Meme Kanseri Hücre Hatlarında Hücre Proliferasyonunu belirlenmesi için üç Farklı Yöntemlerle Karşılaştırılması

Introduction

Tümör bastıncı gen p53, hücre döngüsünün durdurulması, apoptoz ve yaşlanma ¹ de dahil olmak üzere hücresel süreçleri, bir dizi önemli bir düzenleyicidir. Bu genomik stabilite bakımından sorumlu olan, ve bu nedenle, hücre ölümü ve hücre büyümesinin dengesini sağlamak için çok önemlidir. P53 mutasyonlar kanser yaygındır ve kontrolsüz kanseri hücre çoğalması ² giden p53 etkisizleştirme başlıca nedenidir. İlginç bir şekilde, p53 mutasyonlar diğer mekanizmalar p53 fonksiyonunun kaybının sorumlu olduğunu göstermektedir, meme kanserlerinin ³ yaklaşık% 25'ini oluşturmaktadır. En son keşfedilen p53 izoformları insan kanserlerinde bir dizi fazla sentezlendiği gösterilmiştir ve p53 fonksiyonunu ^4,5 modüle edebilirler. P53 izoformu Δ40p53, göğüs kanseri en yüksek şekilde tanımlanan izoform olduğu daha önce gösterilmiştir ve normal komşu Tiss karşılaştırıldığında önemli ölçüde, meme kanseri hücrelerinde yukarı-regüle edildiğiniue ^6. Bunu takiben, stabil bir şekilde LEGO'nun-Ig2-Puro + vektörüne (GFP +) ⁷ kullanarak Δ40p53 aşın sunmak için insan göğüs kanseri hücre çizgisi, MCF-7 kalıt. Bu hücreler yüksek Δ40p53 sentezleme göğüs kanseri hücrelerinin hücre proliferasyonu oranlarını arttırır araştırmak için kullanıldı.

In vitro ^8,9 kültürlenen hücrelerin hücre çoğalmasını ölçmek için bir çok, doğrudan ve dolaylı yöntem vardır. Bu süre boyunca sürekli ölçümleri, veya nokta tahlilleri ¹⁰ olarak da gerçekleştirilebilir. Geleneksel yöntemler, bir hemasitometre kullanarak hücre sayımı olarak, hala yararlıdır. Bu tahlil düşük maliyetli ve hücre sayısının doğrudan ölçüsüdür, ancak sayıları hata ve geniş standart sapma en aza indirmek için büyük hücre sayımları ve çok yetenekli eğitim güvenmek yok. Yüksek verimli biçimleri ile uyumlu ölçümler yapmak için gerekli çukurlu levha tahlillerinin geliştirilmesine yol açmıştır. Bu parlaklık bazlı deneyler measuhücre ^11,12 metabolik aktivitesi ile orantılıdır bir lüminesan sinyal göre hücre sayıları yeniden. Daha yakın zamanlarda, yüksek içerik görüntüleme platformları tanıtımı nicel ve nitel fenotipik veri toplama sağlarken hücre çoğalmasını izlemek yeni araçlar için izin verilen ve sistemlerin ¹³ çeşitli içerir olmuştur. Tüm bu yöntemler sürekli ölçüm ya da bitiş noktası deneyleri yoluyla, hücre büyümesini ölçmek için yollar sağlamak ve her bağlı buna göre tartılır olabilir bütün bunlar duyarlılık açısından, örnek numaraları verimi ve hücre bilgileri ile avantaj ve dezavantajları bir dizi sahip araştırma sorusu üzerine.

Bu protokol, hassasiyet, tekrarlanabilirlik ve çok-yuvalı plaka formatlarında farklı aralıkları kullanılarak, her yöntem ile, in vitro olarak hücre proliferasyonunu ölçmek için üç farklı yöntem tarif eder. Bu protokol hemositometre sayma cha kullanımını karşılaştırmayı amaçladıkmber, 96 saatlik bir süre boyunca, hücre çoğalmasının ölçülmesi bir lüminesans-bazlı hücre canlılığı deneyi ve hücre görüntüleme. Bunu yapmak için, vektör transduse hücreleri (MCF-7-LEGO'nun) büyüme üç farklı hücre yoğunlukları kullanılarak Δ40p53 (MCF-7-Δ40p53) aşırı ifade etmek için dönüştürülmüş hücrelere karşılaştırılmıştır. Hücre çoğalması kadar 96 saat boyunca her 24 saatte ölçülmüştür. Her yöntemin kendine özgü avantajları ve dezavantajları var bulundu ve deney amaca bağlı olarak, her hala çoğalması oranı hakkında bilgi veren değerli bir yöntemdir oldu.

Protocol

Çoğalma Tahliller için hazırlanması 1. Hücreler

Not: her yöntem analiz için aynı biçimde aynı şekilde ve tohum iki hücre çizgileri hazırlamak.

1. T- MCF-7-Lego ve MCF-7-Δ40p53 75 ^cm2 doku kültürü şişeleri 75-80% konfluansa ⁷ hücreleri büyümek kırmızısız fenol,% 10 cenin sığır serumu ile takviye edilmiş Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) (FBS) , 200 mM L-glutamin, 2 ug / ml insülin, ve% 5 _CO2 ile 37 ° C 'de 1 ug / ml Puromisinin. Steril bir biyogüvenlik kabini sınıf II hücreleri anlaştım.
   Not: izdiham hücreleri büyümek için geçen süre tohumlama seyreltme bağlı olarak değişir. Çoğalma denemeleri hücreleri kaplama için hazırlık olarak, 1 hücreleri tohum: takviye edilmiş DMEM içinde 3 seyreltme ve% 75-80 konflüansa kadar 3 gün boyunca normal büyüme koşullarında muhafaza.
2. içine medya dökünüz, şişesi hücreleri çıkarmak içinBir çöp konteyneri. Hemen önceden ısıtılmış 2x tripsin 2 ml hücre tabakası yıkayın. Aspire tripsin. % 5 _CO2 ile 37 ° C de 5 dakika süreyle bir inkübatör hücre tabakası ve yere önceden ısıtılmış tripsin bir 2 ml ilave edilir.
   1. Hücreler ayırmak kez taze DMEM takviye ısıtılan 10 ml hücreleri yıkayın. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 491 x g'de, steril bir 15 ml tüp ve santrifüj hücre süspansiyonu aktarın. Dikkatle aspire ve süpernatant atın.
3. Taze DMEM 5 ml hücre pelletini. 96-delikli plakalardaki hücreler tohum doğru yoğunluğu belirlemek için bir hücre sayımı gerçekleştirin.
   1. 900 ul 1X Dulbecco Fosfat Tamponlu Salin (DPBS) içinde hücre süspansiyonu 100 ul seyreltilir. otomatik hücre tezgahın üzerine yeni bir 60 mikron sensörünü yerleştirin. pistonu basılı tutun ve seyreltilmiş hücre süspansiyonu sensörü daldırın. Yavaş yavaş hücre tezgahın üzerine pistonu bırakın. Hücre cou gelen sensörünü çıkarınnter Tamamlandığında.
      Not: Hücre sayısı hücre / ml hücre sayacı görüntülenir.
4. % 20 konfluansa ° 'de, bir 96-çukurlu plaka içinde (DMEM), 100 ul'lik bir son hacim tohum hücreleri 3-5 gün (Tablo 1 e bakınız) üzerinden çoğalması, hücre büyümesi ve ölçümü için yer açmak için. üç kez tüm hücre hatları tohumu.
   Not: Bu deney için, üç farklı hücre yoğunlukları en uygun hücre yoğunluğu belirlemek için değerlendirildi. Gerekli hücre sayıları Tablo 1'de özetlenmiştir. Tohum hücreleri düşük yoğunlukta daha uzun vadeli büyüme ölçümü gerekirse.
   1. Hemasitometre ve lüminesans tabanlı deneyleri için, (yani deney başına 4 tabak) zaman noktası başına bir tabak hazırlayın. Hücre görüntüleme deneyi için, deney süresince sadece bir plaka hazırlanması.
5. 24 saat boyunca% 5 _CO2 ile 37 ° C 'de hücreleri korumak.

2. belirlenmesi Hücre Bize güveninHemasitometre ing

1. bir hücre kültür inkübatörü içinde 37 ° C'de önceden sıcak hem de orta ve tripsin, fırında ya da su banyosu. Bir atık kabı içine hücrelerden aspire medya, 2x tripsin 30 ul ile bir kez yıkayın ve tripsin aspire.
2. 2x tripsin 30 ul ile tekrar hücreler yıkanır ve 37 ° C'de 5 dakika süreyle inkübe edilir. Yavaşça plaka hücreleri çıkarmak için plakanın kenarına dokunun. takviye edilmiş DMEM içinde 50 ul ilave edin ve hücreleri, tek bir hücre süspansiyonu oluşana kadar pipetleme ile hücrelerin karışımı.
3. % 70 etanol ile yüzey ve cam kapağı temizleme hemasitometre hazırlayın.
4. sayma odaları üzerinde cam kapak-slip yerleştirin ve 'Newton kırılma halkaları' kapak kayma kenarları ve hemasitometre arasında görülebilir kadar yapıştırın.
   Not: Bu kapak-slip doğru hemasitometre yapıştırılır işaret etmektedir.
5. Yavaşça kılcal hareketi ile sayma odasını doldurmak, kapak kayma altında hücre süspansiyonu 20 ul pipetle.Bir mikroskop 10x büyütme altında hemasitometre yerleştirin ve ızgara düzeninde sayma odaları görselleştirmek.
6. ızgara düzeni 4 dış meydanlarında hücreleri saymak. Doğruluğu artırmak için ek dış kareler tekrar sayımı gerekli ya da sayısı kadar 70 ulaştıysa - 100 hücre ^14,15.
   1. Aşağıdaki gibi ml başına hücre konsantrasyonunu hesaplayın: kare x seyreltme faktörü başına ortalama hücre sayısını (kullanılıyorsa) 10 ⁴ x
7. Tekrarlayın 2,1-2,8 her 24 saat 96 saat sonrası tohumlama adımları.

3. Lüminesans bazlı analiz kullanılarak hücre çoğalması belirleme

Not: Bu bir bitiş noktası ölçümüdür. Reaktif hücrelere ilave edildikten sonra, levha bir kez belirlenebilir.

1. 30 dakika boyunca 22 ° C su banyosu içinde çözülme lüminesans reajanı.
2. Yavaşça homojen bir karışım elde etmek için şişeyi ters çevirerek reaktifi karıştırın.
3. aşama (tohumlanmış hücrelerin bir plaka dengeye1.5), 30 dakika boyunca oda sıcaklığında karıştırıldı.
4. Her bir oyuğa lüminesan reaktif 100 ul ekle. 2 dakika boyunca orbital bir karıştırıcı üzerinde içeriği karıştırın. Plaka, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübasyona izin verin.
5. Çok modlu plaka okuyucu yazılımı kullanarak bir parlaklık deney kurma.
   1. Çok modlu plaka okuyucu açın ve yazılımı açın. 'Görev yöneticisi' olarak, 'deney' seçin ve dosya 'new'.Select oluşturmak' 'yan araç çubuğundan ve altında' protokol prosedürü 'sekmesinde,' seçin.
   2. Seç 'Grenier 96 düz dipli' plaka tipi ve 'kullanım kapak' kutusunu işaretleyin. 'Okundu yöntem' kutusunun altında 'okumak' eylemi seçin. 'Lüminesans' algılama yöntemini seçin. 'Tamam' ı tıklatın.
   3. okuma adım kutusunda, 'Tam plakanın' sekmesinin altında taranacak kuyu seçin ve boş kuyu hareket kuyu seçin.
   4. (: Delik, ayna: yok örneğin, fiş, Em) boş filtreye filtre seti ayarlayın. için kazanç ayarlayın135, oyuk başına 0.5 saniyelik bir entegrasyon süresi ve 6.5 mm kadar bir yüksekliğe sahip oku. lüminesans okuma ayarları kaydetmek için 'OK' tıklayın.
6. Bir Lüminesans Oku Sahne
   1. 'Enstrüman kontrolü' sekmesini seçerek plaka tutucu çıkarın ve 'kapağı sağlamaya, plaka sahibinin üzerine 96-plaka out'.Place plaka üzerine tıklayın. altında 'araç kontrolü' sekmesinin plaka 'tıklayarak plaka yuvasını kapatın. Işıklı okuma gerçekleştirmek için araç çubuğundan 'şimdi okuma' üzerine tıklayın.
   2. iyi daha fazla analiz için bir elektronik tabloya her biri için nispi Işıklı birimi (RLU) ölçümleri ihracat.
7. Tekrarlayın hücrelerin ekim sonra yayılması 96 saat her 24 saat kadar kaydetmek için 3.1-3.6 adımları tekrarlayın.

4. Hücre Imager Kullanımı Cep Sayısı belirlenmesi

1. Çok modlu hücre görüntüleyici yazılımı kullanarak bir hücre görüntüleme deney kurma
   1. Çok modlu hücre kamera ve açık th açıne yazılımı.
   2. 'Görev yöneticisi' olarak, 'deneyleri' sekmesini seçin ve 'araç çubuğunu tıklayın' dosyasını 'new'.On oluşturmak' protokol 'sekmesini ve açık' prosedürü 'tab.Select' ayarlanan sıcaklık 'eylem. 'Açık' için inkübatör ayarlayın ve 37 ° C sıcaklığı ayarlamak ve bir sonraki adım 'kutu ile devam etmeden önce' ön ısıtma 'kontrol edin. Ayarları kaydetmek için 'OK' tıklayın.
   3. 'Okumak' eylemi seçin. , 'Image' algılama yöntemine tıklayın 'son nokta / kinetik' okuma türünü ve 'filtreleri' optik türünü seçin. plaka üzerinde tam plaka 'sekmesinin üzerine OK'.Click' tıklayın ve kuyu yansıması. Ayarları kaydetmek için 'OK' tıklayın.
   4. 'Amaç' seçenekler açılır menüden 2.5X hedefi seçin. GFP 469, 525 ve Parlak Field: 'kanalların sekmesinin altında, iki kanal seçin. Her iki kanal için 'otomatik' pozlama kontrol edin ve iyice otomatik pozlama seçin.
   5. aut belirlemeko odak ayarları, 'otomatik odaklama' seçin ve 'seçenekleri' üzerine tıklayın. otomatik odaklama seçenekleri için, 'o zaman otomatik odak tarama ve' yöntemini seçin. Ayarları kaydetmek için 'OK' tıklayın.
   6. Set yatay ve dikey aralığı (um) = 2.881 ve dikey aralık (mikron) = 2.127 ile 3 x 2 montajda kuyu başına birden fazla görüntüleri taramak için 0.Select iyi (um) merkezinden ofset dikey. Prosedür ayarları kaydetmek için 'OK' tıklayın.
      Not: Okuma parametreleri için Tablo 2'ye bakınız.
2. Seçilen Plate Oku Deneme Sahne
   1. Kapağı sağlanması üzerinde, 'araç kontrolü' sekmesine tıklayın ve 'plaka dışarı' function.Place plaka tutucuya 96-plaka seçin. 'Enstrüman kontrolü' sekmesi altında, fonksiyon 'plaka' seçin. Seçin plaka sekmesinden 'şimdi okuma'. 96 saat sonrası tohumlama için her 24 saat kadar okumak tekrarlayın.
3. Kullanımı Cep Kont AnaliziHücre Görüntüleyici Yazılımı.
   1. Bir görüntüyü analiz etmek, görüntülü plaka üzerinde 'veri' sekmesine tıklayın, seçin 'resim [GFP 469, 525 + Aydınlık alan]'. iyi görüntülü bir çift tıklayın.
   2. Yüklenen bir resmin üzerine tıklayın. Seç 'analiz' ve montajı tek bir görüntü analiz edilecek seçin. GFP 'OK'.Check' Click 'sadece kanal ve Tablo 3'te belirtilen olarak ayarlanmış parametreler. Click' görüntülü hücrelere parametreleri uygulamak için BAŞLAT '.
   3. görüntü başına hücre sayımı belirlemek için kullanılır görüntülü hücrelerin üzerine yerleştirilen hücre sayım maskesi, gözlemleyin. Click Deney boyunca görüntülenmiş her plaka için bu ayarları 'değişiklikleri uygulamak' ve korumak.
   4. Bir kez geri görüntülü plaka, açılan menüden 'veri' damla tıklayın ve 'hücre sayımı' seçeneğini seçin. Bu kuyu başına toplam hücre sayısını oluşturur.
   5. daha fazla analiz için o 'ihracat' sekmesini tıklayarak bir elektronik tabloya tüm veri ihracatoyuk başına hücre sayımı f.

Representative Results

kültürlenmiş hücrelerin çoğalmasını,-Δ40p53 MCF-7 hücrelerinin transduse hücre proliferasyon ölçüm farklı yöntemler incelenmesi transdüksiyona MCF-7-LEGO'nun Meme kanseri hücre dizisi ile karşılaştırılmıştır. Karşılaştırıldı üç yöntem - şematik diyagramda özetlenen analizi-alışılmış hemositometre yöntem olup, hücre canlılığı, lüminesans deneyi ve hücre görüntüleme (Şekil 1). Her yöntemin avantajları ve doğru zamanla hücre sayımı ölçmek için dezavantajları vardır, ve en etkili yöntem deney bitiş noktası gereksinimleri ve bir hücre popülasyonu için elde edilebilir bilgilere bağlıdır.

MCF-7-Lego ve MCF-7 hücrelerinin büyümesi Δ40p53 4 gün boyunca 24 saat sonra ölçüldü. Şekil 1 'de gösterildiği gibi, iki hücre, üç farklı hücre yoğunlukları (1.5 x 10 ³ tohumlanmıştır 3; / Çukur) ve hücre sayımı 5 x 10 ³ hücre tohumlama sonra 24, 48, 72 ve 96 saat yapıldı. Her yöntem 96 saat boyunca, bir hemasitometre bir lüminesans bazlı analiz, ve bir hücre görüntüleyici (sırasıyla Şekil 2a, b ve c) kullanılarak, artan hücre çoğalması gösterdi. Hücre çoğalmasının en büyük artış, en yüksek hücre yoğunluğunda (5 x 10 ³ hücre) görülebilir, ve ayrıca bu, bu hücrelerin bir proliferasyon ölçüm için en uygun hücre yoğunluğu olduğu öne her zaman noktasında en yeniden üretilebilir sonuçlar göstermiştir. hücre hatları arasında hücre proliferasyonunda önemli bir fark yoktu.

Farklı yöntemler arasında hücre çoğalmasının ölçülmesi bir lineer regresyon analizi ^6'dır (Tablo 4 Şekil 3) ile karşılaştırılmıştır. Farklı yöntemlerin her biri arasında anlamlı bir ilişki test vardı, karşılaştırma cher iki hücre hücre yoğunluklarının hiç ell proliferasyon (Şekil 3a ve b). Güçlü bir korelasyon lüminesans bazlı tayinin karşılaştırılması ve hücre görüntüleyici arasında gözlenmiştir ^(R2 = 0,8899, s ≤0.0001; ^R2 = 0,9805, s ≤0.0001 sırasıyla Şekil 3a ve b).

Hücre bir görüntü cihazını kullanarak, hücre proliferasyonunun bir görsel sunum (Şekil 4) gösterilmektedir. Bu yöntem tek bir plaka sürekli ölçümler kullandığı hücreler% 100 izdiham yakın ulaşana kadar, hücreler her 24 saat görüntülü olabilir. Şekil 2'de görüldüğü gibi MCF-7-Lego ve MCF-7-Δ40p53 hücrelerinin büyüme oranları tüm zaman noktaları arasında karşılaştırılabilir olmuştur. Bu yöntem görsel birden fazla gün boyunca hücre büyümesini izlemek, ve hücre boyutu ve hücre morpho karşılaştırmak için güçlü olmak da dahil olmak üzere yararlı hücresel bilgi sağlarFarklı hücre hatları arasında logy.

Şekil 1: Hücre proliferasyon ölçüm üç farklı yöntemle bir şematik diyagramıdır hücreler kadar 96 saat boyunca% 5 _CO2 ile 37 ° C 'de birden fazla 96 oyuklu plakalara, üç farklı hücre yoğunluklarında tohumlandı ve kuluçkalanmıştır.. Her 24 saat, hücre çoğalması, bir hemasitometre, bir parlaklık bazlı analiz veya hücre görüntüleme kullanarak ya ölçüldü. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 2:. Hücre Çoğalma Ölçümleri 96 saat Hücre sayımı sonrasında MCF-7-Leg 96 saat süreyle her 24 saatte ölçüldüO ve MCF-7-hücreleri, Δ40p53 üç farklı hücre yoğunluklarında tohumlanır. Hücre sayımı, (b), bir lüminesans tabanlı görece ışık yayma birimi deneyi (RLU), ya da (c) hücre / görüntü hücre bir görüntü cihazını kullanarak sürekli bir hücre sayısı ile, hücreler / ml olarak, (a) hemasitometre kullanılarak ölçülmüştür. Hücre kamera koşulları Tüm deneyler üç bağımsız deneyin ortalamasını temsil etmektedir Tablo 2'de gösterilmiştir, SD ± bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3:. Meme Kanseri Hücre Hatlarında Hücre Proliferasyonunu Ölçme Üç Farklı Yöntemlerin Karşılaştırılması bir lineer regresyon analizi, farklı m arasında karşılıklı ilişkileri karşılaştırmak amacıyla yapıldı (a) MCF-7-hücreleri LEGO'nun ve (b) MCF-7-Δ40p53 hücrelerinde hücre çoğalmasını ölçmek için incelendi ö n- tem. Bir Pearson korelasyon katsayısı hesaplanmış ve önemi hücre çoğalmasını ölçme farklı yöntemler arasında (p <0.05) tespit edilmiştir. Tüm sonuçlar üç bağımsız deneyin ± SD ortalamasını temsil etmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4:. GFP pozitif MCF-7-Lego ve MCF-7-Δ40p53 Göğüs Kanseri Hücreleri görüntüleri hücrelerin temsili görüntüleri 5 x 10 ³ tohumlanır hücrelerinden hücre görüntüleme sistemi, 24 saat kullanılarak çekilen. Ölçek çubuğu 1,000 mikron temsil eder. hücre görüntüleme için parametreler Tablo 2'de özetlenmiştir. = "Https://www.jove.com/files/ftp_upload/54350/54350fig4large.jpg" target = "_ blank" href> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

	Hücre yoğunluğu (hücre / çukur)
hücre tipi	1.5 x 10 3	3.0 x 10 3	5 x 10 3
MCF-7-LEGO	8.4 mL ortam içinde 76 ul	8.3 mL ortam içinde 152 ul	8.2 ml medyada 254 ul
MCF-7-Δ40p53	8.4 mL ortam içinde 93 ul	8.3 mL ortam içinde 185 ul	8.2 ml medyada 308 ul

Tablo 1: 96 kuyucuğu Hücre tohumlama Birimleri.

"Fo: keep-ile-next.within sayfa =" always "> parametreleri oku Plakalı 96 gözlü kip görüntü Amaç 2.5X Renk GFP (469, 525), Parlak Alan Poz Oto odak Otomatik (Tarama sonra otomatik odaklama)

Tablo 2: Hücre Imager Kullanımı Cep Görüntüleme için Okuma Parametreleri.

Tablo 3: Hücre Sayım Analizi Görüntüleme Parametreleri.

Görüntüleme parametreleri
eşik	5000
Minimum nesne boyutu (um)	30
Maksimum nesne boyutu (um)	300

MCF-7-LEGO
	R kare	p-değeri
Lüminesans tabanlı tahlil vs hemositometre	0,6301	0.0021
Hemasitometre vs Hücre görüntüleyici	0,7524	0.0003
Hücre görüntüleyici vs lüminesans bazlı analiz	0,8899	<0.0001
MCF-7-Δ40p53
	R kare	p-değeri
Lu vs hemositometreminescence bazlı analiz	0,8983	<0.0001
Hemasitometre vs Hücre görüntüleyici	0,9303	<0.0001
Hücre görüntüleyici vs lüminesans bazlı analiz	0,9805	<0.0001

Tablo 4: Test Üç Farklı Çoğalma Yöntemlerinin Doğrusal regresyon analizi.

Yöntem	Avantajları	Dezavantajları	Teknik notlar	nihai çıktı
hemositometre	Düşük maliyetli	Yüksek insan hatası	Tek hücre süspansiyonu hazırlamak için birkaç kez pipet	Hücre / mi
	Minimal ekipman gerektirir	tek hücre süspansiyonu gerektirir	doğruluk elde etmek için birden fazla sayıları gerçekleştirin
	Doğrudan hücre sayısı	hücrelerinin yüksek sayıda hücre sayımının doğru bir değerlendirme için gerekli olan
		Endpoint
Lüminesans bazlı analiz	multiwell plakalı formatları ile kullanmak	pahalı reaktifler	Işıktan koruyunuz	Bağıl Lüminesans Birimleri (RLU) / kuyu
	gerçekleştirmek için kolay	Işıklı plaka okuyucu gerektirir	Arka plan lüminesans belirlemek için kontrol kuyuları Dahil
	hızlı tahlil	Isıya duyarlı
	hücre canlılığı, bilgi sağlar	Değişken, hücrelerin metabolik aktivitesine bağlı olarak
		Dolaylı ölçüm
		Endpoint
hücre görüntüleyici	sürekli ölçüm	pahalı görüntüleyici	Emin, hücre görüntüleme 37 ° C olarak ayarlanır	Hücreler / görüntü
	Sıcaklık kontrolü	yoğun Beceri	Hücrelerin gereksiz sallayarak veya kesintileri önlemek
	Hücresel bilgi sağlar	hücrelerin izdiham bağlı değişken
	Maliyet-etkin (Eğer görüntüleyiciyi varsa)	Göreceli sayım
	doğrudan ölçüm
	multiwell plaka biçiminde otomatik görüntüleme

Discussion

Bu protokol, kültürlenmiş hücrelerde hücre çoğalmasını ölçmek için üç farklı yöntem incelenmiştir. Her yöntem 96 saat boyunca hücre çoğalmasının tekrarlanabilir ve hassas ölçümler yeteneğine sahip olduğunu ve sonuçlar (Şekil 2 ve 3) test edilen yöntemlerin her karşılaştırılabilirdir. Lüminesans bazlı analiz ve hücre görüntüleme yöntemi Hem 96 saat sonra, hücre çoğalmasında lineer artış gösteren, en güçlü sonuç (Şekil 2B, C). Ayrıca, zamanla hücre görüntüleme transduse ve non-dönüştürülmüş hücre hatları (Şekil 4) arasındaki büyüme oranları açısından anlamlı bir fark tasvir.

Birçok avantaj ve dezavantajları, bu protokol incelenen her yöntem için olan bir özet için Tablo 5'e bakın. hemasitometre kullanarak geleneksel hücre sayım yöntemi çok az ek reaktifler veya effo gerektiren bir düşük maliyetli bir yöntemdirrt hazırlamak ve çalıştırmak için. Ayrıca, bu yöntem hücre / ml ¹⁴ mutlak hücre sayısını miktarını belirler. Ancak, sayıları arasında büyük standart sapmalar sonuçlanır hücre sayımı, yüksek hata oranları doğasını zaman alıcı ve hücre sayıları yüksek oranda doğru hücre sayımları için gerekli olduğu gerçeğini dahil ciddi dezavantajları vardır. Bu hemasitometre kullanarak hücre sayımı daha sonraki zaman noktalarında düşük hücre yoğunluğunda değişken sonuçlar ve büyük standart sapmalar göstermektedir Şekil 2a, görülebilir. Bu dezavantajlar küçük plaka boyutları ve ekim yoğunlukları gereklidir büyük yüksek verimli ölçümler için bu yöntem küçük örneklem büyüklüğü hücre sayımı için yararlı ve yetersiz olun. Hücre yoğunluğu sayılan hücrelerin en az sayıda daha büyük 100 hücre bir eşik başlayan şekilde, artan eğer bu sınırlamalar hafifletilebilir. Daha fazla hücre süspansiyonu seyreltildi veya hücre d düşürmekensity az 100 hücre sayılarak ve ¹⁵ çoğaltır arasında nedenle değişkenliği artan büyük bir şans. Bununla birlikte, bu yöntem, düşük hücre yüzey alanına, 96 oyuklu bir plaka için uygun değildir ve bu nedenle, analiz kullanılabilir hücrelerin yetersiz sayıda. Bu, bu yöntem ve bu yeteneği gerektiren kullanıcılar için net bir dezavantaj yüksek verim yeteneklerinin eksikliği vurgulamaktadır.

Lüminesans bazlı deney, metabolik olarak aktif hücrelerin ¹⁶ varlığı için bir ölçüdür ATP miktarı ölçülerek hücre canlılığı belirler. Bu deney, hücre çoğalmasını belirlemek için, 96 gözlü bir levha formatında çok sayıda örneğin yüksek miktarda madde taraması için tasarlanmıştır. Bu basit yöntem, metabolik olarak aktif hücrelerin ATP mevcut orantılı olan bir plaka okuyucusu kullanılarak, göreli ışık birimi (RLU), gibi hücre çoğalması miktarını belirler. Bununla birlikte, bu yöntemin en önemli dezavantajı to reaktif mal ve hücrelerin metabolik aktivitesi üzerine ölçüm bağımlılık. Sıcaklık ve hücre döngüsü zaman noktalarında gibi çeşitli hücre kültürü şartları, hali hazırda tahlil ¹⁷ tarafından üretilen ışık yayan bir sinyal ile doğru orantılıdır hücreleri tarafından üretilen ATP'nin miktarını etkileyebilir. Bu nedenle, deneysel deney koşulları hücrelerin metabolik aktivitesine müdahale ve potansiyel olarak hücreler tarafından üretilen göreli ışık yayma sinyalinin engellememelidir belirlemek için önemlidir.

hücre çoğalmasını belirlemek için incelenmiştir üçüncü yöntem göreli hücre sayısını gerçekleştirmek için bir canlı hücre görüntüleme ve yazılım oldu. tahlil süresi boyunca aynı hücreleri kullanılarak, sıcaklık kontrolü ile birlikte, gerçek zamanlı olarak, her bir çoklu görüntüleri yakalamak için otomatik olabilir hücre görüntüleme yüksek verimli yetenekleri vardır. Şekil 4'te gösterildiği gibi, hücre çoğalması m olabilirhücre sayım analizi ile birlikte hücre popülasyonu hakkında ek bilgi verebilir bir süre boyunca aynı plaka içinde gerdiricileriyle. Bu 96 plaka biçimleri yaygın çapraz plaka değişkenliği ve hücre tohumlama hata ortadan kaldırır çok avantajlıdır. Hücre görüntüleyici ile birlikte sağlanan yazılım Tablo 2 ve 3'de belirtilen parametreler kullanılarak hücre sayısı nicelendirilmesi sağlar. Bu yüksek verimli bir ortamda, bu nedenle yararlı ve kolay apoptozis ve sitotoksisite gibi hücresel işlevler gerçekleştirmek üzere diğer analizlere multiplekslenebilmektedir. sistemin en büyük dezavantajı dokunmadan nesneleri ayırmak için yeteneği sınırlıdır yazılımı vardır. alt Hücreler, bu işlevi yerine de, bu testte önemli bir sınırlama yoktur ve bu nedenle hücre tipi özel optimizasyon gerektirir. Bir görüntüleyici kullanarak tek tek deneyler çok düşük maliyetli bir plaka tarafından plaka ölçekte ise de, bu yöntem yaptığınızalet zaten bir laboratuvar kurmak ise ly maliyet etkin. Bu nedenle, bu yüksek verimli analizi için, bu yöntem, uygun hale kültürlenmiş hücrelerin hücre çoğalmasını ölçmek için yeni bir metot sağlar ve ek reaktifler gerektiren önemli bir avantaja sahiptir, ve 96 çukurlu levha otomatik sayım yeteneğine sahiptir. Bu geleneksel hemositometre hücre sayım yöntemine önemli bir gelişme olduğunu ve lüminesans tabanlı tahlil için daha uygun maliyetli bir seçenektir.

Hücre görüntüleyici kullanarak kritik adım çekilen görüntülerin ve görüntü başına müteakip hücre sayımı analizi sırasında. Bu görüntüler hücre görüntüleme platformları bir dizi kullanılarak işlenebilir. Soruşturma kapsamında hücre tipi için en uygun yazılımı belirlemek için bu nedenle çok önemlidir. Farklı görüntüleme yazılımı kullanarak hücre kamera tarafından elde edilen görüntülerden hücre sayımı doğrulamak için yararlı olacaktır. Bu protokol, bir tatbik edilebilirY kültürlenmiş hücreler, ancak Analiz parametreleri her bir hücre hattı için tanımlanması gerekir. Bu sefer ilk başta alıcı olabilir, ancak parametreler girildikten sonra, yöntem, bir anda görüntü tüm plakalara otomatik hale getirilebilir.

Onlar hücre sayısını (hemasitometre hücre kamera) ya da metabolik aktivite (lüminesans tabanlı deney) ölçümü olarak belirli bir süre içinde, bu deneyler, aslında çoğalmasının dolaylı bir ölçüsüdür dikkat etmek önemlidir. Bu yöntemler kolayca çoğalmasını etkileyen diğer önemli faktörler ölçmek için değiştirilebilir. Örneğin, tripan mavisiyle çıkarma metodu kolaylıkla ölü hücreleri hariç ve dolayısıyla hücre canlılığı ¹³ belirlemek için hemositometre ya da hücre görüntüleme yöntemi ya da içine dahil edilebilir. lüminesans bazlı analiz hücre sağlığı hakkında ek bilgi sağlamak için bir sitotoksisite deneyi ile multiplekslenmiş ve bu testte sırasında ölçülen metabolik aktivitesi de hücre viabi bir ölçüsüdür olabilirvasıflı ^12. Bu nedenle, bu deneylerin bir esnekliği, bu yöntemlerin her biri güçlü bir avantajı ise, ek hücre bilgileri sağlamak için diğer tahlillerde ile çoklanması için.

Bu protokol, kararlı bir şekilde GFP genini içeren LEGO'nun-Ig2-Puro + vektörüyle transdüksiyona edilmiş insan göğüs kanseri hücre çizgisi, MCF-7 kullanılır. Bu kültür ortamı içine bir boya maddelerinin eklenmesi ihtiyacı olmadan görüntü GFP optik filtre hücrelerin kullanımını sağlar. Bu yöntem, kolaylıkla veya proliferasyon markeri ile hücrelerin etiketlenmesi tarafından, her iki parlak alan optiği türü kullanarak hücrelerin görüntüleme görüntü GFP-negatif hücreleri ya da birincil hücre çizgileri için değiştirilebilir. Bu protokolde göre yöntemleri, farklı hücre çizgilerinin, çok çeşitli kullanılmak için yeterince sağlam, ancak, her bir hücre hattı için uygun protokol ayarlarının önce belirlenmelidir bulunmaktadır. Aydınlık alan kanalını kullanarak hücrelerin görüntüleme birincil ce için en iyi seçenek temsilrf veya bağlı bu yöntemin uzun vadeli olmalarından, yavaş büyüyen, olanları. Bu lüminesan tabanlı tahlil olarak son nokta tahlilleri, uzun vadeli bir hücre büyümesinin analizi için çok uygun değildir.

Bu protokol, in vitro hücre çoğalmasını ölçmek için üç farklı yöntem anlatmıştır. Her yöntemin rutin hücre büyümesini ölçmek için laboratuarda yapılabilir ve en laboratuarlar aşağıdaki yöntemlerden birini gerçekleştirmek için gerekli becerilere sahip olacaktır. Bununla birlikte, bölünen hücreleri ölçülmesi için uygun başka bir deneylerde, bir dizi bulunmaktadır. Bu DNA sentezine metabolik aktiviteyi ölçmek yöntemler proliferasyonu veya ATP konsantrasyonu ⁹ ilişkili antijenler içerebilir. Örneğin, tahliller gibi bir dizi 3H-timidin gibi bir radyoaktif madde ile hücrelerin etiketlenmesi hücrelerin DNA sentezi oranını ölçmek için geliştirilmiştir. Bu yöntemin bir dezavantajı, radyoaktif maddeler ve bunların bertaraf belirgin kullanımıdır. Diğerrutin olarak hücre proliferasyonunu ölçmek için kullanılan yöntemler ¹⁸ akış sitometrisi kullanılarak ölçülebilir yeni oluşan DNA BrdU etiketleme, kullanımıdır. Akış sitometri hücre sayısı olarak hücre döngüsü bilgileri hem de analiz etmek için kullanılabilir. Bu ancak bu yöntemin dezavantajları sitometresinin akışını işletmek ve elde edilen verilerin ¹⁸ analiz etmek için ek zaman ve adımları, pahalı reaktifler ve artan kullanıcı eğitimli becerilerini içerir, özellikle deneyler için avantajlı bir sonuç olabilir. Bu nedenle, orada hücrelerin büyümesini değerlendirmek için bilim adamlarına pek çok farklı deney vardır ve seçilen yöntem kullanılan hücre tipi, kullanıcı ve beceri düzeyine ve deney uç noktada gerekli verilerin türüne büyük ölçüde bağlıdır.

Sonuç olarak, hücre çoğalmasını ölçmek için üç farklı yöntem meme kanseri hücreleri kullanılarak karşılaştırıldı. Her yöntemin birçok avantajı ve Dezavantajlılara vardıres ve bu nedenle kullanıcı bağımlı ve her bir deney için kendi ihtiyaçlarına göre, hücre sayımı gerçekleştirmek için en uygun tahlil belirlenmesi açısından olup.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium, no phenol-red	ThermoFisher Scientific	21063-045	Supplemented with 10% FBS, 200 mM L-glutamine, 2 µg/ml insulin and 1 µg/ml puromycin
L-glutamine solution (100x)	ThermoFisher Scientific	25030-081
Insulin solution human	Sigma-Aldrich	I9278-5ML
Fetal bovine serum (FBS)	Bovogen Biologicals	SFBS-F-500ml
Puromycin dihydrochloride	Sigma-Aldrich	P9620-10ML
0.5% trypsin-EDTA solution (10x)	ThermoFisher Scientific	15400-054	Dilute to 2x in DPBS
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) (1x)	ThermoFisher Scientific	30028-02
Tissue culture flask, 75 cm2 growth area	Greiner Bio-One	658175
Scepter 2.0 Cell Counter	Merck Millipore		Automated cell counter
96 well multiwell plate, flat bottom	Nunc	167008
Improved Neubauer Hemocytometer	BOECO Germany	BOE 01
Olympus IX51 inverted microscope	Olympus	IX51
CellTiter-Glo 2.0 Assay	Promega	G9242	Luminescence-based assay
Cytation 3 Cell Imaging Multi-Mode Reader	BioTek		Plate reader for luminescence, fluorescence and brightfield cell imaging
Gen5 Data Analysis Software	BioTek	GEN5