Introduction
Le gène suppresseur de tumeur, p53, est un régulateur essentiel d'un certain nombre de processus cellulaires, y compris l' arrêt du cycle cellulaire, l' apoptose et la sénescence 1. Il est responsable du maintien de la stabilité génomique et il est donc essentiel pour le maintien de l'équilibre de la mort cellulaire et la croissance cellulaire. Des mutations dans p53 sont fréquents dans le cancer et sont la principale cause de l' inactivation de p53 menant au cancer de la prolifération cellulaire incontrôlée 2. Fait intéressant, les mutations dans p53 ne comptent pour environ 25% des cancers du sein 3, ce qui suggère que d' autres mécanismes sont responsables de la perte de fonction de p53. Les isoformes de p53 récemment découverts ont été révélés être surexprimé dans un certain nombre de cancers humains, et peuvent moduler la fonction de p53 4,5. Nous avons précédemment montré que l'isoforme de p53, Δ40p53, est l'isoforme la plus fortement exprimée dans le cancer du sein, et il est fortement régulée positivement dans les cellules du cancer du sein, par rapport à la normale adjacente tissue 6. Après cela, nous transduites de manière stable la lignée cellulaire de cancer du sein humain MCF-7 à surexprimer Δ40p53 utilisant le lego-IG2-puro + vecteur (GFP +) 7. Ces cellules ont été utilisées pour étudier si l'expression élevée Δ40p53 augmente le taux de prolifération cellulaire dans les cellules cancéreuses du sein.
Il existe de nombreuses méthodes directes et indirectes de la mesure de la prolifération cellulaire des cellules cultivées in vitro 8,9. Ceux - ci peuvent être effectuées soit en tant que mesures continues dans le temps, ou des essais comme point final 10. les méthodes classiques sont encore utiles, telles que le comptage des cellules en utilisant un hémocytomètre. Cet essai est un faible coût et de la mesure directe du nombre de cellules, mais il ne repose sur de grands nombre de cellules et la formation hautement qualifiée pour minimiser les erreurs et un grand écart par rapport aux standards chiffres. La nécessité d'effectuer des mesures compatibles avec les formats à haut débit a conduit au développement d'essais multipuits-plaque. Ces analyses basées sur la luminescence mesure le nombre de cellules en fonction d'un signal luminescent proportionnel à l'activité métabolique de la cellule 11,12. Plus récemment, l'introduction de la haute teneur des plates - formes d'imagerie a permis de nouveaux outils qui contrôlent la prolifération cellulaire tout en fournissant la collecte quantitative et qualitative des données phénotypiques, et comprend une variété de systèmes 13. Toutes ces méthodes fournissent des pistes pour mesurer la croissance des cellules, soit par mesure ou finaux des essais continus, et possèdent chacun une gamme d'avantages et des inconvénients en ce qui concerne la sensibilité, le débit des numéros d'échantillons, et des informations de cellules, qui peuvent tous être pesé en conséquence en fonction sur la question de la recherche.
Ce protocole décrit trois méthodes différentes pour mesurer la prolifération cellulaire in vitro, avec chaque procédé utilisant des gammes différentes de sensibilité, la reproductibilité et les formats de plaque multi-puits. Ce protocole visait à comparer l'utilisation d'un hémocytomètre comptage chambre, un dosage à base luminescence viabilité cellulaire et d'imagerie cellulaire, dans la mesure de la prolifération cellulaire pendant un décours temporel de 96 heures. Pour ce faire, la croissance des cellules vecteur-transduction (MCF-7-lego) a été comparé à des cellules transduites pour surexprimer Δ40p53 (MCF-7-Δ40p53), en utilisant trois densités cellulaires différentes. La prolifération cellulaire a été mesurée toutes les 24 heures jusqu'à 96 heures. Chaque méthode a été constaté que ses propres avantages et inconvénients, et en fonction du but de l'expérience, chacun est encore une méthode utile pour fournir des informations sur le taux de prolifération.
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Protocol
1. Les cellules Préparation pour la prolifération Assays
Note: Préparer les deux lignées cellulaires de la même manière et de la graine dans le même format pour chaque méthode à analyser.
- Cultivez MCF-7-lego et MCF-7-Δ40p53 7 cellules à 75-80% de confluence dans T 75 cm 2 flacons de culture tissulaire en utilisant du phénol rouge libre milieu Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) additionné de 10% de sérum de veau fœtal (FBS) , 200 mM de L-glutamine, 2 pg / ml d' insuline et 1 pg / ml de puromycine à 37 ° C avec 5% de CO 2. Manipuler les cellules dans une biosécurité stérile classe armoire II.
Remarque: La quantité de temps qu'il faut pour faire croître les cellules jusqu'à la confluence varie en fonction de la dilution de l'ensemencement. En préparation pour le plaquage des cellules pour les analyses de prolifération, ensemencer les cellules à une dilution de 1: 3 dans du DMEM supplémenté et maintenir dans des conditions normales de croissance pendant 3 jours jusqu'à ce que 75-80% de confluence. - Pour éliminer les cellules du flacon, verser les médias enun conteneur de déchets. Laver immédiatement la couche de cellules avec 2 ml de trypsine 2x préchauffé. Aspirer trypsine. Ajouter encore 2 ml de trypsine préchauffée à la couche de cellules et les placer dans un incubateur pendant 5 min à 37 ° C avec 5% de CO 2.
- Une fois que les cellules se détachent, laver les cellules avec 10 ml réchauffé frais complété DMEM. Transférer la suspension cellulaire à un tube stérile de 15 ml et centrifuger à 491 g pendant 5 min à température ambiante. Aspirer soigneusement et jeter le surnageant.
- Remettre en suspension le culot cellulaire dans 5 ml de DMEM frais complété. Effectuer une numération cellulaire pour déterminer la densité correcte pour ensemencer les cellules dans des plaques à 96 puits.
- Diluer 100 ul de la suspension de cellules dans 900 ul de solution saline tamponnée phosphate 1x Dulbecco (DPBS). Placez un nouveau capteur de 60 um sur le compteur de cellules automatisé. Maintenez le piston et immerger le capteur dans la suspension cellulaire diluée. Relâchez doucement le piston sur le compteur de cellules. Retirer le capteur du cou cellulairenter une fois rempli.
Note: Le nombre de cellules sera affiché sur le compteur de cellules en cellules / ml.
- Diluer 100 ul de la suspension de cellules dans 900 ul de solution saline tamponnée phosphate 1x Dulbecco (DPBS). Placez un nouveau capteur de 60 um sur le compteur de cellules automatisé. Maintenez le piston et immerger le capteur dans la suspension cellulaire diluée. Relâchez doucement le piston sur le compteur de cellules. Retirer le capteur du cou cellulairenter une fois rempli.
- Cellules de semences à un volume final de 100 pi (en DMEM) dans une plaque à 96 puits à ~ 20% de confluence pour laisser place à la croissance cellulaire et la mesure de la prolifération sur 3-5 jours (voir le tableau 1). Graine toutes les lignées cellulaires en triple exemplaire.
Remarque: Pour cette expérience, trois densités cellulaires différentes ont été évaluées pour déterminer la densité cellulaire optimale. Les nombres de cellules nécessaires sont résumés dans le tableau 1. Cellules de semences à une densité plus faible si la mesure de plus de croissance à long terme est nécessaire.- Pour l'hémocytomètre et des analyses basées sur la luminescence, préparer une plaque par point de temps (4 plaques par essai). Pour le dosage d'imagerie cellulaire, préparer une seule plaque pendant toute la durée de l'expérience.
- Maintenir les cellules à 37 ° C avec 5% de CO2 pendant 24 heures.
2. Cellule Détermination Count Using un hémocytomètre
- Préchauffer les deux moyennes et de la trypsine à 37 ° C dans un incubateur de culture cellulaire, d'un four ou un bain d'eau. Aspirer le milieu de cellules dans un conteneur à déchets, laver une fois avec 30 pl de 2x trypsine, et aspirer la trypsine.
- Laver les cellules à nouveau avec 30 pi de 2x trypsine, et on incube pendant 5 minutes à 37 ° C. Tapoter doucement bord de la plaque pour déloger les cellules de la plaque. Ajouter 50 pi de DMEM supplémenté et mélanger les cellules par pipetage jusqu'à ce que les cellules forment une suspension cellulaire unique.
- Préparer hémocytomètre par la surface et le couvercle en verre de nettoyage avec 70% d'éthanol.
- Placez le verre lamelle sur les chambres de comptage et apposer jusqu'à ce que 'réfraction anneaux de Newton »peut être vu entre les bords lamelle et l'hémocytomètre.
Note: Ceux-ci indiquent que la lamelle a correctement adhéré à l'hémocytomètre. - pipette doucement 20 pi de suspension cellulaire sous la lamelle, le remplissage de la chambre de comptage par le mouvement capillaire.Placez hémocytomètre sous un grossissement de 10x d'un microscope et de visualiser les chambres de comptage dans la mise en page de la grille.
- Nombre de cellules dans les 4 carrés externes de la configuration de la grille. Pour améliorer la précision, le nombre de répétitions de carrés extérieurs supplémentaires si nécessaire, ou jusqu'à ce que le nombre a atteint 70 - 100 cellules 14,15.
- Calculer la concentration de cellules par ml comme suit: nombre moyen de cellules par facteur carré x de dilution (si elle est utilisée) x 10 4
- Répétez les étapes 2,1-2,8 toutes les 24 heures pendant 96 heures après l'ensemencement.
3. Détermination de la prolifération des cellules en utilisant un dosage à base de Luminescence-
Note: Ceci est une mesure de point de terminaison. Une fois que le réactif est ajouté aux cellules, la plaque ne peut être quantifié d'une fois.
- réactif de luminescence Thaw dans un bain d'eau à 22 ° C pendant 30 min.
- Mélanger délicatement réactif en inversant la bouteille pour obtenir un mélange homogène.
- Equilibrer une plaque de cellules ensemencées (de l'étape1,5) à température ambiante pendant 30 min.
- Ajouter 100 ul de réactif de luminescence dans chaque puits. Mélanger le contenu sur un agitateur orbital pendant 2 min. Laisser la plaque à incuber pendant 10 min à température ambiante.
- Mise en place d'une expérience de luminescence en utilisant le logiciel de lecteur de plaque multi-mode.
- Allumez multi-mode lecteur de plaque et ouvrez le logiciel. Dans le «gestionnaire de tâches», sélectionnez «expériences» et «créer new'.Select 'file' de barre d'outils, et sous« protocole »onglet, sélectionnez« procédure ».
- Sélectionnez 'Grenier 96 fond plat «type de plaque, et cochez la case' utilisation du couvercle. Sélectionnez l'action «lire» sous la case «méthode read '. Sélectionnez la méthode de détection de «luminescence». Cliquez sur 'OK'.
- Dans la zone étape de lecture, sélectionnez les puits à analyser sous l'onglet 'assiette pleine', et sélectionnez puits d'agir comme puits vides.
- Réglez le filtre mis à filtre vide (par exemple, la fiche Em: trou, miroir: none). Réglez le gain sur135, avec un temps d'intégration de 0,5 sec par puits et une hauteur de 6,5 mm lire. Cliquez sur 'OK' pour enregistrer les paramètres pour la lecture de luminescence.
- Exécution d'une luminescentes Lire
- Ejecter support de plaque en sélectionnant l'onglet «contrôle de l'instrument» et cliquez sur «plaque out'.Place plaque de 96 puits sur le support de plaque, assurer le couvercle est en marche. Fermez le support de plaque en cliquant sur 'plaque' onglet sous «contrôle de l'instrument». Cliquez sur 'lire maintenant "de la barre d'outils pour effectuer lecture luminescent.
- Exporter les unité luminescente (ULR) des mesures relatives à chaque puits à une feuille de calcul pour une analyse ultérieure.
- Répétez les étapes 3,1-3,6 pour enregistrer la prolifération toutes les 24 heures jusqu'à 96 heures après l'ensemencement des cellules.
4. Déterminer le comte de cellule en utilisant un imageur portable
- Mettre en place une expérience d'imagerie cellulaire en utilisant le logiciel d'imagerie cellulaire multimode
- Allumez multi-mode imageur cellulaire et e ouvertelogiciels e.
- Dans le «gestionnaire de tâches», sélectionnez l'onglet 'expériences de et «créer new'.On la' 'barre d'outils, cliquez sur' file 'onglet ouvert et« protocole procédure température de consigne' action 'tab.Select'. Set incubateur pour 'on' et régler la température à 37 ° C et vérifier «préchauffage» avant de continuer à l'étape suivante box '. Cliquez sur 'OK' pour enregistrer les paramètres.
- Sélectionnez l'action «lire». Cliquez sur la méthode de détection 'image', sélectionnez 'extrémité / cinétique »lire le type et le type de l'optique" Filtres. Cliquez sur 'OK'.Click sur' onglet pleine plaque »et sélectionner des puits sur la plaque à imager. Cliquez sur 'OK' pour enregistrer les paramètres.
- Sélectionnez l'objectif 2.5X dans la liste déroulante options 'objectifs de. Sous l'onglet 'canaux de sélectionner deux canaux: GFP 469, 525 et Bright Champ. Vérifiez l'exposition 'auto' pour les deux canaux et sélectionnez bien l'auto-exposition.
- Pour déterminer auto les paramètres de mise au point, sélectionnez «auto-focus» et cliquez sur «options». Pour les options d'auto-focus, sélectionnez la méthode «numériser et mise au point automatique. Cliquez sur 'OK' pour enregistrer les paramètres.
- Réglez le décalage horizontal et vertical du centre de bien (um) à 0.Select pour numériser plusieurs images par puits dans un montage 3 x 2, avec un espacement horizontal (um) = 2,881 et de l'espacement vertical (pm) = 2127. Cliquez sur 'OK' pour enregistrer les paramètres de la procédure.
Note: Voir le tableau 2 pour les paramètres de lecture.
- Exécution Lire Expérience sur la planche sélectionnée
- Cliquez sur l'onglet «contrôle de l'instrument» et sélectionnez le function.Place 'assiette sur' plaque de 96 puits dans le support de plaque, assurer le couvercle est en marche. Sous l'onglet «contrôle de l'instrument", sélectionnez la «plaque» fonction. Sélectionnez «lire maintenant» dans l'onglet de la plaque. Répétez lire tous les 24 heures jusqu'à 96 heures après l'ensemencement.
- Analyse du Cell Count Utilisation de laCellule Imager Software.
- Pour analyser une image, cliquez sur l'onglet «données» sur la plaque imagée, 'image [GFP 469, 525 + Fond clair]' select. Double-cliquez sur un bien imagé.
- Cliquez sur une image chargée. Sélectionnez 'analyser' et sélectionner une seule image du montage à analyser. Cliquez sur 'OK'.Check la «GFP» seul canal, et les paramètres fixés comme indiqué dans le tableau 3. Cliquez sur "START" pour appliquer des paramètres aux cellules imagées.
- Observer le masque de comptage de cellules placées sur les cellules imagées, qui est utilisé pour déterminer le nombre de cellules par image. Cliquez sur "appliquer les modifications 'et maintenir ces paramètres pour chaque plaque imagée pendant toute l'expérience.
- Une fois de retour à la plaque imagée, cliquez sur le menu «données» dans le menu déroulant et sélectionnez «nombre de cellules. Ceci générera le nombre total de cellules par puits.
- Exporter toutes les données sur une feuille de calcul en cliquant sur l'onglet «d'exportation» pour une analyse plus approfondie of le nombre de cellules par puits.
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Representative Results
Pour étudier les différentes méthodes de mesure de la prolifération des cellules mises en culture, la prolifération cellulaire des cellules MCF-7-Δ40p53 cellules transduites a été comparée à la MCF-7-lego non transduites lignée cellulaire de cancer du sein. Les trois méthodes qui ont été comparés - la méthode d'imagerie hémocytomètre classique, le dosage de luminescence de la viabilité des cellules et la cellule analyse- sont décrites dans le schéma (Figure 1). Chaque méthode présente des avantages et des inconvénients à mesurer avec précision le comptage des cellules au fil du temps, et la méthode la plus efficace dépend des besoins finaux de l'expérience et les informations qui peuvent être acquis pour une population de cellules.
La croissance des cellules MCF-7-lego et les cellules MCF-7 Δ40p53 ont été mesurées après 24 h pendant 4 jours. Comme on le voit sur la figure 1, les deux lignées cellulaires ont été ensemencées à raison de trois densités cellulaires différentes (1,5 x 10 3 3; 5 x 10 3 cellules / puits) et de la cellule de comptage a été effectué 24, 48, 72 et 96 heures après l' ensemencement. Chacune de ces méthodes a montré une prolifération cellulaire accrue, à l' aide d' un hémocytomètre, un dosage basé sur une luminescence, et un appareil d'imagerie cellulaire (c figures 2a, b, respectivement) au cours de 96 heures. La plus grande augmentation de la prolifération cellulaire a été observée à la plus haute densité de cellules (5 x 10 3 cellules), et a également montré les résultats les plus reproductibles à chaque point de temps, ce qui suggère que ce soit la densité cellulaire optimale pour la mesure de la prolifération de ces cellules. Il n'y avait pas de différence significative dans la prolifération cellulaire entre les lignées cellulaires.
La mesure de la prolifération cellulaire entre les différentes méthodes ont été comparées par une analyse de régression linéaire 6 (Figure 3, Tableau 4). Il y avait une corrélation significative entre chacune des différentes méthodes testées, lorsque l'on compare cell prolifération à toutes les densités cellulaires dans les deux lignées cellulaires (figure 3a et b). La plus forte corrélation a été observée entre la comparaison de l'essai à base de luminescence, et l'appareil d'imagerie cellulaire (R2 = 0,8899, p ≤0.0001; R 2 = 0,9805, p ≤0.0001, la figure 3a et b, respectivement).
Une représentation visuelle de la prolifération cellulaire en utilisant l'imagerie cellulaire est représenté (figure 4). Comme cette méthode utilise des mesures continues d'une seule plaque, les cellules peuvent être imagées toutes les 24 heures jusqu'à ce que les cellules atteignent près de 100% de confluence. Comme le montre la figure 2, les taux des cellules-Δ40p53 MCF-7 MCF-7-lego et de croissance étaient comparables dans tous les points de temps. Cette méthode fournit des informations cellulaires utiles, y compris être en mesure de suivre visuellement la croissance des cellules sur plusieurs jours, et de comparer la taille des cellules et morpho cellulairelogie entre les différentes lignées cellulaires.
Figure 1: Diagramme schématique des trois différentes méthodes de mesure de prolifération cellulaire Des cellules ont été ensemencées à raison de trois densités cellulaires différentes dans de multiples plaques à 96 puits et incubées à 37 ° C avec 5% de CO 2 pendant jusqu'à 96 h.. Chaque 24 heures, la prolifération cellulaire a été mesurée en utilisant soit un hémocytomètre, un essai ou d'une cellule d' imagerie à base de luminescence. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2:. Les mesures de la prolifération des cellules après les chiffres 96 h cellulaires ont été mesurées toutes les 24 heures pendant 96 heures dans les cellules MCF-7-LeGles cellules S et MCF-7-Δ40p53 ensemencées à raison de trois densités cellulaires différentes. Les numérations cellulaires ont été mesurées en utilisant un (a) hémocytomètre dans les cellules / ml, (b) en utilisant un dosage basé sur une luminescence dans les unités luminescentes relatives (ULR) ou (c) une numération cellulaire continue en utilisant un système d' imagerie cellulaire cellules / image. Conditions pour l'imageur cellulaire sont présentés dans le tableau 2. Toutes les expériences représentent la moyenne de trois expériences indépendantes, ± SD S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3:. Comparaison des trois différentes méthodes de mesure de la prolifération cellulaire dans des lignées cellulaires de cancer du sein Une analyse de régression linéaire a été effectuée pour comparer les relations corrélatives entre les différents m ÉTHODES examiné pour mesurer la prolifération cellulaire dans (a) des cellules MCF-7-lego et (b) les cellules MCF-7-Δ40p53. Le coefficient de corrélation de Pearson a été calculé et la signification a été déterminée (p <0,05) entre les différentes méthodes de mesure de la prolifération cellulaire. Tous les résultats représentent la moyenne ± SD de trois expériences indépendantes. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4:. Images de GFP-positives cellules du cancer du sein MCF-7-lego et-Δ40p53 MCF-7 images représentatives de cellules de 5 x 10 3 cellules ensemencées capturées à l' aide d' un imageur de cellules toutes les 24 h. La barre d'échelle représente 1000 um. Paramètres pour l'imagerie cellulaire sont résumés dans le tableau 2. href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/54350/54350fig4large.jpg" target = "_ blank"> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
| La densité cellulaire (cellules / puits) | |||
| Type de cellule | 1,5 x 10 3 | 3,0 x 10 3 | 5 x 10 3 |
| MCF-7-lego | 76 pl dans 8,4 ml de milieu | 152 pi dans 8,3 ml de milieu | 254 pl dans 8,2 ml de milieu |
| MCF-7-Δ40p53 | 93 pl dans 8,4 ml de milieu | 185 pi dans 8,3 ml de milieu | 308 pl dans 8,2 ml de milieu |
Tableau 1: Ensemencement cellulaires volumes pour plaques à 96 puits.
"Fo: keep-with-next.within page =" always ">Tableau 2: lire les paramètres pour imagerie cellulaire utilisant l'imageur portable.
| Les paramètres d'imagerie | ||||
| Seuil | 5000 | |||
| la taille minimale de l'objet (um) | 30 | |||
| taille de l'objet Maximum (pm) | 300 | |||
| MCF-7-lego | ||
| R Carré | p-valeur | |
| Hémocytomètre vs dosage à base luminescence | 0,6301 | 0,0021 |
| Cellule imageur vs. hémocytomètre | 0,7524 | 0,0003 |
| Analyse basée sur la luminescence par rapport à l' imageur cellulaire | 0,8899 | <0.0001 |
| MCF-7-Δ40p53 | ||
| R Carré | p-valeur | |
| Hémocytomètre vs. louanalyse basée sur minescence- | 0,8983 | <0.0001 |
| Cellule imageur vs. hémocytomètre | 0,9303 | <0.0001 |
| Analyse basée sur la luminescence par rapport à l' imageur cellulaire | 0,9805 | <0.0001 |
Tableau 4: Analyse de régression linéaire des trois différentes méthodes de prolifération testés.
| méthode | Avantages | Désavantages | notes techniques | Produit final |
| hémocytomètre | À bas prix | Haute erreur humaine | Pipeter plusieurs fois pour préparer une suspension cellulaire unique | Cellules / ml |
| Nécessite un minimum d'équipement | Nécessite une suspension à cellule unique | Effectuer plusieurs chefs d'accusation pour obtenir une précision | ||
| numération cellulaire directe | Le nombre élevé de cellules nécessaires pour une évaluation précise du nombre de cellules | |||
| Endpoint | ||||
| Analyse basée sur la luminescence | Utilisez des formats multipuits-plaque | réactifs coûteux | Protéger de la lumière | Luminescent relative Unités (ULR) / puits |
| Facile à réaliser | Nécessite lecteur de plaque luminescente | Inclure les puits de contrôle pour déterminer la luminescence de fond | ||
| test rapide | Sensible à la température | |||
| Fournit des informations sur la viabilité des cellules | Variables en fonction de l'activité métabolique des cellules | |||
| mesure indirecte | ||||
| Endpoint | ||||
| cellule imageur | mesure en continu | imageur cher | S'assurer d'imagerie cellulaire est réglée à 37 ° C, | Cellules / image |
| Contrôle de la température | Skill intensive | Eviter une agitation inutile ou la perturbation des cellules | ||
| Fournit des informations cellulaires | Variables en fonction de la confluence des cellules | |||
| Coût-efficacité (si vous avez l'imageur) | nombre relatif | |||
| La mesure directe | ||||
| imagerie automatisée format multipuits-plaque |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian. Dans ce protocole trois méthodes différentes pour mesurer la prolifération cellulaire dans les cellules cultivées ont été examinées. Chaque procédé est capable de mesures reproductibles et précis de la prolifération cellulaire pendant 96 heures, et les résultats étaient comparables entre chacune des méthodes testées (figure 2 et 3). À la fois le dosage à base de luminescence et un procédé d'imagerie de cellules ont produit des résultats les plus robustes, montrant une augmentation linéaire de la prolifération cellulaire après 96 h (figure 2b, c). En outre, l' imagerie cellulaire au fil du temps représenté aucune différence significative dans les taux de croissance entre les lignées de cellules transduites et non transduites (figure 4). Il existe de nombreux avantages et des inconvénients pour chaque méthode examinée dans ce protocole, voir le tableau 5 pour un résumé. La méthode de comptage cellulaire classique en utilisant un hémocytomètre est une méthode peu coûteuse qui nécessite très peu de réactifs ou effo supplémentairesrt pour préparer et exécuter. En outre, ce procédé quantifie un nombre absolu de cellules dans les cellules / ml 14. Cependant, il existe de sérieux inconvénients, qui comprennent le temps nature du comptage des cellules, les taux d'erreur élevés qui se traduit par de grandes déviations standard entre les chiffres, et le fait qu'une grande gamme de nombres de cellules sont nécessaires pour la numération des cellules précises. Ceci peut être vu sur la figure 2a, lorsque le comptage des cellules en utilisant l'hémocytomètre a montré des résultats variables au niveau des densités cellulaires faibles et les écarts-types aux points temporels ultérieurs. Ces inconvénients rendent cette méthode utile pour le comptage des cellules de petite taille des échantillons, et insuffisante pour les grandes mesures à haut débit où les petites tailles de plaques et les densités de semis sont nécessaires. Ces limitations peuvent être atténuées si la densité des cellules a été augmentée, de sorte que le nombre minimal de cellules comptées a commencé à un seuil supérieur à 100 cellules. Plus dilué la suspension cellulaire, ou abaisser la cellule densité, la plus grande chance de compter moins de 100 cellules et donc l' augmentation de la variabilité entre les réplicats 15. Cependant, cette méthode ne convient pas pour une plaque à 96 puits, du fait de la faible surface cellulaire et, par conséquent, le nombre insuffisant de cellules qui peuvent être utilisées dans l'analyse. Cela met en évidence le manque de capacités de débit élevé de cette méthode et un désavantage évident pour les utilisateurs qui ont besoin de cette capacité. Le dosage à base de luminescence détermine la viabilité des cellules en mesurant la quantité d'ATP, qui est une mesure de la présence de cellules métaboliquement actives 16. Cet essai est conçu pour le criblage à haut débit d'échantillons multiples dans un format de plaque à 96 puits pour déterminer la prolifération cellulaire. Cette méthode simple quantifie la prolifération cellulaire comme une unité de luminescence relatives (RLU) en utilisant un lecteur de plaque, qui est proportionnelle à l'ATP présent dans les cellules métaboliquement actives. Cependant, le principal inconvénient de cette méthode est le te coût du réactif et la dépendance de la mesure de l'activité métabolique des cellules. Diverses conditions de culture cellulaire, tels que les points temporels de la température ou du cycle cellulaire, peuvent facilement affecter la quantité d'ATP produite par les cellules, qui est directement proportionnelle au signal luminescent généré par l'essai 17. Par conséquent, il est important de déterminer de manière empirique que les conditions de l'expérience ne pas interférer avec l'activité métabolique des cellules et peut entraver le signal luminescent par rapport produit par les cellules. La troisième méthode examinée pour déterminer la prolifération cellulaire est un système d'imagerie des cellules vivantes et des logiciels pour effectuer un comptage cellulaire relative. Appareil d'imagerie cellulaire a des capacités à haut débit car il peut être automatisé pour capturer plusieurs images pour chaque puits, en temps réel, ainsi que le contrôle de la température, en utilisant les mêmes cellules pendant toute la durée de l'essai. Comme on le voit sur la figure 4, la prolifération cellulaire peut être monitored dans la même plaque sur un décours temporel, qui peut fournir d'autres informations sur la population de cellules avec une analyse de numération cellulaire. Ceci est très avantageux car il élimine la variabilité inter-plaque et cellulaire erreur ensemencement, qui est courante dans 96 formats de plaques ainsi. Le logiciel associé à l'imagerie cellulaire permet la quantification du nombre de cellules en utilisant les paramètres indiqués dans le tableau 2 et 3. Il est donc utile dans un environnement à haut débit et peut facilement être multiplexé à d'autres dosages pour mesurer les fonctions cellulaires telles que l'apoptose ou la cytotoxicité. Un inconvénient majeur du système est le logiciel, qui est limitée dans sa capacité à séparer les objets touchants. Alors qu'il peut remplir cette fonction dans les cellules confluence inférieurs, il constitue une limitation majeure de l'analyse et nécessite donc une optimisation spécifique au type de cellule. En outre, alors que les expériences individuelles en utilisant un imageur sont très bas coût sur une échelle plaque par plaque, cette méthode serait surly être rentable si l'instrument est déjà mis en place dans un laboratoire. Par conséquent, cette offre une nouvelle méthode de mesure de la prolifération cellulaire des cellules cultivées, et a le grand avantage de ne nécessiter aucun réactif supplémentaire, et est capable de plaque à 96 puits comptage automatisé, ce qui rend cette méthode appropriée pour l'analyse à haut débit. Ceci est une amélioration significative par rapport à la méthode de comptage de cellules hémocytomètre classique, et représente un coût solution plus efficace pour le dosage basé sur une luminescence. L'étape critique pour l'utilisation de l'imagerie cellulaire est lors de l'analyse des images capturées et la numération cellulaire subséquente par image. Ces images peuvent être traitées en utilisant un certain nombre de plates-formes d'imagerie cellulaire. Il est donc primordial de déterminer le logiciel le plus approprié pour le type de cellule sous enquête. Il serait utile de valider les comptages de cellules à partir des images acquises par la caméra de cellules en utilisant un logiciel d'imagerie différents. Ce protocole peut être appliqué à undes cellules en culture y, cependant, les paramètres d'analyse devraient être définies pour chaque lignée cellulaire. Cela peut prendre beaucoup de temps au début, mais une fois que les paramètres ont été définis, la méthode peut être automatisée à l'image des plaques entières à la fois. Il est important de noter que ces tests sont, en fait, une mesure indirecte de la prolifération, ils mesurent le nombre de cellules (hémocytomètre, imagerie cellulaire), ou de l'activité métabolique (analyse basée sur la luminescence), au cours d'une période de temps. Ces méthodes peuvent être facilement modifiées pour mesurer d'autres facteurs importants qui peuvent influer sur la prolifération. Par exemple, la méthode d'exclusion au bleu trypan peut facilement être incorporé soit dans le mode de hémocytomètre ou d' imagerie des cellules pour exclure les cellules mortes et par conséquent déterminer la viabilité des cellules 13. L'essai à base de luminescence peut être multiplexé avec un test de cytotoxicité pour fournir des informations supplémentaires sur la santé cellulaire, et l'activité métabolique mesurée au cours de cet essai est une mesure de la cellule viabilité 12. Par conséquent, la souplesse de ces essais devant être multiplexé avec d'autres dosages cellulaires pour fournir des informations supplémentaires sont un avantage de chacune de ces méthodes. Ce protocole utilisé la lignée cellulaire de cancer du sein humain MCF-7 qui ont été transduites de manière stable avec le lego-IG2-puro + vecteur contenant le gène de la GFP. Ceci permet l'utilisation du filtre optique GFP pour imager les cellules, sans qu'il soit nécessaire d'ajouter des agents colorants dans le milieu de culture. Ce procédé peut être facilement modifié pour imager des cellules GFP-négatives ou des lignées cellulaires primaires même, soit par imagerie des cellules en utilisant le brillant de type optique de champ, ou par marquage des cellules avec un marqueur de prolifération. Les méthodes comparées dans ce protocole sont suffisantes pour être utilisé dans une grande variété de différentes lignées cellulaires robustes, mais les paramètres de protocole optimaux pour chaque lignée de cellules individuelles doivent être déterminées en premier. Imagerie des cellules en utilisant le canal de champ lumineux représente la meilleure option pour CE primairells ou ceux qui sont à croissance lente, en raison de la nature à long terme de cette méthode. Point final des dosages tels que le dosage basé sur une luminescence, ne sont pas bien adaptés à l'analyse de la croissance cellulaire à long terme. Ce protocole a décrit trois méthodes différentes pour mesurer la prolifération cellulaire in vitro. Chaque méthode peut être réalisée en routine dans le laboratoire pour mesurer la croissance cellulaire, et la plupart des laboratoires posséderait les compétences nécessaires pour effectuer l'une de ces méthodes. Cependant, il y a aussi une série d'autres tests disponibles pour mesurer les cellules en division. Ceux - ci peuvent comprendre des méthodes qui mesurent la synthèse de l' ADN, l' activité métabolique, des antigènes associés à la prolifération ou la concentration en ATP 9. Par exemple, un certain nombre d'essais ont été développés pour mesurer le taux de synthèse d'ADN des cellules par marquage des cellules avec une substance radioactive telle que de 3H-thymidine. Un inconvénient de cette méthode est l'utilisation évidente des substances radioactives, et leur élimination. Autredes procédés qui sont couramment utilisés pour mesurer la prolifération des cellules comprennent l'utilisation de marquage BrdU d'ADN nouvellement formé, qui peut être mesurée en utilisant la cytométrie en flux 18. La cytométrie en flux peut être utilisée pour analyser à la fois du nombre de cellules ainsi que des informations sur le cycle cellulaire. Ceci peut être un résultat avantageux pour des expériences particulières, mais les inconvénients de ce procédé comprennent le temps supplémentaire et des étapes, des réactifs coûteux et l' augmentation des capacités formées par l' utilisateur afin de faire fonctionner le cytomètre de flux et d' analyser les données résultantes 18. Par conséquent, il y a beaucoup de tests différents disponibles pour les scientifiques pour évaluer la croissance des cellules, et la méthode choisie dépend en grande partie du type cellulaire utilisé, l'utilisateur et leur niveau de compétence, et le type de données nécessaires à l'extrémité de l'expérience. En conclusion, les trois méthodes différentes pour mesurer la prolifération cellulaire ont été comparées en utilisant des cellules de cancer du sein. Chaque méthode présente de nombreux avantages et disadvantages, et est par conséquent et en fonction de leurs exigences pour chaque expérience dépendant de l'utilisateur, en fonction de la détermination du dosage le plus approprié pour effectuer le comptage des cellules. Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian. Les auteurs déclarent qu'ils ont aucun intérêt financier concurrents. Discussion
Disclosures
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium, no phenol-red | ThermoFisher Scientific | 21063-045 | Supplemented with 10% FBS, 200 mM L-glutamine, 2 µg/ml insulin and 1 µg/ml puromycin |
| L-glutamine solution (100x) | ThermoFisher Scientific | 25030-081 | |
| Insulin solution human | Sigma-Aldrich | I9278-5ML | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Bovogen Biologicals | SFBS-F-500ml | |
| Puromycin dihydrochloride | Sigma-Aldrich | P9620-10ML | |
| 0.5% trypsin-EDTA solution (10x) | ThermoFisher Scientific | 15400-054 | Dilute to 2x in DPBS |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) (1x) | ThermoFisher Scientific | 30028-02 | |
| Tissue culture flask, 75 cm2 growth area | Greiner Bio-One | 658175 | |
| Scepter 2.0 Cell Counter | Merck Millipore | Automated cell counter | |
| 96 well multiwell plate, flat bottom | Nunc | 167008 | |
| Improved Neubauer Hemocytometer | BOECO Germany | BOE 01 | |
| Olympus IX51 inverted microscope | Olympus | IX51 | |
| CellTiter-Glo 2.0 Assay | Promega | G9242 | Luminescence-based assay |
| Cytation 3 Cell Imaging Multi-Mode Reader | BioTek | Plate reader for luminescence, fluorescence and brightfield cell imaging | |
| Gen5 Data Analysis Software | BioTek | GEN5 |
References
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Cancer Biology No. 115 la biologie moléculaire la prolifération cellulaire le cancer du sein d'imagerie cellulaire de la biologie du cancer le comptage des cellules View Video
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