Introduction
Het tumor suppressor gen p53, een essentiële regulator van een aantal cellulaire processen zoals celcyclus, apoptose en senescentie 1. Het is verantwoordelijk voor genomische stabiliteit en is daarom cruciaal voor het handhaven van het evenwicht van celdood en celgroei. Mutaties in p53 komen vaak bij kanker en de belangrijkste oorzaak van p53 inactivering leidt tot ongecontroleerde celproliferatie kanker 2. Interessant mutaties in p53 vertegenwoordigen slechts ongeveer 25% van de borstkankers 3, wat suggereert dat andere mechanismen verantwoordelijk voor het verlies van p53 functie. De recent ontdekte p53 isovormen is aangetoond dat overexpressie in een aantal menselijke kankers, en kan p53 functie 4,5 moduleren. We hebben eerder aangetoond dat het p53-isovorm, Δ40p53, is het hoogst tot expressie isovorm bij borstkanker en aanzienlijk opgereguleerd in borstkankercellen, in vergelijking met normale aangrenzende tissue 6. Naar aanleiding van dit, we stabiel getransduceerde menselijke borstkanker cellijn MCF-7 tot Δ40p53 overexpressie met behulp van de LEGO-IG2-puro + vector (GFP +) 7. Deze cellen werden gebruikt om te onderzoeken of hoge Δ40p53 expressie verhoogt celproliferatie aanbiedingen in borstkankercellen.
Er zijn vele directe en indirecte methoden voor het meten van celproliferatie in vitro gekweekte cellen 8,9. Deze kan worden uitgevoerd als continue metingen in de tijd, of eindpunt assays 10. Gebruikelijke werkwijzen zijn nog steeds bruikbaar, zoals celtellingen behulp van een hemocytometer. Deze test is een lage kosten en directe meting van het aantal cellen, maar het vertrouwen op de grote cellen en hoogopgeleide training om fouten en grote standaard afwijkingen van de tellingen te minimaliseren. De noodzaak om metingen geschikt is voor high-throughput formaten voeren heeft geleid tot de ontwikkeling van multiwell-plaat assays. Deze luminescentie-gebaseerde testen measure aantal cellen op basis van een luminescent signaal dat evenredig is met de metabolische activiteit van de cel 11,12. Meer recent, de invoering van hoge gehalte imaging platforms heeft het mogelijk gemaakt voor nieuwe instrumenten die celdeling controleren, terwijl het verstrekken van kwantitatieve en kwalitatieve verzamelen fenotypische data, en omvat een verscheidenheid aan systemen 13. Al deze werkwijzen wegen om celgroei te meten, hetzij door continue meting of eindpunt assays, en bezitten elk een reeks voordelen en nadelen met betrekking tot gevoeligheid, doorvoer van aantallen monsters en celinformatie, die derhalve afhankelijk kan worden gewogen op de onderzoeksvraag.
Dit protocol beschrijft drie verschillende methoden voor het meten van celproliferatie in vitro, waarbij elke methode waarbij verschillende reeksen van gevoeligheid, reproduceerbaarheid en multi-well plaat formaat. Dit protocol doel belang het gebruik van een hemocytometer geteld chamber, een op luminescentie gebaseerde assay cellevensvatbaarheid en mobiele imager, bij de meting van celproliferatie gedurende een tijdsverloop van 96 uur. Hiervoor is de groei van vector-getransduceerde cellen (MCF-7-LEGO) vergeleken met cellen getransduceerd tot overexpressie Δ40p53 (MCF-7-Δ40p53), met behulp van drie verschillende celdichtheden. Celproliferatie werd gemeten elke 24 uur tot 96 uur. Elke methode bleek zijn eigen voor- en nadelen, en afhankelijk van het doel van het experiment, elk nog een waardevolle werkwijze voor het verschaffen van informatie over de snelheid van proliferatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Voorbereiden Cellen voor verspreiding Analyses
Opmerking: Bereid de twee cellijnen op dezelfde wijze en zaad in dezelfde notatie voor elke methode te analyseren.
- Kweek MCF-7-LEGO en MCF-7-cellen Δ40p53 7 tot 75-80% samenvloeiing in T-75 cm2 weefselkweek kolven met behulp fenolrood vrij Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) , 200 mM L-glutamine, 2 ug / ml insuline en 1 ug / ml Puromycine bij 37 ° C met 5% CO2. Behandel cellen in een steriele bioveiligheid kast klasse II.
Opmerking: De hoeveelheid tijd die nodig is om de cellen groeien tot samenvloeiing afhankelijk van het zaaien verdunning. Ter voorbereiding van uitplaten van de cellen voor proliferatie assays, zaad de cellen bij een 1: 3 verdunning in DMEM aangevuld en onderhouden in normale groeiomstandigheden gedurende 3 dagen tot 75-80% confluentie. - Om de cellen uit de kolf te verwijderen, giet de media ineen afvalcontainer. Spoel de cellaag met 2 ml voorverwarmde 2x trypsine. Zuig trypsine. Nogmaals 2 ml voorverwarmde trypsine om de cellaag en plaats in een incubator gedurende 5 minuten bij 37 ° C met 5% CO2.
- Zodra de cellen los te maken, was de cellen met 10 ml vers opgewarmd aangevuld DMEM. Breng de celsuspensie in een steriele 15 ml buis en centrifugeer bij 491 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Zorgvuldig aspireren en gooi de supernatant.
- Resuspendeer de celpellet in 5 ml vers DMEM gesupplementeerd. Voer een celtelling de juiste dichtheid zaad cellen in 96-well platen bepalen.
- Verdun 100 ul van de celsuspensie in 900 ul 1 x Dulbecco's fosfaat gebufferde zoutoplossing (DPBS). Plaats een nieuwe 60 micrometer sensor op de geautomatiseerde cel teller. Houd de zuiger en dompel de sensor in de verdunde celsuspensie. Langzaam laat de zuiger op de mobiele toonbank. Haal de sensor uit de cel counter wanneer voltooid.
Opmerking: De celtelling wordt op de cel teller in cellen / ml.
- Verdun 100 ul van de celsuspensie in 900 ul 1 x Dulbecco's fosfaat gebufferde zoutoplossing (DPBS). Plaats een nieuwe 60 micrometer sensor op de geautomatiseerde cel teller. Houd de zuiger en dompel de sensor in de verdunde celsuspensie. Langzaam laat de zuiger op de mobiele toonbank. Haal de sensor uit de cel counter wanneer voltooid.
- Zaadcellen in een eindvolume van 100 pl (in DMEM) in een 96-puts plaat bij ~ 20% confluentie ruimte voor celgroei en meten van proliferatie gedurende 3-5 dagen (zie tabel 1) mogelijk. Seed alle cellijnen in drievoud.
Opmerking: Voor dit experiment werden drie verschillende celdichtheden beoordeeld om de optimale celdichtheid te bepalen. De vereiste celaantallen zijn samengevat in tabel 1. Zaad cellen bij een lagere dichtheid als meting van meer groei op lange termijn nodig is.- Voor de hemocytometer en-luminescentie gebaseerde testen, bereiden een bord per tijdstip (dwz 4 platen per test). Voor mobiele imager assay bereiden slechts één plaat voor de duur van het experiment.
- Handhaaf cellen bij 37 ° C met 5% CO2 gedurende 24 uur.
2. Vaststellen celgetal Using een hemocytometer
- Voorverwarmen zowel medium en trypsine tot 37 ° C in een celkweek incubator, oven of waterbad. Aspireren media uit cellen in een afvalcontainer, een keer wassen met 30 pi 2x trypsine, en zuig het trypsine.
- Was de cellen opnieuw met 30 ui 2x trypsine en incubeer gedurende 5 minuten bij 37 ° C. Tik zachtjes tegen de rand van de plaat om de cellen los te maken van de plaat. Voeg 50 ul DMEM aangevuld en meng cellen door pipetteren totdat de cellen vormen een enkele celsuspensie.
- Bereid hemocytometer met het schoonmaken van het oppervlak en de glazen afdekplaat met 70% ethanol.
- Plaats de glazen afdekplaat-slip op het tellen van kamers en brengen tot 'Newton's breking ringen' is te zien tussen de cover-slip randen en de hemocytometer.
Opmerking: Deze geven aan dat de cover-slip correct heeft gehandeld op de hemocytometer. - Voorzichtig pipet 20 ul van celsuspensie onder de kap-slip, het vullen van de telkamer door capillaire beweging.Plaats hemocytometer onder 10x vergroting van een microscoop en visualiseren van de telling kamers in het raster lay-out.
- Aantal cellen in de buitenste 4 kwadraten van de grid. Om de nauwkeurigheid te verbeteren, herhalingen van extra buitenste pleinen, indien nodig, of tot de telling heeft bereikt 70-100 cellen 14,15.
- Bereken celconcentratie per ml als volgt: Gemiddeld aantal cellen per vierkante x verdunningsfactor (indien gebruikt) x 10 4
- Herhaal stap 2,1-2,8 elke 24 uur gedurende 96 uur na het zaaien.
3. Bepalen celproliferatie gebruik van een luminescentie-gebaseerde test
Let op: Dit is een eindpunt meting. Zodra het reagens wordt aan de cellen toegevoegd, de plaat slechts eenmaal worden gekwantificeerd.
- Dooi luminescentie reagens in een 22 ° C waterbad gedurende 30 minuten.
- Meng reagens door het inverteren van de fles om een homogeen mengsel te verkrijgen.
- Evenwicht een plaat van gezaaide cellen (uit stap1,5) bij kamertemperatuur gedurende 30 min.
- Voeg 100 ul van luminescentie reagens aan elke well. Meng de inhoud op een orbitale schudder gedurende 2 min. Laat de plaat geïncubeerd gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
- Het opzetten van een luminescentie experiment met behulp van de multi-mode plaat reader software.
- Schakel de multi-mode plaat lezer en de software te openen. In de 'task manager', selecteer 'experimenten' en 'maak new'.Select' file 'van de kant van de werkbalk, en onder' protocol 'tab, selecteer' procedure '.
- Selecteer 'Grenier 96 platte bodem' plaattype, en vink het vakje "gebruik deksel '. Selecteer 'lezen' actie in het kader box 'te lezen methode'. Selecteer 'luminescentie' detectiemethode. Klik op 'OK'.
- In het lezen stap selecteert u de putten onder het tabblad 'volledige plaat' te scannen, en selecteer putten als blanco wells handelen.
- Stel het ingesteld op lege filter filter (bv stekker, Em: gat, spiegel: geen). Stel de winst voor135, met een integratie van 0,5 sec per waterput en een lees hoogte van 6,5 mm. Klik op 'OK' om de instellingen voor de luminescentie te lezen op te slaan.
- Het uitvoeren van een Lichtgevende lezen
- Eject plaathouder door het selecteren van het tabblad 'instrument control' en klik op 'plaat out'.Place 96-well plaat op de plaat houder, zodat het deksel op. Sluit de plaathouder door te klikken op 'plaat' onder het tabblad 'instrument control'. Klik op 'nu' van werkbalk om lichtgevende lezen uit te voeren.
- Exporteren de relatieve lichtgevende eenheid (RLU) metingen van elk putje naar een spreadsheet voor verdere analyse.
- Herhaal stappen 3.1-3.6 proliferatie registreren elke 24 uur tot 96 uur na het zaaien van cellen.
4. Vaststellen celgetal Met behulp van een Cell Imager
- Het opzetten van een cell imaging experiment met behulp van de multi-mode cel imager software
- Schakel de multi-mode cel imager open the software.
- In de 'task manager', selecteert u het tabblad 'experimenten' en 'creëren new'.On de' file 'werkbalk, klik op' 'tab en open' protocol procedure 'tab.Select' ingestelde temperatuur 'actie. Stel incubator 'aan' en stel de temperatuur tot 37 ° C en laat 'voorverwarmen' voordat u verder gaat met de volgende stap box '. Klik op 'OK' om de instellingen op te slaan.
- Selecteer 'lezen' actie. Klik op 'image' detectiemethode, selecteer 'endpoint / kinetische' lezen type en optica 'filters' type. Klik op 'OK'.Click op' tab volledige plaat 'en kies putten op de plaat af te beelden. Klik op 'OK' om de instellingen op te slaan.
- Selecteer de 2.5X doelstelling van de daling onderaan opties 'doelstellingen'. Onder het tabblad 'kanalen', selecteert u twee kanalen: GFP 469, 525 en Bright Field. Controleer 'auto' exposure voor beide kanalen en selecteer de automatische belichting ook.
- Om te bepalen auto focusinstellingen, selecteer 'auto-focus' en klik op 'opties'. Voor de auto-focus opties, selecteert u de 'scannen en vervolgens autofocus' methode. Klik op 'OK' om de instellingen op te slaan.
- Stel de horizontale en verticale verplaatsing van het centrum van de put (pm) waardoor 0.Select meerdere beelden per putje in een 3 x 2 montage scannen met horizontale afstand (pm) = 2881 en verticale afstand (pm) = 2127. Klik op 'OK' om de procedure op te slaan.
Opmerking: Zie tabel 2 voor lezen parameters.
- Het uitvoeren van lezen Experiment op geselecteerde Plate
- Klik op het tabblad 'instrument control' en selecteer de 'plate out' function.Place 96-well plaat in plaat houder, zodat het deksel op. Onder de tab 'instrument control', selecteert u de 'plaat' functie. Selecteer 'lees nu' op het tabblad plaat. Herhaal lees elke 24 uur tot 96 uur na het zaaien.
- Analyse van celtelling DeCell Imager Software.
- Om een beeld te analyseren, klikt u op het tabblad 'gegevens' op de belichte plaat, selecteert u 'picture [GFP 469, 525 + Bright gebied]'. Dubbelklikken op een goed beeld gebracht.
- Klik op een geladen afbeelding. Selecteer 'analyseren' en selecteer een enkel beeld van de montage te analyseren. Klik op 'OK'.Check de' GFP 'enige kanaal, en stel de parameters zoals aangegeven in tabel 3. Klik op' START 'om de parameters van toepassing zijn op de afgebeelde cellen.
- Neem de celtelling masker geplaatst via afgebeeld cellen, die wordt gebruikt om het aantal cellen per beeld bepalen. Klik op deze instellingen 'wijzigingen toe te passen en te handhaven voor elke plaat belicht gedurende het experiment.
- Eenmaal terug in de belichte plaat, klikt u op de drop 'data' down menu en selecteer 'cell count'. Dit brengt het totale aantal cellen per putje te genereren.
- Exporteer alle gegevens naar een spreadsheet door te klikken op de tab 'export' voor verdere analyse of de celtellingen per putje.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Verschillende methoden voor het meten van de proliferatie van gekweekte cellen, de cel proliferatie van MCF-7-Δ40p53 getransduceerde cellen te bestuderen werd vergeleken met de niet-getransduceerde MCF-7-LEGO borstkanker cellijn. De drie methoden werden vergeleken - de conventionele methode hemocytometer cellevensvatbaarheid luminescentie assay en cell imaging analyse- worden beschreven in de schema (figuur 1). Elke methode heeft voor- en nadelen nauwkeurig celtelling in de tijd, en de meest effectieve methode is afhankelijk van het eindpunt eisen van het experiment en de informatie die kan worden verkregen voor een celpopulatie.
De groei van MCF-7-LEGO en MCF-7- cellen Δ40p53 werden gemeten na 24 uur gedurende 4 dagen. Zoals getoond in figuur 1, zijn de twee cellijnen geënt op drie verschillende celdichtheden (1,5 x 10 3 3; 5 x 10 3 cellen / putje) en celtelling werd uitgevoerd 24, 48, 72 en 96 uur na enten. Elke methode aangetoond van celproliferatie met behulp van een hemocytometer, een op luminescentie gebaseerde test en een cel imager (figuren 2a, b en c, respectievelijk) over 96 uur. De grootste toename in cel proliferatie werd gezien bij de hoogste celdichtheid (5 x 10 3 cellen) en toonde ook de meest reproduceerbare resultaten op elk tijdstip, wat suggereert dat dit de optimale celdichtheid voor het meten van proliferatie in deze cellen. Er was geen significant verschil in celproliferatie tussen de cellijnen.
De meting van celproliferatie tussen de verschillende methoden werd vergeleken door lineaire regressieanalyse 6 (Figuur 3; Tabel 4). Er was een significante correlatie tussen elk van de verschillende methoden getest bij vergelijking cproliferatie ell op alle celdichtheden in beide cellijnen (figuur 3a en b). De sterkste correlatie waargenomen tussen de vergelijking van de luminescentie-gebaseerde test en de cel imager (R 2 = 0,8899, p ≤0.0001; R 2 = 0,9805, p ≤0.0001, figuur 3a en b, respectievelijk).
Een visuele weergave van celproliferatie met de cel imager wordt getoond (figuur 4). Aangezien deze methode maakt gebruik van continue metingen van een enkele plaat, kunnen de cellen worden afgebeeld elke 24 uur totdat de cellen te bereiken bijna 100% confluentie. Zoals getoond in figuur 2, de groei van de MCF-7-LEGO en MCF-7-cellen Δ40p53 waren vergelijkbaar voor alle tijdstippen. Deze methode verschaft nuttige cellulaire informatie, met inbegrip van de mogelijkheid om visueel te controleren celgroei over meerdere dagen, en vergelijk celgrootte en mobiele morphologie tussen verschillende cellijnen.
Figuur 1: een schematische voorstelling van de drie verschillende methoden meten van celproliferatie Cellen werden gezaaid op drie verschillende celdichtheden in meerdere 96-putjes platen en geïncubeerd bij 37 ° C met 5% CO2 gedurende maximaal 96 uur.. Elke 24 uur, celproliferatie werd gemeten door hetzij met behulp van een hemocytometer, een luminescentie-gebaseerde test of cell imaging. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2:. Celproliferatie metingen na 96 uur celtellingen werden gemeten elke 24 uur gedurende 96 uur in MCF-7-LEGO en MCF-7-cellen gezaaid Δ40p53 op drie verschillende celdichtheden. Celtellingen werden gemeten met een (a) hemocytometer in cellen / ml, (b) met een luminescentie-gebaseerde test in relatieve luminescentie-eenheden (RLU) of (c) doorlopende celtelling behulp van een mobiele imager / beeld cellen. Voorwaarden voor de cel imager worden weergegeven in tabel 2. Alle experimenten vertegenwoordigen het gemiddelde van drie onafhankelijke experimenten, ± de SD Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3:. Vergelijking van drie verschillende methoden meten van celproliferatie bij borstkanker cellijnen Een lineaire regressie-analyse werd uitgevoerd om de correlatieve verbanden tussen de verschillende m vergelijk ethoden onderzocht voor het meten van celproliferatie in (a) MCF-7-cellen LEGO en (b) MCF-7-cellen Δ40p53. Een Pearson correlatiecoëfficiënt werd berekend en de significantie werd bepaald (p <0,05) tussen de verschillende methoden meten celproliferatie. Alle resultaten geven het gemiddelde ± SD van drie onafhankelijke experimenten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4:. Beelden van GFP-positieve MCF-7-lego en MCF-7-Δ40p53 Breast Cancer Cells Vertegenwoordiger beelden van cellen uit 5 x 10 3 gezaaide cellen opgenomen met een mobiele imager elke 24 uur. De schaal bar vertegenwoordigt 1.000 urn. Parameters voor cell imaging zijn samengevat in Tabel 2. href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/54350/54350fig4large.jpg" target = "_ blank"> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Celdichtheid (cellen / putje) | |||
| celtype | 1,5 x 10 3 | 3,0 x 10 3 | 5 x 10 3 |
| MCF-7-lego | 76 ul in 8,4 ml media | 152 ul in 8,3 ml media | 254 ul in 8,2 ml media |
| MCF-7-Δ40p53 | 93 ul in 8,4 ml media | 185 ul in 8,3 ml media | 308 ul in 8,2 ml media |
Tabel 1: Cell Zaaien volumes voor 96 putjes.
"Fo: keep-met-next.within-page =" always ">Tabel 2: Lees Parameters voor mobiele Imaging Met behulp van de Cell Imager.
| Imaging parameters | ||||
| Drempel | 5000 | |||
| Minimale objectgrootte (pm) | 30 | |||
| Maximale grootte object (pm) | 300 | |||
| MCF-7-lego | ||
| R square | p-value | |
| Hemocytometer versus-luminescentie gebaseerde assay | 0,6301 | 0,0021 |
| Cell imager vs. hemocytometer | 0,7524 | 0,0003 |
| -Luminescentie gebaseerde test versus cel imager | 0,8899 | <0,0001 |
| MCF-7-Δ40p53 | ||
| R square | p-value | |
| Hemocytometer vs. lu-Minescence gebaseerde test | 0,8983 | <0,0001 |
| Cell imager vs. hemocytometer | 0,9303 | <0,0001 |
| -Luminescentie gebaseerde test versus cel imager | 0,9805 | <0,0001 |
Tabel 4: Lineaire regressie analyse van de drie verschillende methoden proliferatie getest.
| Methode | voordelen | nadelen | technische toelichting | uiteindelijke output |
| hemocytometer | Goedkoop | High menselijke fout | Pipet meerdere keren om enkele celsuspensie te bereiden | Cellen / ml |
| Vereist een minimale uitrusting | Vereist single-celsuspensie | Voer meerdere tellingen om de nauwkeurigheid te bereiken | ||
| Direct celgetal | Hoog aantal cellen die nodig zijn voor een nauwkeurige evaluatie van celgetal | |||
| Endpoint | ||||
| -Luminescentie gebaseerde assay | Gebruik in combinatie met multi--plaatformaten | dure reagentia | Beschermen tegen licht | Relatieve Lichtende Units (RLU) / well |
| Eenvoudig uit te voeren | Vereist lichtgevende plaatlezer | Omvatten controle putten achtergrond luminescentie bepalen | ||
| snelle test | Temperatuurgevoelige | |||
| Biedt levensvatbaarheid van de cel informatie | Variabel afhankelijk metabolische activiteit van cellen | |||
| indirecte meting | ||||
| Endpoint | ||||
| Cell imager | continue meting | dure imager | Verzekeren cel imager ingesteld op 37 ° C | Cellen / image |
| Temperatuurregeling | skill intensive | Vermijd onnodige schudden of verstoring van de cellen | ||
| Biedt cellulaire informatie | Variabel afhankelijk van cellen samenvloeiing | |||
| Kosteneffectieve (als je de imager) | relatieve count | |||
| directe meting | ||||
| Geautomatiseerde beeldvorming van multiwell-plaat formaat |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian. In dit protocol werden drie verschillende methoden voor het meten van celproliferatie in gekweekte cellen onderzocht. Elke methode kon reproduceerbare en nauwkeurige metingen van celproliferatie dan 96 uur en de resultaten waren vergelijkbaar tussen elk van de geteste methoden (figuur 2 en 3). Zowel de luminescentie-gebaseerde test en cell imaging methode produceerde de meest robuuste resultaten tonen lineaire toename in celproliferatie na 96 uur (figuur 2b, c). Bovendien cell imaging tijd afgebeeld geen significant verschil in groei tussen de getransduceerde en niet-getransduceerde cellijnen (Figuur 4). Er zijn vele voordelen en nadelen van elke methode in dit protocol onderzocht, zie Tabel 5 voor een overzicht. De conventionele cel telmethode met behulp van een hemocytometer is een goedkope methode die heel weinig extra reagentia of effo vereistrt voor te bereiden en uit te voeren. Bovendien is deze methode kwantificeert absolute aantal cellen in cellen / ml 14. Er zijn echter ernstige nadelen die tijdrovende aard van de celtelling, hoge foutenpercentages die resulteert in grote standaardafwijkingen tussen telt, en dat een hoog bereik van celaantallen nodig voor nauwkeurige celtellingen omvatten. Dit is te zien in figuur 2a, waarbij celtellingen met de hemocytometer vertoonde verschillende resultaten bij lage celdichtheden en grote standaardafwijkingen op latere tijdstippen. Deze nadelen maken deze methode bruikbaar is voor cel tellen van kleine steekproeven, en onvoldoende voor een grotere high throughput metingen waarbij kleinere plaat maten en seeding dichtheden nodig zijn. Deze beperkingen kunnen worden indien de celdichtheid werd verhoogd, zodat het minimale aantal getelde cellen begon een drempel groter dan 100 cellen. Hoe meer verdund de celsuspensie, of verlaag de cel density, hoe groter de kans tellen minder dan 100 cellen en dus het verhogen van de variabiliteit tussen 15 repliceert. Echter, deze methode is niet geschikt voor een plaat 96, door de lage celoppervlak, en dus onvoldoende aantal cellen die kunnen worden gebruikt in de analyse. Dit wijst op het ontbreken van een high throughput mogelijkheden van deze methode en een duidelijk nadeel voor gebruikers die deze mogelijkheid nodig hebben. De luminescentie-gebaseerde test bepaalt cellevensvatbaarheid door meting van de hoeveelheid ATP, wat een maat is voor de aanwezigheid van metabolisch actieve cellen 16. Deze test is ontworpen voor hoge doorvoer screening van meerdere monsters in een 96 well plaat formaat om celproliferatie te bepalen. Deze eenvoudige methode kwantificeert celproliferatie als relatieve luminescentie-eenheid (RLU) met een plaatlezer, die evenredig is met de ATP in de metabolisch actieve cellen. Echter het grote nadeel van deze werkwijze is te kosten van het reagens en de afhankelijkheid van de meting van de metabole activiteit van de cellen. Verschillende cel kweekomstandigheden, zoals temperatuur of celcyclus tijdstippen gemakkelijk invloed op de hoeveelheid ATP geproduceerd door de cellen, die recht evenredig met de luminescente signaal dat door de test 17. Daarom is het belangrijk om empirisch vast te stellen dat de voorwaarden van het experiment niet interfereren met de metabolische activiteit van de cellen en mogelijk belemmeren relatieve luminescente signaal dat door de cellen. De derde methode onderzocht voor het bepalen van celproliferatie een levende cel imager en software om een relatieve celgetal voeren. De cel imager heeft hoge doorstroom hebben als het kan worden geautomatiseerd om meerdere beelden per put vastleggen, in real-time met temperatuurregeling, met dezelfde cellen over de duur van de test. Zoals getoond in figuur 4, kan worden celproliferatie monitored in dezelfde plaat over een tijdsverloop, waarvoor aanvullende informatie over de celpopulatie met celtelling resultaten kunnen leiden. Dit is zeer voordelig aangezien op deze wijze dwarsplaat variabiliteit en cel zaaien fout, die gemeengoed in 96 well plaat formaat. De software die bij de cel imager maakt de kwantificering van het bloedbeeld behulp van de parameters aangegeven in tabel 2 en 3. Het is daarom nuttig in een high-throughput instelling en kan gemakkelijk worden gemultiplexeerd met andere assays cellulaire functies zoals apoptose of cytotoxiciteit te meten. Een belangrijk nadeel van het systeem is de software, die beperkt in zijn vermogen om voorwerpen raken splitsen. Hoewel deze functie uitvoeren lagere confluentie cellen is een belangrijke beperking van de assay en dat bijgevolg celtype-specifiek optimalisatie. Ook, terwijl de afzonderlijke experimenten met behulp van een imager zijn zeer lage kosten op een bord-op-plaat schaal, deze methode zou doen oply worden kosteneffectief als het instrument al is ingesteld in een laboratorium. Derhalve verschaft dit een nieuwe werkwijze voor het meten van celproliferatie of gekweekte cellen, en heeft het grote voordeel dat geen extra reagentia, en kan 96 putjes geautomatiseerde telling, waardoor deze werkwijze geschikt is voor high-throughput analyse. Dit is een aanzienlijke verbetering ten opzichte van de conventionele methode hemocytometer celtelling en is een meer kosteneffectieve optie om de luminescentie-gebaseerde test. De kritische stap bij het gebruik van de cel imager is bij de analyse van de opgenomen beelden en de daaropvolgende celgetal per beeld. Deze beelden kunnen worden bewerkt op een aantal cell imaging platforms. Het is daarom cruciaal om de meest geschikte software voor het celtype onderzochte bepalen. Het zou nuttig zijn om de cel-tellingen van het overgenomen door de cel imager met behulp van verschillende imaging software-images te valideren zijn. Dit protocol kan worden toegepast op eeny gekweekte cellen, maar de analyse parameters moet worden gedefinieerd voor elke cellijn. Dit kan tijdrovend zijn op het eerste, maar zodra de parameters zijn ingesteld, kan de werkwijze worden geautomatiseerd om het hele platen tegelijk. Het is belangrijk op te merken dat deze testen in feite een indirecte maat voor proliferatie en mocht meten celaantal (hemocytometer cel imager) of metabole activiteit (-luminescentie gebaseerde test), gedurende een tijdsperiode. Deze methoden kunnen eenvoudig worden gewijzigd om andere belangrijke factoren die van invloed kunnen proliferatie meten. Bijvoorbeeld, de trypan blauw exclusie werkwijze kan gemakkelijk worden in ofwel de hemocytometer of cel imager werkwijze toegevoegd om dode cellen uit te sluiten en daardoor cellevensvatbaarheid 13 bepalen. De luminescentie-gebaseerde test kan worden gemultiplext met een cytotoxiciteit assay om extra informatie over celgezondheid verschaffen en de metabolische activiteit gemeten tijdens deze test is een meting van cel viabiliteit 12. Daarom is de flexibiliteit van deze assays worden gemultiplexeerd met andere testen extra cellulaire informatie is een sterk voordeel van elk van deze methoden. Dit protocol gebruikt de humane borstkanker cellijn MCF-7 die stabiel zijn getransduceerd met de LEGO-IG2-puro + vector die het GFP-gen. Dit maakt het gebruik van het optische filter voor GFP beeld de cellen, zonder de noodzaak om elke kleurstof agentia toe te voegen aan het kweekmedium. Deze werkwijze kan gemakkelijk het GFP-negatieve cellen of primaire cellijnen worden gemodificeerd, door beeldvorming van de cellen met de lichte optiek veldtype of door het merken van de cellen met een proliferatie merker. De vergelijking van deze protocolmethoden robuust genoeg om gebruikt te worden in een groot aantal verschillende cellijnen, maar de optimale protocol instellingen voor elke afzonderlijke cellijn moet eerst worden vastgesteld. Beeldvorming van cellen met behulp van de heldere veld kanaal vertegenwoordigt de beste optie voor de primaire cells of die langzaam groeiend zijn door de lange duur van deze methode. Eindpunt assays, zoals een op luminescentie gebaseerde test, zijn niet goed geschikt voor de analyse van de lange termijn celgroei. Dit protocol is beschreven drie methoden voor het meten van celproliferatie in vitro. Elke methode kan routinematig worden uitgevoerd in het laboratorium om celgroei te meten, en de meeste laboratoria niet de nodige vaardigheden om een van deze methoden uit te voeren. Er zijn echter ook een aantal andere testen beschikbaar voor het meten van delende cellen. Deze kunnen omvatten werkwijzen die DNA-synthese, metabolische activiteit te meten, geassocieerde antigenen van proliferatie of ATP concentratie 9. Bijvoorbeeld zijn een aantal assays ontwikkeld om de snelheid van DNA-synthese van cellen te meten door het merken van cellen met een radioactieve stof, zoals 3H-thymidine. Een nadeel van deze methode is het duidelijk gebruik van radioactieve stoffen en hun verwijdering. anderswerkwijzen die routinematig worden gebruikt voor het meten van celproliferatie omvatten het gebruik van BrdU labeling van nieuw gevormde DNA kan worden gemeten met flowcytometrie 18. Kan flowcytometrie worden gebruikt om zowel het aantal cellen als celcyclus analyseren. Dit kan een gunstige uitkomst voor bepaalde experimenten, maar de nadelen van deze werkwijze omvatten de extra tijd en stappen dure reagentia en verhoogde gebruiker getraind vaardigheden om de flowcytometer beheren en om de resulterende gegevens 18 geanalyseerd. Daarom zijn er vele verschillende assays beschikbaar voor wetenschappers om de groei van cellen te evalueren, en de gekozen methode grotendeels afhankelijk van het gebruikte celtype, de gebruiker en hun niveau en het type gegevens vereist op het eindpunt van het experiment. Concluderend, zijn drie verschillende methoden voor het meten van celproliferatie vergeleken met behulp borstkankercellen. Elke methode heeft vele voordelen en disadvantages en derhalve gebruikersafhankelijke en op basis van de vereisten voor elk experiment, wat betreft het aanwijzen van de assay celtellingen uit te voeren. Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian. De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen. Discussion
Disclosures
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium, no phenol-red | ThermoFisher Scientific | 21063-045 | Supplemented with 10% FBS, 200 mM L-glutamine, 2 µg/ml insulin and 1 µg/ml puromycin |
| L-glutamine solution (100x) | ThermoFisher Scientific | 25030-081 | |
| Insulin solution human | Sigma-Aldrich | I9278-5ML | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Bovogen Biologicals | SFBS-F-500ml | |
| Puromycin dihydrochloride | Sigma-Aldrich | P9620-10ML | |
| 0.5% trypsin-EDTA solution (10x) | ThermoFisher Scientific | 15400-054 | Dilute to 2x in DPBS |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) (1x) | ThermoFisher Scientific | 30028-02 | |
| Tissue culture flask, 75 cm2 growth area | Greiner Bio-One | 658175 | |
| Scepter 2.0 Cell Counter | Merck Millipore | Automated cell counter | |
| 96 well multiwell plate, flat bottom | Nunc | 167008 | |
| Improved Neubauer Hemocytometer | BOECO Germany | BOE 01 | |
| Olympus IX51 inverted microscope | Olympus | IX51 | |
| CellTiter-Glo 2.0 Assay | Promega | G9242 | Luminescence-based assay |
| Cytation 3 Cell Imaging Multi-Mode Reader | BioTek | Plate reader for luminescence, fluorescence and brightfield cell imaging | |
| Gen5 Data Analysis Software | BioTek | GEN5 |
References
- Lane, D. P. Cancer. p53, guardian of the genome. Nature. 358 (6381), 15-16 (1992).
- Olivier, M., Hollstein, M., Hainaut, P. TP53 mutations in human cancers: origins, consequences, and clinical use. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (1), a001008 (2010).
- Olivier, M., et al. The clinical value of somatic TP53 gene mutations in 1,794 patients with breast cancer. Clin Cancer Res. 12 (4), 1157-1167 (2006).
- Bourdon, J. C., et al. p53 isoforms can regulate p53 transcriptional activity. Genes Dev. 19 (18), 2122-2137 (2005).
- Avery-Kiejda, K. A., et al. Small molecular weight variants of p53 are expressed in human melanoma cells and are induced by the DNA-damaging agent cisplatin. Clin Cancer Res. 14 (6), 1659-1668 (2008).
- Avery-Kiejda, K. A., Morten, B., Wong-Brown, M. W., Mathe, A., Scott, R. J. The relative mRNA expression of p53 isoforms in breast cancer is associated with clinical features and outcome. Carcinogenesis. 35 (3), 586-596 (2014).
- Weber, K., Bartsch, U., Stocking, C., Fehse, B. A multicolor panel of novel lentiviral "gene ontology" (LeGO) vectors for functional gene analysis. Mol Ther. 16 (4), 698-706 (2008).
- Riss, T. L., Moravec, R. A. Cell Biology. Celis, J. E. , Third Edition, Academic Press. 25-31 (2006).
- Ng, K. W., Leong, D. T., Hutmacher, D. W. The challenge to measure cell proliferation in two and three dimensions. Tissue Eng. 11 (1-2), 182-191 (2005).
- Riss, T. L., Moravec, R. A. Use of multiple assay endpoints to investigate the effects of incubation time, dose of toxin, and plating density in cell-based cytotoxicity assays. Assay Drug Dev Technol. 2 (1), 51-62 (2004).
- Butzler, M., Worzella, T., Hungriano, M., Osorio, F., Hanegraaff, I., Cowan, C. Automated cytotoxicity profiling using the CyBi-FeliX instrument, cell health assays and thaw-and-use cells. , http://au.promega.com/resources/pubhub/automated-profiling-using-the-cybi-felix-instrument-cell-health-assays-and-thaw-and-use-cells (2014).
- CellTiter-Glo 2.0 Assay Technical Manual #403. , http://www.promega.com/~/media/files/resources/protocols/technical%20manuals/101/celltiterglo%202%200%20assay%20protocol.pdf (2015).
- Banks, P., Brescia, P. J. Application Guide: Automated Digital Microscopy. , http://www.biotek.com/resources/articles/automated-digital-microscopy.html (2015).
- Bastidas, O. Cell Counting with Neubauer Chamber: Basic Hemocytometer Usage. , http://www.celeromics.com/en/resources/Technical%20Notes/cell-article-chamber.php (2016).
- Bastidas, O. Technical Note: Cell Count for Low Concentration Samples . , http://www.celeromics.com/en/resources/docs/Articles/Low-concentration-cell-counting.pdf (2012).
- Riss, T. L., Moravec, R., Niles, A. L., et al. Cell Viability Assays. Assay Guidance Manual[Internet]. Sittampalam, G. S., Coussens, N. P., Nelson, H., et al. , (2013 May 1 [Updated 2015 Jun 29]) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK144065/ (2013).
- Quent, V. M., Loessner, D., Friis, T., Reichert, J. C., Hutmacher, D. W. Discrepancies between metabolic activity and DNA content as tool to assess cell proliferation in cancer research. J Cell Mol Med. 14 (4), 1003-1013 (2010).
- Crane, J., Mittar, D., Soni, D., McIntyre, C. Cell Cycle Analysis Using the BD BrdU FITC Assay on the BD FACSVerse System. , (2013 May 1 [Updated 2015 Jun 29]) https://www.bdbiosciences.com/documents/BD_FACSVerse_CellCycleAnalysis_AppNote.pdf 1-12 (2011).
Tags
Biologie kanker Moleculaire biologie cel proliferatie borstkanker cell imaging kanker biologie cel tellen View Video
Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.
