Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Förberedelse och tillämpningar av Organotypic Thymic Slice kulturer

Published: August 6, 2016 doi: 10.3791/54355
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 1,3
1Centre de Recherche, Hôpital Maisonneuve-Rosemont, 2Department of Microbiology, Infectiology and Immunology, Université de Montréal, 3Department of Medicine, Université de Montréal
* These authors contributed equally

Summary

Vi beskriver framställningen av tymiska segment som, i kombination med flödescytometri, kan användas för att modellera positiv och negativ selektion av att utveckla T-celler. Tymiska skivor kan även anpassas för in situ-analys av tymocyt migration, lokalisering, och signalering via immunofluorescens och två-foton mikroskopi.

Abstract

Tymus urval fortskrider i en unik och mycket organiserad tymus mikroresulterar i genereringen av en funktionell, själv tolerant T-cellrepertoar. In vitro-modeller för att studera T härstamning engagemang och utveckling har gett värdefulla insikter i denna process. Emellertid är dessa system saknar den fullständiga tredimensionella tymisk milieu nödvändig för T-cellsutveckling och, därför, är ofullständiga approximationer av in vivo tymus urval. Några av utmaningarna i samband med cellutveckling modellering T kan övervinnas genom att använda in situ-modeller som ger en intakt tymus mikro som fullt ut stöder tymus val att utveckla T-celler. Tymus skiva organotypic kulturer komplettera befintlig in situ tekniker. Tymiska skivor bevara integriteten av tymiska kortikala och medullära regioner och tillhandahålla en plattform för att studera utvecklingen av överlagrade tymocyter av en definierad utvecklingsstadiet eller av endogena T ^alnar inom en mogen tymus mikromiljö. Ges möjlighet att generera ~ 20 skivor per mus, tymiska skivor presentera en unik fördel när det gäller skalbarhet för hög genomströmning experiment. Vidare, den relativa lätthet att generera tymiska skivor och potential att överlagra olika tymiska grupper eller andra cellpopulationer från olika genetiska bakgrunder ökar mångsidigheten hos denna metod. Här beskriver vi ett protokoll för framställning av tymus skivor, isolering och överlagring av tymocyter och dissociation av tymiska skivor för flödescytometrisk analys. Detta system kan också anpassas för att studera icke-konventionella T-cellutveckling samt visualisera tymocyt migration, tymocyt-stromal cellinteraktioner, och TCR signaler som är associerade med tymus urval av två-foton mikroskopi.

Introduction

T-celler differentierar genom en serie av utvecklingsmässiga mellanprodukter i tymus under vilken tid de stöter på flera kontrollpunkter som säkerställer alstringen av en funktionell, självtoleranta T-cellrepertoar 1-3. Positiv selektion gynnar överlevnaden av tymocyter med T-cellreceptorer (TCR) förmåga att känna igen, med låg till måttlig affinitet, peptid som presenteras av MHC molekyler (MHC) på kortikala tymiska epitelceller (CTEC) 2,3. Negativ selektion och regulatoriska T (T reg) cell utveckling bidra till upprättandet av självtolerans genom att undanröja eller avledning av tymocyter som svarar starkt själv peptid presenteras av MHC 2,4. Omogna CD4 + CD8 + dubbel positiv (DP) tymocyter uttrycker TCR som passerar urvalsprocessen differentierar till mogna T-cellspopulationer, varav de flesta är MHC klass I-begränsade CD8 + cytotoxiskaeller MHC klass II-begränsade CD4 + hjälpar enstaka positiva (SP) T-celler, innan du lämnar tymus att utföra effektorfunktioner i sekundära lymfoida organ 1-3.

Lägga till komplexiteten i T-cellutveckling är den dynamiska migration och cellulära möten att utveckla tymocyter hela stromaceller nätet 5-9. Dessa stromaceller spelar olika roller i tymocyt utveckling och differentiellt fördelade mellan tymiska kortikala och medullära regioner där positiva och negativa urval förekommer 10. Även positiv selektion sker främst i hjärnbarken finns ackumulerande bevis för att DP tymocyter migrera till märgen och fortsätta att kräva TCR signaler innan de differentierar till mogna T-celler tyder på att märgen kan ge ytterligare signaler som är nödvändiga för slutförandet av positiv selektion och härstamning differentiering 11,12. Ytterligare,trots närvaron av specialiserade märg tymiska epitelceller (MTEC) som uttrycker och nuvarande vävnadsbegränsade antigener underlättar radering av autoreaktiva tymocyter 13,14, sker en stor del av negativ selektion i hjärnbarken som svar på ubiquitously uttryckt själv peptid presenteras av dendritiska celler 15,16. Således måste noggranna modeller av T-cellsutveckling ger en mycket organiserad tymus mikro, med intakt kortikala och medullära regioner, som underlättar samverkan mellan tymocyter och stromaceller och stöder tymocyt migration dessa celler genomgå positiv och negativ selektion.

Att komplettera ex vivo-analyser av tymocyter som ett sätt att studera positiva och negativ selektion, ett antal in vitro, in situ, och in vivo-modeller av T-cellutveckling har utvecklats 17-22. Det har varit notoriskt svårt att sammanfattapositiv urvals in vitro, men samodling av stamcellspopulationer eller T-cellsföregångare med stromala celler som uttrycker Notch-ligand, särskilt OP9-DL1 / 4-celler, har förmågan att stödja T härstamning engagemang och begränsad positiv selektion gör det en ovärderlig in vitro modell studien T-cellutveckling 23-25. Begränsningar i detta system omfattar dock det faktum att dessa celler saknar den unika peptidbearbetning maskiner som finns i tymus stromaceller och tredimensionella tymus mikromiljö.

Även mer tekniskt besvärligt, in situ och in vivo-modeller av tymus val kan övervinna några av de hinder i samband med in vitro-system. Reaggregate tymiska organkulturer (RTOC) innehåller definierade blandningar av tymocyter och tymus stromaceller 18,26,27. Dessa tymiska epitelceller reaggregates upprätthålla MHC klass I och II uttryck och kan stödja development av både konventionella cellgrupper T, men ändå saknar definierade kortikala och medullära strukturer. Fetal tymus organkultur (FTOC) är en populär modell av T-cellutveckling som kan ympas med tymocyter via hängande-droppe kultur lymphodepleted tymiska lober eller via injektion av tymocyter i lymphoreplete thymic lober och stödja en effektiv utveckling av CD4 + och CD8 + T celler över tiden i kultur 18,28-31. Vid initiering av kulturen i foster tymiska lober finns en brist på mTECs, men definierade kortikala och medullära strukturer kan utvecklas över tiden beroende på förhållandena. En viktig faktor är att denna modell företrädesvis kan stödja foster kontra vuxen T-cellsutveckling. Slutligen är intratymisk injektion av definierade thymic prekursorer i vuxna möss tekniskt utmanande men klart ger en miljö för att stödja T-cellutveckling in vivo. Dessa in situ och in vivo-modeller är utmärkta verktyg to studie T-cellutveckling och deras användning bör övervägas på ett experiment-by-försök tillämpa.

Tymiska skivor, men har nyligen dykt upp som en mångsidig, kompletterande modell för att studera tymus urval in situ med möjlighet att rymma unik, komplex och generellt högre genomströmning experiment. Tymiska skivor bibehålla integriteten av kortikala och medullära regioner och ger en ram för stromaceller som stöder tymocyt migration under utveckling samt effektiv positiv och negativ selektion 11,32-39. Tymocyt grupper läggs ovanpå tymiska skivor vandrar in i vävnaden och deras lämplig microenvironmental nisch 34,37. De överlagrade tymocyter kan skiljas från tymus skiva endogena celler via kongena markörer eller fluorescerande märkningar och kan upprätthållas i odling under flera dagar. Tymisk slice organotypiska kulturer kan användas för att studera olika aspekterav T-cellutveckling inklusive tymus urval, tymocyt beteende (migration och cellulära interaktioner) och tymocyt lokalisering, bland andra. Ges möjlighet att generera ~ 20 tymiska skivor per mus, är skalbarheten experiment i allmänhet större än andra in situ modeller av tymus val. Även om framställningen av tymiska skivor kräver specialiserad utrustning, såsom vibratome, och livslängden hos tymiska skivor i kultur är begränsad på grund av förlust av celler över tiden via celldöd och avsaknaden av ett inkapslingsmembran, tymiska skivor ger en utmärkt modell för analys av tymus urval av synkroniserade populationer av tymocyter inom en mogen tymus mikromiljö. Här beskriver vi framställningen av tymiska skivor (inklusive skörd tymus, agaros inbäddning av tymus lober och vibratome sektionering av den inbäddade vävnaden), isolering och överdrogos tymocyter, och dissociation av tymiska skivor för flödescytometrisk analys.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Protokoll för alla djurstudier godkändes av Animal Care kommittén vid Centre de recherche - Hôpital Maisonneuve-Rosemont.

1. Skörd Mouse Thymus för framställning av tymus skivor och enkelcellsuspensioner

  1. Avliva musen med CO2 följt av cervikal dislokation.
  2. I en huv med laminärt flöde, stift musen ventrala sidan upp till en dissektion kortet. Spraya musen med 70% etanol. Ta bort överflödigt alkohol genom att badda med gasväv för att förhindra etanol från att komma in i brösthålan och skada vävnaden.
  3. Lyfta huden vid basen av bröstbenet med en pincett och göra ett snitt genom huden. Förläng snittet i huden uppåt till varje forelimb.
  4. Göra en ytterligare snitt vid basen av bröstbenet att separera membranet från bröstkorgen. sedan klippa varje sida av bröstkorgen mot nyckelbenet. Vänd på bröstkorgen över mot huvudet exponera brösthålan. De två loberna ide tymus ligga ovanpå hjärtat.
  5. Ta bort bindväv runt thymic lober med hjälp av pincett, mikro-dissektion sax, och / eller vassa böjd sax. Använd ett par fina spets böjda pincett för att lyfta enskilda lober underifrån eller via kvarvarande bindväv.
    Obs: Ta inte tag bräss direkt.
  6. Placera tymiska lober i en 15 ml koniska rör innehållande PBS och ställ åt sidan på is tills det behövs.

2. Agarose inbäddning och Vibratome skivning av thymus Lobes

  1. Förbered 4% agaroslösningen för inbäddning genom att lösa 2 g med låg smältpunkt agaros i 50 ml steril PBS och mikrovågsugnen på en låg inställning tills agarosen har helt upplöst. Täck kolven med aluminiumfolie och placera i ett vattenbad vid 55 ° C tills produkten ska användas.
  2. I en vävnadskultur huva, förbereda kompletta RPMI-1640-medium som innehåller 10% fetalt bovint serum (FBS), 4 mM L glutamin, 1x penicillin / streptomycin, och 10 | iM2-merkaptoetanol.
  3. Tillsätt 1,5 ml fullständigt RPMI-1640 media per brunn till en 6-brunnars cellodlingsplatta och placera en cellodlingsinsats i varje brunn. Ställ plattan åt sidan i en inkubator vid 37 ° C tills det behövs.
  4. Förbered en slaskig isvattenbad med vatten och is i en ishink.
  5. Ta försiktigt allt kvarvarande bindväv som omger varje tymus lob med fina spets pincett. Gör detta medan thymic lob är nedsänkt i PBS i en vävnadsodlingsskål, efter överföring till en vävnad torka indränkt med PBS, eller under ett dissektionsmikroskop.
  6. Tillåta agarosen svalna under 40 ° C, när kolven är bara varm vid beröring, för att undvika överhettning av vävnaden. Häll den kylda 4% agaros i en vävnad gjutform till en höjd av ~ 1 cm.
  7. Använd en pincett för att försiktigt överföra tymus loben till en vävnad torka och rulla den försiktigt för att torka den utan att skada vävnaden. Se till att vävnaden torkar helt eller kommer det att glida ut ur agarosen under skärning.
  8. Försiktigt in loben i agarosen och placera den antingen horisontellt (för att öka ytarean hos varje skiva) eller vertikalt (för att öka antalet snitt) vid botten av formen. Placera formen i isvatten under 5-10 min för att tillåta agarosen att stelna.
  9. Under denna tid, förbereda vibratome för skivning genom att montera buffertfacket montering preparatskivan och sätta in vibratome bladet. Placera en bit av laboratorium tejp på preparatskivan. Sterilisera ren, monteras arbetsyta med 70% etanol.
  10. När agarosen stelnar, invertera formen och tryck försiktigt på mitten för att släppa agarosen inbäddad lob.
  11. Använda ett vasst blad för att trimma överskotts agaros omger loben lämnar ~ 2 mm av agaros på varje sida och ~ 0,5 cm vid botten.
  12. Säkra varje agaros block med en droppe vävnadslim till tejpbit på preparatskivan. Flera block kan limmas på bandet.
  13. Rikta vibratome blad with toppen av agarosen blocket. Fyll buffertbrickan med steril PBS tills kniven och agarosen blocket (s) är helt nedsänkt.
  14. § agarosen inbäddad vävnad för att erhålla skivor med en tjocklek av 400-500 pm. Ställ vibratome till 0,225 mm / sek hastighet, 100 Hz, och 5 ° vinkel.
  15. Använd en böjd spatel för att samla in tymiska skivor i en vävnadsodlingsplatta innehållande steril PBS som de skärs. Kasta den första och sista skiva.
  16. Undersök skivorna under ett ljusmikroskop vid 4X förstoring. Välj skivor med intakt tymusvävnad och omgivande agaros (Figur 1A).
  17. Överför skivor till plattan som framställts i steg 2,3 med hjälp av en pipettspetsen att försiktigt glida tymus skiva från den böjda spateln på cellodlingsinsats. Varje insats kan rymma ~ 3 skivor. Se till att skivorna inte vidrör varandra eller cellodlingsinsatsväggar.
  18. Bibehålla plattan vid 37 ° C tills det behövs.
  1. Isolera tymiska lober som beskrivs i avsnitt 1. dissociera lober manuellt för att göra en enda cell suspensionen med en steriliserad 15 ml vävnadskvarn fylld med 5 ml steril PBS innehållande 2% FBS. Överföra celler till en 15 ml koniskt rör.
  2. Centrifugera cellerna vid 545 xg under 5 min vid 4 ° C. Kassera supernatanten och återsuspendera cellerna i 1 ml 1x ACK lyserings-buffert (0,15 M NH4CI, 10 mM KHCO3, 0,1 mM Na2EDTA) vid rumstemperatur under 3 min för att lysera röda blodkroppar.
  3. Fyll röret till 15 ml med PBS innehållande 2% FBS. Centrifugera cellerna vid 545 xg under 5 min vid 4 ° C.
  4. Resuspendera cellerna i 10 ml PBS innehållande 2% FBS och passera celler genom en 255 um nätfilter.
  5. Räkna celler med hjälp av en hemocytometer. Centrifugera cellerna vid 545 xg under 5 min vid 4 ° C, och återsuspendera cellpelleten i PBS innehållande 2% FBS vid en concentration av 1 x 10 7 celler per ml.
  6. Märka cellerna med cell färgämnen som karboxifluorescein succinimidylester (CFSE) enligt tillverkarens protokoll om du inte använder tymocyter från möss som uttrycker kongena markörer eller genetiskt kodade fluorescerande reportrar att skilja från skiva endogena celler.
  7. Efter den slutliga tvätten av de märkta cellerna, resuspendera cellpelleten i kompletta RPMI-1640-medium vid 1-3 x 10 6 celler per 15 pl.

4. Överlagra Tymocyter på Thymic Slices

  1. Använd en pipett att aspirera vätska som omger thymic skivor på insatsen.
    Obs: Var noga med att undvika att skada agarosen. Om agarosen är skadad, kommer överlagrade tymocyter inte fäster på skiva ytan på grund av förlust av ytspänning.
  2. Utan att vidröra skiva med pipettspetsen, overlay 15 pl tymocyter som framställts i avsnitt tre på varje tymus skiva.
  3. Inkubera plate vid 37 ° C under 2 timmar för att tillåta cellerna att migrera in i de thymic skivor.
  4. Efter 2 h, skölj de tymiska skivor 3 gånger med 1 ml PBS för att avlägsna överskott av överlagrade tymocyter som ännu inte har migrerat in i vävnaden.
  5. Inkubera plattan vid 37 ° C tills de tymiska skivor är färdiga att skördas, typiskt 1-72 h beroende på experimentet.

5. Dissociation av thymus skivor för flödescytometri

  1. Förbereda ett mikrocentrifugrör för varje skiva genom att tillsätta 150 | il av PBS innehållande 2% FBS.
  2. Tillsätt 1 ml PBS innehållande 2% FBS till vävnadsodlingsinsatsen med de tymiska segment och försiktigt rör med en böjd spatel för att lösgöra skivorna från ytan av cellodlingsinsats.
  3. Överföra skiva från insatsen till mikrocentrifugrör med hjälp av en böjd spatel.
  4. störa manuellt segment med hjälp av ett rör provmikromortelstöt. Tillsätt 150 | il av PBS innehållande 2% FBS till en slutlig volym 300il.
  5. Filtrera den dissocierade vävnaden genom en 40 ^ m filter in i ett nytt mikrocentrifugrör. De filtrerade cellerna är redo att färgas för flödescytometrisk analys 40.
  6. Filtrera celler en andra gång innan de skickas på en flödescytometer för att säkerställa att all agaros avlägsnas och täpper inte till flödescytometern.
  7. Förvärva cellerna på en flödescytometer och analysera data såsom har beskrivits tidigare 40.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Tymus skivor stöd analys av olika aspekter av T-cellsutveckling som positiv och negativ selektion. För lyckade experiment, är kvaliteten på den tymus-skiva av största vikt. Därför bör tymiska skivor granskas för att säkerställa integriteten för tymusvävnad och att agarosen omger tymus skiva är intakt (Figur 1A). Ytspänning kan äventyras när agarosen skadas vilket orsakar en signifikant minskning av antalet tymocyter som migrerar in i vävnaden. Således, tymiska skivor med tecken på skador eller hack vävnad / tårar i agarosen ska kasseras (Figur 1B).

TCR transgen (tg) möss användes ofta för att studera thymic val på grund av uttrycket av en definierad, funktionell TCR på ytan av varje tymocyt som ökar frekvensen av positiv selektion under polyclonal populationer. För att fånga varje steg i positiv selektion, urvals TCR tg tymocyter kan överlagras ovanpå tymus skivor, och utvecklingen av mogna, CD4 + eller CD8 + SP T-celler följdes under tiden genom flödescytometri 40. Tymocyter isolerade från MHC klass I-begränsade OT-I TCR tg Rag1 - / - p2m - / - möss arresteras på DP steg före tymus val på grund av nödvändigheten av p2m att associera med och stabilisera MHC klass I tung kedja 41 , 42. När överlagras på p2m - / - tymus skivor, urvals OT-I TCR tg tymocyter kvar på DP stadiet och inte generera betydande CD8 + SP T-celler (figur 2A, vänster). Däremot när överdras på WT tymiska skivor vilka innehåller endogena välja ligander, är förmågan hos denna modell för att stödja positiv selektion bevisas av CD8 + T-cellutveckling vid 72 h (figur 2A, höger). Quantification av CD8 + T-cellutveckling som en utläsning av positiv selektion visas i figur 2B.

Tymiska skivor kan också användas för att studera negativ selektion. En stor del av negativ selektion sker som svar på allestädes närvarande antigen 16. Att modellera negativ selektion till ubiquitous antigen, totala tymocyter från OT-I TCR tg Rag1 - / - och vildtyp (WT) möss märktes med CFSE och CTV, respektive, blandades därefter i en 1: 1-förhållande och överlagras på WT skivor (figur 3A). Efter tvättning av överskott tymocyter ades tymiska skivor placeras i kompletta RPMI-1640-medium med eller utan 1 nM av det besläktade agonist peptid med OT-I TCR, SIINFEKL (OVA-peptid). Alla MHC klass I-uttryckande celler kommer att presentera antigen, modellering presentationen av ubiquitously uttryckt antigen i thymus. Efter 24 h av inkubation vid 37 ° C, den andel av OT-I TCR tg cells (% levande CFSE +) för att WT kontrollceller (% levande CTV +) jämfördes genom flödescytometri (figur 3B). En minskning i den relativa andelen OT-I TCR tg celler representerar radering av OTI TCR tg celler som svar på OVA peptiden.

Det är viktigt att notera att på grund av heterogenitet i storlek tymiska skivor samt cell inträde i tymus skivor, bör man inkludera lämplig analys och interna kontroller för att normalisera för dessa variabler. Här var WT-celler blandade med OT-I TCR tg celler och överlagrade ovanpå skivor används som en intern kontroll som denna population bör inte påverkas nämnvärt av närvaron eller frånvaron av OVA-peptid. Omfattningen av negativa urval av OTI TCR tg celler kvantifierades baserat på proportioner snarare än absoluta tal. Först, förhållandet mellan OT-I TCR tg (% levande CFSE +) till WT (% levande CTV +) celler på varje WT tymisk segment i närvaro eller frånvaro av OVA-peptid beräknades. Vart och ett av dessa förhållanden delades sedan med medelvärdet av förhållandet mellan OT-I TCR tg (% levande CFSE +) till WT (% levande CTV +) celler på WT skivor i frånvaro av OVA-peptid. I genomsnitt har 80% av den OT-I TCR tg celler utarmat som svar på allmänt förekommande antigen såsom anges i fig 3C.

Figur 1
Figur 1: Bilderna av tymiska skivor framställda från en vertikalt inbäddad tymus lob. (A) Bra kvalitet skiva med den inbäddade vävnaden och omgivande agaros intakt. (B) Dålig kvalitet skiva med skador på grund av att riva av den inbäddade vävnaden under skärning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

ove_content "fo: keep-together.within-page =" 1 "> figur 2
Figur 2:. Flödescytometrisk analys av positiv selektion i tymus skivor OT-I TCR tg Rag1 - / - p2m - / - tymocyter märktes med CFSE och överlagras på icke-val p2m - / - eller välja WT skivor. Efter 72 h av inkubation vid 37 ° C tillsattes CD8 + T-cellutveckling analyserades med flödescytometri. (A) Representativa data för cellytan CD4 och CD8 uttryck på levande CFSE + TCRβ höga tymocyter från p2m - / - och WT skivor. (B) Kvantifiering av levande CFSE + TCRβ hög cellutveckling CD8 + T på WT skivor jämfört med icke-val kontroller. Varje punkt representerar en individuell tymus skiva och linjen representerar medelvärdet. (*** P <0,001, oparat t-test)ove.com/files/ftp_upload/54355/54355fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3: Flödescytometrisk analys av negativ selektion i tymus skivor 1 A:. 1 förhållandet mellan total CFSE-märkt OT-I TCR tg Rag1 - / - och CTV-märkta WT tymocyter belades på WT skivor i närvaro eller frånvaro av OVA-peptid, SIINFEKL. Efter 24 h av inkubation vid 37 ° C, var de relativa proportionerna av överlagrade celler analyserades med flödescytometri. (A) En schematisk bild av experimentuppställningen visar en överlagring av CTV-märkta WT-celler (blå) blandas 1: 1 med CFSE-märkt OT-I TCR tg celler (grön) på en WT tymus skiva i närvaro eller frånvaro OVA-peptid. (B) Representativa data som visar hur stor andel av levande CFSE + OT-ITCR tg celler och CTV + WT-celler från segment som inkuberades med eller utan OVA-peptid. (C) Data normaliserades mellan skivorna, och det relativa förhållandet av levande CFSE + OT-I TCR tg celler att leva CTV + WT-celler visas. Felstaplar indikerar standardavvikelsen. N = 3 för varje tillstånd. (* p <0,05, oparat t-test). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Här beskriver vi ett protokoll för beredning av tymiska skivor och representativa resultat av effektiv positiv och negativ selektion av överlagrade urvals MHC klass I-begränsad TCR transgena tymocyter med flödescytometri. Detta system har använts med liknande framgång för att stödja positiv selektion av MHC klass II-begränsade CD4 + T-celler från förvals DP tymocyter 32, och, i närvaro av agonist-antigen, negativ selektion och tymisk T reg utveckling 11,12, 36,38,39,43,44. Detta protokoll kan modifieras för att studera tymus val i närvaro eller frånvaro av hämmare, definierade peptider, samt av genetiskt modifierade tymocyter eller stromal cellpopulationer. Tymiska skivor är också mottagliga för överlagring av andra än tymocyt grupper cellpopulationer. Till exempel, har nyligen visat att dendritiska celler som lagts över tymiska skivor effektivt migrera in i vävnaden och kan stödja negativ selection och T reg utveckling 39,43. Studier hittills har använt urvals DP eller totala tymocyter att studera positiva och negativa urval. Även T-cell utveckling kan fortgå under åtminstone 4 dagar i tymus skivor, om intresse att initiera försök med en tidigare stamfader befolkning, det bör tas hänsyn till att en begränsning av detta system är att kvaliteten på de tymiska skivor börjar sjunka efter 1-2 dagar i kultur på grund av celldöd och avsaknad av ett inkapslingsmembran.

Protokollet som beskrivs häri kan också användas för att generera segment från human tymusvävnad med subtila modifieringar. Innan inbäddning i agaros bör human tymusvävnad skäras i fragment, ungefär storleken av en vuxen mus tymus lob. Notably, humana tymiska prover är rika på bindväv, och, i förhållande till murin tymus, är det svårare att framställa god kvalitet skivor. I vår erfarenhet, fetal snarare än neonatal människatymusvävnad är mer gynnsam för skiva beredning. Det har visat sig att de mänskliga tymocyt grupper lokalisera korrekt på både mänskliga och mus thymic skivor 37. Tymus urval av överlagrade mänsklig tymocyt grupper har dock ännu inte rapporterats i tymus skiva modell. Effektiviteten av positiv selektion från en polyklonal population är låg, och på grund av den låga andelen (~ 0,5-2%) av överlagrade tymocyter i tymus skiva, kan det vara svårt att bedöma sådana små mängder positivt selekterade celler. Det kan vara möjligt att införa en human TCR transgen i humana T-cell progenitorceller före överlagra på mänskliga tymiska skivor för att öka positiv selektion effektivitet. Detta också utesluter inte möjligheten bevaka förändringar i endogena T-cellpopulationer i närvaro eller frånvaro av exogena peptider eller andra cellpopulationer och hämmare av TCR signaler, bland annat.

Detta protokoll kan också vara annonsApted för visualisering av tymocyt migration, TCR signaler, och cellulära interaktioner 12,32-38. Tills nyligen har de flesta studier av tymocyt beteende in situ varit begränsad till cortex som medulla är centralt beläget i tymus, strax bortom gränsen för upptäckt av två-foton mikroskopi. Däremot tymiska skivor ger den unika fördelen av att skivorna har intakta tymiska kortikala och medullära regioner och segment ytan ger direkt tillgång till märgen med två-photon avbildning. Dessutom kan tymiska skivor som överdras med celler märkta med kalciumindikatorfärger såsom Indol användas för att övervaka TCR signaler med användning av cytosoliska kalciumnivåer som en indikator på TCR-signaler som är associerade med positiv och negativ selektion genom två-foton-mikroskopi 11,32,36, 38,39,44. För att framställa prover för mikroskopi, kan skivorna användas direkt efter steg 4,5 i protokollet. I detta fall bör man välja lämpliga fluorescerande markörer SUsam för avbildning.

Tymiska kulturer skiva organ är ett utmärkt verktyg för att studera olika aspekter av mus och cellutveckling human T in situ. Men framgångsrik tillämpning av denna teknik kräver särskild uppmärksamhet på kritiska steg i protokollet. För att maximera antalet tymiska skivor som erhållits för hög genomströmning experiment måste ålder av musen används beaktas som storleken på bräss ändras under livstiden för musen. Vi använder vanligtvis 4-8 veckor gamla möss som genererar ~ 20 tymiska skivor per mus. Emellertid fetala, neonatala eller äldre möss Thymi kan teoretiskt användas för att generera ett begränsat antal skivor, beroende på de experimentella behoven hos användaren. För att erhålla god kvalitet skivor, är det ytterst viktigt att ta bort all bindväv som omger thymic lober före inbäddning i agaros. Återstående bindväv är inte effektivt skära av vibratome bladet under skärning och kan skada tymuslober och resulterande skivor. Den största delen av bindväv bör tas bort under tymus skörd (steg 1,5) och tillåter loberna som skall avlägsnas från brösthålan utan signifikant manipulation av vävnaden själv. Efter isolering av lober, försiktigt bort eventuellt kvarvarande bindväv som beskrivs i steg 2,5. Dessutom är absolut nödvändigt för att överlagra tymocyter effektivt på slice ytan upprätthålla integriteten i agarosen omgivande den inbäddade vävnaden. Således är det viktigt att inspektera både bräss skiva och den omgivande agarosen när de väljer thymic skivor för användning i experimentet. Vibratome typiskt ligger utanför vävnadsodling huva, vilket ökar risken för kontaminering. Rengöring av vibratome noggrant mellan experiment och sprutning arbetsområdet och vibratome med 70% etanol före skivning kan begränsa risken för förorening. Det är också viktigt att använda steril PBS för steg 2.13 och 2.15 som nämns i protocol. Slutligen är det också viktigt att skilja överlagrade tymocyter som migrerar in i vävnaden från de celler som är endogena för tymus. Detta kan uppnås genom att märka överlagrade celler med fluorescerande färgämnen som nämns i steg 3,7. Alternativt kan tymocyter från möss som uttrycker kongena markörer eller genetiskt kodade fluorescerande reportrar användas 45,46. I allmänhet är emellertid tymiska skivor är lätta att manipulera och kan anpassas till de specifika experimentella behoven hos användaren, stödja bred tillämpbarhet som bara har börjat på att utforskas.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Vibratome Leica Biosystems VT1000S 
NuSieve GTG Agarose Lonza 50080 Low melting temperature agarose
Embedding Mold (Truncated - T12) Polyciences 18986 22 mm x 22 mm square, truncated to 12 mm x 12 mm
Double Edge Prep Blades Personna 74-0002
Tissue Adhesive 3M  1469SB
0.4 µm Cell Culture Inserts  BD Falcon 353090 Of several brands tested, these maintained the cells atop the slices the best
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline ThermoFisher 21600-010
RPMI-1640 with L-glutamine Wisent 350-000-CL
Fetal Bovine Serum Wisent 080-110 Heat inactivated
L-Glutamine, 200 mM Wisent 609-065-EL
Penicillin/Streptomycin, 100x Wisent 450-201-EL
2-Mercaptoethanol Alfa Aesar A15890
15 ml Tenbroeck Tissue Grinders Wheaton 357426
Nylon Mesh Filter Component Supply U-CMN-255
Microcentrifuge Tube Sample Pestle Bel-Art F19922-0000
40 µm Nylon Cell Strainer BD Falcon 352340
Forceps Inox Tip Dumont  RS-5047 Fine tip curved forceps, size .17 x .10 mm
Micro Forceps Dumont  RS-5090 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Carpenter, A. C., Bosselut, R. Decision checkpoints in the thymus. Nat Immunol. 11, 666-673 (2010).
  2. Starr, T. K., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Positive and negative selection of T cells. Annu Rev Immunol. 21, 139-176 (2003).
  3. Vrisekoop, N., Monteiro, J. P., Mandl, J. N., Germain, R. N. Revisiting thymic positive selection and the mature T cell repertoire for antigen. Immunity. 41, 181-190 (2014).
  4. Stritesky, G. L., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Selection of self-reactive T cells in the thymus. Annu Rev Immunol. 30, 95-114 (2012).
  5. Bousso, P., Bhakta, N. R., Lewis, R. S., Robey, E. Dynamics of thymocyte-stromal cell interactions visualized by two-photon microscopy. Science. 296, 1876-1880 (2002).
  6. Takahama, Y. Journey through the thymus: stromal guides for T-cell development and selection. Nat Rev Immunol. 6, 127-135 (2006).
  7. Halkias, J., Melichar, H. J., Taylor, K. T., Robey, E. A. Tracking migration during human T cell development. Cell Mol Life Sci. 71, 3101-3117 (2014).
  8. Yin, X., Chtanova, T., Ladi, E., Robey, E. A. Thymocyte motility: mutants, movies and migration patterns. Curr Opin Immunol. 18, 191-197 (2006).
  9. Ladi, E., Yin, X., Chtanova, T., Robey, E. A. Thymic microenvironments for T cell differentiation and selection. Nat Immunol. 7, 338-343 (2006).
  10. Klein, L., Kyewski, B., Allen, P. M., Hogquist, K. A. Positive and negative selection of the T cell repertoire: what thymocytes see (and don't see). Nat Rev Immunol. 14, 377-391 (2014).
  11. Ross, J. O., et al. Distinct phases in the positive selection of CD8+ T cells distinguished by intrathymic migration and T-cell receptor signaling patterns. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, E2550-E2558 (2014).
  12. Hu, Z., Lancaster, J. N., Sasiponganan, C., Ehrlich, L. I. CCR4 promotes medullary entry and thymocyte-dendritic cell interactions required for central tolerance. J Exp Med. 212, 1947-1965 (2015).
  13. Anderson, M. S., et al. Projection of an immunological self shadow within the thymus by the aire protein. Science. 298, 1395-1401 (2002).
  14. Takaba, H., et al. Fezf2 Orchestrates a Thymic Program of Self-Antigen Expression for Immune Tolerance. Cell. 163, 975-987 (2015).
  15. McCaughtry, T. M., Baldwin, T. A., Wilken, M. S., Hogquist, K. A. Clonal deletion of thymocytes can occur in the cortex with no involvement of the medulla. J Exp Med. 205, 2575-2584 (2008).
  16. Stritesky, G. L., et al. Murine thymic selection quantified using a unique method to capture deleted T cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 4679-4684 (2013).
  17. Anderson, G., Jenkinson, E. J. Review article: thymus organ cultures and T-cell receptor repertoire development. Immunology. 100, 405-410 (2000).
  18. Hare, K. J., Jenkinson, E. J., Anderson, G. In vitro models of T cell development. Semin Immunol. 11, 3-12 (1999).
  19. de Pooter, R., Zuniga-Pflucker, J. C. T-cell potential and development in vitro: the OP9-DL1 approach. Curr Opin Immunol. 19, 163-168 (2007).
  20. Lian, Z., et al. Intrathymically injected hemopoietic stem cells can differentiate into all lineage cells in the thymus: differences between c-kit+ cells and c-kit < low cells. Stem Cells. 15, 430-436 (1997).
  21. Manna, S., Bhandoola, A. Intrathymic Injection. Methods Mol Biol. 1323, 203-209 (2016).
  22. Goldschneider, I., Komschlies, K. L., Greiner, D. L. Studies of thymocytopoiesis in rats and mice. I. Kinetics of appearance of thymocytes using a direct intrathymic adoptive transfer assay for thymocyte precursors. J Exp Med. 163, 1-17 (1986).
  23. Schmitt, T. M., Zuniga-Pflucker, J. C. Induction of T cell development from hematopoietic progenitor cells by delta-like-1 in vitro. Immunity. 17, 749-756 (2002).
  24. de Pooter, R. F., Schmitt, T. M., Zuniga-Pflucker, J. C. In vitro generation of T lymphocytes from embryonic stem cells. Methods Mol Biol. 330, 113-121 (2006).
  25. Dervovic, D. D., Ciofani, M., Kianizad, K., Zuniga-Pflucker, J. C. Comparative and functional evaluation of in vitro generated to ex vivo CD8 T cells. J Immunol. 189, 3411-3420 (2012).
  26. White, A., Jenkinson, E., Anderson, G. Reaggregate thymus cultures. J Vis Exp. (18), (2008).
  27. Anderson, G., Owen, J. J., Moore, N. C., Jenkinson, E. J. Thymic epithelial cells provide unique signals for positive selection of CD4+CD8+ thymocytes in vitro. J Exp Med. 179, 2027-2031 (1994).
  28. Anderson, G., Jenkinson, E. J. Fetal thymus organ culture. CSH Protoc. , (2007).
  29. Mazda, O., Watanabe, Y., Gyotoku, J., Katsura, Y. Requirement of dendritic cells and B cells in the clonal deletion of Mls-reactive T cells in the thymus. J Exp Med. 173, 539-547 (1991).
  30. Ceredig, R., Jenkinson, E. J., MacDonald, H. R., Owen, J. J. Development of cytolytic T lymphocyte precursors in organ-cultured mouse embryonic thymus rudiments. J Exp Med. 155, 617-622 (1982).
  31. Fairchild, P. J., Austyn, J. M. Developmental changes predispose the fetal thymus to positive selection of CD4+CD8 T cells. Immunology. 85, 292-298 (1995).
  32. Bhakta, N. R., Oh, D. Y., Lewis, R. S. Calcium oscillations regulate thymocyte motility during positive selection in the three-dimensional thymic environment. Nat Immunol. 6, 143-151 (2005).
  33. Le Borgne, M., et al. The impact of negative selection on thymocyte migration in the medulla. Nat Immunol. 10, 823-830 (2009).
  34. Ehrlich, L. I., Oh, D. Y., Weissman, I. L., Lewis, R. S. Differential contribution of chemotaxis and substrate restriction to segregation of immature and mature thymocytes. Immunity. 31, 986-998 (2009).
  35. Ueda, Y., et al. Mst1 regulates integrin-dependent thymocyte trafficking and antigen recognition in the thymus. Nat Commun. 3, 1098 (2012).
  36. Dzhagalov, I. L., Chen, K. G., Herzmark, P., Robey, E. A. Elimination of self-reactive T cells in the thymus: a timeline for negative selection. PLoS Biol. 11, e1001566 (2013).
  37. Halkias, J., et al. Opposing chemokine gradients control human thymocyte migration in situ. J Clin Invest. 123, 2131-2142 (2013).
  38. Au-Yeung, B. B., et al. Quantitative and temporal requirements revealed for Zap70 catalytic activity during T cell development. Nat Immunol. 15, 687-694 (2014).
  39. Melichar, H. J., Ross, J. O., Herzmark, P., Hogquist, K. A., Robey, E. A. Distinct temporal patterns of T cell receptor signaling during positive versus negative selection in situ. Sci Signal. 6, (2013).
  40. Hu, Q., Nicol, S. A., Suen, A. Y., Baldwin, T. A. Examination of thymic positive and negative selection by flow cytometry. J Vis Exp. (68), e4269 (2012).
  41. Mombaerts, P., et al. RAG-1-deficient mice have no mature B and T lymphocytes. Cell. 68, 869-877 (1992).
  42. Hogquist, K. A., et al. T cell receptor antagonist peptides induce positive selection. Cell. 76, 17-27 (1994).
  43. Weist, B. M., Kurd, N., Boussier, J., Chan, S. W., Robey, E. A. Thymic regulatory T cell niche size is dictated by limiting IL-2 from antigen-bearing dendritic cells and feedback competition. Nat Immunol. 16, 635-641 (2015).
  44. Melichar, H. J., Ross, J. O., Taylor, K. T., Robey, E. A. Stable interactions and sustained TCR signaling characterize thymocyte-thymocyte interactions that support negative selection. J Immunol. 194, 1057-1061 (2015).
  45. Hadjantonakis, A. K., Macmaster, S., Nagy, A. Embryonic stem cells and mice expressing different GFP variants for multiple non-invasive reporter usage within a single animal. BMC Biotechnol. 2, (2002).
  46. Schaefer, B. C., Schaefer, M. L., Kappler, J. W., Marrack, P., Kedl, R. M. Observation of antigen-dependent CD8+ T-cell/ dendritic cell interactions in vivo. Cell Immunol. 214, 110-122 (2001).

Tags

Immunologi tymiska skivor organkultur bräss positiv selektion negativ selektion T-cellutveckling.
Förberedelse och tillämpningar av Organotypic Thymic Slice kulturer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sood, A., Dong, M., Melichar, H. J.… More

Sood, A., Dong, M., Melichar, H. J. Preparation and Applications of Organotypic Thymic Slice Cultures. J. Vis. Exp. (114), e54355, doi:10.3791/54355 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter