Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Confronto di tre diversi metodi per la determinazione proliferazione cellulare in Breast Cancer linee cellulari

Published: September 3, 2016 doi: 10.3791/54350
Automatic Translation
1,2, 1,2,3, 1,2
1Medical Genetics, Hunter Medical Research Institute, 2Priority Research Centre for Cancer, School of Biomedical Sciences and Pharmacy, Faculty of Health and Medicine, University of Newcastle, 3Pathology North, John Hunter Hospital

Introduction

Il gene soppressore del tumore, p53, è un regolatore essenziale di un certo numero di processi cellulari, tra cui l'arresto del ciclo cellulare, apoptosi e senescenza 1. E 'responsabile del mantenimento della stabilità genomica, ed è quindi fondamentale per mantenere l'equilibrio di morte cellulare e la crescita delle cellule. Le mutazioni nel p53 sono comuni nel cancro e sono la principale causa di p53 l'inattivazione porta al cancro incontrollata proliferazione cellulare 2. È interessante notare che mutazioni in p53 rappresentano solo circa il 25% dei tumori al seno 3, suggerendo che altri meccanismi sono responsabili per la perdita della funzione di p53. Le isoforme p53 recentemente scoperte hanno dimostrato di essere sovraespresso in un certo numero di tumori umani, e possono modulare la funzione p53 4,5. Abbiamo precedentemente dimostrato che l'isoforma p53, Δ40p53, è l'isoforma più altamente espresso nel cancro al seno, ed è significativamente upregulated in cellule del cancro al seno, rispetto al normale tiss adiacenteue 6. A seguito di questo, abbiamo stabilmente trasdotto linea di cellule di cancro al seno umano MCF-7 per iperespressione Δ40p53 con il Lego-IG2-puro + vettore (GFP +) 7. Queste cellule sono stati usati per indagare se elevata espressione Δ40p53 aumenta i tassi di proliferazione cellulare in cellule di cancro al seno.

Ci sono molti metodi diretti e indiretti di misurazione proliferazione cellulare di cellule coltivate in vitro 8,9. Questi possono essere eseguite sia come misurazioni in continuo nel tempo, o saggi come endpoint 10. I metodi convenzionali sono ancora utili, come ad esempio il conteggio delle cellule utilizzando un emocitometro. Questo test è un basso costo e la misura diretta del numero di cellulare, ma non si basano su grandi conta delle cellule e la formazione altamente qualificata per ridurre al minimo errore e di grandi dimensioni standard di scostamenti dalle conta. La necessità di effettuare misurazioni compatibili con formati ad elevata capacità ha portato allo sviluppo di saggi multipozzetto-piastra. Questi test di luminescenza a base di misure il numero di cellule in base a un segnale di luminescenza che è proporzionale all'attività metabolica delle cellule 11,12. Più recentemente, l'introduzione di piattaforme di imaging ad alto contenuto ha consentito di nuovi strumenti che controllano la proliferazione cellulare, fornendo raccolta dati fenotipica quantitativa e qualitativa, e comprende una varietà di sistemi 13. Tutti questi metodi forniscono vie per misurare la crescita delle cellule, mediante saggi di misura o endpoint continue, e ciascuno possiedono una serie di vantaggi e svantaggi per quanto riguarda la sensibilità, throughput numero di campioni, e informazioni di cellule, ciascuno dei quali può essere pesato conseguenza seconda sulla domanda di ricerca.

Questo protocollo descrive tre metodi diversi per misurare la proliferazione cellulare in vitro, con ogni metodo utilizzando diverse gamme di sensibilità, riproducibilità e formati lastra multi-pozzetto. Questo protocollo prova a confrontare l'uso di un cha conteggio emocitometromber, un saggio luminescenza basato vitalità cellulare, e imager cellulare, nella misurazione della proliferazione cellulare su un corso di tempo 96 ore. Per fare questo, la crescita delle cellule trasdotte vettori (MCF-7-Lego) è stato confrontato con cellule trasdotte la sovraespressione Δ40p53 (MCF-7-Δ40p53), utilizzando tre diverse densità di cellule. La proliferazione cellulare è stata misurata ogni 24 ore per un massimo di 96 ore. Ogni metodo ha dimostrato di avere i propri vantaggi e svantaggi, e in funzione dello scopo dell'esperimento, ognuno ancora è un metodo utile per fornire informazioni sul tasso di proliferazione.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Le cellule Preparazione per la proliferazione Assays

Nota: Preparare due linee cellulari nello stesso modo e sementi nello stesso formato per ciascun metodo da analizzare.

  1. Grow MCF-7-Lego e MCF-7-Δ40p53 7 celle al 75-80% di confluenza nel T 75 cm 2 di tessuto fiasche di coltura usando fenolo-rosso libero di Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) supplementato con 10% di siero fetale bovino (FBS) , 200 mM L-glutammina, 2 ug / ml di insulina e 1 mg / ml puromicina a 37 ° C con 5% di CO 2. Maneggiare le celle di una sicurezza biologica sterile armadietto di classe II.
    Nota: La quantità di tempo necessario per crescere le cellule a confluenza varia a seconda della diluizione semina. In preparazione per la placcatura le cellule per i saggi di proliferazione, seminare le cellule a una diluizione 1: 3 integrato DMEM e mantenere in condizioni di crescita normali per 3 giorni fino a 75-80% di confluenza.
  2. Per rimuovere le cellule dal pallone, versare fuori i media inun contenitore per rifiuti. Lavare immediatamente lo strato di cellule con 2 ml di tripsina 2x pre-riscaldato. Aspirare tripsina. Aggiungere altri 2 ml di tripsina preriscaldata al livello cellulare e posto in un incubatore per 5 min a 37 ° C con 5% di CO 2.
    1. Una volta che le cellule si staccano, lavare le cellule con 10 ml riscaldato fresco integrati DMEM. Trasferire la sospensione cellulare ad una sterile tubo 15 ml e centrifugare a 491 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. Con attenzione aspirare e smaltire il surnatante.
  3. Risospendere il pellet di cellule in 5 ml di fresco INTEGRAZIONI DMEM. Eseguire un numero di celle per determinare la densità giusta per seminare le cellule in piastre da 96 pozzetti.
    1. Diluire 100 ml di sospensione di cellule in 900 ml di 1x Dulbecco tampone fosfato (DPBS). Posizionare un nuovo sensore 60 micron sul bancone delle cellule automatizzato. Tenere premuto il pistone e immergere il sensore nella sospensione cellulare diluita. Rilasciare lentamente lo stantuffo sul bancone cellulare. Rimuovere il sensore dalla cella di counter una volta completato.
      Nota: Il numero di celle viene visualizzato sul contatore delle cellule in cellule / ml.
  4. Cellule seme in un volume finale di 100 microlitri (in DMEM) in una piastra a 96 pozzetti a ~ 20% di confluenza di consentire camera per la crescita cellulare e la misurazione della proliferazione in 3-5 giorni (vedi Tabella 1). Seed tutte le linee cellulari in triplice copia.
    Nota: Per questo esperimento, tre diverse densità di cellule sono state valutate per determinare la densità cellulare ottimale. I numeri di cellule necessarie sono riassunti nella Tabella 1. Le cellule Seed ad una densità inferiore se è richiesta la misurazione di crescita più lungo termine.
    1. Per l'emocitometro e saggi luminescenza-based, preparare un piatto per ogni punto di tempo (vale a dire 4 piastre per test). Per il saggio imager cellule, solo preparare una piastra per la durata dell'esperimento.
  5. Mantenere le cellule a 37 ° C con 5% di CO 2 per 24 ore.

2. Determinazione conte delle cellule USing un emocitometro

  1. Pre-calda sia medio e tripsina a 37 ° C in un incubatore di coltura cellulare, forno o bagnomaria. supporti Aspirare da cellule in un contenitore per rifiuti, lavare una volta con 30 ml di tripsina 2x, e aspirare la tripsina.
  2. Lavare le cellule di nuovo con 30 ml di tripsina 2x, e incubare per 5 minuti a 37 ° C. Battere delicatamente bordo della piastra per rimuovere le cellule dalla piastra. Aggiungere 50 ml di DMEM integrato e mescolare le cellule pipettando fino a quando le cellule formano una sospensione singola cella.
  3. Preparare emocitometro per metri quadrati e copertura in vetro di pulizia con il 70% di etanolo.
  4. Posizionare il vetro di copertura antiscivolo su camere di conteggio e apporre fino a quando può essere visto 'anelli di rifrazione di Newton' tra i bordi di copertura antiscivolo e l'emocitometro.
    Nota: Queste indicano che la copertura antiscivolo ha correttamente aderito alla emocitometro.
  5. pipetta delicatamente 20 ml di sospensione cellulare sotto la copertura antiscivolo, riempiendo la camera di conteggio dal movimento capillare.Mettere emocitometro a 10 ingrandimenti di un microscopio e visualizzare le camere di conteggio nel layout a griglia.
  6. Contare le celle nelle 4 caselle esterne del layout della griglia. Per migliorare la precisione, ripetere i conteggi delle piazze esterne aggiuntivo, se necessario, o fino a quando il conteggio ha raggiunto 70 - 100 cellule 14,15.
    1. Calcolare la concentrazione delle cellule per ml come segue: numero medio di cellule per il fattore di diluizione quadrato x (se utilizzato) x 10 4
  7. Ripetere i passaggi 2,1-2,8 ogni 24 ore per 96 ore post-semina.

3. Determinare la proliferazione delle cellule usando un test a base di luminescenza

Nota: Questa è una misura endpoint. Una volta che il reagente viene aggiunto alle cellule, la piastra può essere quantificato solo una volta.

  1. Scongelare reagente luminescenza a bagnomaria C 22 ° per 30 min.
  2. Mescolare delicatamente il reagente capovolgendo il flacone per ottenere un impasto omogeneo.
  3. Equilibrare un piatto di cellule seminate (dal punto1.5) a temperatura ambiente per 30 min.
  4. Aggiungere 100 ml di reagente di luminescenza per ogni pozzetto. Mescolare il contenuto su un agitatore orbitale per 2 minuti. Lasciare piastra per incubare per 10 minuti a temperatura ambiente.
  5. Impostazione di un esperimento di luminescenza utilizzando il software lettore di piastre multi-mode.
    1. Accendere lettore di piastre multi-mode e aprire il software. Nel 'task manager', selezionare 'esperimenti' e 'creare new'.Select' file 'dalla barra degli strumenti laterale, e sotto' protocollo 'scheda, selezionare' procedura '.
    2. Seleziona 'Grenier 96 fondo piatto' del tipo a piastre, e selezionare la casella 'uso del coperchio'. Selezionare l'azione 'leggere' in scatola 'metodo di lettura'. Seleziona metodo di rilevazione 'luminescenza'. Fare clic su 'OK'.
    3. Nella casella fase di lettura, selezionare i pozzi da sottoporre a scansione nella scheda 'piatto pieno', e selezionare i pozzi di agire come pozzi vuoti.
    4. Impostare il filtro impostato filtro vuoto (ad esempio, la spina, Em: il foro, specchio: nessuno). Impostare il guadagno135, con un tempo di integrazione di 0,5 sec per pozzetto e un'altezza lettura di 6,5 mm. Fare clic su 'OK' per salvare le impostazioni per la lettura luminescenza.
  6. Esecuzione di un luminescenti Leggi
    1. Espellere portatarga selezionando scheda 'il controllo dello strumento' e cliccare su 'piatto out'.Place piastra a 96 pozzetti sul portatarga, assicurando il coperchio è acceso. Chiudere il portatarga cliccando su 'piatto in' scheda sotto 'controllo dello strumento'. Clicca su 'leggere la società' dalla barra degli strumenti per eseguire la lettura luminescenti.
    2. Esportare le misure relative unità luminescente (RLU) per ogni bene ad un foglio di calcolo per ulteriori analisi.
  7. Ripetere i passaggi 3,1-3,6 per registrare la proliferazione ogni 24 ore fino a 96 ore dopo la semina cellule.

4. Determinazione Cell Count Utilizzando un cellulare Imager

  1. Impostazione di un esperimento di imaging cellulare utilizzando il software imager celle multi-mode
    1. Accendere imager cella multi-mode e aperto esimoe software.
    2. Nel 'task manager', selezionare la scheda 'esperimenti' e 'creare new'.On il' 'barra degli strumenti, fare clic su' file 'scheda e aperto' protocollo procedura di set 'tab.Select' temperatura azione '. Impostare incubatore per 'on' e impostare la temperatura a 37 ° C e verificare 'preriscaldamento' prima di continuare con scatola passo successivo '. Fare clic su 'OK' per salvare le impostazioni.
    3. Selezionare l'azione 'leggere'. Clicca sul metodo di rilevazione 'immagine', selezionare 'endpoint / cinetica' di leggere il tipo e il tipo di ottica 'filtri'. Fare clic su 'OK'.Click sulla' scheda piatto pieno 'e selezionare pozzetti sulla piastra di essere ripreso. Fare clic su 'OK' per salvare le impostazioni.
    4. Selezionare l'obiettivo 2.5X dal menu a tendina opzioni 'obiettivi'. Nella scheda 'canali', selezionare due canali: GFP 469, 525 e campo luminoso. Controllare l'esposizione 'auto' per entrambi i canali e selezionare bene l'auto-esposizione.
    5. Per determinare auto le impostazioni di messa a fuoco, selezionare 'auto-focus' e cliccare su 'opzioni'. Per le opzioni di auto-focus, selezionare il metodo di 'eseguire la scansione e poi messa a fuoco automatica'. Fare clic su 'OK' per salvare le impostazioni.
    6. Impostare l'orizzontale e l'offset dal centro di benessere (micron) verticale per 0.Select per acquisire più immagini per bene in un montaggio 3 x 2, con spaziatura orizzontale (micron) = 2.881 e spaziatura verticale (micron) = 2.127. Fare clic su 'OK' per salvare le impostazioni della procedura.
      Nota: Vedere la Tabella 2 per i parametri di lettura.
  2. Esecuzione Leggi Esperimento sulla piastra selezionati
    1. Fare clic sulla scheda 'controllo dello strumento' e selezionare il 'piatto fuori' function.Place piastra da 96 pozzetti in portatarga, assicurando il coperchio è acceso. Nella scheda 'controllo dello strumento', selezionare il 'piatto in' funzione. Seleziona 'di leggere la società' dalla scheda piatto. Ripetere leggere ogni 24 ore fino a 96 ore post-semina.
  3. Analisi del conte cella utilizzando ilCellulare Imager Software.
    1. Per analizzare un'immagine, fare clic sulla scheda '' i dati sulla lastra esposta, 'immagine [GFP 469, 525 + Campo chiaro]' selezionare. Fare doppio clic su una ripreso bene.
    2. Clicca su un'immagine caricata. Seleziona 'analizzare' per selezionare una singola immagine del montaggio da analizzare. Fare clic su 'OK'.Check il' GFP 'solo canale, e dei parametri impostati come indicato nella tabella 3. Fai clic su' Start 'per applicare i parametri alle cellule imaged.
    3. Osservare la maschera conteggio delle cellule posta sopra le celle imaged, che viene utilizzato per determinare il numero di cellule per immagine. Fare clic su 'applicare le modifiche' e mantenere queste impostazioni per ogni lastra esposta per tutto l'esperimento.
    4. Una volta tornati in lastra esposta, cliccare sul menù a 'dati' menu a tendina e selezionare 'conta delle cellule'. Questo genera il numero totale di cellule per pozzetto.
    5. Esportare tutti i dati in un foglio di calcolo, fare clic sulla scheda 'esportazione' per ulteriori analisi of i conteggi delle cellule per pozzetto.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Per studiare diversi metodi di misura della proliferazione delle cellule in coltura, la proliferazione delle cellule di MCF-7-Δ40p53 cellule trasdotte stata confrontata alla non trasdotte MCF-7-Lego linea cellulare di tumore al seno. I tre metodi che sono stati confrontati - il metodo di imaging emocitometro convenzionale, test di luminescenza vitalità cellulare, e la cella analisi-sono illustrate nel diagramma schematico (figura 1). Ogni metodo presenta vantaggi e svantaggi per misurare accuratamente il conteggio delle cellule nel tempo, e il metodo più efficace dipende dai requisiti endpoint dell'esperimento e le informazioni che possono essere acquistati per una popolazione di cellule.

La crescita delle cellule MCF-7-Δ40p53 MCF-7-Lego e sono stati misurati dopo 24 ore per 4 giorni. Come mostrato in figura 1, le due linee di cellule sono state seminate in tre diverse densità di cellule (1,5 x 10 3 3; 5 x 10 3 cellule / pozzetto) e la cella di conteggio è stata effettuata 24, 48, 72 e 96 ore dopo la semina. Ogni metodo ha dimostrato aumento della proliferazione cellulare, utilizzando un emocitometro, un saggio luminescenza a base, e un imager cella (figure 2a, b, c, rispettivamente) durante 96 ore. Il maggior incremento di proliferazione cellulare è stata osservata alla massima densità cellulare (5 x 10 3 cellule), e anche mostrato i risultati più riproducibili in ogni punto temporale, suggerendo che questa sia la densità cellulare ottimale per misurare la proliferazione in queste cellule. Non vi era alcuna differenza significativa nella proliferazione cellulare tra le linee cellulari.

La misurazione della proliferazione cellulare tra i diversi metodi è stato confrontato con un'analisi di regressione lineare 6 (figura 3; Tabella 4). C'era una correlazione significativa tra ciascuno dei diversi metodi testati, quando si confrontano cell proliferazione a tutte le densità cellulari in entrambe le linee cellulari (Figura 3a e b). La correlazione più forte è stata osservata tra il confronto del test luminescenza-based, e la termocamera cella (R 2 = 0,8899, p ≤0.0001; R 2 = 0,9805, p ≤0.0001, rispettivamente Figure 3a e b).

Una rappresentazione visiva della proliferazione cellulare usando l'imager cella è indicato (Figura 4). Poiché questo metodo utilizza misurazioni continue di un'unica piastra, le cellule possono essere esposte ogni 24 ore fino a quando le cellule raggiungono quasi il 100% di confluenza. Come mostrato in figura 2, i tassi di crescita delle cellule-Δ40p53 MCF-7 MCF-7-Lego ed erano paragonabili in tutti i punti temporali. Questo metodo fornisce utili informazioni cellulari, tra cui essere in grado di monitorare visivamente la crescita delle cellule su più giorni, e confrontare le dimensioni delle cellule e morfo cellularelogia tra le diverse linee cellulari.

Figura 1
Figura 1: un diagramma schematico dei tre diversi metodi di misurazione proliferazione cellulare Le cellule sono state seminate in tre diverse densità di cella in più piastre a 96 pozzetti e incubate a 37 ° C con 5% di CO 2 fino a 96 ore.. Ogni 24 ore, la proliferazione cellulare è stata misurata sia usando un emocitometro, un saggio o una cella di imaging luminescenza-based. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

figura 2
Figura 2:. La proliferazione cellulare Misure dopo la conta delle cellule a 96 ore sono stati misurati ogni 24 ore per 96 ore in MCF-7-Legcellule O e MCF-7-Δ40p53 seminate in tre diverse densità di cellule. Conta delle cellule sono stati misurati utilizzando un (a) emocitometro in cellule / ml, (b) utilizzando un saggio basato luminescenza in unità luminescenti relative (RLU), o (c) una conta cellulare continua utilizzando un imager cella cellule / immagine. Condizioni per l'imager cellule sono riportati nella tabella 2. Tutti gli esperimenti rappresentano la media di tre esperimenti indipendenti, ± la deviazione standard Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3:. Confronto di tre diversi metodi di misurazione proliferazione cellulare nel cancro della mammella linee cellulari Un'analisi di regressione lineare è stata eseguita per confrontare i rapporti correlativi tra i diversi m etodi esaminato per misurare la proliferazione cellulare in (a) cellule MCF-7-Lego e (b) le cellule MCF-7-Δ40p53. Un coefficiente di correlazione di Pearson è stato calcolato e la significatività è stato determinato (p <0,05) tra i diversi metodi di misurazione proliferazione cellulare. Tutti i risultati rappresentano la media ± SD di tre esperimenti indipendenti. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4
Figura 4:. Immagini di GFP-positive MCF-7-Lego e MCF-7-Δ40p53 cellule tumorali del seno Immagini rappresentative di cellule da 5 x 10 3 cellule seminate catturato con un imager cellulare ogni 24 ore. La barra di scala rappresenta 1.000 micron. I parametri per l'imaging cellulare sono riassunti nella Tabella 2. href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/54350/54350fig4large.jpg" target = "_ blank"> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

densità cellulare (cellule / pozzetto)
tipo di cella 1,5 x 10 3 3,0 x 10 3 5 x 10 3
MCF-7-Lego 76 ml a 8,4 ml mezzi 152 ml a 8,3 ml mezzi 254 ml a 8,2 ml mezzi
MCF-7-Δ40p53 93 ml a 8,4 ml mezzi 185 ml a 8,3 ml mezzi 308 ml a 8,2 ml mezzi

Tabella 1: Cell Semina volumi per 96 pozzetti.

"Fo: keep-con-next.within-page =" always "> Leggi parametri tipo del piatto 96 bene Modalità Immagine Obbiettivo 2.5X Colore GFP (469, 525), Campo luminoso Esposizione Auto Messa a fuoco Auto (Scan poi messa a fuoco automatica)

Tabella 2: leggere i parametri per l'imaging cellulare Utilizzando l'imager cella.

Tabella 3: Imaging parametri per l'analisi delle cellule di conteggio.

parametri di imaging
Soglia 5000
dimensione dell'oggetto minimo (micron) 30
dimensione oggetto massima (micron) 300
MCF-7-Lego
piazza R p-value
Emocitometro vs. saggio luminescenza-based 0,6301 0,0021
Cellulare imager vs. emocitometro 0,7524 0,0003
Test di luminescenza a base vs. imager cellulare 0,8899 <0.0001
MCF-7-Δ40p53
piazza R p-value
Emocitometro vs. lusaggio minescence-based 0,8983 <0.0001
Cellulare imager vs. emocitometro 0,9303 <0.0001
Test di luminescenza a base vs. imager cellulare 0,9805 <0.0001

Tabella 4: regressione lineare L'analisi dei tre diversi metodi di proliferazione testati.

metodo vantaggi svantaggi Note tecniche output finale
emocitometro A basso costo errore umano Alta Pipetta più volte per preparare sospensioni singola cella Cellule / ml
Richiede un minimo di attrezzature Richiede cella singola sospensione Eseguire più conta per ottenere una precisione
conta delle cellule diretta Elevato numero di cellule necessario per una valutazione accurata del numero di cellule
Endpoint
Saggio luminescenza a base di Utilizzare con i formati pozzetti-plate reagenti costosi Proteggere dalla luce Luminescenti relativa unità (RLU) / bene
Facile da eseguire Richiede lettore di piastre luminescenti Includi pozzetti di controllo per determinare sfondo luminescenza
test rapido Sensibile alla temperatura
Fornisce informazioni vitalità cellulare Variabile a seconda dell'attività metabolica delle cellule
misura indiretta
Endpoint
cellulare imager misura continua imager costoso Assicurarsi imager cella è impostato a 37 ° C Le cellule / immagine
Controllo della temperatura Abilità intensiva Evitare di agitazione non necessaria o distruzione delle cellule
Fornisce informazioni cellulare Variabile a seconda della confluenza delle cellule
Costo-efficacia (se avete la termocamera) conteggio relativo
misura diretta
l'imaging automatico di formato pozzetti-plate

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

In questo protocollo sono state esaminate tre diversi metodi di misurazione proliferazione delle cellule in cellule in coltura. Ogni metodo era capace di misurazioni riproducibili e precise di proliferazione cellulare su 96 ore, ei risultati erano confrontabili tra ciascuno dei metodi testati (Figura 2 e 3). Sia il test di luminescenza-based e metodo di imaging cellulare prodotto i risultati più robusti, mostrando incremento lineare nella proliferazione cellulare dopo 96 ore (Figura 2b, c). Inoltre, l'imaging cellulare nel corso del tempo rappresentato alcuna differenza significativa nei tassi di crescita tra le linee di cellule trasdotte e non trasdotte (Figura 4).

Ci sono molti vantaggi e svantaggi per ogni metodo in esame in questo protocollo, vedere la Tabella 5 per una sintesi. Il metodo di conteggio delle cellule convenzionale utilizzando un emocitometro è un metodo a basso costo che richiede molto poco reagenti o effo aggiuntivirt per preparare ed eseguire. Inoltre, questo metodo quantitates una conta cellulare assoluta in cellule / ml 14. Tuttavia, ci sono svantaggi gravi, che includono il tempo natura del conteggio delle cellule, elevati tassi di errore che si traduce in grandi deviazioni standard tra conteggi, e il fatto che un elevato intervallo di numeri di cellule necessarie per la conta delle cellule accurati. Questo può essere visto nella figura 2a, in cui il conteggio delle cellule usando l'emocitometro mostrato risultati variabili ai densità cellulari bassi e grandi deviazioni standard in momenti successivi. Questi svantaggi rendono questo metodo utile per il conteggio delle cellule dei campioni di piccole dimensioni, e inadeguata per misure ad alto rendimento più grandi in cui sono richieste più piccole dimensioni della piastra e densità di semina. Queste limitazioni possono essere alleviati se la densità cellulare è stato aumentato, in modo che il numero minimo di cellule contate iniziata ad una soglia superiore a 100 cellule. Il più diluita la sospensione cellulare, o abbassare la cella densità, la maggiore possibilità di contare meno di 100 cellule e quindi l'aumento della variabilità tra le repliche 15. Tuttavia, questo metodo non è adatto per una piastra da 96 pozzetti, a causa della bassa area superficiale delle cellule, e quindi, il numero insufficiente di cellule che possono essere utilizzati nell'analisi. Questo mette in evidenza la mancanza di capacità di throughput elevati di questo metodo e un chiaro svantaggio per gli utenti che necessitano di questa capacità.

Il saggio luminescenza a base determina la vitalità cellulare misurando la quantità di ATP, che è una misura della presenza di cellule metabolicamente attive 16. Questo test è destinato throughput screening elevato di campioni multipli in formato di piastra da 96 pozzetti per determinare la proliferazione cellulare. Questo metodo semplice quantitates proliferazione cellulare come unità relativa luminescenza (RLU) utilizzando un lettore di piastre, che è proporzionale alla ATP presente nelle cellule metabolicamente attive. Tuttavia, il principale svantaggio di questo metodo è tl costo del reagente, e la dipendenza della misura sull'attività metabolica delle cellule. Varie condizioni di coltura cellulare, come punti di temperatura o tempo ciclo cellulare, possono influenzare facilmente la quantità di ATP prodotta dalle cellule, che è direttamente proporzionale al segnale luminescente generato dal test 17. Pertanto, è importante determinare empiricamente che le condizioni dell'esperimento non interferiscono con l'attività metabolica delle cellule e potenzialmente ostacolano il segnale luminescente relativa generato dalle cellule.

Il terzo metodo esaminato per determinare la proliferazione cellulare era un imager cellule vive e software per eseguire un conteggio di cella relativa. L'imager cella ha capacità ad alta capacità, come può essere automatizzato per catturare immagini multiple per ogni pozzetto, in tempo reale insieme con controllo della temperatura, utilizzando le stesse cellule per la durata del test. Come mostrato in figura 4, la proliferazione cellulare può essere monitored nello stesso piatto su un percorso di tempo, che può fornire ulteriori informazioni sulla popolazione di cellule insieme all'analisi conteggio delle cellule. Questo è molto vantaggioso in quanto elimina cross-plate variabilità ed errore semina cellulare, che è comune in 96 formati pozzetti. Il software che accompagna il imager cellulare consente la quantificazione della conta delle cellule utilizzando i parametri indicati nella tabella 2 e 3. È pertanto utile in un ambiente ad alta produttività e può essere facilmente canalizzato ad altri test per misurare le funzioni cellulari come apoptosi o citotossicità. Uno svantaggio del sistema è il software, che è limitato nella sua capacità di dividere toccare oggetti. Mentre può svolgere questa funzione in cellule confluenza inferiori, è una limitazione importante del saggio e richiede, pertanto, un'ottimizzazione specifico tipo cellulare. Inoltre, mentre i singoli esperimenti usando un imager sono molto basso costo su scala plate-by-plate, questo metodo farebbe suly essere conveniente se lo strumento è già configurato in un laboratorio. Pertanto, questo fornisce un nuovo metodo per misurare la proliferazione cellulare delle cellule in coltura, e ha il grande vantaggio di non richiedere reagenti aggiuntivi, ed è capace di 96 pozzetti conteggio automatico, rendendo questo metodo appropriato per l'analisi ad alta produttività. Questo è un miglioramento significativo dal metodo di conteggio delle cellule emocitometro convenzionale, ed è un costo più efficace opzione per il test di luminescenza-based.

Il passo fondamentale quando si utilizza l'imager cella è in fase di analisi delle immagini acquisite e la successiva conta delle cellule per immagine. Queste immagini possono essere elaborati usando un numero di piattaforme di imaging cellulare. È quindi indispensabile per determinare il software più appropriato per il tipo di cella in esame. Sarebbe utile per validare i conteggi delle cellule dalle immagini acquisite dalla termocamera cella utilizzando software di imaging diverso. Questo protocollo potrebbe essere applicato ad uncellule coltivate y, tuttavia i parametri di analisi dovrebbero essere definita per ciascuna linea cellulare. Questo può richiedere molto tempo all'inizio, ma una volta impostati i parametri, il metodo può essere automatizzato per immagine intere piastre alla volta.

È importante notare che questi test sono in realtà una misura indiretta della proliferazione, come misurano numero di cellule (emocitometro, imager cellule), o attività metabolica (saggio luminescenza-based), per un periodo di tempo. Questi metodi possono essere facilmente modificati per misurare altri fattori importanti che possono influenzare la proliferazione. Ad esempio, il metodo di esclusione del trypan blue può essere facilmente incorporato il metodo emocitometro o imager cella per escludere cellule morte e quindi determinare la vitalità cellulare 13. Il saggio luminescenza-based può essere canalizzato con un saggio di citotossicità per fornire ulteriori informazioni sulla salute delle cellule, e l'attività metabolica misurata nel corso di questo saggio è anche una misura di viabi cellularelità 12. Pertanto, la flessibilità di questi metodi per essere canalizzato con altri metodi per fornire informazioni aggiuntive cellulare è un forte vantaggio di ciascuno di questi metodi.

Questo protocollo utilizzato la linea cellulare di cancro al seno umano MCF-7 che sono stati stabilmente trasdotte con il Lego-IG2-puro + vettore contenente il gene GFP. Questo consente l'utilizzo del filtro GFP ottiche all'immagine cellule, senza la necessità di aggiungere alcun agente colorante nel mezzo di coltura. Questo metodo può essere facilmente modificato per GFP-negativo immagine o linee cellulari primarie anche, mediante imaging delle cellule usando la luminosità di questo tipo di campo dell'ottica, o etichettando le cellule con un marcatore di proliferazione. I metodi confrontati in questo protocollo sono sufficienti per essere utilizzato in un'ampia varietà di differenti linee cellulari robusto, tuttavia le impostazioni del protocollo ottimali per ogni linea singola cella devono essere determinati prima. Imaging di cellule utilizzando il canale in campo chiaro rappresenta la migliore soluzione per ce primariaLLS o quelli che sono a crescita lenta, a causa della natura a lungo termine di questo metodo. prove endpoint, quali il test di luminescenza basata, non sono particolarmente adatti per l'analisi della crescita cellulare a lungo termine.

Questo protocollo è descritto tre metodi diversi per misurare la proliferazione cellulare in vitro. Ogni metodo può essere eseguita di routine in laboratorio per misurare la crescita delle cellule, e la maggior parte dei laboratori sarebbe in possesso delle competenze necessarie per svolgere uno di questi metodi. Tuttavia, ci sono anche una serie di altri test disponibili per la misurazione cellule in divisione. Questi possono includere metodi che misurano la sintesi del DNA, l'attività metabolica, antigeni associati di proliferazione o la concentrazione di ATP 9. Ad esempio, sono stati sviluppati diversi metodi per misurare la velocità di sintesi del DNA delle cellule etichettando cellule con una sostanza radioattiva come 3H-timidina. Un inconveniente di questo metodo è l'uso evidente di sostanze radioattive, e del loro smaltimento. Altrometodi che vengono abitualmente utilizzati per misurare la proliferazione cellulare includono l'uso di etichettatura BrdU di DNA di nuova formazione, che può essere misurata mediante citofluorimetria 18. Citometria a flusso può essere utilizzato per analizzare sia il numero delle cellule così come informazioni del ciclo cellulare. Questo può essere un risultato vantaggioso per particolari esperimenti, tuttavia gli svantaggi di questo metodo includono il tempo supplementare e gradini, reagenti costosi e maggiori competenze nell'uso addestrato per operare il citofluorimetro e analizzare i dati risultanti 18. Pertanto, ci sono molti saggi differenti disponibili agli scienziati di valutare la crescita delle cellule, e il metodo scelto dipende in larga misura dal tipo cellulare utilizzato, l'utente e il loro livello di abilità, e il tipo di dati richiesti al punto finale dell'esperimento.

In conclusione, tre diversi metodi di misurazione proliferazione cellulare sono stati confrontati con le cellule del cancro al seno. Ogni metodo ha molti vantaggi e disadvantages, ed è quindi user-dipendente e sulla base dei requisiti per ciascun esperimento, in termini di determinare il dosaggio più appropriato per eseguire il conteggio delle cellule.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium, no phenol-red ThermoFisher Scientific 21063-045 Supplemented with 10% FBS, 200 mM L-glutamine, 2 µg/ml insulin and 1 µg/ml puromycin
L-glutamine solution (100x) ThermoFisher Scientific 25030-081
Insulin solution human Sigma-Aldrich I9278-5ML
Fetal bovine serum (FBS) Bovogen Biologicals SFBS-F-500ml
Puromycin dihydrochloride Sigma-Aldrich P9620-10ML
0.5% trypsin-EDTA solution (10x) ThermoFisher Scientific 15400-054 Dilute to 2x in DPBS
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) (1x) ThermoFisher Scientific 30028-02
Tissue culture flask, 75 cm2 growth area Greiner Bio-One 658175
Scepter 2.0 Cell Counter Merck Millipore Automated cell counter
96 well multiwell plate, flat bottom Nunc 167008
Improved Neubauer Hemocytometer BOECO Germany BOE 01
Olympus IX51 inverted microscope Olympus IX51
CellTiter-Glo 2.0 Assay Promega G9242 Luminescence-based assay
Cytation 3 Cell Imaging Multi-Mode Reader BioTek Plate reader for luminescence, fluorescence and brightfield cell imaging
Gen5 Data Analysis Software BioTek GEN5

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lane, D. P. Cancer. p53, guardian of the genome. Nature. 358 (6381), 15-16 (1992).
  2. Olivier, M., Hollstein, M., Hainaut, P. TP53 mutations in human cancers: origins, consequences, and clinical use. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (1), a001008 (2010).
  3. Olivier, M., et al. The clinical value of somatic TP53 gene mutations in 1,794 patients with breast cancer. Clin Cancer Res. 12 (4), 1157-1167 (2006).
  4. Bourdon, J. C., et al. p53 isoforms can regulate p53 transcriptional activity. Genes Dev. 19 (18), 2122-2137 (2005).
  5. Avery-Kiejda, K. A., et al. Small molecular weight variants of p53 are expressed in human melanoma cells and are induced by the DNA-damaging agent cisplatin. Clin Cancer Res. 14 (6), 1659-1668 (2008).
  6. Avery-Kiejda, K. A., Morten, B., Wong-Brown, M. W., Mathe, A., Scott, R. J. The relative mRNA expression of p53 isoforms in breast cancer is associated with clinical features and outcome. Carcinogenesis. 35 (3), 586-596 (2014).
  7. Weber, K., Bartsch, U., Stocking, C., Fehse, B. A multicolor panel of novel lentiviral "gene ontology" (LeGO) vectors for functional gene analysis. Mol Ther. 16 (4), 698-706 (2008).
  8. Riss, T. L., Moravec, R. A. Cell Biology. Celis, J. E. , Third Edition, Academic Press. 25-31 (2006).
  9. Ng, K. W., Leong, D. T., Hutmacher, D. W. The challenge to measure cell proliferation in two and three dimensions. Tissue Eng. 11 (1-2), 182-191 (2005).
  10. Riss, T. L., Moravec, R. A. Use of multiple assay endpoints to investigate the effects of incubation time, dose of toxin, and plating density in cell-based cytotoxicity assays. Assay Drug Dev Technol. 2 (1), 51-62 (2004).
  11. Butzler, M., Worzella, T., Hungriano, M., Osorio, F., Hanegraaff, I., Cowan, C. Automated cytotoxicity profiling using the CyBi-FeliX instrument, cell health assays and thaw-and-use cells. , http://au.promega.com/resources/pubhub/automated-profiling-using-the-cybi-felix-instrument-cell-health-assays-and-thaw-and-use-cells (2014).
  12. CellTiter-Glo 2.0 Assay Technical Manual #403. , http://www.promega.com/~/media/files/resources/protocols/technical%20manuals/101/celltiterglo%202%200%20assay%20protocol.pdf (2015).
  13. Banks, P., Brescia, P. J. Application Guide: Automated Digital Microscopy. , http://www.biotek.com/resources/articles/automated-digital-microscopy.html (2015).
  14. Bastidas, O. Cell Counting with Neubauer Chamber: Basic Hemocytometer Usage. , http://www.celeromics.com/en/resources/Technical%20Notes/cell-article-chamber.php (2016).
  15. Bastidas, O. Technical Note: Cell Count for Low Concentration Samples . , http://www.celeromics.com/en/resources/docs/Articles/Low-concentration-cell-counting.pdf (2012).
  16. Riss, T. L., Moravec, R., Niles, A. L., et al. Cell Viability Assays. Assay Guidance Manual[Internet]. Sittampalam, G. S., Coussens, N. P., Nelson, H., et al. , (2013 May 1 [Updated 2015 Jun 29]) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK144065/ (2013).
  17. Quent, V. M., Loessner, D., Friis, T., Reichert, J. C., Hutmacher, D. W. Discrepancies between metabolic activity and DNA content as tool to assess cell proliferation in cancer research. J Cell Mol Med. 14 (4), 1003-1013 (2010).
  18. Crane, J., Mittar, D., Soni, D., McIntyre, C. Cell Cycle Analysis Using the BD BrdU FITC Assay on the BD FACSVerse System. , (2013 May 1 [Updated 2015 Jun 29]) https://www.bdbiosciences.com/documents/BD_FACSVerse_CellCycleAnalysis_AppNote.pdf 1-12 (2011).

Tags

Cancer Biology Numero 115 biologia molecolare la proliferazione delle cellule il cancro al seno l'imaging cellulare biologia del cancro il conteggio delle cellule
Confronto di tre diversi metodi per la determinazione proliferazione cellulare in Breast Cancer linee cellulari
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Morten, B. C., Scott, R. J.,… More

Morten, B. C., Scott, R. J., Avery-Kiejda, K. A. Comparison of Three Different Methods for Determining Cell Proliferation in Breast Cancer Cell Lines. J. Vis. Exp. (115), e54350, doi:10.3791/54350 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter