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Biology

Comparação de três métodos diferentes de determinação da proliferação celular em linhas celulares de cancro da mama

Published: September 3, 2016 doi: 10.3791/54350
Automatic Translation
1,2, 1,2,3, 1,2
1Medical Genetics, Hunter Medical Research Institute, 2Priority Research Centre for Cancer, School of Biomedical Sciences and Pharmacy, Faculty of Health and Medicine, University of Newcastle, 3Pathology North, John Hunter Hospital

Introduction

O gene supressor do tumor, p53, é um regulador essencial de um número de processos celulares, incluindo a paragem do ciclo celular, apoptose e senescência 1. Ela é responsável pela manutenção da estabilidade genómica, e é, portanto, crucial para manter o equilíbrio de morte celular e o crescimento celular. As mutações em p53 são comuns no cancro e são a principal causa de inactivação de p53 que conduz à proliferação descontrolada de células de cancro 2. Curiosamente, as mutações em p53 representam apenas cerca de 25% dos cancros da mama 3, sugerindo que outros mecanismos são responsáveis ​​pela perda de função de p53. As isoformas p53 recentemente descobertos têm sido mostrados para ser sobre-expresso num certo número de cancros humanos, e são capazes de modular a função de p53 4,5. Nós mostramos anteriormente que a isoforma p53, Δ40p53, é a isoforma mais altamente expresso em cancro da mama, e é significativamente regulada positivamente em células de cancro da mama, quando comparado com tiss normal adjacenteue 6. Após isso, transduzida de forma estável a linha de células do cancro da mama humano MCF-7 para sobre-expressar Δ40p53 usando o LEGO-IG2-Puro + vector (GFP +) 7. Estas células foram utilizadas para investigar se a expressão elevada Δ40p53 aumenta as taxas de proliferação celular em células de cancro da mama.

Existem muitos métodos diretos e indiretos de medição da proliferação celular de células cultivadas in vitro 8,9. Estes podem ser realizadas tanto como medições contínuas ao longo do tempo, ou como ensaios de ponto final 10. Os métodos convencionais são ainda úteis, tais como contagem de células utilizando um hemocitómetro. Este ensaio é um baixo custo e medida direta do número de células, mas não contam com grandes contagens de células e formação altamente qualificada para minimizar desvios de erro e um grande padrão de as contagens. A necessidade de se realizar medidas compatíveis com os formatos de alto rendimento tem levado ao desenvolvimento de ensaios com vários poços de placa. Estes ensaios baseados em luminescência measure número de células com base em um sinal luminescente que é proporcional à actividade metabólica da célula 11,12. Mais recentemente, a introdução de plataformas de imagem de alta conteúdo tem permitido novas ferramentas que monitoram a proliferação de células, proporcionando a coleta de dados fenotípicos quantitativa e qualitativa, e inclui uma variedade de sistemas 13. Todos estes métodos fornecem avenidas para medir o crescimento celular, quer por ensaios de medição ou de ponto de extremidade contínuas, e cada um possui uma série de vantagens e desvantagens no que diz respeito à sensibilidade, taxa de transferência dos dados da amostra, e informações de célula, todas as quais podem ser ponderados em conformidade dependendo sobre a questão de pesquisa.

Este protocolo descreve três métodos diferentes para medir a proliferação celular in vitro, com cada método utilizando diferentes gamas de sensibilidade, reprodutibilidade e formatos de placas multi-poços. Este protocolo teve como objetivo comparar a utilização de um cha hemocit�etro contagemmber, um ensaio de luminescência à base de viabilidade celular, e gerador de imagens de células, na medição da proliferação de células ao longo de um curso de tempo de 96 horas. Para fazer isso, o crescimento de células transduzidas por vetores (MCF-7-LEGO) foi comparada com as células transduzidas para sobre-expressar Δ40p53 (MCF-7-Δ40p53), utilizando três diferentes densidades celulares. A proliferação celular foi medida a cada 24 h durante até 96 h. Cada método verificou-se ter as suas próprias vantagens e desvantagens, e, dependendo do objectivo da experiência, cada um ainda é um método valioso para fornecer informação sobre a taxa de proliferação.

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Protocol

1. Células Preparação para a proliferação Ensaios

Nota: Preparar as duas linhas celulares do mesmo modo e sementes no mesmo formato para cada método a ser analisado.

  1. Crescer células MCF-7 e MCF-LEGO-7-Δ40p53 7 células a 75-80% de confluência em T de 75 cm 2 frascos de cultura de tecidos utilizando fenol-vermelho livre de Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) suplementado com soro fetal bovino a 10% (FBS) , 200 mM de L-glutamina, 2 ug / ml de insulina e 1 ug / ml de puromicina a 37 ° C com 5% de CO 2. Lidar com células em uma biossegurança estéril classe gabinete II.
    Nota: A quantidade de tempo que leva para crescer as células até à confluência varia dependendo da diluição semeadura. Na preparação para o plaqueamento das células para os ensaios de proliferação, as células de semente a uma diluição de 1: 3 em meio DMEM suplementado e manter em condições normais de crescimento durante 3 dias, até 75-80% de confluência.
  2. Para remover as células do frasco, deitar fora os meios de comunicação emum recipiente de resíduos. Imediatamente lavar a camada de células com 2 ml de tripsina 2x pré-aquecido. Aspirar tripsina. Adicionar mais 2 ml de tripsina pré-aquecido para a camada de células e colocar numa incubadora durante 5 min a 37 ° C com 5% de CO 2.
    1. Uma vez que as células de separar, lavar as células com 10 ml de DMEM fresco suplementado aquecido. Transferir a suspensão de células para um tubo de 15 ml estéril e centrifugar a 491 xg durante 5 min à TA. Aspirar cuidadosamente e descartar o sobrenadante.
  3. Ressuspender o sedimento de células em 5 ml de DMEM suplementado fresco. Executar uma contagem de células para determinar a densidade correcta para propagar as células em placas de 96 poços.
    1. Dilui-se 100 ul da suspensão de células em 900 ul de 1x Dulbecco salina tamponada com fosfato (DPBS). Coloque um novo sensor de 60 mm para o contador de células automatizado. Segurar o êmbolo para baixo e submergir o sensor na suspensão diluída de células. Lentamente, liberte o êmbolo no balcão da célula. Remova o sensor do cou celularnter quando concluído.
      Nota: A contagem das células será exibida no contador de células em células / ml.
  4. Semear as células em um volume final de 100 ul de DMEM (em) numa placa de 96 cavidades, com ~ 20% de confluência para permitir espaço para o crescimento de células e a medição da proliferação ao longo de 3-5 dias (ver Tabela 1). Semente todas as linhas de células em triplicado.
    Nota: Para esta experiência, três densidades celulares diferentes foram avaliados para determinar a densidade celular ideal. Os números de células necessários encontram-se resumidos na Tabela 1. Semear as células a uma densidade mais baixa, se é necessária a medição de crescimento mais longo prazo.
    1. Para o hemocitómetro e ensaios à base de luminescência, preparar uma placa por ponto de tempo (isto é, 4 placas por ensaio). Para o ensaio de células Imager, preparar uma única placa para a duração da experiência.
  5. Manter as células a 37 ° C com 5% de CO 2 durante 24 horas.

2. Determinar celular Contagem Using um hemocitômetro

  1. Pré-aquecido tanto médio e tripsina a 37 ° C numa incubadora de cultura de células, forno ou banho-maria. media aspirado de células em um recipiente de resíduos, lave uma vez com 30 mL de tripsina 2x, e aspire a tripsina.
  2. Lave as células mais uma vez com 30 ul de tripsina 2x, e incubar durante 5 minutos a 37 ° C. Bater levemente borda da placa para desalojar as células da placa. Adicionar 50 ul de DMEM suplementado e misturar as células por pipetagem até que as células formam uma suspensão de célula única.
  3. Prepare hemocitômetro por superfície e tampa de vidro limpeza com etanol 70%.
  4. Coloque a tampa do deslizamento de vidro sobre câmaras de contagem e apor até 'de Newton anéis refração' pode ser visto entre as bordas da tampa-derrapante eo hemocitômetro.
    Nota: Estes indicam que a tampa-derrapante tem corretamente aderido à hemocitômetro.
  5. Gentilmente pipeta 20 ul de suspensão de células sob a tampa-derrapante, enchendo a câmara de contagem pelo movimento capilar.Coloque hemocit�etro em 10x de um microscópio e visualizar as câmaras de contagem no layout grid.
  6. Contagem de células do 4 quadrados exteriores da disposição da grade. Para melhorar a precisão, número de repetições de quadrados exteriores adicionais, se necessário, ou até a contagem atingiu 70 - 100 células 14,15.
    1. Calcule a concentração de células por mL, como se segue: Média da contagem de células por factor de diluição x quadrado (se usado) x 10 4
  7. Repita os passos de 2,1-2,8 a cada 24 horas para 96 ​​horas pós-semeadura.

3. determinando a proliferação celular utilizando um ensaio à base de luminescência

Nota: Esta é uma medida endpoint. Uma vez que o reagente é adicionado às células, a placa só pode ser quantificada uma vez.

  1. reagente de luminescência Thaw em um 22 ° C banho de água durante 30 minutos.
  2. Misturar suavemente reagente, invertendo o frasco para se obter uma mistura homogénea.
  3. Equilibrar uma placa de células semeadas (da etapa1,5) à temperatura ambiente durante 30 min.
  4. Adiciona-se 100 ul de reagente de luminescência de cada poço. Misturar o conteúdo em um agitador orbital durante 2 min. Permitir que a placa a incubar durante 10 min à temperatura ambiente.
  5. A criação de um experimento de luminescência utilizando o software leitor de placas multi-modo.
    1. Ligue leitor de placas multi-modo e abrir o software. No 'gerenciador de tarefas ", selecione" experiências "e" criar new'.Select' file 'da barra de ferramentas lateral, e sob "protocolo" guia, selecione "Procedimento".
    2. Selecione 'Grenier 96 fundo plano "tipo de placa, e marque a caixa" uso tampa'. Selecione a ação "ler" sob a caixa "método lidas '. Selecione método de detecção de "luminescência". Clique em 'OK'.
    3. Na caixa de etapa ler, selecione os poços a serem digitalizados na guia "prato cheio", e selecione poços de agir poços como em branco.
    4. Definir o conjunto de filtros para filtrar vazio (por exemplo, plugue, Em: buraco, espelho: nenhum). Definir o ganho para135, com um tempo de integração de 0,5 s por poço e uma altura de 6,5 mm ler. Clique em "OK" para salvar as configurações para a leitura de luminescência.
  6. Executando uma luminescentes Leia
    1. Ejectar suporte da placa, selecionando guia 'controle de instrumentos' e clique em 'placa out'.Place placa de 96 poços no suporte da placa, assegurando a tampa está ligado. Feche o suporte da placa, clicando em 'placa em' Guia sob 'controle de instrumentos. Clique em 'leia agora "na barra de ferramentas para executar leitura luminescente.
    2. Exportar as medições relativas unidade luminescente (RLU) de cada poço para uma folha de cálculo para análise posterior.
  7. Repita os passos de 3,1-3,6 para gravar a proliferação cada 24 horas até 96 horas após a semeadura células.

4. Determinar contagem de células utilizando um gerador de imagens celular

  1. A criação de um experimento de imagens de células usando o software gerador de imagens de células multi-mode
    1. Ligue imager célula multi-modo e th abertae software.
    2. No 'gerenciador de tarefas', selecione a aba 'experimentos' e 'criar new'.On o' 'da barra de ferramentas, clique em' arquivo 'guia e aberto' protocolo de procedimento de ajuste de temperatura ação "tab.Select ''. Definir incubadora para 'on' e ajustar a temperatura para 37 ° C e verificar "pré-aquecimento" antes de continuar com a caixa próximo passo '. Clique em "OK" para salvar as configurações.
    3. Selecione a ação 'ler'. Clique no método de detecção de 'imagem', selecione 'endpoint / cinético "ler tipo e tipo de óptica" Filtros ". Clicar em 'OK'.Click em "guia prato cheio' e selecione poços na placa a ser trabalhada. Clique em "OK" para salvar as configurações.
    4. Selecione o objetivo 2.5X no menu suspenso opções «objectivos». Sob a aba "canais", selecione dois canais: GFP 469, 525 e Campo brilhante. Verificar a exposição 'auto' para ambos os canais e selecione o auto-exposição bem.
    5. Para determinar auto ajustes de foco, selecione "auto-foco" e clique em "Opções". Para as opções de foco automático, selecione o método de "digitalizar e foco automático '. Clique em "OK" para salvar as configurações.
    6. Defina o deslocamento horizontal e vertical do centro de bem (im) para 0.Select para digitalizar várias imagens por poço em uma montagem 3 x 2, com espaçamento horizontal (mm) = 2.881 e espaçamento vertical (mm) = 2.127. Clique em "OK" para salvar as configurações do procedimento.
      Nota: Consulte a Tabela 2 para os parâmetros de leitura.
  2. Realizando Leia Experiment na placa Selecionado
    1. Clique na aba 'controle de instrumentos' e selecione o 'prato out' function.Place placa de 96 poços no suporte da placa, assegurando a tampa está ligado. No separador 'controle de instrumentos ", selecione a opção' placa em 'função. Selecione 'ler agora "a partir do separador placa. Repita ler cada 24 horas até 96 horas após a semeadura.
  3. Análise da contagem celular utilizando oCelular Software Imager.
    1. Para analisar uma imagem, clique na guia "Dados" na placa com imagens, 'imagem [GFP 469, 525 + campo Bright] "select. Dê um duplo clique em um bem trabalhada.
    2. Clique em uma imagem carregada. Selecione "Analisar" e selecionar uma única imagem da montagem a ser analisado. Clique em 'OK'.Check o "GFP" canal só, e definir os parâmetros, conforme descrito na Tabela 3. Clique em' Start 'para aplicar os parâmetros para as células fotografada.
    3. Observar a máscara contagem das células colocadas sobre as células fotografadas, que é usado para determinar a contagem de células por imagem. Clique em "Aplicar alterações" e manter essas configurações para cada placa fotografada durante todo o experimento.
    4. Depois de voltar à placa com imagens, clique sobre a queda de 'dados' no menu suspenso e selecione 'contagem de células'. Isto irá gerar a contagem total de células por poço.
    5. Exportar todos os dados para uma planilha, clicando na guia "exportação" para posterior análise of as contagens de células por poço.

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Representative Results

Para estudar diferentes métodos de medição da proliferação de células em cultura, a proliferação de células de MCF-7-Δ40p53 células transduzidas foi comparado com o MCF-7-LEGO não transduzidas linha celular de cancro da mama. Os três métodos que foram comparados - o método de imagiologia hemocitómetro convencional, ensaio de luminescência a viabilidade das células, e células Análisis- são descritas no diagrama esquemático (Figura 1). Cada método tem vantagens e desvantagens para medir com precisão de contagem de células ao longo do tempo, e o método mais eficaz depende dos requisitos de ponto final da experiência e a informação que pode ser adquirida por uma população de células.

O crescimento de células MCF-7- Δ40p53 MCF-7-LEGO e foram medidas após 24 horas durante 4 dias. Como mostrado na Figura 1, as duas linhas celulares foram semeadas a três densidades celulares diferentes (1,5 x 10 3 3; 5 x 10 3 células / poço) e a célula de contagem foi realizada 24, 48, 72 e 96 horas após a sementeira. Cada método demonstrou aumento da proliferação de células, utilizando um hemocitómetro, um ensaio baseado em luminescência, e um gerador de imagens de células (Figuras 2a, b e c, respectivamente) ao longo de 96 h. O maior aumento na proliferação das células foi observada a uma densidade de células mais elevada (5 x 10 3 células), e também mostrou os resultados mais reprodutíveis em cada ponto de tempo, sugerindo que este seja a densidade celular óptima para a medição da proliferação nestas células. Não houve diferença significativa na proliferação de células entre linhas de células.

A medição da proliferação de células entre as diferentes métodos foram comparados por uma análise de regressão linear 6 (Figura 3, Tabela 4). Houve uma correlação significativa entre cada um dos diferentes métodos testados, comparando cEll proliferação em todas as densidades celulares em ambas as linhas celulares (Figura 3a e b). Observou-se a correlação mais forte entre a comparação do ensaio à base de luminescência, e o gerador de imagens de células (R2 = 0,8899, p ≤0.0001; R2 = 0,9805, p ≤0.0001, Figura 3a e b, respectivamente).

Uma representação visual de proliferação celular utilizando o gerador de imagens de células é mostrado (Figura 4). Como este método utiliza medições contínuas de uma única placa, as células podem ser visualizados todos os 24 horas até as células atingirem perto de 100% de confluência. Como mostrado na Figura 2, as taxas de crescimento das células-Δ40p53 MCF-7 de células MCF-7-LEGO e foram comparáveis ​​entre todos os pontos de tempo. Este método proporciona informação celular útil, inclusive sendo capaz de monitorar visualmente crescimento celular em vários dias, e comparar o tamanho das células e morfo celularlogia entre as diferentes linhas celulares.

figura 1
Figura 1: um diagrama esquemático dos três métodos diferentes medição da proliferação celular As células foram semeadas a três densidades celulares diferentes em várias placas de 96 poços e incubadas a 37 ° C com 5% de CO 2 durante até 96 h.. Cada 24 horas, a proliferação celular foi medida por um ou outro usando um hemocitômetro, um ensaio ou célula de imagem baseado em luminescência. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2:. Medidas Proliferação Celular após contagem de 96 horas celulares foram medidos a cada 24 horas para 96 horas em MCF-7-Legcélulas de S e MCF-7-Δ40p53 semeadas em três diferentes densidades celulares. As contagens de células foram medidos usando um (a) hemocitómetro em células / ml, (b), utilizando um ensaio baseado em luminescência em unidades luminescentes relativas (RLU), ou (c) uma contagem de células contínua usando um gerador de imagens de células células / imagem em. Condições para o gerador de imagens de células são apresentados na Tabela 2. Todos os experimentos representam a média de três experimentos independentes, ± SD Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3:. Comparação de três métodos diferentes de medição proliferação celular em linhas celulares de cancro da mama A análise de regressão linear foi realizada para comparar as relações correlativas entre os diferentes m étodos examinados para medir a proliferação de células em (a) células MCF-7-LEGO e (b) as células MCF-7-Δ40p53. Um coeficiente de correlação de Pearson foi calculado e a significância foi determinada (P <0,05) entre os diferentes métodos que medem a proliferação celular. Todos os resultados representam a média ± o desvio padrão de três experiências independentes. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4
Figura 4:. Imagens de GFP-positivas MCF-7-LEGO e MCF-7-Δ40p53 células cancerosas da mama Imagens representativas de células a partir de 5 x 10 3 células semeadas capturado usando um gerador de imagens de células a cada 24 horas. A barra de escala representa 1.000 m. Parâmetros para imagens de células encontram-se resumidos na Tabela 2. href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/54350/54350fig4large.jpg" target = "_ blank"> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A densidade celular (células / poço)
tipo de célula 1,5 x 10 3 3,0 x 10 3 5 x 10 3
MCF-7-LEGO 76 ul 8,4 ml em meios 152 ul em 8,3 ml de meio 254 ul em 8,2 ml de meio
MCF-7-Δ40p53 93 ul 8,4 ml em meios 185 ul em 8,3 ml de meio 308 ul em 8,2 ml de meio

Tabela 1: celular Semeando Volumes para placas de 96 poços.

"Fo: manter-com-next.within-page =" always "> Leia parâmetros tipo de placa 96 bem Modo Imagem Objetivo 2.5X Cor GFP (469, 525), Campo brilhante Exposição Auto Foco Auto (Digitalizar, em seguida, o foco automático)

Tabela 2: Leia Parâmetros para imagens de células Usando o Imager celular.

Tabela 3: Geração de parâmetros para análise de células de contagem.

parâmetros de imagem
Limite 5000
tamanho do objeto mínima (mm) 30
tamanho do objeto máxima (mm) 300
MCF-7-LEGO
quadrada R p-valor
Hemocitómetro vs ensaio baseado em luminescência 0,6301 0,0021
Imager celular vs. hemocit�etro 0,7524 0,0003
Ensaio baseado em luminescência vs. imager celular 0,8899 <0.0001
MCF-7-Δ40p53
quadrada R p-valor
Hemocit�etro vs. luensaio baseado em minescence 0,8983 <0.0001
Imager celular vs. hemocit�etro 0,9303 <0.0001
Ensaio baseado em luminescência vs. imager celular 0,9805 <0.0001

Tabela 4: Regressão Linear Análise dos três métodos de proliferação diferentes testadas.

Método vantagens desvantagens notas técnicas saída final
hemocit�etro Baixo custo erro humano alta Pipetar várias vezes para preparar a suspensão de células individuais Células / ml
Requer o mínimo de equipamento Requer a suspensão de uma única célula Executar várias contagens para conseguir precisão
contagem celular directa Elevado número de células necessário para avaliação precisa da contagem de células
Endpoint
Ensaio baseado em luminescência Use com formatos de vários poços de placas reagentes caros Proteger da luz Unidades luminescentes Relativa (RLU) / bem
Fácil de executar Requer leitor de placas luminescentes Incluem poços de controlo para determinar a luminescência fundo
ensaio rápido sensível à temperatura
Fornece informações viabilidade celular Variável em função da actividade metabólica de células
medida indireta
Endpoint
imager celular medição contínua imager caro Assegurar Imager célula é ajustado para 37 ° C Células / imagem
Controle de temperatura habilidade intensiva Evitar a agitação desnecessária ou ruptura das células
Fornece informações celular Variável, dependendo confluência de células
Relação custo-benefício (se você tiver o gerador de imagens) contagem relativa
medição direta
de imagem automatizado de formato de múltiplas cavidades de placas

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Discussion

Neste protocolo foram examinados três diferentes métodos de medição da proliferação celular em células em cultura. Cada método foi capaz de medições reprodutíveis e precisos de proliferação de células durante 96 h, e os resultados foram comparáveis ​​entre cada um dos métodos testadas (Figura 2 e 3). Tanto o ensaio à base de luminescência e método de imagem de células produzido os resultados mais robustos, mostrando um aumento linear na proliferação de células após 96 horas (Figura 2b, c). Adicionalmente, imagens de células ao longo do tempo representado não houve diferença significativa nas taxas de crescimento entre as linhas de células transduzidas e não transduzidas (Figura 4).

Há muitas vantagens e desvantagens de cada método examinada neste protocolo, consulte a Tabela 5 para um resumo. O método convencional de contagem de células utilizando um hemocitómetro é um método de baixo custo que requer muito pouco ou reagentes adicionais effort para preparar e executar. Além disso, este método quantifica uma contagem absoluta de células em células / ml 14. No entanto, existem desvantagens graves, que incluem o tempo que demora a contagem celular, as taxas de erro elevadas que resulta em grandes desvios padrão entre as contagens, e o facto de uma grande gama de números de células são necessárias para a contagem de células precisas. Isto pode ser visto na Figura 2A, onde a contagem celular utilizando o hemocitómetro mostrou resultados variáveis ​​com as densidades celulares baixas, e os grandes desvios padrão nos pontos de tempo posteriores. Estas desvantagens tornam este método útil para contagem de células de amostras de pequenas dimensões, e inadequado para medições de alto rendimento maiores, onde são necessários tamanhos de placas menores e densidades de semeadura. Estas limitações podem ser aliviados se a densidade de células foi aumentado, de modo a que o número mínimo de células contadas começou com um limite de maior do que 100 células. Quanto mais diluída a suspensão de células, ou diminuir a célula density, maior a chance de contar a menos de 100 células e, portanto, aumentando a variabilidade entre replica 15. No entanto, este método não é adequado para uma placa de 96 poços, devido à área de superfície celular baixa, e, por conseguinte, o número insuficiente de células que pode ser utilizado na análise. Isso destaca a falta de capacidades de alto rendimento deste método e uma clara desvantagem para os usuários que exigem esta capacidade.

O ensaio baseia-luminescência determina a viabilidade das células medindo a quantidade de ATP, o que é uma medida da presença de células metabolicamente activas 16. Este ensaio é concebido para triagem de alto rendimento de múltiplas amostras num formato de placa de 96 poços para determinar a proliferação celular. Este método simples quantifica a proliferação celular como uma unidade de luminescência relativa (RLU), utilizando um leitor de placas, o qual é proporcional ao ATP presente nas células metabolicamente activas. No entanto, a grande desvantagem deste método é tele custo do reagente, e a dependência da medição da actividade metabólica das células. As várias condições de cultura de células, tais como pontos de temperatura ou de tempo do ciclo celular, pode facilmente afectar a quantidade de ATP produzida pelas células, o que é directamente proporcional ao sinal luminescente gerado pelo ensaio de 17. Portanto, é importante para determinar empiricamente que as condições da experiência não interferir com a actividade metabólica das células e potencialmente impedir o sinal luminescente relativa gerada pelas células.

O terceiro método examinados para determinar a proliferação celular foi um gerador de imagens de células vivas e software para executar uma contagem de células relativo. O gerador de imagens de células tem capacidades de alto rendimento, uma vez que pode ser automatizado para capturar imagens múltiplas para cada poço, em tempo real, juntamente com controle de temperatura, utilizando as mesmas células ao longo da duração do ensaio. Como mostrado na Figura 4, a proliferação de células pode ser monitored na mesma placa ao longo de um curso de tempo, que pode proporcionar informação adicional sobre a população de células juntamente com a análise de contagem de células. Isto é muito vantajoso, uma vez que elimina a variabilidade inter-chapa e de erro sementeira de células, o que é comum em 96 formatos de placa de poços. O software que acompanha o gerador de imagens de células permite a quantificação de contagens de células, usando os parâmetros descritos na Tabela 2 e 3. É, portanto, útil num ambiente de alto rendimento e pode ser facilmente multiplexados com outros ensaios para medir as funções celulares, tais como apoptose ou citotoxicidade. Uma grande desvantagem do sistema é o software, que é limitada na sua capacidade para dividir tocar objectos. Embora possa desempenhar esta função em células de confluência inferiores, é uma das principais limitações do ensaio e, por conseguinte, requer a optimização específicas do tipo de célula. Além disso, enquanto experiências individuais usando um gerador de imagens são muito baixo custo em uma escala placa-a-placa, este método faria emly ser rentável se o instrumento já está configurado em um laboratório. Portanto, esta proporciona um novo método para medir a proliferação celular de células de cultura, e tem a grande vantagem de que não requer reagentes adicionais, e é capaz de placa de 96 poços a contagem automatizada, tornando este método adequado para a análise de alto rendimento. Esta é uma melhoria significativa sobre o método de contagem celular hemocitómetro convencional, e é uma opção de custo mais eficaz para o ensaio à base de luminescência.

O passo crítico ao usar o gerador de imagens de células é durante a análise das imagens capturadas e contagem de células subsequente por imagem. Estas imagens podem ser processadas através de um número de plataformas de imagem de células. Por conseguinte, é fundamental para determinar o software mais adequado para o tipo de células sob investigação. Seria útil para validar as contagens de células a partir das imagens adquiridas por o gerador de imagens de células utilizando o software de imagem diferente. Este protocolo poderia ser aplicada para umacélulas cultivadas y, no entanto, os parâmetros de análise teria que ser definidas para cada linha celular. Isto pode ser demorado no início, mas uma vez que os parâmetros tenham sido definidos, o método pode ser automatizada para a imagem placas inteiras de uma vez.

É importante notar que estes ensaios são, de facto, uma medida indirecta da proliferação, tal como se mede o número de células (hemocitómetro, gerador de imagens de células), ou actividade metabólica (ensaio à base de luminescência), ao longo de um período de tempo. Estes métodos podem ser facilmente alterada para medir outros fatores importantes que podem influenciar a proliferação. Por exemplo, o método de exclusão de azul de tripano pode facilmente ser incorporada quer o método de hemocitómetro ou gerador de imagens de célula para excluir as células mortas e, portanto, determinar a viabilidade das células 13. O ensaio baseia-luminescência podem ser multiplexados com um ensaio de citotoxicidade para fornecer informações adicionais sobre a saúde das células, e a actividade metabólica medida durante este ensaio é também uma medida da célula viabilidade 12. Por conseguinte, a flexibilidade destes ensaios a ser multiplexado com outros ensaios para fornecer informação adicional celular é uma forte vantagem de cada um destes métodos.

Este protocolo utilizado a linha celular de cancro da mama humano MCF-7, que foram transduzidas de forma estável com o LEGO-IG2-Puro + vector contendo o gene da GFP. Isto permite o uso do filtro GFP óptica de imagem das células, sem a necessidade de adicionar qualquer agente corante para o meio de cultura. Este método pode ser facilmente modificado para a imagem células GFP-negativo ou linhas celulares primárias mesmo, quer por imagiologia de células utilizando o tipo de campo brilhante óptica, ou por marcação das células com um marcador de proliferação. Os métodos comparados neste protocolo são suficientemente robusto para ser utilizado numa ampla variedade de diferentes linhas celulares, no entanto, as configurações do protocolo óptimas para cada linha celular individual deve ser determinada em primeiro lugar. Imagiologia de células utilizando o canal de campo claro representa a melhor opção para ce primárialls ou aqueles que são de crescimento lento, devido à natureza de longo prazo deste método. Os ensaios de ponto final, tal como o ensaio à base de luminescência, não são bem adequadas para a análise do crescimento das células a longo prazo.

Este protocolo foi descrito três métodos diferentes para medir a proliferação de células in vitro. Cada método pode ser realizado rotineiramente em laboratório para medir o crescimento celular, ea maioria dos laboratórios que possuem as habilidades necessárias para realizar um dos seguintes métodos. No entanto, há também uma variedade de outros ensaios disponíveis para a medição de células em divisão. Estes podem incluir métodos que medem a síntese de ADN, a actividade metabólica, antigénios associados de proliferação ou a concentração de ATP 9. Por exemplo, um número de ensaios foram desenvolvidos para medir a taxa de síntese de ADN de células por marcação das células com uma substância radioactiva, tal como 3H-timidina. Uma desvantagem deste método é a utilização de substâncias radioactivas óbvio, e à sua eliminação. De outrosmétodos que são rotineiramente utilizados para medir a proliferação celular incluem o uso de marcação com BrdU de ADN recém-formada, que pode ser medida utilizando citometria de fluxo 18. A citometria de fluxo pode ser utilizado para analisar tanto o número de células bem como a informação do ciclo celular. Isso pode ser um resultado vantajoso para as experiências particulares, no entanto as desvantagens deste método incluem o tempo adicional e passos, reagentes caros e aumento de habilidades treinados pelo usuário, a fim de operar o citômetro de fluxo e analisar os dados resultantes 18. Portanto, existem muitos ensaios diferentes disponíveis para os cientistas para avaliar o crescimento das células, e o método escolhido é em grande parte dependente do tipo de célula utilizado, o utilizador e o seu nível de habilidade, e o tipo de dados necessários para o ponto final da experiência.

Em conclusão, três diferentes métodos de medir a proliferação celular foram comparados usando células de câncer de mama. Cada método tem muitas vantagens e disadvantagES, e é, portanto, e com base nos seus requisitos para cada experimento dependente do utilizador, em termos de determinação do doseamento mais apropriado para realizar a contagem de células.

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Disclosures

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium, no phenol-red ThermoFisher Scientific 21063-045 Supplemented with 10% FBS, 200 mM L-glutamine, 2 µg/ml insulin and 1 µg/ml puromycin
L-glutamine solution (100x) ThermoFisher Scientific 25030-081
Insulin solution human Sigma-Aldrich I9278-5ML
Fetal bovine serum (FBS) Bovogen Biologicals SFBS-F-500ml
Puromycin dihydrochloride Sigma-Aldrich P9620-10ML
0.5% trypsin-EDTA solution (10x) ThermoFisher Scientific 15400-054 Dilute to 2x in DPBS
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) (1x) ThermoFisher Scientific 30028-02
Tissue culture flask, 75 cm2 growth area Greiner Bio-One 658175
Scepter 2.0 Cell Counter Merck Millipore Automated cell counter
96 well multiwell plate, flat bottom Nunc 167008
Improved Neubauer Hemocytometer BOECO Germany BOE 01
Olympus IX51 inverted microscope Olympus IX51
CellTiter-Glo 2.0 Assay Promega G9242 Luminescence-based assay
Cytation 3 Cell Imaging Multi-Mode Reader BioTek Plate reader for luminescence, fluorescence and brightfield cell imaging
Gen5 Data Analysis Software BioTek GEN5

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References

  1. Lane, D. P. Cancer. p53, guardian of the genome. Nature. 358 (6381), 15-16 (1992).
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Comparação de três métodos diferentes de determinação da proliferação celular em linhas celulares de cancro da mama
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Morten, B. C., Scott, R. J., Avery-Kiejda, K. A. Comparison of Three Different Methods for Determining Cell Proliferation in Breast Cancer Cell Lines. J. Vis. Exp. (115), e54350, doi:10.3791/54350 (2016).

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