3 or as lyphilized powder in sealed vials. Aliquot upon opening. Store extra as dried lipid films under inert atmosphere at -20 °C. Keep stocks in CHCl3/MeOH (2:1, v/v) at -20 °C. let come to RT before opening |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt), 18:1 PS (DOPS) | Avanti Polar Lipids | 840035 | Same as above. |
| 1-stearoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, 18:0-20:4 PE (SAPE) | Avanti Polar Lipids | 850804 | Same as above. |
| L-α-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate (Brain, Porcine) (ammonium salt), Brain PI(4,5)P2 | Avanti Polar Lipids | 840046 | Same as above. |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl) (ammonium salt), 18:1 NBD PE | Avanti Polar Lipids | 810145 | Same as above. |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt), 18:1 PEG2000 PE | Avanti Polar Lipids | 880130 | Same as above. |
| cholesterol (ovine wool, >98%) | Avanti Polar Lipids | 700000 | Same as above. |
| DiD' oil; DiIC18(5) oil (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindodicarbocyanine Perchlorate) | Molecular Probes | D-307 | |
| Rotavapor R-210 | Buchi | R-210 | heat bath above Tm of lipids used |
| OG n-Octyl-β-D-Glucopyranoside | Affymetrix | 0311 | store at -20 °C, let come to RT before opening |
| Shaker - Eppendorf Thermomixer R | Eppendorf | ||
| Slide-A-Lyze Dialysis Cassettes, 20k MWCO, 3 ml | life technologies | 66003 | |
| Bio-Beads SM-2 Adsorbents | Bio-Rad | 1523920 | |
| OptiPrep Density Gradient Medium | Sigma-Aldrich | D1556 | |
| Ultracentrifugation tube, Thinwall, Ultra-Clear, 13.2 ml, 14 x 89 mm | Beckman Coulter | 41121703 | |
| Beckman SW41 Ti rotor | |||
| SuflorhodamineB | Molecular Probes | S-1307 | |
| Econo-Column Chromatography Columns, 2.5 × 10 cm | Bio-Rad | 7372512 | |
| Sepharose CL-4B | GE Healthcare | 17-0150-01 | |
| SYPRO Orange Protein Gel Stain | Molecular Probes | S-6650 | 5,000x Concentrate in DMSO |
| PDMS block | |||
| Sylgard 184 Silicone elastomer kit, PDMS | Dow Corning | 3097358-1004 | |
| Pyrex glass petri dish, 150 x 20 mm, complete with cover | Corning | 3160-152 | |
| Hole puncher - Reusable Biopsy Punch, 0.75 mm | World Precision Instruments | 504529 | |
| Manual Hole Punching Machine | SYNEO | MHPM-UNV | |
| Drill .035 x .026 x 1.5 304 SS TiN coated round punch | SYNEO | CR0350265N20R4 | drill diameter: 0.9 mm, punch bore size: 0.74 mm |
| Tygon Microbore tubing, 0.25 mm ID, 0.76 mm OD | Cole-Parmer | 06419-00 | 0.010" ID, 0.030" OD |
| Silicone Tubing (0.51 mm ID, 2.1 mm OD | Cole-Parmer | 95802-00 | 0.020" ID, 0.083" OD |
| Cover glass - cleanroom cleaned | |||
| Schott Nexterion cover slip glass D | Schott | 1472305 | |
| plasma cleaner | Harrick | PDC-32G | |
| pTIRF setup and accessories | |||
| IX81 microscope body | Olympus | IX81 | |
| EM CCD camera | Andor | ixon-ultra-897 | |
| Thermo Plate, heated microscope stage | Tokai Hit | MATS-U52RA26 | |
| 1 ml hamilton glass syringes (4x) | Hamilton | 81365 | |
| syringe pump | kd Scientific | KDS-230 | |
References
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