Summary
Описано получение тимуса срезов, которые, в сочетании с проточной цитометрии, могут быть использованы для моделирования позитивной и негативной селекции развития Т-клеток. Тимуса ломтики также могут быть адаптированы для на месте анализа тимоцитов миграции, локализации и сигнализации с помощью иммунофлуоресценции и двухфотонной микроскопии.
Abstract
Тимуса продолжается отбор в уникальной и высоко организованной тимуса микросреды приводит к генерации функционального, само толерантные Т - клеточного репертуара. В пробирке модели для изучения T коммитирование и развития предоставили ценную информацию в этом процессе. Тем не менее, эти системы не имеют полную трехмерную тимуса среду , необходимую для развития Т - клеток и, следовательно, являются неполными аппроксимации тимуса селекции в естественных условиях. Некоторые из проблем , связанных с развитием моделирования Т - клеток может быть преодолена путем использования в моделях на места , которые обеспечивают интактного тимуса микросреду , который полностью поддерживает тимуса выбор развивающихся Т - клеток. Тимуса культуры ломтик органотипической дополнение к существующим методам в точке. Тимуса ломтики сохранить целостность тимуса коркового и мозгового регионов и обеспечить платформу для изучения развития накладными тимоцитах определенной стадии развития или эндогенного Т сгезов внутри зрелого тимуса микросреды. Учитывая способность генерировать ~ 20 срезов на мышь, тимуса ломтики представляют собой уникальное преимущество с точки зрения масштабируемости для высокопроизводительных экспериментов. Кроме того, относительная легкость в создании тимуса срезов и потенциал для наложения различных подмножеств тимуса или других клеточных популяций из разных генетических фонов повышает универсальность этого метода. Здесь мы опишем протокол для подготовки тимуса срезов, изоляции и наложения тимоцитов и диссоциации тимуса срезов для анализа проточной цитометрии. Эта система также может быть адаптирована для изучения развития нетрадиционного Т-клеток, а также визуализировать тимоцитов миграции, тимоцитов-стромальных взаимодействий клеток и TCR сигналов, связанных с вилочковой селекции с помощью двухфотонной микроскопии.
Introduction
Т - клетки дифференцируются через ряд промежуточных развития в тимусе , во время которого они сталкиваются несколько контрольно - пропускных пунктов , которые обеспечивают формирование функциональной, само толерантные Т - клеточного репертуара 1-3. Положительный отбор способствует выживанию тимоцитов с рецепторами Т - клеток (TCR) , способных распознавать, с низкой до умеренной аффинностью, пептида , представленные главного комплекса гистосовместимости (MHC молекул) на корковых тимуса эпителиальных клеток (CTEC) 2,3. Отрицательный отбор и развитие клеток регуляторных Т (Т р) способствовать созданию аутотолерантности через ликвидацию или утечки тимоцитов , которые сильно реагируют на само-пептида , представленного MHC 2,4. Незрелые CD4 + CD8 + двойной положительный (DP) тимоцитов выражения ТКО , которые проходят процесс отбора дифференцируются в зрелые субпопуляции Т - клеток, большинство из которых являются MHC класса I-ограниченный CD8 + цитотоксическихили МНС класса II с ограничением CD4 + хелперов одиночных положительных (SP) Т - клетки, перед выходом из тимуса выполнять эффекторные функции во вторичных лимфоидных органах 1-3.
Добавление к сложности развития Т - клеток является динамическая миграция и клеточные столкновения развивающихся тимоцитов в рамках всей сети стромальных клеток 5-9. Эти стромальные клетки играют различные роли в развитии тимоцитов и дифференциально распределены между тимуса коркового и мозгового регионов , где положительные и отрицательные отбор происходят 10. Хотя положительный отбор происходит в основном в коре головного мозга, есть накопление доказательств того, что DP тимоциты мигрируют в костный мозг и продолжают требовать сигналов TCR, прежде чем они дифференцируются в зрелые Т-клетки, предполагающих, что продолговатый может предоставлять дополнительные сигналы, необходимые для завершения положительного отбора и линии дифференциация 11,12. В дальнейшем,несмотря на наличие специализированных медуллярных тимуса эпителиальных клеток (Mtec) , которые выражают и присутствующих тканей с ограничением антигенов , способствующих удаления аутореактивных тимоцитов 13,14, большая часть негативной селекции происходит в коре головного мозга в ответ на Повсеместно выражали себя пептид , представленный дендритные клетки 15,16. Таким образом, точные модели развития Т-клеток должны обеспечивать высокоорганизованной тимуса микросреду, с неповрежденной коркового и мозгового областей, что облегчает взаимодействие между тимоцитов и стромальных клеток, а также поддерживает миграцию тимоцитов, как эти клетки подвергаются позитивной и негативной селекции.
В дополнение к экс виво анализ тимоцитов в качестве средства изучения позитивной и негативной селекции, ряд ин витро, на месте, и в естественных условиях модели развития Т - клеток, были разработаны 17-22. Это было известно, трудно резюмироватьположительный выбор в пробирке, но сокультивирования популяций стволовых клеток или предшественников Т - клеток с стромальных клеток , экспрессирующих лиганд Notch, в частности OP9-DL1 4 клеток /, имеет возможность поддерживать T коммитирование и ограниченный положительный выбор делает его незаменимым в пробирке модель для исследование развития Т - клеток 23-25. Ограничения этой системы, однако, включают в себя тот факт, что эти клетки лишены уникальной обработки пептидный машины нашли в вилочковой стромальных клеток и трехмерную тимуса микросреду.
Хотя технически более громоздким, на месте и в естественных условиях модели тимуса отбора могут преодолеть некоторые из барьеров , связанных с системами в пробирке. Перегруппировываться тимуса культуры органов (РИПЦ) содержат определенные смеси тимоцитов и тимуса стромальных клеток 18,26,27. Эти тимуса эпителиальные reaggregates клеток поддерживать экспрессию класса I и II MHC и может поддерживать developmeнт как обычных подмножеств Т-клеток, но все еще не имеют определенные коркового и мозгового структур. Эмбрионального тимуса органной культуры (FTOC) является популярной моделью развития Т - клеток , которые могут быть посеяны с тимоцитов через висячей капле культуры lymphodepleted тимуса долей или через инъекции тимоцитов в lymphoreplete тимуса долей и поддерживать эффективное развитие CD4 + и CD8 + T клетки с течением времени в культуре 18,28-31. В начала культивирования эмбриональных тимуса долей существует недостаток mTECs, но определенные коркового и мозгового структуры могут развиваться с течением времени в зависимости от условий. Важным моментом является то, что эта модель может преимущественно поддерживать плода по сравнению с развитием взрослых Т-клеток. Наконец, внутритимусной инъекция определенных предшественников тимуса у взрослых мышей является технически сложной задачей, но очевидно, обеспечивает среду для поддержки Развитие Т - клеток в естественных условиях. Они на месте и в естественных условиях модели являются отличными инструментами то развитии исследования Т-клеток и их использование должно рассматриваться на основе эксперимента, по-эксперимента.
Тимуса ломтики, тем не менее, в последнее время появились в качестве универсального, комплементарной модели для исследования тимуса выбор на месте с возможностью размещения уникальной, сложной и в целом выше экспериментов пропускной способности . Тимуса ломтики сохранить целостность коркового и мозгового вещества регионов и обеспечить основу для стромальных клеток , которая поддерживает миграцию тимоцитов в процессе развития, а также эффективной позитивной и негативной селекции 11,32-39. Тимоцитов подмножества добавлены на вершине тимуса ломтиками мигрируют в ткани и их соответствующей нише микросреды 34,37. Накладываемого тимоцитов можно отличить от тимуса срезов эндогенных клеток с помощью конгенных маркеров или флуоресцентных меток и может поддерживаться в культуре в течение нескольких дней. Тимуса срез органотипической культуры могут быть использованы для изучения различных аспектовразвития Т-клеток, включая отбор тимуса, поведение тимоцитов (миграция и клеточных взаимодействий), а также локализации тимоцитов, среди других. Учитывая способность генерировать ~ 20 тимуса ломтиков на мышь, масштабируемость экспериментов , как правило , больше , чем другие в моделях натурных тимуса селекции. Хотя подготовка тимуса срезов требует специального оборудования, такого как vibratome, а срок службы тимуса срезов в культуре ограничено из-за потери клеток с течением времени через гибель клеток и отсутствие инкапсулирования мембраны, тимуса срезы обеспечивают отличную модель для анализа тимуса выбора синхронизированных популяций тимоцитов в зрелом тимуса микросреды. Здесь мы опишем приготовление тимуса срезов (включая заготовки тимус, агароза вложение тимуса долей и vibratome секционирования внедренного ткани), выделение и наложение тимоцитов и диссоциации тимуса срезов для анализа проточной цитометрии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Протоколы для всех исследований на животных были одобрены Комитетом по уходу за животными в Центре де Recherche - Hôpital Maisonneuve-Шиллер.
1. Заготовка мыши Thymus по подготовке тимуса Ломтики и одноклеточных суспензий
- Эвтаназии мышь с CO 2 с последующим смещением шейных позвонков.
- В ламинарном потоке, приколоть мыши брюшную сторону до рассечение борту. Спрей мышь с 70% этанола. Удалите излишки спирта путем протирания марлю, чтобы предотвратить попадание этанола в грудной полости и повреждения ткани.
- Подтяжка кожи у основания грудины с парой щипцов и сделать разрез через кожу. Продлить разрез кожи вверх к каждой передней конечности.
- Сделать дополнительный Срез у основания грудины, чтобы отделить диафрагму от грудной клетки. Затем разрежьте каждую сторону грудной клетки по направлению к ключице. Флип грудную клетку через сторону головы обнаженным грудной полости. Две лопастивилочковой железы лежат на верхней части сердца.
- Снимите соединительную ткань вокруг тимуса лепестков с помощью щипцов, микро-рассечение ножницами, и / или острые изогнутые ножницы. Используйте пару тонких кончик пинцетом изогнуты, чтобы поднять отдельные лопасти из-под или через оставшиеся соединительной ткани.
Примечание: Не беритесь тимус непосредственно. - Поместите тимуса долей в 15 мл коническую пробирку, содержащую PBS и оставляли на льду до тех пор, пока это необходимо.
2. Агарозном Встраивание и Vibratome нарезка тимуса долями
- Готовят 4% раствор агарозы для встраивания растворением 2 г низкой температурой плавления агарозы в 50 мл стерильной PBS и микропомахивание на низком уровне до тех пор, пока агароза полностью не растворится. Накройте колбу с алюминиевой фольгой и поместите в водяной бане при температуре 55 ° С до готовности к использованию.
- В капот культуре ткани, подготовить полную среду RPMI-1640, который содержит 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 4 мМ L глутамин, 1x пенициллина / стрептомицина и 10 мкМ2-меркаптоэтанол.
- Добавить 1,5 мл полной среды RPMI-1640, в каждую лунку на 6-луночный культуральный планшет и поместить клеточной культуры вставку в каждую лунку. Установите пластину в сторону в термостате при 37 ° С до тех пор, пока это необходимо.
- Подготовьте слякотной ванну ледяной воды с водой и льдом в ведерке со льдом.
- Осторожно удалите все оставшиеся соединительной ткани вокруг каждого тимуса мочку с помощью тоненького кончика пинцета. Сделать это в то время как вилочковой лопасть погружена в PBS в чашке для культивирования ткани, после того, как налипать ткани салфетку пропитана PBS, или под микроскопом рассекает.
- Дайте агарозы остыть ниже 40 ° С, когда колбу просто теплая на ощупь, чтобы избежать перегрева ткани. Налейте охлажденный 4% агарозы в форму ткани до высоты ~ 1 см.
- Используйте пару щипцов тщательно передачи тимуса мочку к ткани обтереть и раскатать его осторожно, чтобы высушить его, не повреждая ткани. Убедитесь в том, что ткань высохнет полностью или выскользнет из агарозы во время нарезки,
- Осторожно вставьте мочку в агарозы и позиционировать его как по горизонтали (для увеличения площади поверхности каждого среза) или по вертикали (чтобы увеличить количество срезов) в нижней части формы. Поместите форму в ледяной воде в течение 5-10 мин, чтобы позволить агарозы, чтобы затвердеть.
- За это время подготовить vibratome для нарезки путем установки лотка для буфера, сборка образца диска, и вставить vibratome лезвие. Поместите часть лабораторной ленты на образец диска. Стерилизовать чистый, собранное рабочее пространство с 70% этанола.
- После того, как агарозном затвердевает, инвертировать форму и слегка нажмите на ее центр, чтобы освободить агарозы встроенной мочку.
- Используйте острое лезвие, чтобы обрезать лишнюю агарозы, окружающий мочку оставляя ~ 2 мм агарозы с каждой стороны и ~ 0,5 см в нижней части.
- Закрепите каждый агарозы блок с каплей клея ткани на кусок ленты на образец диска. Несколько блоков могут быть склеены на ленте.
- Совместите Wi vibratome лезвияго в верхней части блока агарозы. Заполните лоток буфера стерильной PBS, пока блок (ы) лезвие и агарозном полностью погружены в воду.
- Раздел агарозном внедренный ткани, чтобы получить срезы толщиной 400-500 мкм. Установите vibratome до 0,225 мм / сек скорость, частота 100 Гц, и 5 ° угол.
- Используйте изогнутую лопаточку, чтобы собрать вилочковой ломтики в тканевой культуральной чашке, содержащей стерильный PBS, как они отрезаны. Выбросьте первый и последний кусочек.
- Осмотрите срезы под световым микроскопом при увеличении 4X. Выберите ломтики с неповрежденной тимуса ткани и окружающей агарозы (рис 1А).
- Перенесите ломтики на тарелку, полученного на стадии 2.3, используя наконечник пипетки, чтобы аккуратно вставьте тимуса кусочек от изогнутого шпателя на вставке клеточной культуры. Каждая вставка может вместить ~ 3 ломтика. Убедитесь, что ломтики не соприкасаются друг с другом или вставных стенок культуры клеток.
- Поддерживать планшет при 37 ° С до тех пор, пока это необходимо.
- Изолировать тимуса мочки, как описано в разделе 1. Диссоциируют мочки вручную, чтобы сделать суспензию отдельных клеток, используя стерильную 15 мл тканевой шлифовальной машины, заполненную 5 мл стерильной PBS, содержащим 2% FBS. Перенести клетки в коническую пробирку на 15 мл.
- Центрифуга клетки при 545 х г в течение 5 мин при температуре 4 ° С. Жидкость над осадком сливают и клетки вновь суспендируют в 1 мл 1х ACK буфера для лизиса (0,15 М NH 4 Cl, 10 мМ КНСО 3, 0,1 мМ Na 2 EDTA) при комнатной температуре в течение 3 мин , чтобы лизировать красные кровяные клетки.
- Наполните пробирку до 15 мл с PBS, содержащим 2% FBS. Центрифуга клетки при 545 х г в течение 5 мин при температуре 4 ° С.
- Ресуспендируют клеток в 10 мл PBS, содержащем 2% FBS и клетки проходят через фильтр с размером ячеек 255 мкм.
- Граф клеток с использованием гемоцитометра. Центрифуга клетки при 545 мкг в течение 5 мин при 4 ° С, и ресуспендируют осадок клеток в PBS, содержащем 2% FBS при Концданию 1 × 10 7 клеток на мл.
- Этикетка клетки с клеточными красители, такие как карбоксифлуоресцеин сукцинимидил эфира (CFSE) в соответствии с протоколами производителя, если не используется тимоцитов от мышей, экспрессирующих конгенных маркеров или генетически кодируемые флуоресцентные репортеров отличить от среза эндогенных клеток.
- После последней промывки меченых клеток, ресуспендируют осадок клеток в условиях полной среды RPMI-1640 , на 1-3 х 10 6 клеток на 15 мкл.
4. Наложение тимоцитов на тимуса Ломтики
- Используйте пипетку аспирата любую жидкость, окружающую тимуса ломтики на вставке.
Примечание: Будьте осторожны, чтобы не повредить агарозы. Если агарозы поврежден, накладываемого тимоцитов не оседают на поверхность среза из-за потери поверхностного натяжения. - Не касаясь кусок кончиком пипетки, наложенной 15 мкл тимоцитов, полученных в разделе 3 на каждую тимуса среза.
- Выдержите НОАКТЕ при температуре 37 ° С в течение 2 часов, чтобы позволить клеткам мигрировать в тимуса ломтиками.
- Через 2 часа смойте тимуса ломтиков 3 раза 1 мл PBS, чтобы удалить избыток наложенных друг на друга тимоцитов, которые еще не перенесутся в ткань.
- Инкубируйте планшет при 37 ° С до тех пор, вилочковой срезы не будут готовы быть собраны, как правило, 1-72 ч в зависимости от эксперимента.
5. Диссоциация тимуса слайсы для проточной цитометрии
- Готовят микроцентрифужных трубки для каждого среза путем добавления 150 мкл PBS, содержащего 2% FBS.
- Добавить 1 мл PBS, содержащим 2% FBS с культурой ткани с вкладышем тимуса ломтиками и осторожно перемешать с изогнутым шпателем, чтобы отделить ломтики от поверхности вкладыша клеточной культуры.
- Перенести фрагмент из вставки в микроцентрифужных трубки с помощью изогнутого шпателя.
- Вручную сорвать срез с использованием образца микроцентрифужных трубки пестик. Добавьте 150 мкл PBS, содержащего 2% FBS, до конечного объема 300мкл.
- Фильтр диссоциированной ткани через фильтр с размером 40 мкм в новую пробирку микроцентрифужных. Отфильтрованные клетки готовы к окрашивали для анализа методом проточной цитометрии 40.
- Фильтрующие элементы во второй раз перед передачей их на проточном цитометре, чтобы гарантировать, что все агарозы удаляется и не закупоривает поток цитометр.
- Acquire клетки на проточном цитометре и анализировать данные , как было описано ранее 40.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Тимуса анализ поддержки ломтиков различных аспектов развития Т-клеток, таких как позитивной и негативной селекции. Для успешных экспериментов, качество тимуса среза имеет первостепенное значение. Таким образом, тимуса срезы следует изучить , чтобы гарантировать целостность тимуса ткани и что агарозы окружающая тимуса срез цела (Фигура 1А). Поверхностное натяжение может быть поставлена под угрозу, когда агарозы поврежден в результате чего значительное уменьшение числа тимоцитов, которые мигрируют в ткани. Таким образом, тимуса ломтики с признаками повреждения тканей или вмятин / слезы в агарозы должны быть отброшены (Фигура 1В).
ТКС трансгенный (Tg) мышей часто используются для изучения тимуса выбор из-за экспрессии определенного, функционального TCR на поверхности каждого тимоцитов, что увеличивает частоту положительной селекции над полиЦlonal популяции. Для того , чтобы захватить каждую стадию позитивной селекции, предварительный отбор TCR тимоцитов трансгенных могут быть наложены на вершине тимуса ломтиками, а также развитие зрелых, CD4 + или CD8 + SP Т - клетки с последующим течением времени с помощью проточной цитометрии 40. Тимоциты , выделенные из класса MHC I-ограниченного OT-I TCR трансгенных RAG1 - / - β2m - / - мышей арестовано на стадии DP до тимуса выбора из - за необходимости β2m ассоциировать с и стабилизировать МНС класса I тяжелая цепь 41 , 42. Когда накладными на β2m - / - тимуса ломтиками, предварительный отбор OT-I TCR тимоцитов остаются трансгенных на стадии DP и не генерируют значительные CD8 + SP Т - клетки (рис 2А, слева). В отличие от этого , когда наложена на WT тимуса срезов , содержащих эндогенные выбора лигандов, способность этой модели для поддержки позитивной селекции свидетельствует развитие CD8 + Т - клеток на 72 ч (рис 2А, справа). Цюйantification развития CD8 + Т - клеток в качестве считывания положительного выбора показан на рисунке 2B.
Тимуса ломтиков также могут быть использованы для изучения негативной селекции. Большая часть негативной селекции происходит в ответ на антиген повсеместной 16. Для моделирования негативной селекции повсеместного антигена, общее количество тимоцитов от OT-I TCR тг RAG1 - / - и дикого типа мышей (WT) были помечены CFSE и CTV, соответственно, затем смешивают в соотношении 1: 1 и накладными на ломтики WT (Рисунок 3А). После смывания избытка тимоцитов, тимуса ломтики были помещены в полный RPMI-1640 с добавлением или без 1 нМ родственного, агониста пептида OT-I TCR, SIINFEKL (OVA пептид). Все МНС класса I клеток, экспрессирующих представит антиген, моделирование представления Повсеместно выраженного антигена в тимусе. Через 24 часа инкубации при 37 ° С, доля OT-I TCR трансгенных CELLs (% живут CFSE +) для управления WT клеток (% живут CTV +) сравнивали с помощью проточной цитометрии (рис 3B). Уменьшение относительной доли OT-I TCR трансгенных клеток представляет собой удаление OTI TCR трансгенных клеток в ответ на OVA пептида.
Важно отметить, что из-за неоднородности размеров тимуса срезов, а также проникновение в клетку в тимуса ломтиками, следует включать соответствующий анализ и внутреннего контроля для нормализации этих переменных. Здесь, WT клетки, смешанные с OT-I TCR трансгенных клеток и наложенные поверх ломтиков были использованы в качестве внутреннего контроля, поскольку это население не должно быть значительной степени зависит от наличия или отсутствия OVA пептида. Степень негативной селекции OTI TCR трансгенных клеток количественно основаны на пропорциях, а не абсолютных цифрах. Во- первых, отношение между ВЗ-I TCR Т.Г. (% живут CFSE +) для WT (% живут КТВ +) клеток на каждом WT тимуса срезе в присутствии или рассчитывалась отсутствие OVA пептида. Каждый из этих отношений был затем делится на среднее соотношение между OT-I TCR Т.Г. (% живой CFSE +) для WT (% + CTV живых клеток) на ломтики WT в отсутствие OVA пептида. В среднем, 80% от OT-I TCR трансгенных клеток были истощены в ответ на вездесущего антигена , как показано на рисунке 3C.
Рисунок 1: Типичные изображения тимуса срезов , полученных из вертикально встроенных тимуса доли. (A) Хорошее качество среза с вложенной ткани и окружающие агарозы нетронутыми. (B) Плохое качество среза с повреждением из - за разрыва вложенной ткани во время нарезки. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рис . 2: анализ потока цитометрии положительного отбора в вилочковой ломтиков OT-I TCR RAG1 трансгенных - / - β2m - / - тимоциты метили CFSE и накладными на без выбора β2m - / - или выбора срезов WT. После 72 ч инкубации при 37 ° С, развитие CD8 + Т - клеток анализировали с помощью проточной цитометрии. (A) репрезентативные данные клеточной поверхности экспрессии CD4 и CD8 на живом CFSE + TCR & beta ; высокие тимоцитов от β2m - / - и WT ломтиков. (B) Количественная CFSE + TCR & beta ; развитие клеток CD8 + T живут высоко на кусочки WT по сравнению с не-выбора элементов управления. Каждая точка представляет отдельный тимуса срез и линия представляет собой среднее значение. (*** Р <0,001, непарный т тест)ove.com/files/ftp_upload/54355/54355fig2large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3: Поток анализ цитометрии отрицательного отбора в тимуса ломтиков в соотношении 1:. Отношение 1 от общего числа CFSE меченных ОТ-I TCR тг RAG1 - / - и КТВ меченные WT тимоцитов накладывались на ломтики WT в присутствии или в отсутствие OVA пептид, SIINFEKL. После 24 ч инкубации при температуре 37 ° С, относительные пропорции накладными клеток анализировали с помощью проточной цитометрии. (А) Схема смешанного 1 Экспериментальная установка , показывающий наложение CTV-меченого WT клеток (синий): 1 с CFSE-меченых OT-I TCR трансгенных клеток (зеленый) на вилочковой среза WT в присутствии или в отсутствии яйцеклеток пептида. (B) Типичные данные , изображающие долю живого CFSE + OT-ITCR Т.Г. клетки и КТВ + WT клетки из срезов , которые были инкубированы с или без OVA пептида. (С) Данные были нормализованы между кусочками, и относительное соотношение живого CFSE + OT-I TCR трансгенных клеток живых клеток КТВ + WT показан. Столбики ошибок указывают стандартное отклонение. N = 3 для каждого условия. (* р <0,05, непарный т тест). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы опишем протокол для подготовки тимуса срезов и репрезентативных результатов эффективной позитивной и негативной селекции накладным предварительного отбора I-ограниченный TCR трансгенных тимоцитов класса MHC с помощью проточной цитометрии. Эта система была использована с таким же успехом , чтобы поддержать положительный выбор МНС класса II-ограниченных CD4 + Т - клеток от предварительного отбора DP тимоцитов 32, и, в присутствии агониста антигена, отрицательного отбора и развития 11,12 рег тимуса Т, 36,38,39,43,44. Этот протокол может быть изменен, чтобы изучить тимуса выбор в присутствии или в отсутствие ингибиторов, определенных пептидов, а также генетически модифицированных тимоцитов или популяции клеток стромы. Тимуса ломтики также поддаются накладываемого клеточных популяций, отличных от тимоцитов подмножеств. Например, недавно было показано, что дендритные клетки тимуса, наложенного на ломтики эффективно мигрировать в ткани и может поддерживать отрицательную selectioп и Т р развитие 39,43. Исследования на сегодняшний день используются предварительного отбора DP или полной тимоцитов изучить положительный и отрицательный отбор. Хотя развитие Т-клеток может протекать в течение по крайней мере, 4 дней в тимуса срезах, если заинтересованы в инициировании эксперименты с более ранним населением прародителей, это следует принимать во внимание, что ограничение этой системы состоит в том, что качество тимуса срезов начинает снижаться после того, как 1-2 дня в культуре из-за гибели клеток и отсутствие инкапсулирующего мембраны.
Протокол, описанный здесь, также может быть использован для генерирования срезов из тимуса ткани человека с тонкими модификациями. Перед тем как вложения в агарозе, тимуса ткани человека должна быть разрезана на фрагменты, примерно размер взрослой мыши тимуса лепестка. Следует отметить, что тимуса образцы человека богаты соединительной ткани, а также, по отношению к мышиным тимуса, труднее подготовить хорошие ломтики качества. По нашему опыту, плода, а не неонатального человектимуса ткани является более благоприятной для приготовления срезов. Было показано , что подмножества тимоцитов человека правильно локализовать на обоих человеческих и мышиных ломтиков 37 тимуса. Тимуса выбор наложенных человеческого тимоцитов подмножеств, однако, до сих пор не сообщалось в вилочковой модели среза. Эффективность позитивной селекции из поликлонального населения низок, а из-за низкой доли (~ 0,5-2%) из наложенных друг на друга тимоцитов в тимусе срезе, может быть трудно оценить такие малые количества положительно отобранных клеток. Это может быть целесообразным ввести человека TCR трансген в клетках человека клеток-предшественников Т предшествующего уровня для наложения на тимуса ломтиков человека для повышения эффективности положительного отбора. Это также не исключает возможности мониторинга изменений в эндогенных популяции Т-клеток в присутствии или в отсутствие экзогенного пептидов или других клеточных популяций и ингибиторов сигналов TCR, среди других.
Этот протокол также может быть объявлениеЭптед для визуализации тимоцитов миграции, сигналов TCR и клеточных взаимодействий 12,32-38. До недавнего времени большинство исследований поведения тимоцитов на месте были ограничены в коре головного мозга , как продолговатый находится в центре города в тимусе, только за пределом обнаружения с помощью двухфотонной микроскопии. В противоположность этому, тимуса ломтики обеспечивают уникальное преимущество в том, что ломтики имеют неповрежденные тимуса коркового и мозгового областей и поверхность среза позволяет получить прямой доступ к мозговом путем визуализации двух фотонов. Кроме того, тимуса ломтики наложенные с клетками , меченными индикаторных кальция красители , такие как индол- могут быть использованы для мониторинга сигналов TCR с использованием цитозольных уровня кальция в качестве индикатора TCR сигналов , связанных с положительной и отрицательной селекции с помощью двухфотонной микроскопии 11,32,36, 38,39,44. Для подготовки образцов для микроскопии, срезы могут быть использованы непосредственно после шага 4.5 протокола. В этом случае следует соблюдать осторожность, чтобы выбрать соответствующие маркеры флуоресцентных суITable для работы с изображениями.
Тимуса культуры срез органа являются отличным инструментом для изучения различных аспектов мыши и человеческого развития Т - клеток на месте. Тем не менее, успешное применение этой техники требует особого внимания к важным шагам в протоколе. Для того, чтобы максимально увеличить количество тимуса срезов, полученных при больших экспериментов пропускная способность, возраст мыши, используемой должны быть приняты во внимание, так как размер изменений тимуса в течение всего времени жизни мыши. Как правило, мы используем 4-8-недельных мышей, которые генерируют ~ 20 тимуса ломтики на мышь. Тем не менее, у плода, новорожденных и пожилых мышей thymi теоретически могут быть использованы для создания ограниченного числа срезов в зависимости от экспериментальных потребностей пользователя. Для получения хорошего качества ломтиков, это имеет первостепенное значение, чтобы удалить всю соединительную ткань, окружающую тимуса мочки до встраивания в агарозы. Оставаясь соединительной ткани не эффективно разрезается vibratome лезвия во время нарезки и может привести к повреждению тимусамочки и результирующие дольки. Основная часть соединительной ткани должны быть удалены во время вилочковой уборки (этап 1.5) и позволяет мочки удалить из грудной полости без существенного манипулирования самой ткани. После выделения мочки, тщательно удалить остатки соединительной ткани, как указано в пункте 2.5. Кроме того, сохранение целостности агарозы окружающей внедренный ткани необходимо для эффективного накладывания тимоцитов на поверхности среза. Таким образом, крайне важно, чтобы проверить как срез тимуса и окружающий агарозы при выборе вилочковой срезов для использования в эксперименте. Vibratome, как правило, находится за пределами капот культуры ткани, увеличивая потенциальный риск загрязнения. Очистка vibratome тщательно между экспериментами и распыления рабочей области и vibratome с 70% этанолом до нарезка может ограничить потенциал загрязнения. Кроме того, важно использовать стерильный PBS для шагов 2,13 и 2,15, как указано в пrotocol. Наконец, важно также, чтобы отличить обложенных тимоцитов, которые мигрируют в ткани из клеток, которые являются эндогенными в тимус. Это может быть достигнуто путем маркировки Налагаемое клеток с флуоресцентными красителями, как указано в пункте 3.7. В качестве альтернативы, тимоцитов мышей , экспрессирующих конгенных маркеры или генетически кодируемых флуоресцентных репортерам могут быть использованы 45,46. В целом, однако, тимуса ломтики легко манипулировать и могут быть адаптированы к конкретным экспериментальным потребностям пользователя, поддерживающих широкую применимость, что только начинает исследоваться.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vibratome | Leica Biosystems | VT1000S | |
| NuSieve GTG Agarose | Lonza | 50080 | Low melting temperature agarose |
| Embedding Mold (Truncated - T12) | Polyciences | 18986 | 22 mm x 22 mm square, truncated to 12 mm x 12 mm |
| Double Edge Prep Blades | Personna | 74-0002 | |
| Tissue Adhesive | 3M | 1469SB | |
| 0.4 µm Cell Culture Inserts | BD Falcon | 353090 | Of several brands tested, these maintained the cells atop the slices the best |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | ThermoFisher | 21600-010 | |
| RPMI-1640 with L-glutamine | Wisent | 350-000-CL | |
| Fetal Bovine Serum | Wisent | 080-110 | Heat inactivated |
| L-Glutamine, 200 mM | Wisent | 609-065-EL | |
| Penicillin/Streptomycin, 100x | Wisent | 450-201-EL | |
| 2-Mercaptoethanol | Alfa Aesar | A15890 | |
| 15 ml Tenbroeck Tissue Grinders | Wheaton | 357426 | |
| Nylon Mesh Filter | Component Supply | U-CMN-255 | |
| Microcentrifuge Tube Sample Pestle | Bel-Art | F19922-0000 | |
| 40 µm Nylon Cell Strainer | BD Falcon | 352340 | |
| Forceps Inox Tip | Dumont | RS-5047 | Fine tip curved forceps, size .17 x .10 mm |
| Micro Forceps | Dumont | RS-5090 |
References
- Carpenter, A. C., Bosselut, R. Decision checkpoints in the thymus. Nat Immunol. 11, 666-673 (2010).
- Starr, T. K., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Positive and negative selection of T cells. Annu Rev Immunol. 21, 139-176 (2003).
- Vrisekoop, N., Monteiro, J. P., Mandl, J. N., Germain, R. N. Revisiting thymic positive selection and the mature T cell repertoire for antigen. Immunity. 41, 181-190 (2014).
- Stritesky, G. L., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Selection of self-reactive T cells in the thymus. Annu Rev Immunol. 30, 95-114 (2012).
- Bousso, P., Bhakta, N. R., Lewis, R. S., Robey, E. Dynamics of thymocyte-stromal cell interactions visualized by two-photon microscopy. Science. 296, 1876-1880 (2002).
- Takahama, Y. Journey through the thymus: stromal guides for T-cell development and selection. Nat Rev Immunol. 6, 127-135 (2006).
- Halkias, J., Melichar, H. J., Taylor, K. T., Robey, E. A. Tracking migration during human T cell development. Cell Mol Life Sci. 71, 3101-3117 (2014).
- Yin, X., Chtanova, T., Ladi, E., Robey, E. A. Thymocyte motility: mutants, movies and migration patterns. Curr Opin Immunol. 18, 191-197 (2006).
- Ladi, E., Yin, X., Chtanova, T., Robey, E. A. Thymic microenvironments for T cell differentiation and selection. Nat Immunol. 7, 338-343 (2006).
- Klein, L., Kyewski, B., Allen, P. M., Hogquist, K. A. Positive and negative selection of the T cell repertoire: what thymocytes see (and don't see). Nat Rev Immunol. 14, 377-391 (2014).
- Ross, J. O., et al. Distinct phases in the positive selection of CD8+ T cells distinguished by intrathymic migration and T-cell receptor signaling patterns. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, E2550-E2558 (2014).
- Hu, Z., Lancaster, J. N., Sasiponganan, C., Ehrlich, L. I. CCR4 promotes medullary entry and thymocyte-dendritic cell interactions required for central tolerance. J Exp Med. 212, 1947-1965 (2015).
- Anderson, M. S., et al. Projection of an immunological self shadow within the thymus by the aire protein. Science. 298, 1395-1401 (2002).
- Takaba, H., et al. Fezf2 Orchestrates a Thymic Program of Self-Antigen Expression for Immune Tolerance. Cell. 163, 975-987 (2015).
- McCaughtry, T. M., Baldwin, T. A., Wilken, M. S., Hogquist, K. A. Clonal deletion of thymocytes can occur in the cortex with no involvement of the medulla. J Exp Med. 205, 2575-2584 (2008).
- Stritesky, G. L., et al. Murine thymic selection quantified using a unique method to capture deleted T cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 4679-4684 (2013).
- Anderson, G., Jenkinson, E. J. Review article: thymus organ cultures and T-cell receptor repertoire development. Immunology. 100, 405-410 (2000).
- Hare, K. J., Jenkinson, E. J., Anderson, G. In vitro models of T cell development. Semin Immunol. 11, 3-12 (1999).
- de Pooter, R., Zuniga-Pflucker, J. C. T-cell potential and development in vitro: the OP9-DL1 approach. Curr Opin Immunol. 19, 163-168 (2007).
- Lian, Z., et al. Intrathymically injected hemopoietic stem cells can differentiate into all lineage cells in the thymus: differences between c-kit+ cells and c-kit < low cells. Stem Cells. 15, 430-436 (1997).
- Manna, S., Bhandoola, A. Intrathymic Injection. Methods Mol Biol. 1323, 203-209 (2016).
- Goldschneider, I., Komschlies, K. L., Greiner, D. L. Studies of thymocytopoiesis in rats and mice. I. Kinetics of appearance of thymocytes using a direct intrathymic adoptive transfer assay for thymocyte precursors. J Exp Med. 163, 1-17 (1986).
- Schmitt, T. M., Zuniga-Pflucker, J. C. Induction of T cell development from hematopoietic progenitor cells by delta-like-1 in vitro. Immunity. 17, 749-756 (2002).
- de Pooter, R. F., Schmitt, T. M., Zuniga-Pflucker, J. C. In vitro generation of T lymphocytes from embryonic stem cells. Methods Mol Biol. 330, 113-121 (2006).
- Dervovic, D. D., Ciofani, M., Kianizad, K., Zuniga-Pflucker, J. C. Comparative and functional evaluation of in vitro generated to ex vivo CD8 T cells. J Immunol. 189, 3411-3420 (2012).
- White, A., Jenkinson, E., Anderson, G. Reaggregate thymus cultures. J Vis Exp. (18), (2008).
- Anderson, G., Owen, J. J., Moore, N. C., Jenkinson, E. J. Thymic epithelial cells provide unique signals for positive selection of CD4+CD8+ thymocytes in vitro. J Exp Med. 179, 2027-2031 (1994).
- Anderson, G., Jenkinson, E. J. Fetal thymus organ culture. CSH Protoc. , (2007).
- Mazda, O., Watanabe, Y., Gyotoku, J., Katsura, Y. Requirement of dendritic cells and B cells in the clonal deletion of Mls-reactive T cells in the thymus. J Exp Med. 173, 539-547 (1991).
- Ceredig, R., Jenkinson, E. J., MacDonald, H. R., Owen, J. J. Development of cytolytic T lymphocyte precursors in organ-cultured mouse embryonic thymus rudiments. J Exp Med. 155, 617-622 (1982).
- Fairchild, P. J., Austyn, J. M. Developmental changes predispose the fetal thymus to positive selection of CD4+CD8 T cells. Immunology. 85, 292-298 (1995).
- Bhakta, N. R., Oh, D. Y., Lewis, R. S. Calcium oscillations regulate thymocyte motility during positive selection in the three-dimensional thymic environment. Nat Immunol. 6, 143-151 (2005).
- Le Borgne, M., et al. The impact of negative selection on thymocyte migration in the medulla. Nat Immunol. 10, 823-830 (2009).
- Ehrlich, L. I., Oh, D. Y., Weissman, I. L., Lewis, R. S. Differential contribution of chemotaxis and substrate restriction to segregation of immature and mature thymocytes. Immunity. 31, 986-998 (2009).
- Ueda, Y., et al. Mst1 regulates integrin-dependent thymocyte trafficking and antigen recognition in the thymus. Nat Commun. 3, 1098 (2012).
- Dzhagalov, I. L., Chen, K. G., Herzmark, P., Robey, E. A. Elimination of self-reactive T cells in the thymus: a timeline for negative selection. PLoS Biol. 11, e1001566 (2013).
- Halkias, J., et al. Opposing chemokine gradients control human thymocyte migration in situ. J Clin Invest. 123, 2131-2142 (2013).
- Au-Yeung, B. B., et al. Quantitative and temporal requirements revealed for Zap70 catalytic activity during T cell development. Nat Immunol. 15, 687-694 (2014).
- Melichar, H. J., Ross, J. O., Herzmark, P., Hogquist, K. A., Robey, E. A. Distinct temporal patterns of T cell receptor signaling during positive versus negative selection in situ. Sci Signal. 6, (2013).
- Hu, Q., Nicol, S. A., Suen, A. Y., Baldwin, T. A. Examination of thymic positive and negative selection by flow cytometry. J Vis Exp. (68), e4269 (2012).
- Mombaerts, P., et al. RAG-1-deficient mice have no mature B and T lymphocytes. Cell. 68, 869-877 (1992).
- Hogquist, K. A., et al. T cell receptor antagonist peptides induce positive selection. Cell. 76, 17-27 (1994).
- Weist, B. M., Kurd, N., Boussier, J., Chan, S. W., Robey, E. A. Thymic regulatory T cell niche size is dictated by limiting IL-2 from antigen-bearing dendritic cells and feedback competition. Nat Immunol. 16, 635-641 (2015).
- Melichar, H. J., Ross, J. O., Taylor, K. T., Robey, E. A. Stable interactions and sustained TCR signaling characterize thymocyte-thymocyte interactions that support negative selection. J Immunol. 194, 1057-1061 (2015).
- Hadjantonakis, A. K., Macmaster, S., Nagy, A. Embryonic stem cells and mice expressing different GFP variants for multiple non-invasive reporter usage within a single animal. BMC Biotechnol. 2, (2002).
- Schaefer, B. C., Schaefer, M. L., Kappler, J. W., Marrack, P., Kedl, R. M. Observation of antigen-dependent CD8+ T-cell/ dendritic cell interactions in vivo. Cell Immunol. 214, 110-122 (2001).
