Summary
우리는 유동 세포 계측법와 함께, T 세포 현상의 양 및 음의 선택을 모델링하는데 사용될 수 있고, 흉선 조각의 제조를 설명한다. 흉선 조각은 또한 흉선 세포 마이그레이션, 현지화의 현장에서 분석하도록하고, 면역 및 두 광자 현미경을 통해 시그널링 할 수있다.
Abstract
기능, 자기 허용 T 세포 레퍼토리의 생성의 결과로 독특하고 고도로 조직화 된 흉선 미세 환경에서 흉선 선택 진행한다. T 계보의 헌신과 개발을 연구하는 체외 모델은이 과정에 귀중한 통찰력을 제공하고 있습니다. 그러나, 이러한 시스템은 T 세포의 발달에 필요한 완전한 입체 흉선 환경이 부족하고, 따라서, 생체 내 선택 흉선 불완전 근사치이다. 모델링 T 세포의 개발과 관련된 문제들 중 일부는 전체 T 세포 개발 흉선 선택을 지원 온전한 흉선 미세 제공 시츄 모델을 사용하여 극복 될 수있다. 흉선 슬라이스의 Organotypic 문화는 현장 기술에 기존의 보완. 흉선 조각은 흉선 피질과 수질 지역의 무결성을 보존하고 정의 발달 단계 또는 내인성 T (c)의 중첩 흉선 세포의 개발을 연구 할 수있는 플랫폼을 제공성숙한 흉선 미세 환경 내에서 ELL 학생. 마우스 당 20 ~ 슬라이스를 생성 할 수있는 능력이 주어 흉선 슬라이스 높은 처리량 실험 성 측면에서 고유 한 이점을 제시한다. 또한, 다양한 유전 적 배경에서 다른 흉선의 서브 세트 또는 다른 세포 집단을 오버레이 흉선 조각과 잠재력을 생성하는 상대적 용이성이 방법의 다양성을 향상시킨다. 여기에서 우리는 흉선 조각, 격리 및 흉선 세포의 오버레이 및 유세포 분석을위한 흉선 조각 해리의 제조를위한 프로토콜을 설명합니다. 이 시스템은 흉선 세포 이주, 흉선 세포 - 실질 세포의 상호 작용 및 이광자 현미경 흉선 선택과 연관된 TCR 신호의 비 통상적 인 T 세포의 발달을 연구뿐만 아니라 가시화하도록 구성 될 수있다.
Introduction
T 세포는 기능성 자기 저항성 T 세포 레퍼토리 1-3의 생성을 위해 여러 체크 포인트가 발생하는 시간 동안 흉선 발달 중간체 일련 구별. 긍정적 인 선택은 대뇌 피질의 흉선 상피 세포 (CTEC) 2,3에 주요 조직 적합성 복합체 분자 (MHC)에 의해 제공 온건 친 화성 펩타이드에 저와, 인식 할 수있는 T 세포 수용체 (TCR)와 흉선 세포의 생존을 촉진한다. 음의 선택 및 규제 T (T REG) 세포 개발은 MHC 2,4 제시 자체 펩타이드에 강력하게 대응 흉선 세포의 제거 또는 전환을 통해 자기 관용의 설립에 기여한다. 미성숙 한 CD4 + CD8 + 더블 양성 (DP)은 성숙한 T 세포의 소집단으로 선정 과정을 통과 차별화 TCR도를 발현하는 흉선 세포,있는 MHC 클래스 I가 제한 CD8 + 세포 독성 대부분입니다또는 MHC 클래스 차 림프 기관 1-3 이펙터 기능을 수행하는 흉선을 종료하기 전에 CD4 + 헬퍼 단일 양성 (SP) T 세포를 II 제한.
T 세포 개발의 복잡성을 추가 동적 이동과 간질 셀 네트워크에 걸쳐 5-9 흉선 개발 셀룰러 조우한다. 이러한 기질 세포는 흉선 세포 개발에 뚜렷한 역할을하고 차별적 긍정적이고 부정적인 선택 (10)를 발생하는 흉선 피질과 수질 영역 사이에 분포한다. 긍정적 인 선택은 주로 피질에서 발생하지만, DP의 흉선 세포는 골수로 마이그레이션하고는 수질이 긍정적 인 선택과 혈통의 완료에 필요한 추가 신호를 제공 할 수 있음을 시사 성숙한 T 세포로 분화하기 전에 TCR 신호를 필요로 계속 축적 증거가있다 분화 11, 12. 더욱이,자기 반응성 흉선 세포 (13, 14)의 삭제를 용이하게 표현 전문 수질 흉선 상피 세포 (mTEC)와 현재의 조직 제한 항원의 존재에도 불구하고, 부정적인 선택의 큰 비율은 보편적으로 자기 펩타이드는 수지상 제시 표현에 대한 응답에서 피질에서 발생 세포 (15, 16). 따라서, T 세포 발달의 정확한 모델은 흉선 세포 및 간질 세포 사이의 상호 작용을 용이하게하고, 이러한 세포를 양성 및 음성 선별을 거쳐으로서 흉선 세포 이동을 지원 그대로 피질 및 수질 영역으로 고도로 조직화 흉선 미세 환경을 제공해야한다.
생체 보완 반응계에서, 포지티브 및 네거티브 선택, 시험관들을 연구하는 수단으로서 흉선 세포 분석 및 T 세포 발달의 생체 내 모델에서 17-22을 개발되어왔다. 요점을 되풀이하기 어렵기로 악명이있다긍정적 인 체외에서 선택하지만, 노치 리간드를 발현하는 줄기 세포 집단 또는 기질 세포와 T 세포 전구체의 공 배양, 특히 OP9-DL1가 / 4 세포로 체외 모델에에게 귀중한을 T 계보의 헌신과 제한된 양의 선택을 지원하는 기능이 있습니다 연구 T 세포 개발 23-25. 이 시스템의 한계는, 그러나, 이들 세포는 흉선 간질 세포에서 발견되는 고유 펩타이드 처리 장치 및 입체 흉선 미세 부족하다는 점을 포함한다.
기술적으로 복잡, 시험 관내 시스템에 관한 장벽들을 극복 할 수있는 동일계 및 흉선 선택의 생체 내 모델에서 비록. 재 응집 흉선 기관 배양 (RTOC)는 흉선 세포와 흉선 간질 세포 18,26,27의 혼합물 정의가 들어 있습니다. 이 흉선 상피 세포 reaggregates는 MHC 클래스 I 및 II 식을 유지하고 developme에 지원할 수 있습니다NT를 모두 기존의 T 세포 하위 집합으로, 그러나 아직도 피질과 수질 구조를 정의 부족합니다. 태아 흉선 기관 문화 (FTOC)은 lymphoreplete 흉선 로브에 lymphodepleted 흉선 로브 또는 흉선 세포의 주입을 통해 매달려 놓기 문화를 통해 흉선 세포의 시드와 CD4 +와 CD8 + T의 효율적인 개발을 지원할 수있는 T 세포 발달의 인기 모델입니다 문화 18,28-31에서 시간이 지남에 따라 세포. 태아 흉선 로브의 문화의 개시에 mTECs의 소수가 있지만, 정의 피질과 수질 구조는 조건에 따라 시간이 지남에 개발할 수 있습니다. 중요한 고려 사항이 모델 우선적 성인 T 세포 발달 대 태아 지원할 수 있다는 것이다. 마지막으로, 성인 마우스에서 정의 된 흉선 전구체의 intrathymic 주입은 기술적으로 도전하지만 명확하게 지원하는 환경을 제공합니다 생체 내에서 T 세포의 발달. 현장 및 생체 모델이 우수한 도구 t이다O 연구 T 세포의 발달 및 사용은 실험별로 실험을 기초로 고려되어야한다.
흉선 슬라이스 그러나 최근 고유 복잡하며, 일반적으로 높은 처리 실험을 수용 할 가능성 시츄 흉선 선택을 연구하는 다목적 상보 모델로 떠오르고있다. 흉선 슬라이스 피질 및 수질 영역의 무결성을 유지 및 개발뿐만 아니라 효율적인 양성 및 음성 선별 11,32-39 동안 흉선 세포 이동을 지원하는 간질 세포의 프레임 워크를 제공한다. 흉선 조각 꼭대기에 추가 흉선 세포의 부분 집합은 조직에 자신의 적절한 미세 환경 틈새 34, 37로 마이그레이션 할 수 있습니다. 오버레이는 흉선 congenic 표지 또는 형광 라벨을 통해 슬라이스 내인성 흉선 세포로부터 구별 할 수 있고, 몇 일 동안 배양 유지할 수있다. 흉선 슬라이스의 Organotypic 배양 물은 다양한 양상을 연구하기 위해 사용될 수있다다른 사람의 사이에서 흉선 선택, 흉선 세포 행동 (이동과 세포의 상호 작용), 및 흉선 세포 현지화를 포함한 T 세포 개발. 마우스 당 20 ~ 흉선 슬라이스를 생성 할 수있는 능력이 주어 실험의 확장 성 흉선 선택 시츄 모델에서 다른 것보다 일반적으로 크다. 흉선 조각의 제조 전문 등 vibratome 같은 장치, 및 세포 사멸을 통해 시간에 따른 세포의 손실 및 캡슐화 막 부족으로 인해 제한되어 배양 흉선 슬라이스의 수명 시간을 필요로하지만, 흉선 슬라이스 우수한 모델을 제공 성숙한 흉선 미세 환경 내에서 흉선 세포의 동기화 인구의 흉선 선택의 분석. 여기에서 우리는 유세포 분석을위한 흉선 조각, 격리 및 흉선 세포의 오버레이 및 해리 (흉선, 흉선 로브의 아가로 오스 삽입 및 내장 조직 vibratome 절편을 수확 포함) 흉선 조각의 준비에 대해 설명합니다.
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Protocol
HOPITAL Maisonneuve - 로즈 몬트 - 모든 동물 연구를위한 프로토콜 센터 드 공들인에서 동물 관리위원회에 의해 승인되었다.
흉선 조각의 제조 및 단일 세포 현탁액 1. 수확 마우스 흉선
- 자궁 경부 전위 다음 CO 2와 마우스를 안락사.
- 층류 후드에서 절개 보드 마우스 복부 측면을 고정. 70 % 에탄올로 마우스를 분무. 흉강을 입력하고 조직을 손상 에탄올을 방지하기 위해 거즈로 뿌리며 마치에 의해 초과 알코올을 제거합니다.
- 포셉 한 쌍의 흉골의 기지에서 피부를 들어 올려 피부를 통해 상처를합니다. 각 앞다리 위쪽으로 피부의 상처를 확장합니다.
- 흉곽에서 다이어프램을 분리하는 흉골의 기지에서 추가 컷을 확인합니다. 그런 다음 쇄골을 향해 흉곽의 각면을 잘라. 흉강을 노출 머리를 향해 흉곽을 뒤집습니다. 두 돌출부흉선은 심장의 상단에 거짓말.
- 집게, 마이크로 해부 가위를 사용하여 흉선 로브 주위의 결합 조직을 제거 및 / 또는 날카로운 곡선 가위. 아래에서 또는 결합 조직을 나머지를 통해 개별 로브를 들어 올릴 좋은 팁 곡선 포셉 한 쌍을 사용합니다.
참고 : 직접 흉선을 파악하지 마십시오. - PBS를 포함하는 15 ML 원뿔 관에서 흉선 로브를 놓고 필요할 때까지 얼음에 따로 설정합니다.
2. 아가로 오스 임베딩 및 흉선 로브의 Vibratome 슬라이스
- 멸균 PBS 50ml에 2g 저 융점 아가로 오스를 용해 아가로 오스가 완전히 용해 될 때까지 낮은 설정에은 전자 레인지에 의해 삽입을 위해 4 % 아가로 오스 솔루션을 준비합니다. 사용할 준비가 될 때까지 55 ° C에서 물을 욕조에 알루미늄 호일 및 장소 플라스크를 커버.
- 조직 배양 후드에서, 전체의 10 % 소 태아 혈청을 포함하는 RPMI-1640 용지 (FBS), 4- 밀리미터 L 글루타민, 1X 페니실린 / 스트렙토 마이신 및 10 μM 준비2- 머 캅토 에탄올.
- 6 웰 세포 배양 플레이트에 웰 당 1.5 ㎖의 RPMI-1640 완료된 미디어를 추가하고 각 웰의 세포 배양 삽입물을 놓는다. 필요할 때까지 37 ° C에서 인큐베이터에서 따로 접시를 설정합니다.
- 얼음 양동이에 물과 얼음과 눈 녹은 얼음 수조를 준비합니다.
- 조심스럽게 좋은 팁 집게를 사용하여 각 흉선 로브를 둘러싼 나머지 모든 결합 조직을 제거합니다. 조직 상으로 전송이 PBS에 담가, 또는 해부 현미경 와이프 후 흉선 로브는, 조직 배양 접시에 PBS에 잠긴 상태에서이 작업을 수행합니다.
- 아가로 오스는 조직의 과열을 방지하기 위해, 플라스크 터치 단지 따뜻한 40 ° C, 이하 식히십시오. ~ 1cm의 높이 조직 금형에 아가로 냉각 된 4 % 붓는다.
- 신중하게 조직 닦아 조직을 손상없이 건조 부드럽게 롤에 흉선 로브를 전송하는 집게 한 쌍을 사용합니다. 조직이 완전히 건조되었는지 확인하거나이 슬라이스 동안 아가로 오스 밖으로 밀어 것입니다.
- 조심스럽게 아가로 로브를 삽입 가로 몰드의 하단 (슬라이스의 수를 증가시키는) 수직 (각각의 조각의 면적을 증가시키기 위해) 또는 그 중 하나의 위치. 아가로 오스가 고형화 할 수 있도록 5 ~ 10 분 동안 얼음 물에 금형을 놓습니다.
- 이 시간 동안, 버퍼 트레이 장착 검지 디스크를 조립하고, vibratome 블레이드를 삽입함으로써 슬라이싱 용 vibratome 준비. 시편 디스크에 실험실 테이프의 조각을 놓습니다. 70 % 에탄올로 세정, 조립 작업을 소독.
- 아가로 오스 응고되면, 부드럽게 아가로 오스 포함 로브를 해제의 중심에서 몰드를 눌러 반전.
- 하단에 ~ 0.5 cm를 엽 각 측에 아가로 오스의 ~ 2mm을 떠나 주변을 초과 아가로 오스를 손질하기 위해 날카로운 칼날을 사용합니다.
- 시편 디스크에서 테이프의 조각에 조직 접착제 한 방울 각 아가로 오스 블록을 고정합니다. 여러 블록 테이프에 접착 될 수있다.
- vibratome 블레이드 위스콘신에 맞 춥니 다아가 블록의 상단 토륨. 블레이드와 아가로 오스 블록 (들) 완전히 몰입 될 때까지 멸균 PBS로 버퍼 트레이를 입력합니다.
- 제 아가로 오스 포함 된 조직은 400 ~ 500 ㎛의 두께로 슬라이스를 얻을 수있다. 0.225 mm / sec의 속도, 100 Hz의 주파수, 5 ° 각도로 vibratome를 설정합니다.
- 그들은 잘라 멸균 PBS를 함유 한 조직 배양 플레이트에 흉선 슬라이스를 수집 절곡 주걱을 사용한다. 첫 번째와 마지막 조각을 폐기하십시오.
- 4 배 배율의 광학 현미경 하에서 조각을 검사합니다. 그대로 흉선 조직과 주변 아가로 오스 (그림 1A)와 슬라이스를 선택합니다.
- 부드럽게 세포 배양 인서트 상 절곡 주걱에서 흉선 슬라이스 슬라이드 피펫 팁을 사용함으로써 단계 2.3에서 제조 한 판에 조각을 전송. 각 삽입 ~ 3 조각을 수용 할 수 있습니다. 슬라이스가 서로 또는 세포 배양 삽입 벽을 만지지 않도록합니다.
- 필요할 때까지 37 ° C에서 접시를 유지한다.
- 섹션 1에서 설명한 바와 같이, 2 % FBS를 함유하는 멸균 PBS 5ml를 가득 멸균 15ml의 조직 분쇄기를 사용하여 단일 세포 현탁액을 만들기 위해 수동 로브 떼어 놓다 흉선 돌출부를 분리. 15 ML 원뿔 튜브에 세포를 전송합니다.
- 4 ℃에서 5 분 동안 545 XG에서 세포를 원심 분리기. 상층 액을 제거하고, 적혈구를 용해시키기 위해 3 분 동안 실온에서 1X ACK 용해 완충액 (0.15 M NH4Cl를 10 mM의 KHCO 3, 0.1 밀리미터 나 2 EDTA) 1 ㎖로 세포를 재현 탁.
- PBS 2 % FBS를 포함하여 15 ml의 튜브를 입력합니다. 4 ℃에서 5 분 동안 545 XG에서 세포를 원심 분리기.
- 2 % FBS를 함유하는 PBS 10 ㎖로 세포를 재현 탁하고, 255 ㎛의 메쉬 필터로 셀을 통과한다.
- 혈구를 사용하여 세포를 계산합니다. 39 ° C에서 5 분 동안 545 XG에 세포를 원심 분리기 및 CONCENTR에서 2 % FBS를 함유하는 PBS에서 세포 펠렛을 재현 탁ml의 당 1 × 10 7 세포의 ATION.
- 휴대 전화 등의 카르복시의 숙신 이미 딜 에스테르 염료 (CFSE) 슬라이스 내생 세포로부터 구별하는 congenic 마커 또는 유전자 인코딩 된 형광 기자를 표현하는 쥐의 흉선 세포를 사용하지 않을 경우 제조 업체의 프로토콜에 따라 함께 세포를 레이블.
- 표지 된 세포의 최종 세척 후, 15 μL 당 1-3 × 106 세포에서 완전 RPMI-1640 배지에서 세포 펠렛을 재현 탁.
4. 흉선 조각에 흉선 세포를 오버레이
- 삽입의 흉선 조각을 둘러싼 액체를 대기음 피펫을 사용합니다.
참고 : 아가로 오스가 손상되지 않도록주의하십시오. 아가로 오스가 손상된 경우 포개어 흉선 의한 표면 장력의 손실 슬라이스 표면에 부착하지 않을 것이다. - 피펫 팁 오버레이 각 흉선 슬라이스에 섹션 3에서 제조 된 흉선 세포의 15 μl를 슬라이스를 건드리지 않고.
- 인민 해방군을 품어2 시간 동안 37 ° C에서 테는 세포가 흉선 조각으로 마이그레이션 할 수 있습니다.
- 2 시간 후, 아직 조직으로 마이그레이션하지 않은 초과 중첩 흉선 세포를 제거하는 1 ml의 PBS로 흉선 조각을 3 회 씻어.
- 흉선 조각이 수확 될 준비가 될 때까지 실험에 따라 일반적으로 1-72 시간을 37 ° C에서 접시를 품어.
유동 세포 계측법에 대한 흉선 조각 5. 해리
- 2 % FBS가 포함 된 PBS 150 μl를 추가하여 각 슬라이스에 대한 microcentrifuge 관을 준비합니다.
- 흉선 슬라이스로 조직 배양 인서트 2 % FBS를 함유하는 1 ml의 PBS를 첨가하고 부드럽게 세포 배양 인서트의 표면으로부터 슬라이스 분리 굴곡 주걱으로 교반 하였다.
- 굴곡 주걱을 사용하여 microcentrifuge 관에 삽입에서 슬라이스를 전송합니다.
- 수동으로 microcentrifuge 관 샘플 유봉을 사용하여 슬라이스를 방해. 최종 부피 (300)는 2 % FBS를 함유하는 PBS 150 μl를 추가μL.
- 새로운 마이크로 원심 튜브에 40 μm의 필터를 통해 해리 조직 필터. 여과 된 세포는 유세포 분석 (40)에 대한 물들 일 준비가 된 것입니다.
- 사이토 모든 아가가 제거되고 사이토 흐름을 방해하지 않도록하기 위해 흐름들을 전달하기 전에 세포를 두 번째 필터.
- 유세포에 세포를 수집하고 (40) 이전에 설명한 바와 같이 데이터를 분석한다.
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Representative Results
이러한 양 및 음의 선택과 같은 T 세포 발달의 여러 측면의 흉선 슬라이스 지원 분석. 성공적인 실험 들어, 흉선 조각의 품질이 중요하다. 따라서, 흉선 슬라이스는 흉선 조직의 무결성을 보장하기 위해 검사되어야하고 흉선 슬라이스를 둘러싼 아가 그대로 (도 1a)된다. 아가로 오스는 흉선 조직으로 이전의 수의 상당한 감소를 유발 손상 될 때, 표면 장력이 저하 될 수있다. 따라서, 조직 손상이나 흠의 표시와 흉선 조각 / 아가로 오스의 눈물 (그림 1B) 폐기해야합니다.
TCR 트랜스 제닉 (Tg)가 마우스 인해 종종 polyc 위에 포지티브 선택 빈도를 증가마다 흉선 세포의 표면 상에 정의 된 기능적 TCR 발현에 흉선 선택 공부 채용lonal 인구. 양성 선별의 각 단계를 캡처하기 위해, TCR TG 흉선 세포는 흉선 조각 위에 오버레이 될 수있는 사전 선택 및 성숙의 개발, CD4 + 또는 CD8 + T 세포 SP 40 유동 세포 계측법에 의해 시간이 지남에 따랐다. OT-I TCR TG Rag1을 내가 제한 MHC 클래스에서 고립 된 흉선 세포 - / - β2m - / - 생쥐 인해 MHC 클래스와 연관 안정 β2m의 필요성에 DP 단계 이전에 흉선 선택에 체포되는 I 중쇄 (41) 42. - / - β2m에 오버레이하면 흉선 조각, 사전 선택 OT-I TCR TG 흉선 세포는 DP 단계에서 남아 상당한 CD8 + SP T 세포 (그림 2A, 왼쪽)를 생성하지 않습니다. 선택 내인성 리간드를 포함하는 WT 흉선 슬라이스 겹쳐 때 반면, 양성 선별을 지원하는 모델의 능력은 (오른쪽도 2A) 72 시간에서 CD8 + T 세포의 발달에 의해 입증된다. 숨어양성 선별의 판독 등의 CD8 + T 세포의 발달 antification는도 2b에 도시된다.
흉선 조각은 음의 선택을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 부정적인 선택의 큰 비율은 유비쿼터스 항원 (16)에 대한 응답으로 발생합니다. - / - 유비쿼터스 항원, OT-I TCR TG Rag1에서 총 흉선 세포에 부정적인 선택을 모델링하고 야생형 (WT) 마우스는 각각 다음 1로 혼합 CFSE와 CTV, 표지했다 : WT 조각에 1의 비율과 겹쳐 (그림 3A). 과량의 흉선 세포를 세정 후, 흉선 슬라이스 또는 동족 1 nM의 상기 OT-I TCR, SIINFEKL (OVA 펩티드)의 작용제 펩타이드없이 완전 RPMI-1640 배지에서 넣었다. I 발현 세포 모든 MHC 클래스는 흉선에서 보편적으로 발현 항원 표현을 모델링 항원을 제시한다. 37 ° C, OT-I TCR TG CEL의 비율에서 배양 24 시간 후WT 제어 셀 LS (% 라이브 CFSE +) (% 라이브 CTV +)의 유동 세포 계측법 (도 3b)에 의해 비교 하였다. OT-I TCR TG 세포의 상대적인 비율의 감소는 OVA 펩티드에 응답 OTI TCR TG 세포의 결실을 나타낸다.
기인 흉선 슬라이스의 크기 이질성과 흉선 세포 조각으로 엔트리를 하나 이들 변수를 정상화하기위한 적절한 분석 및 내부 제어를 포함한다는 것을 주목하는 것이 중요하다. 여기서, 슬라이스 꼭대기 OT-I TCR TG 세포와 혼합하고 겹쳐 WT 세포 모집단 크게 OVA 펩티드의 존재 또는 부재에 의해 영향을 받아서는 안 등의 내부 대조군으로서 사용 하였다. OTI TCR TG 세포의 부정적인 선택의 범위는 비율이 아닌 절대 숫자에 따라 정량 하였다. 먼저, WT에 OT-I TCR TG (% 라이브 CFSE +)의 비 존재하에 각 WT 흉선 슬라이스 (% 라이브 CTV +) 세포 또는 OVA 펩티드의 유무를 산출 하였다. 이러한 비율은 각각 다음 OVA 펩티드의 부재하에 WT 슬라이스의 WT에 OT-I TCR의 TG (% 라이브 CFSE +) 사이의 비율 (% 라이브 CTV +) 세포의 평균에 의해 분할 하였다. 도 3c에 도시 된 바와 같이, 평균적 OT-I TCR TG 세포의 80 %는 유비쿼터스 항원에 대한 응답으로 방전 하였다.
그림 1 : 수직으로 삽입 된 흉선 로브로부터 제조 된 흉선 슬라이스의 대표 이미지. (A) 포함 된 조직과 아가로 오스 그대로 주변에 좋은 품질의 조각. (B)에 의한 공격 태도를 보여준 중에 포함 된 조직으로 찢어 손상과 품질이 낮은 조각. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 :. 흉선 조각에 긍정적 인 선택의 유세포 분석 OT-I TCR TG Rag1 - / - β2m - / - 흉선 세포가 β2m 비 선택에 CFSE로 표지 및 중첩 된 - / - 또는 WT 슬라이스를 선택. 37 ° C에서 배양 한 후 72 시간 후에, CD8 + T 세포의 발달은 유동 세포 계측법으로 분석 하였다. (A) 라이브 CFSE β2m에서 + TCRβ 높은 흉선 세포에 세포 표면 CD4 및 CD8 표현의 대표적인 데이터 - / -와 WT 조각. 비 선택 컨트롤에 비해 WT 조각에 라이브 CFSE + TCRβ 높은 CD8 + T 세포 개발의 (B) 정량. 각 점은 개별 흉선 슬라이스를 나타내고, 행의 평균을 나타낸다. (** p <0.001, 짝 t 시험)ove.com/files/ftp_upload/54355/54355fig2large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3 : 흉선 슬라이스 음성 선별의 유세포 분석 1 :. 총 CFSE 표지 된 OT-I TCR TG Rag1 1 비 - / - 및 CTV 표지 WT의 흉선 세포의 존재 또는 부재 WT 슬라이스 적층했다 OVA 펩티드, SIINFEKL. 37 ° C에서 24 시간 배양 후, 중첩 셀의 상대적인 비율은 유동 세포 계측법으로 분석 하였다. (A) 실험 셋업 CTV 표지 WT 세포 (파란색)의 오버레이를 도시 한 혼합의 개략 : 유무에 WT 흉선 슬라이스 상 CFSE 표지 된 OT-I TCR TG 세포 (녹색)으로 1 OVA 펩타이드. (B) 살아있는 CFSE + OT-I의 비율을 나타내는 대표 데이터또는 OVA 펩티드없이 배양 조각에서 TCR TG 세포 및 WT 세포 CTV +. (C) 데이터는 조각 사이에 정상화하고, CTV + WT 세포를 살 수있는 라이브 CFSE + OT-I TCR TG 세포의 상대적 비율이 표시됩니다. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. 각 조건에 대한 N = 3. (* P <0.05, 짝 t 테스트). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기에서 우리는 흉선 조각 및 유동 세포 계측법에 의해 중첩 사전 선택 MHC 클래스 I 제한 TCR 유전자 변형 흉선 세포의 효율적인 양성 및 음성 선택의 대표적인 결과의 제조를위한 프로토콜을 설명합니다. 이 시스템은 작용제 항원 음성 선별 및 흉선 T에 등록 개발 11,12의 존재하에 예비 선택 DP의 흉선 (32)로부터 MHC 클래스 II 제한 CD4 + T 세포의 양성 선별을 지원하기 위해 유사한 성공 사용되었으며 36,38,39,43,44. 이 프로토콜은 유전자 변형 흉선 또는 간질 세포 집단뿐만 아니라 억제제, 정의 된 펩티드의 존재 또는 부재 흉선 선택 공부 변형 될 수있다. 흉선 조각은 또한 흉선 세포 하위 집합이 아닌 다른 세포 집단의 오버레이 의무가 있습니다. 예를 들어, 최근에 효율적 조직으로 이전 및 음성을 지원할 수 selectio 흉선 슬라이스에 중첩하는 수지상 세포를 나타내었다n 및 T의 레지 개발 39,43. 지금까지 연구는 긍정적이고 부정적인 선택을 연구하기 위해 사전 선택 DP 또는 총 흉선 세포를 사용했다. T 세포 발달 흉선 슬라이스 적어도 4 일 동안 수행 할 수 있지만 이전 전구 인구 실험을 시작하기에 관심이 있다면, 본 시스템의 한계는 흉선 조각의 품질이 후 감소하기 시작 있다는 것을 고려해야한다 에 의한 세포 사멸과 캡슐 막의 부족 문화 1-2일.
여기에 기술 된 프로토콜은 미묘한 변형 인간 흉선 조직으로부터 슬라이스를 생성하기 위해 사용될 수있다. 아가로 매립하기 전에 인간 흉선 조직 단편으로 성인 마우스 흉선 로브 대략 크기를 절단한다. 특히, 인간 흉선 샘플은 양질 조각을 준비하는 것이 더 어렵고, 뮤린 흉선에 비해, 결합 조직이 풍부하고. 우리의 경험에서, 태아가 아니라 신생아 인간흉선 조직 슬라이스 준비에 더 도움이되는 것입니다. 인간의 흉선 세포 하위 집합은 모두 인간과 마우스의 흉선 조각 (37)에 제대로 지역화 것으로 나타났다. 중첩 인간 흉선 세포의 서브 세트의 선택은 흉선 그러나 아직 흉선 슬라이스 모델에서보고되지 않았다. 클론 집단에서 양성 선별 효율이 낮고, 흉선 의한 슬라이스 포개어 흉선의 낮은 비율 (~ 0.5 %), 양 선택된 셀의 같은 작은 번호를 평가하기 어렵다. 긍정적 인 선택의 효율성을 높이기 위해 인간의 흉선 조각에 오버레이 이전에 인간 T 세포의 전구 세포에 인간 TCR의 형질 전환 유전자를 소개 실현 될 수있다. 또한이 중에서도 외인성 펩티드 또는 다른 세포 집단 및 TCR 신호의 억제제의 존재 또는 부재 내인성 T 세포 집단에서의 모니터링 변화의 가능성을 배제하지 않는다.
이 프로토콜은 또한 광고 할 수있다흉선 세포 마이그레이션, TCR 신호 및 세포 상호 작용 12,32-38의 시각화를위한 apted. 수질은 중앙 흉선에있는 바와 같이 최근까지 현장에서 흉선 세포 행동의 대부분의 연구는 두 광자 현미경에 의한 검출 한계를 넘어, 피질로 제한되어있다. 반대로, 흉선 조각 조각이 그대로 흉선 및 골수 피질 영역을 가지고있는 고유의 장점을 제공하고, 슬라이스 표면 이광자 촬상하여 골수에 직접 액세스 할 수있다. 또, 인돌 칼슘 인디케이터 염료로 표지 된 세포와 겹쳐 흉선 슬라이스는 이광자 현미경 11,32,36하여 양 및 음의 선택과 연관된 TCR 신호의 지표로서 세포질 칼슘 농도를 사용 TCR 신호를 모니터링하기 위해 사용될 수있다 38,39,44. 현미경의 샘플을 준비하기 위해, 슬라이스 프로토콜 4.5 단계 후에 바로 사용할 수있다. 이 경우,주의 SU 적합한 형광 표지를 선택하기 위해주의해야이미징을위한 itable.
흉선 슬라이스 기관 배양 시츄 마우스와 인간 T 세포 발달의 다양한 양상을 연구하기위한 훌륭한 도구이다. 그러나,이 기술의 성공적인 응용 프로그램은 프로토콜의 중요한 단계에 특별한주의가 필요합니다. 높은 처리량 실험 수득 흉선 슬라이스의 수를 최대화하기 위해 사용 된 쥐의 나이는 마우스의 수명에 걸쳐 흉선 변화의 크기가 고려되어야한다. 우리는 일반적으로 ~ 마우스 당 20 흉선 조각을 생성 4~8주 된 마우스를 사용합니다. 그러나, 태아, 신생아 이상 마우스 thymi 이론적으로 사용자의 요구에 따라 실험 슬라이스 제한된 수를 생성하기 위해 사용될 수있다. 양질 조각을 얻기 위해, 종래의 아가로 매립 흉선 돌출부를 둘러싸는 모든 결합 조직을 제거하기 위해 매우 중요하다. 결합 조직을 잔존 효과적으로 슬라이싱 중에 vibratome 블레이드에 의해 절단되지 않고 손상 될 수 흉선로브와 결과 조각. 결합 조직의 대부분은 흉선 수확 중에 제거 (150 단계) 상기 돌출부는 상기 조직 자체의 상당한 조작없이 흉강로부터 제거 될 수있게한다. 단계 2.5에 설명 된대로 로브를 분리 한 후 신중하게 남아있는 결합 조직을 제거합니다. 또한, 내장 조직을 둘러싸는 아가의 무결성을 유지하는 슬라이스 상에 효과적으로 오버레이 흉선 필수적이다. 따라서,이 실험에서 사용하기 위해 흉선 슬라이스 선택시 흉선 슬라이스 주변 아가 모두를 검사하는 것이 중요하다. vibratome은 전형적으로 오염의 위험을 증가 조직 배양 후드의 외측에 위치된다. 실험 사이에서 완전히 vibratome 청소 전에 슬라이싱 70 % 에탄올로 작업 영역 vibratome 분무하여 오염에 대한 가능성을 제한 할 수있다. 상기 p-에 언급 된 단계는 2.13 및 2.15 멸균 PBS를 사용하는 것도 중요rotocol. 마지막으로, 흉선 내생 세포의 조직으로 이전 포개어 흉선 세포를 구별하는 것이 중요하다. 이를 단계 3.7에 언급 된 형광 염료와 겹쳐 세포를 라벨링함으로써 달성 될 수있다. 또한, congenic 마커 또는 유전자 인코딩 된 형광 기자를 표현 마우스의 흉선 세포는 45, 46 사용할 수 있습니다. 그러나, 일반적으로, 흉선 슬라이스 조작하기 쉽고 만 탐구하기 시작했다 광범위한 적용 가능성을지지하는 사용자의 특정 요구에 실험적으로 적용 할 수있다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vibratome | Leica Biosystems | VT1000S | |
| NuSieve GTG Agarose | Lonza | 50080 | Low melting temperature agarose |
| Embedding Mold (Truncated - T12) | Polyciences | 18986 | 22 mm x 22 mm square, truncated to 12 mm x 12 mm |
| Double Edge Prep Blades | Personna | 74-0002 | |
| Tissue Adhesive | 3M | 1469SB | |
| 0.4 µm Cell Culture Inserts | BD Falcon | 353090 | Of several brands tested, these maintained the cells atop the slices the best |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | ThermoFisher | 21600-010 | |
| RPMI-1640 with L-glutamine | Wisent | 350-000-CL | |
| Fetal Bovine Serum | Wisent | 080-110 | Heat inactivated |
| L-Glutamine, 200 mM | Wisent | 609-065-EL | |
| Penicillin/Streptomycin, 100x | Wisent | 450-201-EL | |
| 2-Mercaptoethanol | Alfa Aesar | A15890 | |
| 15 ml Tenbroeck Tissue Grinders | Wheaton | 357426 | |
| Nylon Mesh Filter | Component Supply | U-CMN-255 | |
| Microcentrifuge Tube Sample Pestle | Bel-Art | F19922-0000 | |
| 40 µm Nylon Cell Strainer | BD Falcon | 352340 | |
| Forceps Inox Tip | Dumont | RS-5047 | Fine tip curved forceps, size .17 x .10 mm |
| Micro Forceps | Dumont | RS-5090 |
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