Summary
Vi beskriver fremstillingen af thymiske udsnit, der, i kombination med flowcytometri, kan anvendes til at modellere positiv og negativ selektion for at udvikle T-celler. Thymiske skiver kan også tilpasses til in situ-analyse af thymocyt migration, lokalisering, og signalering via immunofluorescens og to-foton mikroskopi.
Abstract
Thymiske udvælgelse foregår på en unik og meget organiseret thymisk mikromiljø resulterer i dannelsen af et funktionelt, selv-tolerant T-celle-repertoire. In vitro modeller til at studere T linjeforpligtelse og udvikling har givet værdifuld indsigt i denne proces. Men disse systemer mangler den komplette tredimensionale thymisk milieu nødvendig for T-celleudvikling og dermed er ufuldstændige tilnærmelser af in vivo thymisk udvælgelse. Nogle af udfordringerne i forbindelse med modellering T-celle udvikling kan overvindes ved hjælp af in situ-modeller, der giver en intakt thymus mikromiljø, der fuldt ud understøtter thymus udvalg for at udvikle T-celler. Thymus skive organotypiske kulturer supplere eksisterende in situ teknikker. Thymus skiver bevare integriteten af thymic kortikale og medullære regioner og skabe en platform for at studere udviklingen af overlejrede thymocytter af en defineret udviklingsstadiet eller af endogent T calen inden en moden thymus mikromiljø. I betragtning af evnen til at generere ~ 20 skiver per mus, thymus skiver udgør en enestående fordel i form af skalerbarhed for high throughput eksperimenter. Yderligere er den relative lethed ved generering thymus skiver og potentiale til at overlejre forskellige thymiske delmængder eller andre cellepopulationer fra forskellige genetiske baggrunde øger alsidigheden af denne fremgangsmåde. Her beskriver vi en protokol for udarbejdelsen af thymus skiver, isolation og overlejring af thymocytter, og dissociation af thymiske skiver til flowcytometrisk analyse. Dette system kan også tilpasses til at studere ikke-konventionelle T-celle-udvikling samt visualisere thymocyt migration, thymocyt-stromal celle-interaktioner, og TCR-signaler associeret med thymisk udvælgelse af to-foton mikroskopi.
Introduction
T-celler differentiere gennem en række udviklingsmæssige mellemprodukter i thymus, i hvilket tidsrum de støder flere checkpoints, der sikrer dannelsen af et funktionelt, selv-tolerant T-celle-repertoire 1-3. Positiv selektion fremmer overlevelsen af thymocytter med T-celle receptorer (TCR), der kan genkende, med lav til moderat affinitet, peptid præsenteret af dominerende histokompatibilitetskompleks molekyler (MHC) på kortikale thymiske epitelceller (CTec) 2,3. Negativ udvælgelse og regulatoriske T (T reg) celle udvikling bidrage til oprettelsen af selv-tolerance ved at fjerne eller omdirigering af thymocytter, der reagerer kraftigt til selv-peptid præsenteret af MHC 2,4. Umodne CD4 + CD8 + dobbelt positive (DP) thymocyter udtrykkende TCR'er der passerer udvælgelsesprocessen differentierer til modne T-celle-subpopulationer, hvoraf størstedelen er MHC klasse I-begrænsede CD8 + cytotoksiskeeller MHC klasse II-begrænset CD4 + helper enkelt positive (SP) T-celler, før du afslutter thymus til at udføre effektorfunktioner i de sekundære lymfoide organer 1-3.
Tilføjelse til kompleksiteten af T-celle udvikling er den dynamiske migration og cellulære møder for at udvikle thymocytter hele stromal celle netværket 5-9. Disse stromale celler spiller distinkte roller i thymocyt udvikling og er forskelligt fordelt mellem de thymiske kortikale og medullære regioner, hvor positiv og negativ selektion opstår 10. Selvom positiv selektion foregår primært i hjernebarken, der er akkumulerende beviser for, at DP thymocytter migrere til medulla og fortsat kræve TCR signaler, før de differentierer til modne T-celler, hvilket antyder, at medulla kan give yderligere signaler nødvendige for at gennemføre positiv selektion og slægt differentiering 11,12. Længere,på trods af tilstedeværelsen af specialiserede medullære thymiske epitelceller (MTEC), som udtrykker og præsenterer vævsbegrænset antigener letter deletion af autoreaktive thymocyter 13,14, en stor del af negativ selektion forekommer i cortex i afhængighed ubikvitært selv-peptid præsenteret af dendritiske celler 15,16. Således må nøjagtige modeller af T-celle udvikling tilvejebringe en velorganiseret thymisk mikromiljø, med intakt corticale og medullære regioner, der letter interaktionen mellem thymocytter og stromale celler, og støtter thymocyt migration som disse celler undergår positiv og negativ selektion.
For at supplere ex vivo-analyser af thymocytter som et middel til at studere positiv og negativ selektion, en række in vitro, in situ, og in vivo-modeller af T-celle udvikling er blevet udviklet 17-22. Det har været notorisk vanskeligt at rekapitulerepositiv selektion in vitro, men cokultur af stamceller cellepopulationer eller T-celle-forstadier med stromale celler, der udtrykker Notch-ligand, især OP9-DL1 / 4-celler, har evnen til at understøtte T linjeforpligtelse og begrænset positiv selektion gør det en uvurderlig in vitro model til undersøgelse T-celle udvikling 23-25. Begrænsninger ved dette system imidlertid nævnes, at disse celler mangler det unikke peptid maskiner findes i thymiske stromaceller og det tredimensionale thymisk mikromiljø.
Selvom mere teknisk besværlig, in situ og in vivo modeller af thymus valg kan overvinde nogle af de barrierer relateret til in vitro-systemer. Reaggregate thymiske organkulturer (RTOC) indeholder definerede blandinger af thymocytter og thymiske stromaceller 18,26,27. Disse thymiske epitelial celle reaggregates vedligeholde MHC klasse I og II udtryk og kan støtte development af både konventionelle T-celle delmængder, men stadig ikke defineret kortikale og medullære strukturer. Føtal thymus organkultur (FTOC) er en populær model af T-celle udvikling, som kan podes med thymocytter via hængende-dråbe kultur af lymphodepleted thymiske lapper eller via injektion af thymocytter i lymphoreplete thymiske lapper og støtte effektiv udvikling af CD4 + og CD8 + T celler over tid i kultur 18,28-31. Ved initiering af kulturen i føtale tymisk lapper der er en mangel på mTECs, men definerede kortikale og medullære strukturer kan udvikle sig over tid, afhængigt af forholdene. En vigtig overvejelse er, at denne model præferentielt kan støtte føtal versus voksen T-celle udvikling. Endelig intrathymisk injektion af definerede tymisk forstadier i voksne mus er teknisk udfordrende, men helt klart skaber et miljø til at understøtte Udvikling T-celle in vivo. Disse in situ og in vivo modeller er fremragende værktøjer to undersøgelse T-celle udvikling og deres anvendelse bør overvejes på et eksperiment-by-eksperiment basis.
Thymiske skiver har dog for nylig vist sig som en alsidig, komplementær model til at studere thymisk udvælgelse in situ med mulighed for at rumme unik, kompleks, og generelt højere throughput eksperimenter. Thymus skiver bevare integriteten af de kortikale og medullære regioner og skabe en ramme af stromale celler, der understøtter thymocyt migration under udvikling samt effektiv positiv og negativ selektion 11,32-39. Thymocyt delmængder tilføjet toppen thymiske skiver migrere ind i vævet og deres passende microenvironmental niche 34,37. De overlejrede thymocytter kan skelnes fra thymisk skive endogene celler via kongene markører eller fluorescerende mærker og kan opretholdes i kultur i flere dage. Thymisk skive organotypiske kulturer kan anvendes til at undersøge forskellige aspekteraf T-celle udvikling, herunder thymus udvælgelse, thymocyt adfærd (migration og cellulære interaktioner), og thymocyt lokalisering, blandt andre. I betragtning af evnen til at generere ~ 20 thymiske skiver per mus, skalerbarhed eksperimenter er generelt større end andre in situ modeller af thymisk udvælgelse. Selv udarbejdelse af thymiske skiver kræver specialiseret udstyr, såsom vibratome, og levetiden for thymiske skiver i kultur er begrænset på grund af tab af celler over tid via celledød og manglen på et indkapslende membran, thymus skiver giver en fremragende model til analyse af thymisk udvælgelse af synkroniserede populationer af thymocytter inden en moden thymisk mikromiljø. Her beskriver vi udarbejdelsen af thymiske skiver (herunder høst thymus, agarose indlejring af thymus lapper og vibratome sektionering af den indlejrede væv), isolering og overliggende af thymocytter, og dissociation af thymiske skiver til flowcytometrisk analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokoller for alle dyreforsøg blev godkendt af Animal Care udvalg ved Centre de recherche - Hôpital Maisonneuve-Rosemont.
1. Høst Mouse Thymus for Udarbejdelse Thymuslidelser Skiver og enkelt celle suspensioner
- Aflive musen med CO 2 efterfulgt af cervikal dislokation.
- I en laminar flow hætte, pin musen ventrale side op til en dissektion bord. Spray mus med 70% ethanol. Fjern overskydende alkohol duppe med gaze for at forhindre ethanol kommer ind i brysthulen og beskadige vævet.
- Løft huden ved bunden af brystbenet med en tang og lave et snit gennem huden. Udvid snittet i huden opad til hver forben.
- Gøre en ekstra snit i bunden af brystbenet for at adskille membranen fra brystkassen. Derefter skæres hver side af brystkassen mod kravebenet. Flip brystkassen over mod hovedet udsætte brysthulen. De to kamre afThymus ligge oven på hjertet.
- Fjern bindevævet omkring thymiske lapper med pincet, mikro-dissektion saks, og / eller skarpe krum saks. Brug et par fine spids buede pincet til at løfte de enkelte lapper nedefra eller via resterende bindevæv.
Bemærk: Du må ikke tage fat i thymus direkte. - Placer thymus lapper i en 15 ml konisk rør indeholdende PBS og der er afsat på is indtil de skal bruges.
2. Agarose Indlejring og Vibratome Slicing Thymuslidelser Lobes
- Forbered 4% agaroseopløsning til indlejring ved opløsning 2 g lavt smeltepunkt agarose i 50 ml sterilt PBS og microwaving på en lav indstilling, indtil agarosen er fuldstændigt opløst. Dæk kolbe med aluminiumsfolie og sted i et vandbad ved 55 ° C indtil den er klar til brug.
- I en vævskultur hætte, forberede komplet RPMI-1640 medie, der indeholder 10% føtalt bovint serum (FBS), 4 mM L glutamin, 1x penicillin / streptomycin, og 10 uM2-mercaptoethanol.
- Tilføj 1,5 ml komplet RPMI-1640 medium per brønd til en 6-brønds celledyrkningsplade og placere en celledyrkningsinsert i hver brønd. Sæt pladen til side i en inkubator ved 37 ° C indtil brug.
- Forbered en sjappet isvand bad med vand og is i en ice bucket.
- Fjern forsigtigt alle resterende bindevæv der omgiver hver thymus lap hjælp fine spids pincet. Gør dette, mens thymus lap er nedsænket i PBS i en vævskulturskål, efter overførsel på et væv serviet vædet med PBS, eller under et dissektionsmikroskop.
- Tillad agarose afkøle under 40 ° C, når kolben er blot varm at røre ved, for at undgå overophedning vævet. Hæld den afkølede 4% agarose i et væv støbeform til en højde på ~ 1 cm.
- Brug en tang til omhyggeligt overføre thymus lap til et væv tørre og rul den forsigtigt at tørre det uden at beskadige vævet. Sørg for, at vævet tørrer helt, eller det vil glide ud af agarose under udskæring.
- Sæt forsigtigt lap ind i agarose og placere den enten horisontalt (for at øge overfladearealet af hver skive) eller lodret (for at øge antallet af skiver) ved bunden af formen. Anbring formen i isvand i 5-10 minutter for at tillade agarosen at størkne.
- I løbet af denne tid, forberede vibratome til udskæring ved at montere buffer bakken, samling af objektpladen, og indsætte vibratome klinge. Læg et stykke laboratorium tape på prøven disken. Steriliser ren, samlet arbejdsområde med 70% ethanol.
- Når agarose størkner, vend formen og tryk forsigtigt i centrum at frigive agarose indlejret lap.
- Brug en skarp kniv til at trimme det overskydende agarose omgiver lap forlader ~ 2 mm agarose i hver side og ~ 0,5 cm ved bunden.
- Fastgøre hver agarose blok med en dråbe vævslim til stykke tape på prøven disken. Flere blokke kan limes på båndet.
- Juster vibratome klinge with toppen af agarose blok. Fyld buffer bakke med sterilt PBS indtil kniven og agarose blok (e) er helt nedsænket.
- Afsnittet agarosen indlejrede væv til opnåelse af skiver med en tykkelse på 400-500 um. Indstil vibratome til 0,225 mm / sek hastighed, 100 Hz frekvens, og 5 ° vinkel.
- Brug en bøjet spatel at indsamle de thymiske skiverne i en vævsdyrkningsplade indeholdende steril PBS som de er skåret. Kassér den første og sidste skive.
- Undersøg skiverne under et lysmikroskop ved 4X forstørrelse. Vælg de skiver med intakt thymus væv og omgivende agarose (figur 1A).
- Overfør skiverne til pladen forberedt i trin 2.3 ved hjælp af en pipettespids til forsigtigt skubbe thymus skive fra den bøjede spatel på celledyrkningsinsert. Hver indsats kan rumme ~ 3 skiver. Sørg skiverne ikke rører hinanden eller de celledyrkningsinsert vægge.
- Oprethold pladen ved 37 ° C indtil brug.
- Isoler thymiske lapper som beskrevet i afsnit 1. Adskil lapper manuelt at foretage en enkelt cellesuspension under anvendelse af en steriliseret 15 ml vævsmalemaskine fyldt med 5 ml sterilt PBS indeholdende 2% FBS. Overfør cellerne til et 15 ml konisk rør.
- Centrifugeres cellerne ved 545 x g i 5 min ved 4 ° C. Supernatanten fjernes, og cellerne resuspenderes i 1 ml 1x ACK lysis buffer (0,15 M NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0,1 mM Na2EDTA) ved stuetemperatur i 3 min for at lysere røde blodlegemer.
- Fyld røret til 15 ml med PBS indeholdende 2% FBS. Centrifugeres cellerne ved 545 x g i 5 min ved 4 ° C.
- Resuspender cellerne i 10 ml PBS indeholdende 2% FBS og passerer celler gennem en 255 um mesh filter.
- Tæl celler under anvendelse af et hæmocytometer. Centrifuger cellerne ved 545 x g i 5 min ved 4 ° C, og resuspender cellepelleten i PBS indeholdende 2% FBS ved en concentration på 1 x 10 7 celler pr.
- Mærk cellerne med cellulære farvestoffer, såsom carboxyfluorescein succinimidylester (CFSE) ifølge producentens protokoller hvis ikke bruger thymocytter fra mus, der udtrykker kongene markører eller genetisk indkodede fluorescerende reportere at skelne fra slice endogene celler.
- Efter den sidste vask af de mærkede celler, resuspender cellepelleten i komplette RPMI-1640-medier på 1-3 x 10 6 celler pr 15 pi.
4. Overlejring Thymocytter på tymisk Skiver
- Brug en pipette til at suge enhver væske, der omgiver thymus skiver på indsatsen.
Bemærk: Sørg for at undgå at beskadige agarose. Hvis agarose er beskadiget, vil de overlejrede thymocyter ikke tillægger skive overflade på grund af tab af overfladespænding. - Uden at røre skive med pipettespidsen, overlay 15 ul thymocytter udarbejdet i afsnit 3 på hver thymus skive.
- Inkubér plate ved 37 ° C i 2 timer for at tillade cellerne at migrere ind i de thymiske skiver.
- Efter 2 timer, skylles de thymiske skiver 3 gange med 1 ml PBS for at fjerne overskydende overlejrede thymocytter, der endnu ikke er migreret ind i vævet.
- Inkubér pladen ved 37 ° C, indtil de thymiske udsnit er klar til at blive høstet, typisk 1-72 timer afhængigt af forsøget.
5. Dissociation Thymuslidelser Skiver til flowcytometri
- Forbered et mikrocentrifugerør for hver skive ved at tilsætte 150 pi PBS indeholdende 2% FBS.
- Tilsæt 1 ml PBS indeholdende 2% FBS til vævskultur insert med thymic skiver og forsigtigt omrøres med en bøjet spatel at frigøre skiver fra overfladen af celledyrkningsinsert.
- Overfør udsnittet fra indsatsen til mikrocentrifugerør ved anvendelse af et bøjet spatel.
- Manuelt forstyrre skive under anvendelse af en prøve mikrocentrifugerør støder. Tilføj 150 pi PBS indeholdende 2% FBS til et endeligt volumen 300pi.
- Filtrer den dissocierede væv gennem et 40 um filter over i en ny mikrocentrifugerør. De filtrerede celler er klar til at blive farvet for flowcytometrisk analyse 40.
- Filtrer celler en anden gang inden de sendes på et flowcytometer at sikre, at alle agarose fjernes og tilstopper ikke flowcytometeret.
- Erhverve cellerne på et flowcytometer og analysere data som tidligere beskrevet 40.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Thymus skiver support analyse af forskellige aspekter af T-celle udvikling såsom positiv og negativ selektion. For vellykkede eksperimenter, kvaliteten af thymus skive er altafgørende. Således bør thymiske skiver undersøges for at sikre integriteten af den thymiske væv og at agarose omgiver thymiske skive er intakt (figur 1A). Overfladespænding kan kompromitteres, når agarose er beskadiget forårsager et betydeligt fald i antallet af thymocytter der migrerer ind i vævet. Således thymus skiver med tegn på vævsskade eller rifter / tårer i agarose skal kasseres (figur 1B).
TCR transgene (tg) mus er ofte ansat til at studere thymisk udvælgelse grund af ekspressionen af et defineret, funktionel TCR på overfladen af hver thymocyt som øger frekvensen af positiv selektion i løbet polyclonal populationer. For at indfange hver fase af positiv selektion, forvalg TCR tg thymocytter kan overlejres oven thymiske skiver, og udvikling af modne, CD4 + eller CD8 + SP-T-celler følges over tid ved flowcytometri 40. Thymocyter isoleret fra MHC klasse I-begrænsede OT-I TCR tg RAG1 - / - p2m - / - mus standset på DP stadium forud for thymisk udvælgelse grund af nødvendigheden af p2m til at associere med og stabilisere MHC klasse I tung kæde 41 , 42. Når overlejret på p2m - / - thymus skiver, den første udvælgelse OT-I TCR tg thymocytter forblive på DP scenen og ikke skabe betydelige CD8 + SP T-celler (figur 2A, til venstre). I modsætning hertil, når overlejret på WT thymiske skiver indeholdende endogene udvælge ligander, er evnen hos denne model til at understøtte positiv selektion fremgår af CD8 + T-celle udvikling efter 72 timer (figur 2A, højre). Quantification af CD8 + T-celle udvikling som en udlæsning af positiv selektion er vist i figur 2B.
Thymiske skiver kan også anvendes til at studere negativ selektion. En stor del af negativ selektion sker som reaktion på allestedsnærværende antigen 16. At modellere negativ selektion til allestedsnærværende antigen, samlede thymocytter fra OT-I TCR tg RAG1 - / - og vildtype (WT) mus blev mærket med CFSE og CTV henholdsvis derefter blandet i et 1: 1 forhold og overlejret på WT skiver (figur 3A). Efter vask overskydende thymocytter blev de thymiske skiver anbragt i komplette RPMI-1640-medier med eller uden 1 nM af den beslægtede, agonistpeptidet af OT-I TCR, SIINFEKL (OVA peptid). Alle MHC klasse I udtrykkende celler vil præsentere antigenet, modellering præsentationen af allestedsnærværende udtrykt antigen i thymus. Efter 24 timers inkubation ved 37 ° C, er andelen af OT-I TCR tg cells (% levende CFSE +) til WT kontrolceller (% bor CTV +) blev sammenlignet ved flowcytometri (figur 3B). Et fald i den relative andel af OT-I TCR tg celler repræsenterer sletning af OTI TCR tg celler som respons på OVA peptid.
Det er vigtigt at bemærke, at på grund af heterogenitet i størrelsen af thymiske skiver samt celle indrejse i thymiske skiver, bør man medtage passende analyse og interne kontroller for at normalisere for disse variabler. Her blev WT celler blandet med OT-I TCR tg celler og overlejret oven skiver bruges som en intern kontrol, da denne patientgruppe ikke skulle blive væsentligt påvirket af tilstedeværelsen eller fraværet af OVA peptid. Omfanget af negative udvalg af OTI TCR tg celler blev kvantificeret baseret på forholdet snarere end absolutte tal. Første er forholdet mellem OT-I TCR tg (% bor CFSE +) til WT (% levende CTV +) celler på hver WT thymisk skive i nærvær eller fravær af OVA-peptid blev beregnet. Hver af disse forhold blev derefter divideret med gennemsnittet af forholdet mellem OT-I TCR tg (% bor CFSE +) til WT (% levende CTV +) celler på WT skiver i fravær af OVA-peptid. I gennemsnit blev 80% af OT-I TCR tg celler depleteret som respons på allestedsnærværende antigen som vist i figur 3C.
Figur 1: Repræsentative billeder af thymiske skiver fremstillet af en lodret indlejret thymisk lap. (A) God kvalitet skive med den integrerede væv og omgivende agarose intakt. (B) Dårlig kvalitet skive med skader som følge af overrivning af den indlejrede væv under udskæring. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2:. Flowcytometrisk analyse af positiv selektion i thymiske skiver OT-I TCR tg RAG1 - / - p2m - / - thymocytter blev mærket med CFSE og overlejret på ikke-udvælgelse p2m - / - eller vælge WT skiver. Efter 72 timers inkubation ved 37 ° C blev CD8 + T celle udvikling analyseret ved flowcytometri. (A) Repræsentative data for celleoverfladen CD4 og CD8 udtryk på live CFSE + TCRβ høje thymocytter fra p2m - / - og WT skiver. (B) Kvantificering af levende CFSE + TCRβ høj CD8 + T-celle-udvikling på WT skiver sammenlignet med ikke-udvælgelse kontroller. Hver prik repræsenterer en individuel thymisk skive og linien repræsenterer middelværdien. (*** P <0,001, uparret t-test)ove.com/files/ftp_upload/54355/54355fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Flow cytometri af negativ selektion i thymiske skiver A 1:. 1-forhold mellem total CFSE-mærket OT-I TCR tg RAG1 - / - og CTV-mærkede WT thymocytter blev overlejret på WT skiver i nærvær eller fravær af OVA-peptid, SIINFEKL. Efter 24 timers inkubation ved 37 ° C blev de relative andele af overlejrede celler analyseret ved flowcytometri. (A) En skematisk af den eksperimentelle opstilling viser en overlejring af CTV-mærkede WT-celler (blå) blandet 1: 1 med CFSE-mærket OT-I TCR tg celler (grøn) på en WT thymisk skive i nærvær eller fravær af OVA-peptid. (B) Repræsentative data afbilder andelen af levende CFSE + OT-ITCR tg celler og CTV + WT celler fra skiver, der blev inkuberet med eller uden OVA-peptid. (C) Dataene blev normaliseret mellem skiver, og det relative forhold mellem levende CFSE + OT-I TCR tg celler til at leve CTV + WT-celler er vist. Fejlsøjler indikerer standardafvigelse. N = 3 for hver betingelse. (* p <0,05, uparret t-test). Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her beskriver vi en protokol for udarbejdelsen af thymiske skiver og repræsentative resultater af effektiv positiv og negativ selektion af overlejret præ-valg MHC klasse I-begrænset TCR transgene thymocytter ved flowcytometri. Dette system er blevet anvendt med lignende succes at understøtte positiv selektion af MHC klasse II-begrænsede CD4 + T-celler fra præ-udvælgelse DP thymocyter 32, og i nærværelse af agonist-antigen, negativ selektion og thymus T reg udvikling 11,12, 36,38,39,43,44. Denne protokol kan modificeres til at studere thymisk udvælgelse i nærvær eller fravær af inhibitorer, defineret peptider, såvel som af genetisk modificerede thymocytter eller stromale cellepopulationer. Thymus skiver er også modtagelig for overlejring af andre end thymocyt delmængder cellepopulationer. For eksempel blev det for nylig vist, at dendritiske celler overlejret på thymiske skiver effektivt migrere ind i vævet og kan understøtte negativ selection og T reg udvikling 39,43. Undersøgelser til dato har brugt forvalg DP eller totale thymocytter at studere positiv og negativ selektion. Skønt T-celle-udvikling kan fortsætte i mindst 4 dage i thymiske skiver, hvis interesse i at iværksætte forsøg med en tidligere progenitorpopulationen, bør det tages i betragtning, at en begrænsning ved dette system er, at kvaliteten af de thymiske skiver begynder at falde efter 1-2 dage i kultur som følge af celledød og mangel på et indkapslende membran.
Den heri beskrevne protokol kan også anvendes til generering af skiver fra humant thymisk væv med subtile ændringer. Før indlejring i agarose bør humant thymisk væv skæres i fragmenter, nogenlunde på størrelse med en voksen mus thymisk lap. Især humane thymiske prøver er rige på bindevæv, og i forhold til murin thymus, er det mere vanskeligt at fremstille god kvalitet skiver. Det er vores erfaring, føtal snarere end neonatal menneskethymus væv er mere befordrende for skive forberedelse. Det har vist sig, at humane thymocyt delmængder lokalisere korrekt på både mennesker og mus thymiske skiver 37. Thymisk udvælgelse af overlejrede humant thymocyt delmængder imidlertid endnu ikke blevet rapporteret i thymiske skive model. Effektiviteten af positiv selektion fra et polyklonalt population er lav, og på grund af den lave andel (~ 0,5-2%) af overlejrede thymocyter i thymus skive, kan det være vanskeligt at vurdere sådanne små antal af positivt selekterede celler. Det kan være muligt at indføre et menneske TCR transgen i humane T-celle stamceller før overlay på menneskelige thymus skiver at øge positiv selektion effektivitet. Dette udelukker heller ikke muligheden for overvågning af ændringer i endogene T-celle populationer i tilstedeværelse eller fravær af exogene peptider eller andre cellepopulationer og hæmmere af TCR-signaler, blandt andre.
Denne protokol kan også være annonceApted til visualisering af thymocyt migration, TCR-signaler, og cellulære interaktioner 12,32-38. Indtil for nylig har de fleste studier af thymocyt adfærd in situ været begrænset til cortex som medulla er centralt beliggende i thymus, lige uden for detektionsgrænsen ved to-foton mikroskopi. I modsætning hertil thymiske skiver giver den unikke fordel ved, at skiverne har intakte thymiske corticale og medullære regioner og skive overflade giver direkte adgang til medulla ved to-foton-billeddannelse. Desuden kan thymiske skiver belagt med celler mærket med calcium indikatorfarvestoffer såsom indol anvendes til at overvåge TCR signaler under anvendelse cytosoliske calcium niveauer som en indikator for TCR-signaler associeret med positiv og negativ selektion ved to-foton mikroskopi 11,32,36, 38,39,44. At fremstille prøver til mikroskopi, kan skiverne anvendes direkte efter trin 4.5 i protokollen. I dette tilfælde skal man sørge for at vælge passende fluorescerende markører suitable til billeddannelse.
Thymiske skive organkulturer er et fremragende redskab til at studere forskellige aspekter af muse og human T-celle udvikling in situ. Men vellykket anvendelse af denne teknik kræver særlig opmærksomhed på kritiske trin i protokollen,. For at maksimere antallet af thymiske skiver opnået for høje throughput eksperimenter, skal der tages en alder af musen bruges i betragtning som størrelsen af thymus ændringer i hele levetiden af musen. Vi bruger typisk 4-8 uger gamle mus, der genererer ~ 20 thymiske skiver per mus. Imidlertid føtale, neonatale eller ældre mus Thymi kan teoretisk anvendes til at generere et begrænset antal skiver afhængigt af de eksperimentelle brugers behov. For at opnå god kvalitet skiver, er det altafgørende at fjerne alt bindevæv omgiver thymus lapper før indlejring i agarose. Resterende bindevæv er ikke effektivt afskæres af vibratome bladet under udskæring og kan beskadige thymiskelapper og deraf skiver. Hovedparten af bindevæv bør fjernes under thymus høst (trin 1.5) og tillader lapperne skal fjernes fra brysthulen uden væsentlig manipulation af selve vævet. Efter isolering af de lapper, forsigtigt fjerne eventuelle bindevæv som skitseret i trin 2.5. Derudover er bydende nødvendigt for at overlejre thymocytter effektivt på skive overfladen integritet bevares agarosen omkring indlejrede væv. Således er det kritisk at inspicere både thymus skive og den omgivende agarose ved valg af thymiske skiver til anvendelse i eksperimentet. Den vibratome er typisk placeret uden for vævskultur hætte, øge den potentielle risiko for kontaminering. Rengøring af vibratome grundigt i mellem eksperimenter og sprøjtning arbejdsområdet og vibratome med 70% ethanol før udskæring kan begrænse risikoen for forurening. Det er også vigtigt at bruge sterilt PBS i trin 2.13 og 2.15 som nævnt i den protokol. Endelig er det også afgørende at skelne overlejrede thymocytter, der migrerer ind i vævet fra cellerne, der er endogene for thymus. Dette kan opnås ved mærkning af overlejrede celler med fluorescerende farvestoffer, som nævnt i trin 3.7. Alternativt kan thymocytter fra mus, som udtrykker kongene markører eller genetisk indkodede fluorescerende reportere anvendes 45,46. Men generelt, thymus skiver er lette at håndtere og kan tilpasses til de specifikke eksperimentelle brugers behov, støtte bred anvendelighed, der kun begyndt at blive udforsket.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vibratome | Leica Biosystems | VT1000S | |
| NuSieve GTG Agarose | Lonza | 50080 | Low melting temperature agarose |
| Embedding Mold (Truncated - T12) | Polyciences | 18986 | 22 mm x 22 mm square, truncated to 12 mm x 12 mm |
| Double Edge Prep Blades | Personna | 74-0002 | |
| Tissue Adhesive | 3M | 1469SB | |
| 0.4 µm Cell Culture Inserts | BD Falcon | 353090 | Of several brands tested, these maintained the cells atop the slices the best |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | ThermoFisher | 21600-010 | |
| RPMI-1640 with L-glutamine | Wisent | 350-000-CL | |
| Fetal Bovine Serum | Wisent | 080-110 | Heat inactivated |
| L-Glutamine, 200 mM | Wisent | 609-065-EL | |
| Penicillin/Streptomycin, 100x | Wisent | 450-201-EL | |
| 2-Mercaptoethanol | Alfa Aesar | A15890 | |
| 15 ml Tenbroeck Tissue Grinders | Wheaton | 357426 | |
| Nylon Mesh Filter | Component Supply | U-CMN-255 | |
| Microcentrifuge Tube Sample Pestle | Bel-Art | F19922-0000 | |
| 40 µm Nylon Cell Strainer | BD Falcon | 352340 | |
| Forceps Inox Tip | Dumont | RS-5047 | Fine tip curved forceps, size .17 x .10 mm |
| Micro Forceps | Dumont | RS-5090 |
References
- Carpenter, A. C., Bosselut, R. Decision checkpoints in the thymus. Nat Immunol. 11, 666-673 (2010).
- Starr, T. K., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Positive and negative selection of T cells. Annu Rev Immunol. 21, 139-176 (2003).
- Vrisekoop, N., Monteiro, J. P., Mandl, J. N., Germain, R. N. Revisiting thymic positive selection and the mature T cell repertoire for antigen. Immunity. 41, 181-190 (2014).
- Stritesky, G. L., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Selection of self-reactive T cells in the thymus. Annu Rev Immunol. 30, 95-114 (2012).
- Bousso, P., Bhakta, N. R., Lewis, R. S., Robey, E. Dynamics of thymocyte-stromal cell interactions visualized by two-photon microscopy. Science. 296, 1876-1880 (2002).
- Takahama, Y. Journey through the thymus: stromal guides for T-cell development and selection. Nat Rev Immunol. 6, 127-135 (2006).
- Halkias, J., Melichar, H. J., Taylor, K. T., Robey, E. A. Tracking migration during human T cell development. Cell Mol Life Sci. 71, 3101-3117 (2014).
- Yin, X., Chtanova, T., Ladi, E., Robey, E. A. Thymocyte motility: mutants, movies and migration patterns. Curr Opin Immunol. 18, 191-197 (2006).
- Ladi, E., Yin, X., Chtanova, T., Robey, E. A. Thymic microenvironments for T cell differentiation and selection. Nat Immunol. 7, 338-343 (2006).
- Klein, L., Kyewski, B., Allen, P. M., Hogquist, K. A. Positive and negative selection of the T cell repertoire: what thymocytes see (and don't see). Nat Rev Immunol. 14, 377-391 (2014).
- Ross, J. O., et al. Distinct phases in the positive selection of CD8+ T cells distinguished by intrathymic migration and T-cell receptor signaling patterns. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, E2550-E2558 (2014).
- Hu, Z., Lancaster, J. N., Sasiponganan, C., Ehrlich, L. I. CCR4 promotes medullary entry and thymocyte-dendritic cell interactions required for central tolerance. J Exp Med. 212, 1947-1965 (2015).
- Anderson, M. S., et al. Projection of an immunological self shadow within the thymus by the aire protein. Science. 298, 1395-1401 (2002).
- Takaba, H., et al. Fezf2 Orchestrates a Thymic Program of Self-Antigen Expression for Immune Tolerance. Cell. 163, 975-987 (2015).
- McCaughtry, T. M., Baldwin, T. A., Wilken, M. S., Hogquist, K. A. Clonal deletion of thymocytes can occur in the cortex with no involvement of the medulla. J Exp Med. 205, 2575-2584 (2008).
- Stritesky, G. L., et al. Murine thymic selection quantified using a unique method to capture deleted T cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 4679-4684 (2013).
- Anderson, G., Jenkinson, E. J. Review article: thymus organ cultures and T-cell receptor repertoire development. Immunology. 100, 405-410 (2000).
- Hare, K. J., Jenkinson, E. J., Anderson, G. In vitro models of T cell development. Semin Immunol. 11, 3-12 (1999).
- de Pooter, R., Zuniga-Pflucker, J. C. T-cell potential and development in vitro: the OP9-DL1 approach. Curr Opin Immunol. 19, 163-168 (2007).
- Lian, Z., et al. Intrathymically injected hemopoietic stem cells can differentiate into all lineage cells in the thymus: differences between c-kit+ cells and c-kit < low cells. Stem Cells. 15, 430-436 (1997).
- Manna, S., Bhandoola, A. Intrathymic Injection. Methods Mol Biol. 1323, 203-209 (2016).
- Goldschneider, I., Komschlies, K. L., Greiner, D. L. Studies of thymocytopoiesis in rats and mice. I. Kinetics of appearance of thymocytes using a direct intrathymic adoptive transfer assay for thymocyte precursors. J Exp Med. 163, 1-17 (1986).
- Schmitt, T. M., Zuniga-Pflucker, J. C. Induction of T cell development from hematopoietic progenitor cells by delta-like-1 in vitro. Immunity. 17, 749-756 (2002).
- de Pooter, R. F., Schmitt, T. M., Zuniga-Pflucker, J. C. In vitro generation of T lymphocytes from embryonic stem cells. Methods Mol Biol. 330, 113-121 (2006).
- Dervovic, D. D., Ciofani, M., Kianizad, K., Zuniga-Pflucker, J. C. Comparative and functional evaluation of in vitro generated to ex vivo CD8 T cells. J Immunol. 189, 3411-3420 (2012).
- White, A., Jenkinson, E., Anderson, G. Reaggregate thymus cultures. J Vis Exp. (18), (2008).
- Anderson, G., Owen, J. J., Moore, N. C., Jenkinson, E. J. Thymic epithelial cells provide unique signals for positive selection of CD4+CD8+ thymocytes in vitro. J Exp Med. 179, 2027-2031 (1994).
- Anderson, G., Jenkinson, E. J. Fetal thymus organ culture. CSH Protoc. , (2007).
- Mazda, O., Watanabe, Y., Gyotoku, J., Katsura, Y. Requirement of dendritic cells and B cells in the clonal deletion of Mls-reactive T cells in the thymus. J Exp Med. 173, 539-547 (1991).
- Ceredig, R., Jenkinson, E. J., MacDonald, H. R., Owen, J. J. Development of cytolytic T lymphocyte precursors in organ-cultured mouse embryonic thymus rudiments. J Exp Med. 155, 617-622 (1982).
- Fairchild, P. J., Austyn, J. M. Developmental changes predispose the fetal thymus to positive selection of CD4+CD8 T cells. Immunology. 85, 292-298 (1995).
- Bhakta, N. R., Oh, D. Y., Lewis, R. S. Calcium oscillations regulate thymocyte motility during positive selection in the three-dimensional thymic environment. Nat Immunol. 6, 143-151 (2005).
- Le Borgne, M., et al. The impact of negative selection on thymocyte migration in the medulla. Nat Immunol. 10, 823-830 (2009).
- Ehrlich, L. I., Oh, D. Y., Weissman, I. L., Lewis, R. S. Differential contribution of chemotaxis and substrate restriction to segregation of immature and mature thymocytes. Immunity. 31, 986-998 (2009).
- Ueda, Y., et al. Mst1 regulates integrin-dependent thymocyte trafficking and antigen recognition in the thymus. Nat Commun. 3, 1098 (2012).
- Dzhagalov, I. L., Chen, K. G., Herzmark, P., Robey, E. A. Elimination of self-reactive T cells in the thymus: a timeline for negative selection. PLoS Biol. 11, e1001566 (2013).
- Halkias, J., et al. Opposing chemokine gradients control human thymocyte migration in situ. J Clin Invest. 123, 2131-2142 (2013).
- Au-Yeung, B. B., et al. Quantitative and temporal requirements revealed for Zap70 catalytic activity during T cell development. Nat Immunol. 15, 687-694 (2014).
- Melichar, H. J., Ross, J. O., Herzmark, P., Hogquist, K. A., Robey, E. A. Distinct temporal patterns of T cell receptor signaling during positive versus negative selection in situ. Sci Signal. 6, (2013).
- Hu, Q., Nicol, S. A., Suen, A. Y., Baldwin, T. A. Examination of thymic positive and negative selection by flow cytometry. J Vis Exp. (68), e4269 (2012).
- Mombaerts, P., et al. RAG-1-deficient mice have no mature B and T lymphocytes. Cell. 68, 869-877 (1992).
- Hogquist, K. A., et al. T cell receptor antagonist peptides induce positive selection. Cell. 76, 17-27 (1994).
- Weist, B. M., Kurd, N., Boussier, J., Chan, S. W., Robey, E. A. Thymic regulatory T cell niche size is dictated by limiting IL-2 from antigen-bearing dendritic cells and feedback competition. Nat Immunol. 16, 635-641 (2015).
- Melichar, H. J., Ross, J. O., Taylor, K. T., Robey, E. A. Stable interactions and sustained TCR signaling characterize thymocyte-thymocyte interactions that support negative selection. J Immunol. 194, 1057-1061 (2015).
- Hadjantonakis, A. K., Macmaster, S., Nagy, A. Embryonic stem cells and mice expressing different GFP variants for multiple non-invasive reporter usage within a single animal. BMC Biotechnol. 2, (2002).
- Schaefer, B. C., Schaefer, M. L., Kappler, J. W., Marrack, P., Kedl, R. M. Observation of antigen-dependent CD8+ T-cell/ dendritic cell interactions in vivo. Cell Immunol. 214, 110-122 (2001).
