Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Sammenligning av tre forskjellige metoder for bestemmelse Cell Proliferation i brystkreftcellelinjer

Published: September 3, 2016 doi: 10.3791/54350
Automatic Translation
1,2, 1,2,3, 1,2
1Medical Genetics, Hunter Medical Research Institute, 2Priority Research Centre for Cancer, School of Biomedical Sciences and Pharmacy, Faculty of Health and Medicine, University of Newcastle, 3Pathology North, John Hunter Hospital

Introduction

Den tumorsuppressorgen, p53, er en viktig regulator av en rekke cellulære prosesser, inkludert cellesyklus-stans, apoptose og begynnende alderdom 1. Den er ansvarlig for å opprettholde genomisk stabilitet, og er derfor av avgjørende betydning for å opprettholde balanse mellom celledød og cellevekst. Mutasjoner i p53 er vanlig i kreft og er den viktigste årsaken til p53 inaktivering fører til ukontrollert kreftcelleformering 2. Interessant, mutasjoner i p53 bare står for ca 25% av brystkrefttilfeller 3, noe som tyder på at andre mekanismer er ansvarlig for tap av p53-funksjon. De nylig oppdagede p53-isoformer har vist seg å være overuttrykt i mange humane kreftformer, og kan modulere p53-funksjon 4,5. Vi har tidligere vist at p53 isoformen, Δ40p53, er de mest sterkt uttrykt isoform i brystkreft, og er signifikant oppregulert i brystkreftceller, sammenlignet med normal tilstøtende tissue 6. Etter dette, vi stabilt omformet den menneskelige brystkreft cellelinje MCF-7 til overuttrykker Δ40p53 hjelp av Lego-IG2-puro + vektor (GFP +) 7. Disse cellene ble brukt for å undersøke om høy Δ40p53 uttrykk øker celle spredning priser brystkreft celler.

Det finnes mange direkte og indirekte metoder for måling av celle proliferasjon av dyrkede celler in vitro 8,9. Dette kan utføres enten som kontinuerlige målinger over tid, eller som endepunkt analyser 10. Konvensjonelle metoder er fortsatt nyttig, for eksempel celletelling ved hjelp av et hemocytometer. Denne analysen er en lav kostnad og direkte mål på celle nummer, men det er avhengig av store celletall og dyktige opplæring for å minimere feil og store standardavvik fra tellingene. Behovet for å utføre målinger kompatible med high-throughput formater har ført til utvikling av multiwell-plate analyser. Disse luminescens-baserte analyser målere celleantall basert på et selvlysende signal som er proporsjonalt med den metabolske aktivitet av cellen 11,12. I den senere tid, har innføringen av høye innhold avbildnings plattformer er tillatt for nye verktøy som overvåker celleproliferasjon og samtidig gi kvantitative og kvalitative fenotypisk datainnsamling, og omfatter en rekke systemer 13. Alle disse metoder gir muligheter for å måle cellevekst, enten ved kontinuerlig måling eller endepunkt analyser, og hver har en rekke fordeler og ulemper med hensyn til følsomhet, gjennomstrømning av prøvenummer, og celleinformasjon, som alle kan bli veid følgelig avhengig på problemstillingen.

Denne protokollen beskriver tre forskjellige metoder for å måle celleproliferasjon in vitro, med hver fremgangsmåte som utnytter forskjellige områder av følsomhet, reproduserbarhet og multi-brønn plate-format. Denne protokollen var å sammenligne bruk av et hemocytometer telling chamber, en luminescens-baserte celleviabilitet analysen, og celle-imager, ved måling av celleproliferasjon i løpet av en 96 timers tids kurs. For å gjøre dette, ble veksten av vektor transduced celler (MCF-7-lego) sammenlignet med celler transduced å overuttrykker Δ40p53 (MCF-7-Δ40p53), ved hjelp av tre ulike celletettheter. Celleproliferasjon ble målt hver 24. time i opptil 96 timer. Hver metode ble funnet å ha sine egne fordeler og ulemper, og avhengig av det formål av forsøket, som hver fremdeles er en verdifull metode for å tilveiebringe informasjon om hastigheten av proliferasjon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Klar Cells for proliferasjonsanalyser

NB: Bland de to cellelinjer på samme måte og frø i samme format for hver metode som skal analyseres.

  1. Grow MCF-7-Lego og MCF-7-Δ40p53 7 celler til 75-80% konfluens i T 75 cm2 vevsdyrkingskolber ved hjelp av fenol-rød fri Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) , 200 mM L-glutamin, 2 ug / ml insulin og 1 ug / ml puromycin ved 37 ° C med 5% CO2. Håndtak celler i en steril biosikkerhet kabinett klasse II.
    Merk: Tiden det tar å dyrke cellene til samløpet varierer avhengig av seeding fortynning. I forberedelse for plating av cellene for proliferasjonsanalyser, frø cellene ved et 1: 3 fortynning i DMEM supplementert og vedlikeholde i normale vekstbetingelser i 3 dager til 75-80% konfluens.
  2. For å fjerne celler fra flasken, hell av media ien avfallsbeholder. Vask straks cellelaget med 2 ml forvarmes 2x trypsin. Aspirer trypsin. Tilsett ytterligere 2 ml forvarmet trypsin til cellelaget som plasseres i en inkubator i 5 minutter ved 37 ° C med 5% CO2.
    1. Når cellene løsner, vaske cellene med 10 ml varmet frisk supplert DMEM. Overfør cellesuspensjonen til et sterilt 15 ml rør og sentrifuger ved 491 xg i 5 minutter ved romtemperatur. Nøye aspirer og kast supernatanten.
  3. Cellepelleten suspenderes i 5 ml frisk supplert DMEM. Utfør en celletall for å bestemme riktig tetthet å frø cellene i 96-brønners plater.
    1. Fortynn 100 ul av cellesuspensjonen i 900 ul 1x Dulbeccos fosfatbufret saltløsning (DPBS). Plasser en ny 60 mikrometer sensoren på automatisert celleteller. Hold nede stempelet og senk sensoren i den fortynnede cellesuspensjonen. Sakte slipper stempelet på celleteller. Fjerne sensoren fra cellen belnter når fullført.
      Merk: Celletallet vil bli vist på celleteller i celler / ml.
  4. Seed celler i et sluttvolum på 100 ul (i DMEM) i en 96-brønns plate ved ~ 20% konfluens for å gi plass for cellevekst og måling av spredning over 3-5 dager (se tabell 1). Seed alle cellelinjer i tre eksemplarer.
    Merk: For dette eksperimentet ble tre ulike celletettheter vurderes for å bestemme optimal celletetthet. De nødvendige celletall er oppsummert i tabell 1. Seed celler ved en lavere tetthet hvis målingen av mer langvarige vekst er nødvendig.
    1. For hemocytometer og luminescens baserte analyser, utarbeide en plate per tidspunkt (dvs 4 plater per test). For cellen avbildningsanalyse, fremstille bare en plate for varigheten av forsøket.
  5. Opprettholde cellene ved 37 ° C med 5% CO2 i 24 timer.

2. Bestemme Cell Count ossing en hemocytometer

  1. Pre-varme både medium og trypsin til 37 ° C i en cellekulturinkubator, ovn eller vannbad. Sug medier fra celler i en avfallsbeholder, vaskes en gang med 30 ul av 2x trypsin, og aspirer trypsin.
  2. Vask celler en gang med 30 ul av 2x trypsin, og inkuber i 5 minutter ved 37 ° C. Slå forsiktig på kanten av platen for å løsne cellene fra platen. Tilsett 50 ul supplert DMEM og bland celler ved å pipettere inntil cellene danner en enkelt cellesuspensjon.
  3. Forbered hemocytometer ved å rense overflaten og glassplate med 70% etanol.
  4. Plasser glass cover-slip over tellekamre og fest til 'Newtons brytning ringer' kan sees mellom cover-slip kantene og hemocytometer.
    Merk: Dette indikerer at cover-slip har riktig holdt hemocytometer.
  5. Forsiktig pipette 20 ul av cellesuspensjonen under dekk-slip, fylling av tellekammer ved kapillær bevegelse.Plasser hemocytometer henhold 10x forstørrelse av et mikroskop og visualtellekamre i rutenettet.
  6. Telle celler i de 4 ytre kvadratene av rutenettet. For å forbedre nøyaktigheten, gjentatte tilfeller av flere ytre firkanter hvis nødvendig, eller til tellingen har nådd 70 - 100 celler 14,15.
    1. Beregn cellekonsentrasjonen per ml som følger: Gjennomsnittlig celletall per kvadrat x fortynningsfaktoren (hvis brukt) x 10 4
  7. Gjenta trinn 2,1-2,8 hver 24 time for 96 timer etter seeding.

3. Bestemme Cell Proliferation Ved hjelp av en Luminescence basert analyse

Merk: Dette er et endepunkt måling. Når reagens blir tilsatt til cellene, kan platen bare kan kvantifiseres samtidig.

  1. Tine luminisensen reagens i et 22 ° C vannbad i 30 min.
  2. Bland reagens forsiktig ved å vende flasken for å oppnå en homogen blanding.
  3. Ekvilibrere en plate av seeded celler (fra trinn1,5) ved romtemperatur i 30 minutter.
  4. Tilsett 100 ul av luminescens reagens til hver brønn. Blande innholdet på en orbital-rystemaskin i 2 minutter. La platen inkuberes i 10 minutter ved RT.
  5. Sette opp en luminescens eksperiment ved hjelp av multi-modus plateleser programvare.
    1. Slå på multimodus plateleser og åpne programvaren. I "Oppgavebehandling", velg "eksperimenter" og "skape new'.Select 'file' fra side verktøylinjen, og under 'protokoll' fanen, velg" prosedyre ".
    2. Velg "Grenier 96 flat bunn 'plate type, og sjekk' bruk lokket" -boksen. Velg "lese" aksjon under "les metode" -boksen. Velg "luminescens 'påvisningsmetoden. Klikk på "OK".
    3. I lese trinnet merker du brønnene som skal skannes under fanen "full plate ', og velg brønner for å fungere som tomme brønner.
    4. Sett filter satt til tomt filter (f.eks plugg, Em: hull, speil: ingen). Sett gain til135, med en integrasjonstiden på 0,5 sekunder per brønn og en lese høyde på 6,5 mm. Klikk "OK" for å lagre innstillingene for luminescens lese.
  6. Utføre en Lysende Les
    1. Løs ut plate holder ved å velge instrument kontroll "-kategorien og klikk på" plate out'.Place 96-brønns plate til plate holderen, slik at lokket er på. Lukk plateholderen ved å klikke på 'plate i "under" instrument kontroll fanen. Klikk på "les nå" fra verktøylinjen for å utføre selvlysende lese.
    2. Eksportere de relative målinger lysende enhet (RLU) for hver brønn til et regneark for videre analyse.
  7. Gjenta trinn 3,1-3,6 å registrere spredning hver 24 timer opp til 96 timer etter såing celler.

4. Fastsettelse Cell Count Ved hjelp av en Cell Imager

  1. Sette opp en celle bildebehandling eksperiment ved hjelp av multi-modus celle imager programvare
    1. Slå på multimodus celle imager og åpen the-programvare.
    2. I "Oppgavebehandling", velg fanen 'eksperimenter' og 'lage new'.On "Fil" på verktøylinjen, klikk på "protokollen" fanen og åpne "prosedyre" fanen.Velg' innstilt temperatur "handling. Sett kuvøse til "på" og sette temperaturen til 37 ° C og sjekk "forvarme" før du fortsetter med neste trinn "-boksen. Klikk "OK" for å lagre innstillingene.
    3. Velg "lese" handling. Klikk på «image» deteksjonsmetode, velg "endepunkt / kinetisk" lese type og 'filtre' optikk type. Klikk 'OK'.Click på "full plate' fanen og velg brønner på platen som skal avbildes. Klikk OK for å lagre innstillingene.
    4. Velg 2,5x objektiv fra rullegardin 'mål' alternativer. Under fanen 'kanaler', velge to kanaler: GFP 469, 525 og Bright Field. Sjekk 'auto' eksponering for begge kanaler og velger automatisk eksponering godt.
    5. For å bestemme auto fokusinnstillinger, velger du "auto-fokus" og klikk på "alternativer". For autofokus alternativer, velger du "skanne og deretter autofokus" -metoden. Klikk "OK" for å lagre innstillingene.
    6. Still horisontale og vertikale forskjøvet fra midten av brønnen (mikrometer) til 0.Select å skanne flere bilder per brønn i en 3 x 2 montage, med horisontal avstand (mm) = 2881 og vertikal avstand (mikrometer) = 2127. Klikk "OK" for å lagre prosedyre innstillinger.
      Merk: Se tabell 2 for lese parametere.
  2. Utføre Les Eksperimenter på Selected Plate
    1. Klikk på "instrument kontroll" -kategorien og velg "plate ut" function.Place 96-brønns plate i plateholderen, slik at lokket er på. Under "instrument kontroll" fanen, velg 'plate i "-funksjonen. Velg "lese nå" fra fanen plate. Gjenta lese hver 24 timer opp til 96 timer etter seeding.
  3. Analyse av celletall BrukeCell Imager Software.
    1. Å analysere et bilde, klikker du på "data" -fanen på avbildede plate, velger du "bilde [GFP 469, 525 + Bright feltet] '. Dobbeltklikk på en avbildes godt.
    2. Klikk på en ladd bilde. Velg "analyserer" og velg et enkelt bilde av montasjen som skal analyseres. Klikk OK'.Check den "GFP 'eneste kanalen, og sette parametre som beskrevet i tabell 3. Klikk på' START 'for å bruke parametere til de avbildes cellene.
    3. Observere celletellemasken plassert over avbildes celler, som blir anvendt for å bestemme celletall per bilde. Klikk "gjelder endringer 'og vedlikeholde disse innstillingene for hver plate avbildes gjennom hele forsøket.
    4. Tilbake på avbildede plate, klikk på 'data' rullegardinmenyen og velg "celletall". Dette vil generere det totale celletall per brønn.
    5. Eksportere alle data til et regneark ved å klikke på «eksportere» -fanen for videre analyse of celletellinger per brønn.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For å studere forskjellige metoder for å måle proliferasjon av dyrkede celler, celleformering av MCF-7-Δ40p53 transduserte celler ble sammenlignet med den ikke-transduserte MCF-7-Lego brystkreftcellelinje. De tre metodene som ble sammen - den konvensjonelle metode hemocytometer, celleviabilitet luminescens analyse og celleavbildnings analyse- er skissert i det skjematiske diagram (figur 1). Hver metode har fordeler og ulemper for nøyaktig å måle celletelling over tid, og den mest effektive metoden avhenger av endepunkts kravene forsøket og den informasjon som kan anskaffes for en cellepopulasjon.

Veksten av MCF-7-lego og MCF-7 Δ40p53 celler ble målt etter 24 timer i 4 dager. Som vist i figur 1, ble de to cellelinjene sådd ut ved tre forskjellige celletetthet (1,5 x 10 3 3; 5 x 10 3 celler / brønn) og celletelling ble utført 24, 48, 72 og 96 timer etter såing. Hver metode vist økt celleproliferasjon, ved hjelp av et hemocytometer, en luminescens-baserte analysen, og en celle imager (figurene 2a, b og c, henholdsvis) i løpet av 96 timer. Den største økning i celleformering ble observert ved den høyeste celletetthet (5 x 10 3-celler), og viste også de mest reproduserbare resultater ved hvert tidspunkt, noe som tyder på at dette er den optimale celletettheten for måling av proliferasjon i disse cellene. Det var ingen signifikant forskjell i celleformering mellom cellelinjer.

Målingen av celleproliferasjon mellom de ulike metoder ble sammenlignet ved en lineær regresjonsanalyse 6 (figur 3, tabell 4). Det var en signifikant korrelasjon mellom hver av de forskjellige metoder ble testet, når man sammenligner cell spredning i det hele tatt av celletettheter i begge cellelinjer (figur 3a og b). Den sterkeste korrelasjon ble observert mellom den sammenligning av den luminescens-baserte assay, og cellen imager (R2 = 0,8899, p ≤0.0001; R2 = 0,9805, p ≤0.0001, figur 3a og b, henholdsvis).

En visuell representasjon av celleproliferasjon ved bruk av cellen imager er vist (figur 4). Da denne fremgangsmåte anvender kontinuerlige målinger av en enkelt plate, kan cellene bli avbildet hver 24 timer før cellene når tilnærmet 100% konfluens. Som vist i figur 2, vekstratene i de MCF-7-lego og MCF-7-Δ40p53 celler var sammenlignbare på tvers av alle tidspunkter. Denne metoden gir nyttig cellular informasjon, inkludert å være i stand til å visuelt overvåke cellevekst over flere dager, og sammenligne cellestørrelse og celle Morphologi mellom ulike cellelinjer.

Figur 1
Figur 1: et skjematisk diagram av de tre forskjellige metoder Måling Cell Proliferation Celler ble sådd ut ved tre forskjellige celletettheter opp i flere 96-brønners plater og inkubert ved 37 ° C med 5% CO2 i opp til 96 timer.. Hver 24-timers, celleproliferasjon ble målt ved enten å bruke en hemocytometer, en luminescens-baserte analysen eller celle bildebehandling. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2:. Celleproliferasjon Målinger etter 96 timer celler ble målt hver 24 time for 96 timer i MCF-7-legO og MCF-7-celler sådd ut Δ40p53 ved tre forskjellige celletettheter. -Celler ble målt ved anvendelse av en (a) hemocytometer i celler / ml, (b) ved anvendelse av en luminescens-baserte analysen i relative luminescerende heter (RLU), eller (c) en kontinuerlig celletall ved hjelp av en celle kamera i celler / bilde. Betingelser for cellen imager er vist i tabell 2. Alle forsøkene representerer gjennomsnittet av tre uavhengige eksperimenter, ± SD Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3:. Sammenligning av tre forskjellige metoder Måling Cell Proliferation i brystkreftcellelinjer En lineær regresjonsanalyse ble utført for å sammenligne trene seg forholdet mellom de forskjellige m ethods kontrollert for å måle celleproliferasjon i (a) MCF-7-Lego celler og (b) MCF-7-celler Δ40p53. En Pearsons korrelasjonskoeffisient ble beregnet, og signifikans ble bestemt (p <0,05) mellom de forskjellige metoder som måler celleproliferasjon. Alle resultater representerer gjennomsnitt ± SD av tre uavhengige eksperimenter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4:. Bilder av GFP-positive MCF-7-lego og MCF-7-Δ40p53 brystkreft celler Representative bilder av celler fra 5 x 10 3 seeded celler tatt med et mobilkamera hver 24 time. Målestokk representerer 1000 mikrometer. Parametere for celle avbildning er oppsummert i tabell 2. href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/54350/54350fig4large.jpg" target = "_ blank"> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Celletetthet (celler / brønn)
celletype 1,5 x 10 3 3,0 x 10 3 5 x 10 3
MCF-7-lego 76 pl i 8,4 ml media 152 mikroliter i 8,3 ml media 254 mikroliter i 8,2 ml media
MCF-7-Δ40p53 93 pl i 8,4 ml media 185 mikroliter i 8,3 ml media 308 mikroliter i 8,2 ml media

Tabell 1: Celle Seeding Volumene for 96 brønners plater.

"Fo: keep-med-next.within-side =" always "> Les parametere plate typen 96 brønner Modus Bilde Objektiv 2,5x Farge GFP (469, 525), Bright Feltet Utsettelse Auto Fokus Auto (Scan deretter autofokus)

Tabell 2: Les Parametere for Cell Imaging Bruke Cell Imager.

Tabell 3: Imaging Parametere for Cell Counting Analysis.

Imaging parametere
Terskel 5000
Minste objekt størrelse (um) 30
Maksimal objektstørrelse (mikrometer) 300
MCF-7-lego
R kvadrat p-verdi
Hemocytometer vs. luminescens-baserte analysen 0,6301 0,0021
Cell imager vs. hemocytometer 0,7524 0,0003
Luminescens-baserte analysen vs. celle imager 0,8899 <0.0001
MCF-7-Δ40p53
R kvadrat p-verdi
Hemocytometer vs. luminescence-baserte analysen 0,8983 <0.0001
Cell imager vs. hemocytometer 0,9303 <0.0001
Luminescens-baserte analysen vs. celle imager 0,9805 <0.0001

Tabell 4: Lineær regresjonsanalyse av de tre ulike Formerinasanalyse metoder testet.

Metode Fordeler ulemper tekniske notater endelige resultatet
hemocytometer lav pris Høy menneskelige feil Pipette flere ganger for å fremstille enkeltcellesuspensjon Celler / ml
Krever minimalt med utstyr Krever enkeltcellesuspensjon Utføre flere tellinger for å oppnå nøyaktighet
Direkte legemer Høyt antall celler som er nødvendig for nøyaktig vurdering av celletall
Endpoint
Luminescens-baserte analysen Brukes med multiwell-plateformater Dyrt reagenser Beskytt mot lys Relativ Selvlysende Units (RLU) / brønn
Lett å utføre Krever selvlysende plateleser Inkluder kontrollbrønner for å bestemme bakgrunnen luminescens
rask analyse Temperatur-sensitive
Gir celleviabilitet informasjon Variabel avhengig av metabolsk aktivitet av cellene
indirekte måling
Endpoint
Cell imager kontinuerlig måling dyrt imager Sørg celle imager er satt til 37 ° C Celler / bilde
Temperatur kontroll Skill intensiv Unngå unødvendig risting eller avbrudd av celler
Gir cellular informasjon Variabel avhengig av samløpet av celler
Kostnadseffektiv (hvis du har imager) relativ count
Direkte måling
Automatisert avbildning av flere brønner-plate format

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denne protokollen tre ulike metoder for å måle celleproliferasjon i dyrkede celler ble undersøkt. Hver metode var i stand til å reproduserbare og nøyaktige målinger av celleformering i løpet av 96 timer, og resultatene var sammenlignbare mellom hver av metodene som ble testet (figur 2 og 3). Både luminescens-baserte analysen og celleavbildningsmetode produserte de mest robuste resultater, viser lineær økning i celleproliferasjon etter 96 timer (figur 2b, c). I tillegg celle avbildning over tid er vist noen signifikant forskjell i veksthastigheten mellom de transduserte og ikke-omsatte cellelinjer (figur 4).

Det er mange fordeler og ulemper for hver metode undersøkt i denne protokollen, se tabell 5 for en oppsummering. Den konvensjonelle celletellemetoden ved hjelp av en hemocytometer er en rimelig metode som krever svært lite ekstra reagenser eller effort for å forberede og kjøre. Videre quantitates denne metoden en absolutt celletall i celler / ml 14. Det er imidlertid alvorlige ulemper, som inkluderer den tidkrevende natur av celletelling, høye feilrater som resulterer i store standardavvik mellom tellinger, og det faktum at en høy rekke celle tall er nødvendige for nøyaktig celletall. Dette kan sees på figur 2a, hvor celletelling ved hjelp av hemocytometer viste variable resultater ved lave celletettheter, og store standardavvik på senere tidspunkter. Disse ulempene gjør denne metoden nyttig for celle telling av små utvalgsstørrelser, og utilstrekkelig for større høy gjennomstrømning målinger der mindre tallerken størrelser og seeding tettheter kreves. Disse begrensningene kan bli mildnet hvis celletettheten ble øket, slik at det minimale antall celler tellet begynte ved en terskel som er større enn 100 celler. Jo mer fortynnede cellesuspensjonen, eller senke celle density, jo større sjanse for å telle mindre enn 100 celler, og dermed øke variasjonen mellom gjentak 15. Imidlertid er denne fremgangsmåten uegnet for en 96-brønners plate, på grunn av lave celleoverflate-området, og dermed utilstrekkelig antall celler som kan benyttes i analysen. Dette understreker mangelen på høy gjennomstrømning egenskapene til denne metoden, og en klar ulempe for brukere som krever denne evnen.

Den luminescens-baserte analysen bestemmer cellelevedyktigheten ved å måle mengden av ATP, som er et mål for tilstedeværelsen av metabolsk aktive celler 16. Denne analysen er utformet for høy kapasitets screening av flere prøver i en 96-brønners plateformat for å bestemme cellevekst. Denne enkle metode quantitates celleproliferasjon som en relativ luminescens enhet (RLU) ved anvendelse av en plateleser, som er proporsjonal med den tilstedeværende ATP i metabolsk aktive celler. Men den største ulempe ved denne fremgangsmåte er than koste av reagenset, og avhengigheten av måleverdien på metabolsk aktivitet av cellene. Forskjellige celledyrkningsbetingelser, slik som temperatur eller cellesyklus tidspunkter, kan lett påvirke mengden av ATP som produseres i cellene, noe som er direkte proporsjonal med den luminescerende signalet som genereres av analyse 17. Derfor er det viktig å empirisk å bestemme at betingelsene for forsøket ikke kommer i konflikt med den metabolske aktiviteten til cellene, og potensielt hindre den relative luminescerende signalet generert av cellene.

Den tredje metoden undersøkt for å bestemme celleproliferasjon var en levende celle imager og programvare for å utføre en relativ celletall. Cellen imager har high-throughput funksjoner som den kan automatiseres for å fange opp flere bilder for hver brønn, i sann tid sammen med temperaturstyring, ved hjelp av de samme celler i løpet av varigheten av forsøket. Som vist i figur 4, kan celleproliferasjon være monitored i samme plate over et tidsforløp, noe som kan gi ytterligere informasjon om cellepopulasjon sammen med celletelling analyse. Dette er meget fordelaktig, siden det eliminerer tverrplate variabilitet og celle såing feil, noe som er vanlig i 96-brønners plateformater. Programvaren som følger cellen imager tillater kvantifisering av celletall ved hjelp av de verdier som er oppført i tabell 2 og 3. Det er derfor nyttig i en high-throughput omgivelser og kan lett bli multiplekset med andre assays for å måle cellulære funksjoner som apoptose eller cytotoksisitet. En vesentlig ulempe ved systemet er den programvare som er begrenset i sin evne til å splitte rørende stedene. Selv om det kan utføre denne funksjonen i lavere Confluence celler, er det en stor begrensning av analysen og derfor krever celletype spesifikk optimalisering. Også, mens individuelle eksperimenter ved bruk av et avbildnings er meget lav kostnad på en plate-til-plate skala, denne metoden ville viderely være kostnadseffektivt hvis instrumentet er allerede satt opp i et laboratorium. Derfor tilveiebringer denne en ny fremgangsmåte for måling av celle proliferasjon av dyrkede celler, og har den store fordelen at den krever ingen ytterligere reagenser, og er i stand til 96-brønners plate automatisk telling, noe som gjør denne fremgangsmåte egnet for high-throughput-analyse. Dette er en vesentlig forbedring i forhold til den konvensjonelle hemocytometer celletellingsmetode, og er et mer kostnadseffektivt alternativ til den luminescens-baserte analysen.

Det kritiske trinnet når du bruker mobilkamera er under analysen av bildene og påfølgende celletall per bilde. Disse bildene kan behandles ved hjelp av en rekke celle bilde plattformer. Det er derfor viktig å bestemme den mest passende programvare for celletype under etterforskning. Det ville være nyttig å validere celletall fra bildene kjøpt opp av cellen kamera ved hjelp av ulike bildebehandlingsprogrammer. Denne protokollen kan brukes til eny dyrkede celler, men analyseparametrene ville måtte bli definert for hver cellelinje. Dette kan være tidkrevende i starten, men når parametrene er satt, kan metoden være automatisert til bilde hele plater på en gang.

Det er viktig å merke seg at disse analyser er i virkeligheten et indirekte mål på proliferasjon, som de måler celletall (hemocytometer, celle imager), eller metabolsk aktivitet (luminescens-baserte assay), over en tidsperiode. Disse metodene kan enkelt endres til å måle andre viktige faktorer som kan påvirke spredning. For eksempel kan trypan blå eksklusjon fremgangsmåte lett kan innarbeides i enten den hemocytometer eller celle imager metode for å ekskludere døde celler og dermed bestemme celle-levedyktighet 13. Den luminescens-baserte analysen kan bli multiplekset med en cytotoksisitet analyse for å gi ytterligere informasjon om celle helse, og den metabolske aktiviteten målt i løpet av denne undersøkelse er også en måling av celle viabiheten 12. Derfor er fleksibiliteten av disse analysene for å bli multiplekset med andre metoder for å tilveiebringe ytterligere informasjon, mobilnettet er en sterk fordel av hver av disse metodene.

Denne protokollen brukes den menneskelige brystkreftcellelinje MCF-7 som har vært stabilt transduced med Lego-IG2-puro + vektor som inneholder GFP-genet. Dette tillater bruk av GFP optikk filter av bildet cellene, uten behov for å legge til farvestoffer i dyrkningsmediet. Denne fremgangsmåten kan lett modifiseres for å avbilde GFP-negative celler eller til og med primære cellelinjer, enten med CCD-cellene ved hjelp av lys felt optikk typen, eller ved merking av cellene med en spredning markør. Metodene sammenlignet i denne protokollen er robuste nok til å brukes i en rekke forskjellige cellelinjer, men de optimale protokollinnstillingene for hver enkelt cellelinje bør bestemmes først. Imaging av celler ved hjelp av den lyse feltet kanal representerer det beste alternativet for primær cells eller de som vokser langsomt, på grunn av langsiktig karakter av denne metoden. End-point-analyser, slik som luminescens-baserte analysen, er ikke godt egnet for analyse av langsiktig cellevekst.

Denne protokollen har beskrevet tre forskjellige metoder for å måle celleformering in vitro. Hver metode kan rutinemessig utført i laboratoriet for å måle cellevekst, og de fleste laboratorier vil ha de nødvendige ferdigheter til å utføre en av disse metodene. Det finnes imidlertid også en rekke andre analyser som er tilgjengelige for å måle delende celler. Disse kan omfatte metoder som måler DNA syntese, metabolsk aktivitet, tilknyttede antigener for spredning eller ATP konsentrasjon 9. For eksempel har et antall av metoder blitt utviklet for å måle graden av DNA-syntese av celler ved å merke celler med et radioaktivt stoff, slik som 3H-tymidin. En ulempe ved denne fremgangsmåte er den åpenbare anvendelse av radioaktive stoffer, og deres disposisjon. Annenmetoder som rutinemessig brukes ved måling av celleproliferasjon omfatter bruk av BrdU-merking av nydannede DNA, som kan måles ved hjelp av flowcytometri 18. Flowcytometri kan brukes til å analysere både celle nummer, samt cellesyklus informasjon. Dette kan være et fordelaktig resultat for spesielle forsøk, men ulempene ved denne metoden er den ytterligere tid og trinn, kostbare reagenser og økte bruker trent ferdigheter for å operere den strømningscytometer og analysere de resulterende data 18. Derfor er det mange forskjellige analyser tilgjengelig for forskere å vurdere vekst av celler, og den valgte metoden er i stor grad avhengig av celletype som brukes, brukeren og deres ferdighetsnivå, og hvilken type data som kreves ved endepunktet av eksperimentet.

Som konklusjon, ble tre forskjellige metoder for å måle celleproliferasjon sammenlignet ved hjelp av brystkreftceller. Hver metode har mange fordeler og disadvantages, og er derfor brukeravhengig og basert på deres krav for hvert eksperiment, når det gjelder å bestemme den mest hensiktsmessige analyse for å utføre celletelling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium, no phenol-red ThermoFisher Scientific 21063-045 Supplemented with 10% FBS, 200 mM L-glutamine, 2 µg/ml insulin and 1 µg/ml puromycin
L-glutamine solution (100x) ThermoFisher Scientific 25030-081
Insulin solution human Sigma-Aldrich I9278-5ML
Fetal bovine serum (FBS) Bovogen Biologicals SFBS-F-500ml
Puromycin dihydrochloride Sigma-Aldrich P9620-10ML
0.5% trypsin-EDTA solution (10x) ThermoFisher Scientific 15400-054 Dilute to 2x in DPBS
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) (1x) ThermoFisher Scientific 30028-02
Tissue culture flask, 75 cm2 growth area Greiner Bio-One 658175
Scepter 2.0 Cell Counter Merck Millipore Automated cell counter
96 well multiwell plate, flat bottom Nunc 167008
Improved Neubauer Hemocytometer BOECO Germany BOE 01
Olympus IX51 inverted microscope Olympus IX51
CellTiter-Glo 2.0 Assay Promega G9242 Luminescence-based assay
Cytation 3 Cell Imaging Multi-Mode Reader BioTek Plate reader for luminescence, fluorescence and brightfield cell imaging
Gen5 Data Analysis Software BioTek GEN5

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lane, D. P. Cancer. p53, guardian of the genome. Nature. 358 (6381), 15-16 (1992).
  2. Olivier, M., Hollstein, M., Hainaut, P. TP53 mutations in human cancers: origins, consequences, and clinical use. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (1), a001008 (2010).
  3. Olivier, M., et al. The clinical value of somatic TP53 gene mutations in 1,794 patients with breast cancer. Clin Cancer Res. 12 (4), 1157-1167 (2006).
  4. Bourdon, J. C., et al. p53 isoforms can regulate p53 transcriptional activity. Genes Dev. 19 (18), 2122-2137 (2005).
  5. Avery-Kiejda, K. A., et al. Small molecular weight variants of p53 are expressed in human melanoma cells and are induced by the DNA-damaging agent cisplatin. Clin Cancer Res. 14 (6), 1659-1668 (2008).
  6. Avery-Kiejda, K. A., Morten, B., Wong-Brown, M. W., Mathe, A., Scott, R. J. The relative mRNA expression of p53 isoforms in breast cancer is associated with clinical features and outcome. Carcinogenesis. 35 (3), 586-596 (2014).
  7. Weber, K., Bartsch, U., Stocking, C., Fehse, B. A multicolor panel of novel lentiviral "gene ontology" (LeGO) vectors for functional gene analysis. Mol Ther. 16 (4), 698-706 (2008).
  8. Riss, T. L., Moravec, R. A. Cell Biology. Celis, J. E. , Third Edition, Academic Press. 25-31 (2006).
  9. Ng, K. W., Leong, D. T., Hutmacher, D. W. The challenge to measure cell proliferation in two and three dimensions. Tissue Eng. 11 (1-2), 182-191 (2005).
  10. Riss, T. L., Moravec, R. A. Use of multiple assay endpoints to investigate the effects of incubation time, dose of toxin, and plating density in cell-based cytotoxicity assays. Assay Drug Dev Technol. 2 (1), 51-62 (2004).
  11. Butzler, M., Worzella, T., Hungriano, M., Osorio, F., Hanegraaff, I., Cowan, C. Automated cytotoxicity profiling using the CyBi-FeliX instrument, cell health assays and thaw-and-use cells. , http://au.promega.com/resources/pubhub/automated-profiling-using-the-cybi-felix-instrument-cell-health-assays-and-thaw-and-use-cells (2014).
  12. CellTiter-Glo 2.0 Assay Technical Manual #403. , http://www.promega.com/~/media/files/resources/protocols/technical%20manuals/101/celltiterglo%202%200%20assay%20protocol.pdf (2015).
  13. Banks, P., Brescia, P. J. Application Guide: Automated Digital Microscopy. , http://www.biotek.com/resources/articles/automated-digital-microscopy.html (2015).
  14. Bastidas, O. Cell Counting with Neubauer Chamber: Basic Hemocytometer Usage. , http://www.celeromics.com/en/resources/Technical%20Notes/cell-article-chamber.php (2016).
  15. Bastidas, O. Technical Note: Cell Count for Low Concentration Samples . , http://www.celeromics.com/en/resources/docs/Articles/Low-concentration-cell-counting.pdf (2012).
  16. Riss, T. L., Moravec, R., Niles, A. L., et al. Cell Viability Assays. Assay Guidance Manual[Internet]. Sittampalam, G. S., Coussens, N. P., Nelson, H., et al. , (2013 May 1 [Updated 2015 Jun 29]) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK144065/ (2013).
  17. Quent, V. M., Loessner, D., Friis, T., Reichert, J. C., Hutmacher, D. W. Discrepancies between metabolic activity and DNA content as tool to assess cell proliferation in cancer research. J Cell Mol Med. 14 (4), 1003-1013 (2010).
  18. Crane, J., Mittar, D., Soni, D., McIntyre, C. Cell Cycle Analysis Using the BD BrdU FITC Assay on the BD FACSVerse System. , (2013 May 1 [Updated 2015 Jun 29]) https://www.bdbiosciences.com/documents/BD_FACSVerse_CellCycleAnalysis_AppNote.pdf 1-12 (2011).

Tags

Cancer Biology molekylærbiologi cellevekst brystkreft celle bildebehandling kreft biologi celletelling
Sammenligning av tre forskjellige metoder for bestemmelse Cell Proliferation i brystkreftcellelinjer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Morten, B. C., Scott, R. J.,… More

Morten, B. C., Scott, R. J., Avery-Kiejda, K. A. Comparison of Three Different Methods for Determining Cell Proliferation in Breast Cancer Cell Lines. J. Vis. Exp. (115), e54350, doi:10.3791/54350 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter