Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Immunology and Infection

הכנה ויישומים של תרבויות Organotypic הרתי Slice

doi: 10.3791/54355 Published: August 6, 2016
* These authors contributed equally

Summary

אנו מתארים את הכנת פרוסות הרתי, בשילוב עם cytometry זרימה, יכול לשמש מודל בחירה חיובית ושלילית לפתח תאי T. פרוסות הרתי ניתן להתאים גם לניתוח באתרו של הגירה thymocyte, לוקליזציה, ואיתות באמצעות immunofluorescence ושני פוטון מיקרוסקופית.

Abstract

התמורה מבחר הרתי בתוך microenvironment הרתי ייחודי מאוד מאורגנת וכתוצאה מכך הדור של רפרטואר תא T פונקציונלי, עמיד בפני עצמי. מודלים חוץ גופית ללמוד מחויבות השושלת T ופיתוח סיפקו תובנות חשובות לגבי התהליך הזה. עם זאת, מערכות אלו חסרים את המילייה הרתי תלת ממדים המלאות נחוצה להתפתחות תאי T, ולכן הם קירובים שלמים של in vivo מבחר הרתי. כמה מן האתגרים הקשורים לפיתוח תא דוגמנות T ניתן להתגבר באמצעות במודלים באתרו המספקים microenvironment הרתי שלם שתומך מבחר הרתי מלא לפתח תאי T. תרבויות organotypic פרוסת הרתי משלימים קיימים טכניקות באתרו. פרוסות הרתי לשמור על שלמות של אזורים קורטיקליים מדולרי הרתי ולספק פלטפורמה ללמוד פיתוח של thymocytes כיסו של שלב התפתחותי מוגדר או של ג T אנדוגניאמות בתוך microenvironment הרתי בוגר. בהינתן היכולת ליצור ~ 20 פרוסות לכל עכבר, פרוסות הרתי להציג יתרון ייחודי במונחים של מדרגיות לניסויי קצב העברת נתונים גבוהות. יתר על כן, הקלות היחסית ביצירת פרוסות הרתי ופוטנציאל כיסוי תת הרתי שונה או אוכלוסיות תאים אחרות מרקע גנטי מגוונים משפרת את הרבגוניות של שיטה זו. כאן אנו מתארים פרוטוקול להכנת פרוסות הרתי, בידוד כיסוי של thymocytes, ניתוק של פרוסות הרתי עבור ניתוח תזרים cytometric. מערכת זו יכולה גם להיות מותאמת ללמוד פיתוח תאי T בלתי קונבנציונלי וכן לדמיין גירת thymocyte, אינטראקציות תא-סטרומה thymocyte, ואותות TCR הקשורים בחירה הרתי על ידי מיקרוסקופ שני פוטונים.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

T תאים להבדיל באמצעות סדרה של ביניים התפתחותיים התימוס במהלכן הם נתקלים בכמה מחסומים המבטיחים בדור של רפרטואר תא T פונקציונלי, עמיד בפני עצמי 1-3. סלקציה חיובית מקדמת את ההישרדות של thymocytes עם קולטנים של תאי T (TCR) מסוגלים להכיר, עם נמוך הזיקה מתונה, פפטיד שהציגו מולקולות מורכבות histocompatibility גדולות (MHC) על תאי אפיתל הרתי קליפת מוח (cTEC) 2,3. סלקציה שלילית ו- T רגולטוריים התפתחות התא (T reg) לתרום להקמת סובלנות עצמית באמצעות חיסול או הסטת thymocytes שמגיבים בחריפות-פפטיד עצמי שהציג MHC 2,4. בשלה CD4 + CD8 + חיובית כפולה (DP) thymocytes להביע TCRs שעוברים תהליך הבחירה להתמיין תת-אוכלוסיות של תאי T בוגרים, שרובם הם מהשורה MHC-מוגבל ואני ציטוטוקסיות CD8 +או בכיתת MHC II-מוגבל CD4 + עזר יחיד חיובי (SP) ותאי T, לפני היציאה התימוס כדי לבצע פעולות מפעיל באיברים הלימפה משני 1-3.

מה שמוסיף למורכבות של פיתוח תאי T, ההגירה הדינמית ומפגשים הסלולר לפתח thymocytes ברחבי רשת תא סטרומה 5-9. בתאי סטרומה אלה ממלאים תפקידים ברורים בפיתוח thymocyte ומופצים באופן דיפרנציאלי בין האזורים קורטיקליים מדולריים הרתי שבו חיובי סלקציה שלילית להתרחש 10. למרות סלקציה חיובית מתרחשת בעיקר בקליפת המוח, יש ראיות מצטבר thymocytes העקור נודד אל הלשד ולהמשיך לדרוש אותות TCR לפני שהם להתמיין לתאי T בוגרים דבר המצביעים על כך הלשד עשוי לספק אותות נוספים הדרושים להשלמת מבחר חיובי שושלת בידול 11,12. נוסף,למרות נוכחותם של תאי אפיתל הרתי מדולרי מיוחדים (Mtec) מבטאים ו אנטיגנים הנוכחי מוגבל רקמות הקלת מחיקה של thymocytes אוטוריאקטיבים 13,14, חלק גדול של סלקציה שלילית מתרחש בקליפה בתגובה הביע בכל מקום בגוף-פפטיד עצמי שהציג הדנדריטים תאים 15,16. לפיכך, מודלים מדויקים של פיתוח תאי T חייב לספק microenvironment הרתי מאורגן, עם קליפת המוח ללא פגע ואזורים מדולרי, המאפשר אינטראקציה בין thymocytes ותאי סטרומה, ותומך הגירה thymocyte כמו תאים אלה עוברים סלקציה חיובית ושלילית.

כדי להשלים vivo לשעבר מנתח של thymocytes כאמצעי לימוד מבחר חיובי ושלילי, מספר במבחנה, באתרו, ו במודלי vivo של התפתחות תאי T פותח 17-22. זה כבר ידוע לשמצה קשה לשחזרבחירה במבחנה חיובית, אבל coculture של אוכלוסיות תא גזע או מבשרי תא T עם תאי סטרומה להביע ליגנד Notch, בעיקר OP9-DL1 / 4 תאים, יש לו את היכולת לתמוך במחויבות שושלת T ו סלקציה חיובית מוגבלת מה שהופך אותו לא יסולא בפז במודל חוץ גופייה כדי מחקר תאי T פיתוח 23-25. מגבלות של מערכת זו, עם זאת, כוללים את העובדה כי תאים אלה חסרים את מכונות עיבוד פפטיד ייחודי המצוי בתאי סטרומה הרתי ואת microenvironment הרתי תלת ממדי.

למרות שלמעלה טכנית מסורבלת, באתרו במודלים vivo של מבחר הרתי יכול להתגבר על מחסומים הקשורים למערכות במבחנה. תרבויות איבר Reaggregate הרתי (RTOC) מכילים מוגדר תערובות של thymocytes ותאי סטרומה הרתי 18,26,27. reaggregates תא אפיתל הרתי אלה לשמור הביטוי שהייתי בכיתה MHC ו- II והוא יכול לתמוך developmeNT של שני תת התא הקונבנציונלי T, אך עדיין חסרת מוגדר מבנים קורטיקליים מדולריים. תרבות איבר הרתי עוברית (FTOC) היא מודל פופולרי של פיתוח תאי T שניתן זורע עם thymocytes באמצעות תרבות תליית טיפת אונות הרתי lymphodepleted או באמצעות זריקה של thymocytes לתוך lymphoreplete אונות הרתי ולתמוך בפיתוח יעיל של CD4 + ו- CD8 + T תאים לאורך זמן בתרבות 18,28-31. ב החניכה של התרבות של אונות הרתי העובר יש מחסור של mTECs, אך מוגדר מבנים קורטיקליים מדולריים עלולים לפתח לאורך זמן בהתאם לתנאים. שיקול חשוב הוא כי מודל זה עשוי לתמוך עוברי מועדף לעומת פיתוח תא הבוגר T. לבסוף, הזרקת intrathymic של מבשרי הרתי מוגדר בעכברים בוגרים הוא מאתגר מבחינה טכנית אך ברור מספקת סביבה לתמיכה פיתוח תאי T in vivo. אלו באתרו במודלים vivo הם לא כלים מצויניםo מחקר T תא הפיתוח והשימוש שלהם צריך להיחשב על בסיס ניסוי אחר ניסוי.

פרוסות הרתי, לעומת זאת, צמחו לאחרונה כמודל צדדי, משלים ללמוד בחירה הרתי באתרו עם האפשרות להכיל ייחודי, מורכב, ובדרך כלל ניסויי תפוקה גבוהים יותר. פרוסות הרתי לשמור על השלמות של האזורים קורטיקליים מדולריים ולספק מסגרת של תאי סטרומה שתומכת גירת thymocyte במהלך פיתוח, כמו גם מבחר חיובי ושלילי יעיל 11,32-39. תת thymocyte הוסיף גבי פרוסות הרתי נודדים לתוך רקמות נישת microenvironmental המתאימה שלהם 34,37. Thymocytes המעולף ניתן להבחין בין תאי אנדוגני פרוסה הרתי באמצעות סמני congenic או תוויות ניאון והוא יכול להישמר בתרבות במשך כמה ימים. תרבויות organotypic פרוסה הרתי יכול לשמש כדי לחקור היבטים שוניםההתפתחות של תאי T כולל מבחר הרתי, התנהגות thymocyte (הגירה אינטראקציות הסלולר), ולוקליזציה thymocyte, בין היתר. בהינתן היכולת ליצור ~ 20 פרוסות הרתי לכל עכבר, את יכולת ההרחבה של ניסויים היא בדרך כלל גדולה יותר מאשר אחרים במודלים באתרו של מבחר הרתי. למרות הכנת פרוסות הרתי דורשת ציוד מיוחד, כגון vibratome, ואת זמן החיים של פרוסות הרתי בתרבות מוגבלת בשל אובדן של תאים לאורך זמן באמצעות מוות של תאים וחוסר קרום encapsulating, פרוסות הרתי לספק מודל מצוין לניתוח של מבחר הרתי של אוכלוסיות מסונכרנות של thymocytes בתוך microenvironment הרתי בוגר. כאן אנו מתארים את הכנת פרוסות הרתי (כולל קצירת התימוס, הטבעת agarose של אונות התימוס vibratome חתך של הרקמות המוטבעות), בידוד שכיסה של thymocytes, הניתוק של פרוסות הרתי עבור ניתוח התזרים cytometric.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

פרוטוקולים לכל במחקרים בבעלי החיים אושרו על ידי ועדת הטיפול בבעלי החיים בבית המשוכלל והנדיר de המרכז - Hôpital Maisonneuve-Rosemont.

1. קציר עכבר קורנית עבור הכנת הרתי פרוסה השעיות תא בודדות

  1. להרדים את העכבר עם CO 2 ואחריו נקע בצוואר הרחם.
  2. במנדף זרימה למינרית, להצמיד בצד הגחון העכבר עד קרש החיתוך. תרסיס העכבר עם אתנול 70%. הסר אלכוהול עודף בטופחו עם גזה כדי למנוע אתנול מלהיכנס חלל בית החזה פגיעה ברקמה.
  3. הרם את העור בבסיס של עצם החזה עם זוג מלקחיים ולעשות חתך דרך העור. הארך את החתך של העור כלפי מעלה לכל forelimb.
  4. תן קיצוץ נוסף בבסיס עצם החזה להפריד את הסרעפת מן הצלעות. ואז לחתוך בכל צד של כלוב הצלעות כלפי עצם הבריח. תהפוך את כלוב הצלעות מעל לכיוון הראש לחשוף את חלל בית החזה. שתי האונות שלהתימוס לשכב על החלק העליון של הלב.
  5. הסר את רקמת חיבור סביב האונות הרתי באמצעות מלקחיים, מספרי מייקרו לנתיחה, ו / או במספריים מעוגלים חדים. השתמש זוג מלקחי קצה מעוקל בסדר להרים את האונות בודדות מתחת או באמצעות נותרי רקמת חיבור.
    הערה: אין לתפוס את התימוס ישירות.
  6. מניחים את האונות הרתי צינור חרוטי 15 מ"ל המכיל PBS ומניחים בצד על הקרח עד הצורך.

2. והטבעה Agarose ו Vibratome חיתוך של הרתי אונות

  1. הכן 4% פתרון agarose להטבעת ידי המסת 2 גרם agarose נקודת התכה נמוכה ב 50 מ"ל סטרילי PBS ו במיקרוגל בעוצמה נמוכה עד agarose נמס לגמרי. מכסים הבקבוק בנייר כסף ומניחים אלומיניום באמבט מים ב 55 ° C עד מוכן לשימוש.
  2. במנדף בתרבית רקמה, להכין התקשורת RPMI להשלים-1640 המכיל 10% בסרום שור העובר (FBS), 4 מ"מ גלוטמין, פניצילין / סטרפטומיצין 1x, ו -10 מיקרומטר2-mercaptoethanol.
  3. הוסף 1.5 מ"ל להשלים התקשורת RPMI-1640 לכל היטב צלחת תרבית תאים 6 באר ומקום הכנס תרבית תאים בכל טוב. הגדר את הצלחת בצד באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס עד הצורך.
  4. כן אמבט מי קרח עכור עם מים וקרח בתוך דלי קרח.
  5. מוציאים בזהירות את כל רקמות החיבור שנותרו סביב כל האונה הרתי באמצעות מלקחיים טיפ נאה. האם זה בעוד האונה הרתי היא שקועה PBS בצלחת בתרבית רקמה, לאחר העביר לתוך ממחטת נייר לנגב ספוגת PBS, או תחת מיקרוסקופ לנתח.
  6. אפשר agarose להתקרר מתחת ל -40 מעלות צלזיוס, כאשר הבקבוק הוא רק חם למגע, כדי למנוע התחממות יתר הרקמה. יוצקים את 4% מקורר agarose לתוך תבנית רקמה עד לגובה של ס"מ 1 ~.
  7. השתמש זוג מלקחיים להעביר את האונה הרתי בקפידה כדי רקמה לנגב ולגלגל אותו בעדינות כדי לייבש אותו מבלי לפגוע ברקמה. ודא כי הרקמה מתייבש לגמרי או שזה יהיה להחליק החוצה של agarose במהלך חיתוך.
  8. בזהירות להכניס את האונה לתוך agarose ולמקם אותו או אופקית (כדי להגדיל את שטח הפנים של כל פרוסה) או אנכית (כדי להגדיל את מספר פרוסות) בתחתית התבנית. מניחים את התבנית במי קרח למשך 5-10 דקות, כדי לאפשר agarose כדי לחזק.
  9. במהלך תקופה זו, להכין את vibratome עבור חיתוך על ידי הרכבת מגש החיץ, להרכבת דיסק הדגימה, והחדרת להב vibratome. מניחים חתיכת סרט במעבדה על הדיסק הדגימה. לעקר את סביבת העבודה נקייה, התאספו עם 70% אתנול.
  10. לאחר agarose מבצרת, להפוך את התבנית ולחץ בעדינות במרכזה לשחרר את האונה מוטבע agarose.
  11. השתמש סכין חד לחתוך את agarose העודף סביב האונה עוזב ~ 2 מ"מ של agarose בכל צד ו ~ 0.5 סנטימטר בתחתית.
  12. Secure כל בלוק agarose עם טיפת דבק רקמות חתיכת סרט על דיסק הדגימה. יכול להיות דבוק בלוקים מרובים בקלטת.
  13. יישר את wi להב vibratome th העליון של הבלוק agarose. מלאו את מגש חיץ עם PBS סטרילי עד הבלוק הלהב agarose (ים) שקועים לחלוטין.
  14. סעיף הרקמה מוטבע agarose להשיג פרוסות בעובי של 400-500 מיקרומטר. הגדר את vibratome כדי 0.225 מ"מ / מהירות שניות, 100 הרץ תדיר, ו -5 ° זווית.
  15. השתמש מרית והתכופפה לאסוף את הפרוסות הרתי לתוך צלחת בתרבית רקמה המכילה PBS סטרילית כפי שהם נחתכים. מחק את הפרוסה הראשונה והאחרונה.
  16. בדוק את הפרוסות תחת מיקרוסקופ אור בהגדלת 4X. בחר את הפרוסות עם רקמת הרתי שלמה סביב agarose (איור 1 א).
  17. מעביר את הפרוסות לצלחת מוכנה בשלב 2.3 באמצעות קצה פיפטה כדי להחליק את פרוסת הרתי בעדינות מן המרית מכופף על כנס תרבית תאים. כל כנס יכול להכיל ~ 3 פרוסות. ודא פרוסות לא נוגעים זה בזה או הקירות להכניס תרבית תאים.
  18. שמור את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס עד הצורך.

class = "jove_title"> 3. הכנת thymocytes עבור שכיסה

  1. לבודד האונות הרתי כמתואר בסעיף 1. לנתק את האונות באופן ידני כדי לעשות השעיה תא בודד באמצעות מטחנת 15 מעוקר מ"ל רקמות מלא 5 מ"ל של PBS סטרילי המכיל 2% FBS. העברת התאים צינור חרוטי 15 מ"ל.
  2. צנטריפוגה התאים ב 545 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C.. בטל supernatant ו resuspend התאים 1 מ"ל של חיץ תמוגה 1x ACK (0.15 M NH 4 Cl, 10 מ"מ KHCO 3, 0.1 מ"מ Na 2 EDTA) בטמפרטורת החדר למשך 3 דקות עד lyse בתאי הדם האדומים.
  3. מלאו את צינור עד 15 מ"ל עם PBS המכיל 2% FBS. צנטריפוגה התאים ב 545 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C..
  4. Resuspend התאים 10 מ"ל של PBS המכיל 2% FBS ולהעביר התאים דרך מסנן רשת 255 מיקרומטר.
  5. ספירת תאים באמצעות hemocytometer. צנטריפוגה התאים ב 545 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C, ו resuspend התא גלולה ב PBS המכיל 2% FBS בכל concentration של 1 x 10 7 תאים לכל מ"ל.
  6. התווית התאים עם צבעים סלולריים כמו אסתר succinimidyl carboxyfluorescein (CFSE) על פי פרוטוקולים של יצרן אם לא באמצעות thymocytes מעכברים להביע סמני congenic או כתבי ניאון מקודד גנטי להבחין מתאי אנדוגני פרוסים.
  7. לאחר לשטוף הסופי של התאים שכותרתו, resuspend התא גלולה ב מדיה מלאה RPMI-1640 ב 1-3 x 10 6 תאים לכל 15 μl.

4. שכיסה thymocytes על פרוסות הרתי

  1. השתמש פיפטה כדי לשאוב כל נוזל המקיף את הפרוסות הרתי על ההוספה.
    הערה: תשמרי על עצמך כדי למנוע נזק agarose. אם agarose פגום, thymocytes המעולף לא לצרף אל פני השטח פרוסה כתוצאה מאובדן מתח פנים.
  2. מבלי לגעת פרוסה עם קצה פיפטה, כיסוי 15 μl של thymocytes מוכן בסעיף 3 על כל פרוסה הרתי.
  3. דגירת PLAטה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות כדי לאפשר לתאים לנדוד אל פרוסות הרתי.
  4. לאחר 2 שעות, לשטוף את פרוסות הרתי 3 פעמים עם 1 מ"ל PBS להסיר thymocytes מעולף עודף שעדיין לא עברו לתוך הרקמה.
  5. דגירה את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס עד שהפרוסות הרתי מוכנות להיות שנקטף, בדרך כלל 1-72 שעות תלויות בניסוי.

5. דיסוציאציה של הרתי פרוסות cytometry זרימה

  1. הכן צינור microcentrifuge עבור כל פרוסה על ידי הוספת 150 μl של PBS המכיל 2% FBS.
  2. הוסף 1 מ"ל של PBS המכיל 2% FBS כדי להכניס את בתרבית רקמה עם פרוסות הרתי ומערבבים בעדינות עם מרית כפוף לנתק את פרוסות מפני השטח של להכניס תרבית תאים.
  3. מעביר את הפרוסה מן הכנס אל צינור microcentrifuge בעזרת מרית מכופפת.
  4. ידני לשבש את הפרוסה באמצעות עלי מדגם צינור microcentrifuge. להוסיף 150 μl של PBS המכיל 2% FBS לנפח סופי 300μl.
  5. סנן את הרקמה ניתקה דרך פילטר 40 מיקרומטר לתוך צינור microcentrifuge חדש. התאים המסוננים מוכנים להיות מוכתם עבור ניתוח התזרים cytometric 40.
  6. סנן תאים בשנית לפני העברת על cytometer זרימה כדי להבטיח כי כל agarose מוסר ואינו לסתום את זרימת cytometer.
  7. רוכש את התאים על cytometer זרימה ולנתח נתונים כפי שתואר קודם לכן 40.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

ניתוח תמיכת פרוסות הרתי של היבטים שונים של פיתוח תא T כגון מבחר חיובי ושלילי. עבור ניסויים מוצלחים, איכות הפרוסה הרתי היא בעל חשיבות עליונה. לפיכך, פרוסות הרתי צריך להיבדק כדי להבטיח את שלמות הרקמה הרתי וכי agarose סביב פרוסה הרתי הוא תמים (איור 1 א). מתח פנים אפשר להתפשר כאשר agarose פגום וגרם לצמצום משמעותי במספר thymocytes הנודדים אל הרקמות. לפיכך, פרוסות הרתי עם סימנים של נזק לרקמות או ניקס / דמעות agarose צריך להיות מושלך (איור 1B).

עכברים מהונדסים TCR (TG) מועסק לעתים קרובות ללמוד בחירה הרתי בשל הביטוי של TCR מוגדר, פונקציונלי על פני השטח של כל thymocyte המגדיל את תדירות הסלקציה חיובית על polycאוכלוסיות lonal. כדי ללכוד כל שלב של סלקציה חיובית, טרום הבחירה thymocytes TG TCR יכול להיות מעולף על גבי פרוסות הרתי, לבין התפתחות בוגרת, CD4 + או CD8 + SP תאי T אחריו לאורך זמן על ידי זרימת cytometry 40. Thymocytes מבודד מהכיתה MHC I-מוגבל OT-I TCR TG Rag1 - / - β2m - / - עכברים נעצרים בשלב העקורים לפני הבחירה הרתי כתוצאה מהצורך של β2m לשייך ולייצב את הכיתה MHC לי שרשרת כבדה 41 , 42. כאשר מעולפים על גבי β2m - / - פרוסות הרתי, את thymocytes TG מראש מבחר OT-I TCR להישאר בשלב העקור, ואינו מייצר תאי CD8 + SP T משמעותיות (איור 2 א, משמאל). לעומת זאת, כאשר מעולף על פרוסות הרתי WT המכילות הליגנדים בחירת אנדוגני, היכולת של המודל הזה לתמוך סלקציה חיובית באה לידי ביטוי התפתחות תא CD8 + T ב 72 שעות (איור 2 א, מימין). quantification של התפתחות תא CD8 + T בתור מחוץ לקרוא של סלקציה חיובית מוצג באיור 2B.

פרוסות הרתי יכולות לשמש גם כדי ללמוד סלקציה שלילית. חלק גדול של סלקציה שלילית מתרחש בתגובה לאנטיגן בכל מקום 16. מודל סלקציה שלילית לאנטיגן בכל מקום, thymocytes סך OT-I TCR TG Rag1 - / - ו wild-type (WT) עכברים תויגו עם CFSE ו CTV, בהתאמה, ולאחר מכן מעורבב ביחס של 1: 1 והועבר פרוסות WT (איור 3 א). לאחר שטיפת את thymocytes עודף, פרוסות הרתי הונחו התקשורת להשלים RPMI-1640 עם או בלי 1 ננומטר של מאותו מקור, פפטיד אגוניסט של TCR OT-I, SIINFEKL (פפטיד OVA). כל כיתת MHC לי לבטא בתאים תציג את האנטיגן, דוגמנות הצגת אנטיגן הביע בכל מקום בגוף התימוס. לאחר 24 שעות של דגירה על 37 מעלות צלזיוס, שיעור-OT אני TCR TG cells (% מתגוררים CFSE +) לתאים שליטה WT (% מתגוררים CTV +) הושווה על ידי cytometry זרימה (איור 3 ב). ירידה בחלקם היחסי של תאים TG OT-I TCR מייצג המחיקה של תאי TG OTI TCR בתגובה פפטיד OVA.

חשוב לציין כי בשל ההטרוגניות בגודל של פרוסות הרתי וכן ערך בתא לפרוסות הרתי, אחד צריך לכלול ניתוח מתאים ובקרות פנימיות לנרמל למשתנים אלה. הנה, תאי WT מעורבבים עם OT-I TCR TG תאים ומצופים גבי פרוסות שמשו בקרה פנימית כמו אוכלוסייה זו לא צריכה להיות השפעה משמעותית על קיומו או אי קיומו של פפטיד OVA. היקף סלקציה שלילית של תאים TG OTI TCR היה לכמת מבוסס על פרופורציות ולא במספרים מוחלטים. ראשית, היחס בין OT-I TCR TG (% מתגוררים CFSE +) כדי WT (% מתגוררים CTV +) תאים על כל פרוסה הרתי WT בנוכחות או אי קיומו של פפטיד OVA חושב. כל יחסים אלו חולקה מכן על ידי הממוצע של היחס בין OT-I TCR TG (% מתגוררים CFSE +) כדי WT (% מתגוררים CTV +) תאים על פרוסות WT בהעדר פפטיד OVA. בממוצע, 80% מכלל התאים TG OT-I TCR היו מתרוקנים בתגובה לאנטיגן בכל מקום, כפי שהוא מתואר באיור 3C.

איור 1
איור 1: נציג תמונות של פרוסות הרתי שהוכנו אונה הרתי מוטבעת אנכי. (א) פרוסה באיכות טובה עם רקמת מוטבע והסביבה agarose ללא פגע. (ב) פרוס איכות ירודה עם ניזק עקב קריעת הרקמות המוטבעות במהלך חיתוך. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

ove_content "FO: keep-together.within-page =" 1 "> איור 2
איור 2:. ניתוח תזרים cytometric של סלקציה חיובית בפרוסות הרתי OT-I TG Rag1 TCR - / - β2m - / - thymocytes תויגו עם CFSE והועבר הלא בחירת β2m - / - או בחירת פרוסות WT. לאחר 72 שעות של דגירה על 37 מעלות צלזיוס, התפתחות התא CD8 + T נותח על ידי cytometry הזרימה. (א) נציג נתונים של שטח פני התא CD4 ו CD8 ביטוי על חי CFSE + TCRβ thymocytes גבוה מ β2m - / - ופרוסות WT. (ב) כימות של חית CFSE + TCRβ גבוהה התפתחות תא CD8 + T על פרוסות WT בהשוואה לקבוצת ביקורת הלא בחירה. כל נקודה מייצגת פרוסה הרתי הפרט לבין שורה מייצגת את הממוצע. (*** P <0.001, t מזווג מבחן)ove.com/files/ftp_upload/54355/54355fig2large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3: ניתוח תזרים cytometric של סלקציה שלילית בפרוסות הרתי A 1:. יחס 1 של CFSE שכותרתו OT-I TCR TG Rag1 הכולל - / - ו שכותרתו CTV thymocytes WT היו מעולף על פרוסות WT בנוכחות או בהעדר OVA פפטיד, SIINFEKL. לאחר 24 שעות של דגירה על 37 מעלות צלזיוס, את הפרופורציות היחסיות של תאים מעולפים נותחו על ידי cytometry זרימה. (א) סכימטי של ניסוי ההגדרה מראה כיסוי של CTV שכותרתו תאי WT (כחול) מעורבב 1: 1 עם שכותרתו CFSE תאי TG OT-I TCR (ירוק) על פרוסת הרתי WT בנוכחות או בהעדר של פפטיד OVA. (ב) נציג נתונים המתארים את שיעור חי CFSE + OT-ליתאי TG TCR ו CTV + WT תאי פרוסות הודגרו עם או בלי פפטיד OVA. (ג) נתונים היו מנורמל בין פרוסות, ואת המשקל היחסי של תאי TG CFSE חי + OT-I TCR לחיות תאי CTV + WT מוצג. ברי שגיאה מצביעים סטיית התקן. N = 3 עבור כל תנאי. (* p <0.05, מבחן t מזווג). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

כאן אנו מתארים פרוטוקול להכנת פרוסות הרתי ותוצאות נציג מבחר חיובי ושלילי היעיל של הגבלה אני בכיתת MHC מראש מבחר המעולף thymocytes המהונדס TCR ידי cytometry זרימה. מערכת זו נוצל בעבר בהצלחה דומה לתמוך סלקציה חיובית של הכיתה MHC II-מוגבל CD4 + T תאים thymocytes העקורים מראש מבחר 32, ו, בנוכחות אנטיגן אגוניסט, סלקציה שלילית ופיתוח reg הרתי T 11,12, 36,38,39,43,44. פרוטוקול זה יכול להיות שונה כדי ללמוד בחירה הרתי בנוכחות או בהעדר מעכבים, פפטידים מוגדרים, כמו גם של thymocytes או אוכלוסיות תאי סטרומה מהונדסים גנטי. פרוסות הרתי הן גם נתונים על שכבת העל של אוכלוסיות תאים אחרות מאשר תת thymocyte. לדוגמא, הוצג לאחרונה כי תאי דנדריטים מעולפים על פרוסות הרתי להעביר ביעילות לתוך הרקמה ויכול לתמוך selectio השליליתn ו- T reg פיתוח 39,43. מחקרים שנערכו עד כה, משתמשים עקורים טרום בחירה או thymocytes הכולל ללמוד מבחר חיובי ושלילי. למרות ההתפתחות של תאי T יכולה להמשיך לפחות 4 ימים פרוסים הרתי, אם מעוניין בייזום ניסויים עם אוכלוסיית אב קודם לכן, זה צריך להילקח בחשבון כי מגבלה של מערכת זו היא כי איכות הפרוסות הרתי מתחילה לרדת לאחר 1-2 ימים בתרבות בשל מוות של תאים וחוסר קרום אוטם.

הפרוטוקול המתואר במסמך זה יכול לשמש גם ליצירת פרוסות מרקמות הרתי אדם עם שינויים עדינים. לפני מוטבע agarose, רקמות הרתי אדם צריכות לחתוך לרסיסים, פחות או יותר בגודל של אונה הרתי עכבר בוגר. יש לציין, דגימות הרתי האדם עשירים רקמת חיבור, ו, ביחס התימוס Murine, זה יותר קשה להכין פרוסות באיכות טובה. מניסיוננו, העובר ולא אנושי בילודרקמת הרתי היא תורמת יותר להכנת פרוסה. הוכח כי תת thymocyte אנושיים לבצע לוקליזציה כהלכה משני פרוסות הרתי האדם והעכבר 37. מבחר הרתי של תת thymocyte אדם מעולף, עם זאת, טרם דווחו במודל פרוסה הרתי. היעילות של סלקציה חיובית מאוכלוסיית polyclonal נמוכה, זאת בשל השיעור הנמוך (~ 0.5-2%) של thymocytes המעולף של הפרוסה הרתי, זה עלול להיות קשה להעריך במספרים קטנים כאלה של תאים שנבחרו באופן חיובי. זה עשוי להיות אפשרי להציג transgene TCR אדם ובתאי תא אנושיים T לפני כיסוי על פרוסות הרתי אנושיות כדי להגביר את יעילות סלקציה חיובית. זה גם אינו מונע את האפשרות לעקוב אחרי תזוזות אוכלוסיות תאי T האנדוגניים קיומו או אי קיומו של פפטידים אקסוגניים או אוכלוסיות תאים אחרות ומעכבים של אותות TCR, בין יתר.

פרוטוקול זה יכול להיות גם מודעapted להדמיה של הגירה thymocyte, אותות TCR, אינטראקציות הסלולר 12,32-38. עד לאחרונה, רוב המחקרים של התנהגות thymocyte באתרו היה מוגבל בקליפת המוח המוארך נמצא במיקום מרכזי התימוס, ממש מעבר לגבול של זיהוי על ידי מיקרוסקופ שני הפוטונים. לעומת זאת, פרוסות הרתי לספק את היתרון הייחודי שיש להם את הפרוסות הרתי שלמים אזורים קורטיקליים מדולריים ועל פני השטח הפרוסים מאפשר גישה ישירה אל הלשד ידי הדמית שני פוטונים. בנוסף, פרוסות הרתי ועליהן תאים שכותרתו עם צבעי אינדיקטור בסידן כגון Indol יכולות לשמש כדי לפקח על אותות TCR באמצעות רמות סידן cytosolic כאינדיקטור אותות TCR הקשורים מבחר חיובי ושלילי על ידי מיקרוסקופ שני פוטונים 11,32,36, 38,39,44. כדי להכין את הדגימות במיקרוסקופ, הפרוסות ניתן להשתמש ישירות לאחר שלב 4.5 של הפרוטוקול. במקרה זה, יש להקפיד לבחור סמני ניאון מתאימים suitable הדמיה.

תרבויות איבר הפרוסה הרתי הן כלים מצוינים ללמוד היבטים שונים של עכבר ופיתוח תא T האנושי באתרו. עם זאת, יישום מוצלח של טכניקה זו דורש תשומת לב מיוחדת שלבים קריטיים בפרוטוקול. כדי למקסם את מספר פרוסות הרתי שהושגו בניסויים תפוקה גבוהה, הגיל של העכבר בשימוש חייב להילקח בחשבון כמו גודל של שינויים התימוס ברחבי זמן החיים של העכבר. אנו משתמשים בדרך כלל עכברים ישנים 4-8 בשבוע שיוצרים ~ 20 פרוסות הרתי לכל עכבר. עם זאת, העובר, עכברים בילוד ומעלה thymi יכול תיאורטית לשמש כדי ליצור מספר מוגבל של פרוסות בהתאם לצרכים ניסיוניים של המשתמש. לקבלת פרוסות באיכות טובה, זה הוא בעל חשיבות עליונה כדי להסיר את כל רקמת חיבור המקיפה את האונות הרתי לפני מוטבע agarose. הנותרים רקמת חיבור לא לחתוך ביעילות על ידי להב vibratome במהלך חיתוך ויכול להזיק הרתיאונות ופרוסות שהתקבלו. חלק הארי של רקמת חיבור להסירו במהלך מסיק התימוס (שלב 1.5) ומאפשר האונות יוסרה חלל בית החזה ללא מניפולציה משמעותית של הרקמה עצם. לאחר לבודד את האונות, להסיר בזהירות את כל רקמת החיבור שיורית כפי שמתואר בשלב 2.5. בנוסף, שמירה על שלמות agarose סביב הרקמות המוטבעות הכרחית עבור שכיסה thymocytes ביעילות על פני השטח הפרוסים. לכן, חשוב לבדוק הן את הפרוסה התימוס ואת agarose שמסביב בעת בחירת פרוסות הרתי לשימוש בניסוי. Vibratome הוא בדרך כלל ממוקם מחוץ למכסה המנוע בתרבית רקמה, מעלה את הסיכון הפוטנציאלי של זיהום. ניקוי vibratome ביסודיות בין הניסויים וריסוס העבודה באזור vibratome עם אתנול 70% לפני חיתוך יכול להגביל את פוטנציאל זיהום. כמו כן, חשוב להשתמש PBS סטרילי לצעדים 2.13 ו 2.15 כאמור ב protocol. לבסוף, הוא גם חיוני להבחין thymocytes מעולף הנודדים אל הרקמות מתאי כי הם אנדוגני התימוס. זו יכולה להיות מושגת על ידי סימון תאים ועליהן צבעי ניאון כאמור בשלב 3.7. לחלופין, thymocytes מעכברים להביע סמני congenic או כתבי ניאון מקודד גנטי ניתן להשתמש 45,46. באופן כללי, לעומת זאת, פרוסות הרתי קלות לתפעל ואפשר להתאימו לצרכי הניסוי הספציפיים של המשתמש, תמיכת תחולתה רחבה כי החלו רק כדי להיחקר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Vibratome Leica Biosystems VT1000S 
NuSieve GTG Agarose Lonza 50080 Low melting temperature agarose
Embedding Mold (Truncated - T12) Polyciences 18986 22 mm x 22 mm square, truncated to 12 mm x 12 mm
Double Edge Prep Blades Personna 74-0002
Tissue Adhesive 3M  1469SB
0.4 µm Cell Culture Inserts  BD Falcon 353090 Of several brands tested, these maintained the cells atop the slices the best
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline ThermoFisher 21600-010
RPMI-1640 with L-glutamine Wisent 350-000-CL
Fetal Bovine Serum Wisent 080-110 Heat inactivated
L-Glutamine, 200 mM Wisent 609-065-EL
Penicillin/Streptomycin, 100x Wisent 450-201-EL
2-Mercaptoethanol Alfa Aesar A15890
15 ml Tenbroeck Tissue Grinders Wheaton 357426
Nylon Mesh Filter Component Supply U-CMN-255
Microcentrifuge Tube Sample Pestle Bel-Art F19922-0000
40 µm Nylon Cell Strainer BD Falcon 352340
Forceps Inox Tip Dumont  RS-5047 Fine tip curved forceps, size .17 x .10 mm
Micro Forceps Dumont  RS-5090 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Carpenter, A. C., Bosselut, R. Decision checkpoints in the thymus. Nat Immunol. 11, 666-673 (2010).
  2. Starr, T. K., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Positive and negative selection of T cells. Annu Rev Immunol. 21, 139-176 (2003).
  3. Vrisekoop, N., Monteiro, J. P., Mandl, J. N., Germain, R. N. Revisiting thymic positive selection and the mature T cell repertoire for antigen. Immunity. 41, 181-190 (2014).
  4. Stritesky, G. L., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Selection of self-reactive T cells in the thymus. Annu Rev Immunol. 30, 95-114 (2012).
  5. Bousso, P., Bhakta, N. R., Lewis, R. S., Robey, E. Dynamics of thymocyte-stromal cell interactions visualized by two-photon microscopy. Science. 296, 1876-1880 (2002).
  6. Takahama, Y. Journey through the thymus: stromal guides for T-cell development and selection. Nat Rev Immunol. 6, 127-135 (2006).
  7. Halkias, J., Melichar, H. J., Taylor, K. T., Robey, E. A. Tracking migration during human T cell development. Cell Mol Life Sci. 71, 3101-3117 (2014).
  8. Yin, X., Chtanova, T., Ladi, E., Robey, E. A. Thymocyte motility: mutants, movies and migration patterns. Curr Opin Immunol. 18, 191-197 (2006).
  9. Ladi, E., Yin, X., Chtanova, T., Robey, E. A. Thymic microenvironments for T cell differentiation and selection. Nat Immunol. 7, 338-343 (2006).
  10. Klein, L., Kyewski, B., Allen, P. M., Hogquist, K. A. Positive and negative selection of the T cell repertoire: what thymocytes see (and don't see). Nat Rev Immunol. 14, 377-391 (2014).
  11. Ross, J. O., et al. Distinct phases in the positive selection of CD8+ T cells distinguished by intrathymic migration and T-cell receptor signaling patterns. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, E2550-E2558 (2014).
  12. Hu, Z., Lancaster, J. N., Sasiponganan, C., Ehrlich, L. I. CCR4 promotes medullary entry and thymocyte-dendritic cell interactions required for central tolerance. J Exp Med. 212, 1947-1965 (2015).
  13. Anderson, M. S., et al. Projection of an immunological self shadow within the thymus by the aire protein. Science. 298, 1395-1401 (2002).
  14. Takaba, H., et al. Fezf2 Orchestrates a Thymic Program of Self-Antigen Expression for Immune Tolerance. Cell. 163, 975-987 (2015).
  15. McCaughtry, T. M., Baldwin, T. A., Wilken, M. S., Hogquist, K. A. Clonal deletion of thymocytes can occur in the cortex with no involvement of the medulla. J Exp Med. 205, 2575-2584 (2008).
  16. Stritesky, G. L., et al. Murine thymic selection quantified using a unique method to capture deleted T cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 4679-4684 (2013).
  17. Anderson, G., Jenkinson, E. J. Review article: thymus organ cultures and T-cell receptor repertoire development. Immunology. 100, 405-410 (2000).
  18. Hare, K. J., Jenkinson, E. J., Anderson, G. In vitro models of T cell development. Semin Immunol. 11, 3-12 (1999).
  19. de Pooter, R., Zuniga-Pflucker, J. C. T-cell potential and development in vitro: the OP9-DL1 approach. Curr Opin Immunol. 19, 163-168 (2007).
  20. Lian, Z., et al. Intrathymically injected hemopoietic stem cells can differentiate into all lineage cells in the thymus: differences between c-kit+ cells and c-kit < low cells. Stem Cells. 15, 430-436 (1997).
  21. Manna, S., Bhandoola, A. Intrathymic Injection. Methods Mol Biol. 1323, 203-209 (2016).
  22. Goldschneider, I., Komschlies, K. L., Greiner, D. L. Studies of thymocytopoiesis in rats and mice. I. Kinetics of appearance of thymocytes using a direct intrathymic adoptive transfer assay for thymocyte precursors. J Exp Med. 163, 1-17 (1986).
  23. Schmitt, T. M., Zuniga-Pflucker, J. C. Induction of T cell development from hematopoietic progenitor cells by delta-like-1 in vitro. Immunity. 17, 749-756 (2002).
  24. de Pooter, R. F., Schmitt, T. M., Zuniga-Pflucker, J. C. In vitro generation of T lymphocytes from embryonic stem cells. Methods Mol Biol. 330, 113-121 (2006).
  25. Dervovic, D. D., Ciofani, M., Kianizad, K., Zuniga-Pflucker, J. C. Comparative and functional evaluation of in vitro generated to ex vivo CD8 T cells. J Immunol. 189, 3411-3420 (2012).
  26. White, A., Jenkinson, E., Anderson, G. Reaggregate thymus cultures. J Vis Exp. (18), (2008).
  27. Anderson, G., Owen, J. J., Moore, N. C., Jenkinson, E. J. Thymic epithelial cells provide unique signals for positive selection of CD4+CD8+ thymocytes in vitro. J Exp Med. 179, 2027-2031 (1994).
  28. Anderson, G., Jenkinson, E. J. Fetal thymus organ culture. CSH Protoc. (2007).
  29. Mazda, O., Watanabe, Y., Gyotoku, J., Katsura, Y. Requirement of dendritic cells and B cells in the clonal deletion of Mls-reactive T cells in the thymus. J Exp Med. 173, 539-547 (1991).
  30. Ceredig, R., Jenkinson, E. J., MacDonald, H. R., Owen, J. J. Development of cytolytic T lymphocyte precursors in organ-cultured mouse embryonic thymus rudiments. J Exp Med. 155, 617-622 (1982).
  31. Fairchild, P. J., Austyn, J. M. Developmental changes predispose the fetal thymus to positive selection of CD4+CD8 T cells. Immunology. 85, 292-298 (1995).
  32. Bhakta, N. R., Oh, D. Y., Lewis, R. S. Calcium oscillations regulate thymocyte motility during positive selection in the three-dimensional thymic environment. Nat Immunol. 6, 143-151 (2005).
  33. Le Borgne, M., et al. The impact of negative selection on thymocyte migration in the medulla. Nat Immunol. 10, 823-830 (2009).
  34. Ehrlich, L. I., Oh, D. Y., Weissman, I. L., Lewis, R. S. Differential contribution of chemotaxis and substrate restriction to segregation of immature and mature thymocytes. Immunity. 31, 986-998 (2009).
  35. Ueda, Y., et al. Mst1 regulates integrin-dependent thymocyte trafficking and antigen recognition in the thymus. Nat Commun. 3, 1098 (2012).
  36. Dzhagalov, I. L., Chen, K. G., Herzmark, P., Robey, E. A. Elimination of self-reactive T cells in the thymus: a timeline for negative selection. PLoS Biol. 11, e1001566 (2013).
  37. Halkias, J., et al. Opposing chemokine gradients control human thymocyte migration in situ. J Clin Invest. 123, 2131-2142 (2013).
  38. Au-Yeung, B. B., et al. Quantitative and temporal requirements revealed for Zap70 catalytic activity during T cell development. Nat Immunol. 15, 687-694 (2014).
  39. Melichar, H. J., Ross, J. O., Herzmark, P., Hogquist, K. A., Robey, E. A. Distinct temporal patterns of T cell receptor signaling during positive versus negative selection in situ. Sci Signal. 6, (2013).
  40. Hu, Q., Nicol, S. A., Suen, A. Y., Baldwin, T. A. Examination of thymic positive and negative selection by flow cytometry. J Vis Exp. (68), e4269 (2012).
  41. Mombaerts, P., et al. RAG-1-deficient mice have no mature B and T lymphocytes. Cell. 68, 869-877 (1992).
  42. Hogquist, K. A., et al. T cell receptor antagonist peptides induce positive selection. Cell. 76, 17-27 (1994).
  43. Weist, B. M., Kurd, N., Boussier, J., Chan, S. W., Robey, E. A. Thymic regulatory T cell niche size is dictated by limiting IL-2 from antigen-bearing dendritic cells and feedback competition. Nat Immunol. 16, 635-641 (2015).
  44. Melichar, H. J., Ross, J. O., Taylor, K. T., Robey, E. A. Stable interactions and sustained TCR signaling characterize thymocyte-thymocyte interactions that support negative selection. J Immunol. 194, 1057-1061 (2015).
  45. Hadjantonakis, A. K., Macmaster, S., Nagy, A. Embryonic stem cells and mice expressing different GFP variants for multiple non-invasive reporter usage within a single animal. BMC Biotechnol. 2, (2002).
  46. Schaefer, B. C., Schaefer, M. L., Kappler, J. W., Marrack, P., Kedl, R. M. Observation of antigen-dependent CD8+ T-cell/ dendritic cell interactions in vivo. Cell Immunol. 214, 110-122 (2001).
הכנה ויישומים של תרבויות Organotypic הרתי Slice
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sood, A., Dong, M., Melichar, H. J. Preparation and Applications of Organotypic Thymic Slice Cultures. J. Vis. Exp. (114), e54355, doi:10.3791/54355 (2016).More

Sood, A., Dong, M., Melichar, H. J. Preparation and Applications of Organotypic Thymic Slice Cultures. J. Vis. Exp. (114), e54355, doi:10.3791/54355 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter