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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Preparação e Aplicações de culturas organotípicas Tímico Fatia

Published: August 6, 2016 doi: 10.3791/54355
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 1,3
1Centre de Recherche, Hôpital Maisonneuve-Rosemont, 2Department of Microbiology, Infectiology and Immunology, Université de Montréal, 3Department of Medicine, Université de Montréal
* These authors contributed equally

Summary

Descreve-se a preparação de fatias do timo que, em combinação com a citometria de fluxo, podem ser utilizados para modelar selecção positiva e negativa do desenvolvimento de células T. Fatias do timo pode também ser adaptado para a análise in si tu de migração de timócitos, localização e a sinalização através de imunofluorescência e microscopia de dois fotões.

Abstract

Seleção rendimentos do timo em um microambiente tímico única e altamente organizada resultando na geração de um repertório de células T funcional, auto-tolerante. Modelos in vitro para estudar o compromisso linhagem T e desenvolvimento forneceram informações valiosas sobre este processo. No entanto, estes sistemas têm a meio do timo tridimensional completa necessária para o desenvolvimento da célula T e, por conseguinte, são aproximações incompletos in vivo de selecção tímica. Alguns dos desafios relacionados com o desenvolvimento de células T de modelagem pode ser superado usando em modelos in situ que fornecem um microambiente tímico intacta que apoia plenamente a seleção do timo de desenvolvimento de células T. Timo culturas fatia organotípicas complementar as técnicas in situ. fatias tímicos preservar a integridade das regiões corticais e medulares do timo e oferecer uma plataforma para estudar o desenvolvimento de timócitos sobrepostas de um estágio de desenvolvimento definidas ou de endógena T cells dentro de um microambiente tímico maduro. Dada a capacidade de gerar ~ 20 fatias por rato, fatias do timo apresentar uma vantagem única em termos de escalabilidade para experimentos de alto rendimento. Além disso, a relativa facilidade na geração de fatias do timo e potencial para sobrepor diferentes subconjuntos de timo ou de outras populações de células de diversas origens genéticas aumenta a versatilidade do presente método. Descrevemos aqui um protocolo para a preparação de fatias do timo, o isolamento e a sobreposição de timócitos, e dissociação de fatias do timo para a análise de citometria de fluxo. Este sistema também pode ser adaptado para estudar o desenvolvimento de células T não-convencionais, bem como visualizar a migração de timócitos, as interacções das células de timócitos-estromal, e sinais associados com TCR selecção tímica por microscopia de dois fotões.

Introduction

As células T diferenciam por meio de uma série de intermediários de desenvolvimento no timo durante o qual eles encontram vários pontos de controlo que asseguram a geração de, um repertório de células T auto-tolerante funcional 1-3. A selecção positiva promove a sobrevivência dos timócitos com receptores de células T (TCR), capazes de reconhecer, com baixa a moderada afinidade, péptido apresentados por moléculas de grandes complexos de histocompatibilidade (MHC) sobre as células epiteliais tímicas corticais (2,3 CTEC). Selecção negativa e desenvolvimento de células T reguladoras (T reg) contribuir para o estabelecimento da auto-tolerância através da eliminação ou desvio de timócitos que respondem fortemente a auto-peptídeo apresentado por MHC 2,4. Imaturos CD4 + CD8 + positivas dupla (DP) timócitos expressando TCRs que passam o processo de selecção diferenciam em subpopulações de células T maduras, a maioria dos quais são de classe I-restringida de MHC de células CD8 + citotóxicasou MHC de classe II restrito de células T CD4 + auxiliares individuais positivas (SP), antes de sair do timo para realizar as funções efectoras nos órgãos linfóides secundários 1-3.

Adicionando à complexidade do desenvolvimento de células T é a migração dinâmica e encontros celulares do desenvolvimento de timócitos em toda a rede celular de estroma 5-9. Estas células estromais desempenham papéis distintos no desenvolvimento de timócitos e são diferencialmente distribuídos entre as regiões corticais e medulares do timo, onde positivo e seleção negativa ocorrem 10. Embora a selecção positiva ocorre principalmente no córtex, não há acumulação de provas de que os timócitos DP migrar para a medula e continuar a exigir que os sinais de TCR, antes de se diferenciar em células T maduras, sugerindo que a medula pode fornecer sinais adicionais necessários para a realização de selecção positiva e linhagem 11,12 diferenciação. Mais distante,apesar da presença de células especializadas medulares do timo epiteliais (MTEC) que expressam e apresentam antigénios restrita a um tecido que facilitem a eliminação de timócitos autorreactivas 13,14, uma grande proporção de selecção negativa ocorre no córtex em resposta a expresso ubiquamente auto-péptido apresentado por dendrítica células 15,16. Assim, modelos precisos de desenvolvimento de células T deve proporcionar um microambiente tímico altamente organizada, com cortical intacta e regiões medulares, que facilita a interacção entre timócitos e células do estroma, e suporta a migração de timócitos como estas células sofrem de selecção positiva e negativa.

Para complementar ex vivo análises de timócitos como um meio de estudar a selecção positiva e negativa, um certo número de ensaios in vitro, in situ, e em modelos in vivo do desenvolvimento de células T têm sido desenvolvidos 17-22. Tem sido notoriamente difícil de recapitulara selecção positiva, in vitro, mas co-cultura de populações de células estaminais ou precursores de células T com células estromais que expressam ligando de Notch, nomeadamente OP9-DL1 / 4 células, tem a capacidade de suportar compromisso linhagem T e selecção positivo reduzido tornando-se um valor inestimável modelo in vitro para desenvolvimento de células T estudo 23-25. As limitações deste sistema, no entanto, incluem o facto de estas células não possuem a maquinaria de processamento de péptidos única encontrada nas células do estroma de timo e o microambiente tímico tridimensional.

Embora tecnicamente mais complicada, in situ e in vivo em modelos de selecção tímica pode superar alguns dos obstáculos relacionados com os sistemas in vitro. Culturas de órgãos tímicos Reaggregate (RTOC) contêm misturas de timócitos e de células do estroma de timo 18,26,27 definido. Estas células epiteliais tímicas reaggregates manter a MHC de classe I e II de expressão e pode suportar development de ambos os subconjuntos de células T convencionais, mas ainda não têm definido estruturas corticais e medulares. Fetal cultura de órgão tímico (FTOC) é um modelo popular de desenvolvimento de células T que pode ser semeada com timócitos via cultura de suspensão-gota de lóbulos do timo lymphodepleted ou por meio de injecção de timócitos em lymphoreplete lóbulos do timo e apoiar o desenvolvimento eficiente de células T CD4 + e CD8 + T células ao longo do tempo na cultura 18,28-31. No início da cultura de lobos do timo fetal há uma escassez de mTECs, mas as estruturas corticais e medulares definidos podem desenvolver ao longo do tempo, dependendo das condições. Uma consideração importante é que este modelo pode preferencialmente suportar fetal contra o desenvolvimento de células T do adulto. Finalmente, injeção intratímico de precursores do timo definidos em camundongos adultos é tecnicamente desafiador, mas claramente fornece um ambiente para apoiar Desenvolvimento de células T in vivo. Estes in situ e em modelos in vivo são excelentes ferramentas to desenvolvimento de células T estudo ea sua utilização deve ser considerada a título experimental de-by-experimento.

Fatias do timo, no entanto, surgiram recentemente como um modelo versátil, complementares para estudar a seleção do timo in situ com a possibilidade de acomodar única, complexa e experimentos de taxa de transferência, geralmente mais elevados. Fatias do timo manter a integridade das regiões corticais e medulares e fornecer um quadro de células estromais que suporta a migração de timócitos durante o desenvolvimento, bem como eficiente selecção positiva e negativa 11,32-39. Subconjuntos de timócitos adicionados no topo de fatias do timo migram para o tecido e seu nicho microambiental adequada 34,37. Os timócitos sobrepostas podem ser distinguidas das células endógenas fatia de timo através de marcadores cong�icas ou marcadores fluorescentes e podem ser mantidas em cultura durante vários dias. culturas organotípicas fatia do timo pode ser utilizado para estudar vários aspectosdo desenvolvimento de células T, incluindo selecção tímica, o comportamento de timócitos (migração e interacções celulares), e localização de timócitos, entre outros. Dada a capacidade de gerar ~ 20 fatias do timo por ratinho, a escalabilidade das experiências é geralmente maior do que o outro em modelos in situ de selecção tímica. Embora a preparação de fatias do timo requer equipamento especializado, tal como o vibratome, e o tempo de vida de fatias do timo em cultura é limitada devido à perda de células ao longo do tempo através de morte celular e a ausência de uma membrana de encapsulação, as fatias do timo fornecer um excelente modelo por análise de selecção tímica de populações sincronizadas de timócitos dentro de um microambiente tímico madura. Aqui, descrevemos a preparação de fatias do timo, incluindo a colheita (o timo, a incorporação de agarose de lóbulos do timo e vibratome seccionamento do tecido embebido), isolamento e revestimento dos timócitos, e dissociação de fatias do timo para a análise de citometria de fluxo.

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Protocol

Protocolos para todos os estudos com animais foram aprovados pelo Comitê de Terapia animal no Centro de recherche - Hôpital Maisonneuve-Rosemont.

1. colheita mouse Thymus para Preparação de tímicos Slices e suspensões de células individuais

  1. Eutanásia do rato com CO 2, seguida por deslocação cervical.
  2. Em uma capela de fluxo laminar, pin lado o rato ventral-se a uma placa de dissecação. Pulverizar o rato com 70% de etanol. Remova qualquer excesso de álcool, esfregando com uma gaze para evitar que o etanol de entrar na cavidade torácica e danificar o tecido.
  3. Levantar a pele na base do esterno com um par de pinças e fazer um corte através da pele. Estender o corte da pele para cima para cada membro anterior.
  4. Fazer um corte adicional na base do esterno para separar o diafragma da caixa torácica. Em seguida, corte cada lado da caixa torácica para a clavícula. Virar a caixa torácica na direção da cabeça expondo a cavidade torácica. Os dois lóbuloso timo se encontram na parte superior do coração.
  5. Remover o tecido conjuntivo em torno dos lobos do timo usando uma pinça, tesoura micro-dissecação, e / ou tesoura curva afiadas. Use um par de ponta curvada uma pinça fina para levantar os lobos individuais por baixo ou através do restante do tecido conjuntivo.
    Nota: Não segure o timo diretamente.
  6. Coloque os lóbulos do timo em um tubo cônico de 15 ml contendo PBS e reserve em gelo até ser necessário.

2. Agarose Embedding e Vibratome Corte do timo Lobes

  1. Preparar a solução de agarose a 4% para a incorporação dissolvendo 2 g de baixo ponto de fusão de agarose em 50 ml estéril PBS e microondas em um nível baixo até que a agarose se dissolva completamente. Cubra balão com folha de alumínio e coloque num banho de água a 55 ° C até que esteja pronto para uso.
  2. Num capuz de cultura de tecidos, preparar meio completo RPMI-1640 que contém soro fetal de bovino 10% (FBS), L-glutamina 4 mM, 1x penicilina / estreptomicina, e 10 uM2-mercaptoetanol.
  3. Adicionar 1,5 ml de meio RPMI-1640 completo por poço para uma placa de cultura celular de 6 poços e colocar uma inserção de cultura de células em cada poço. Definir o prato de lado numa incubadora a 37 ° C até ser necessário.
  4. Prepare um banho de água gelada lamacenta com água e gelo em um balde de gelo.
  5. Remova cuidadosamente todo o tecido conjuntivo permanecendo em torno de cada lóbulo do timo usando uma pinça de ponta fina. Fazer isto enquanto o lóbulo tímico é submersa em PBS numa placa de cultura de tecidos, depois de transferência para um lenço de papel embebido com PBS, ou sob um microscópio de dissecação.
  6. Permitir que a agarose arrefecer abaixo de 40 ° C, quando o balão é apenas a quente ao toque, para evitar o sobreaquecimento do tecido. Verter a arrefeceu-se 4% de agarose para um molde de tecido a uma altura de 1 cm ~.
  7. Use um par de fórceps para transferir cuidadosamente o lobo do timo a um lenço de papel e enrole-o delicadamente para secá-lo sem danificar o tecido. Certifique-se de que o tecido seque completamente ou ele vai deslizar para fora da agarose durante cortando.
  8. Cuidadosamente inserir o lóbulo em que a agarose e posicioná-lo horizontalmente, quer (para aumentar a área de superfície de cada fatia) ou verticalmente (para aumentar o número de fatias), na parte inferior do molde. Coloque o molde em água de gelo durante 5-10 minutos para permitir que a agarose solidificar.
  9. Durante este tempo, preparar vibratome para cortar através da montagem de tabuleiro de tampão, a montagem do disco de amostra, e inserir a lâmina vibratome. Coloque um pedaço de fita de laboratório sobre o disco de amostra. Esterilizar o espaço de trabalho limpo, montado com 70% de etanol.
  10. Uma vez que os solidifica de agarose, inverter o molde e pressione suavemente em seu centro para liberar a agarose incorporado lóbulo.
  11. Usar uma lâmina afiada para cortar o excesso de agarose em torno do lóbulo deixando ~ 2 mm de agarose em cada lado e ~ 0,5 cm na parte inferior.
  12. Fixe cada bloco de agarose com uma gota de cola de tecido para o pedaço de fita adesiva no disco de amostra. Vários blocos podem ser colados na fita.
  13. Alinhe o wi lâmina vibratomepo do topo do bloco de agarose. Encha a bandeja de tampão com PBS estéril até que o bloco (s) de lâmina e agarose são totalmente imersos.
  14. Secção do tecido de agarose incorporado para obter fatias com uma espessura de 400-500 um. Defina o vibratome a 0,225 mm / seg de velocidade, freqüência de 100 Hz e 5 ° ângulo.
  15. Usar uma espátula dobrada para recolher as fatias do timo em uma placa de cultura de tecido contendo PBS estéril à medida que são cortadas. Rejeitar a primeira e última fatia.
  16. Examine as fatias sob um microscópio de luz em uma ampliação de 4X. Escolha as fatias com tecido tímico intacta e em torno de agarose (Figura 1A).
  17. Transferir as fatias para a placa, preparado no passo 2.3, utilizando uma ponta de pipeta para deslizar suavemente a fatia timo da espátula dobrada sobre a inserção de cultura de célula. Cada inserção pode acomodar ~ 3 fatias. Certifique-se as fatias não se tocam ou as paredes da inserção de cultura de células.
  18. Manter a placa a 37 ° C até ser necessário.
  1. Isolar lóbulos do timo, tal como descrito na secção 1. dissociar os lóbulos manualmente para fazer uma suspensão de células individuais utilizando um triturador de tecido de 15 ml esterilizado cheia com 5 ml de PBS estéril contendo 2% de FBS. Transferir as células para um tubo cónico de 15 ml.
  2. Centrifugar as células a 545 xg durante 5 min a 4 ° C. Descartar o sobrenadante e ressuspender as células em 1 ml de tampão de lise 1x ACK (0,15 M NH 4 Cl, 10 mM de KHCO3, 0,1 mM Na2EDTA) à temperatura ambiente durante 3 min para lisar as células vermelhas do sangue.
  3. Encher o tubo para 15 ml com PBS contendo 2% de FBS. Centrifugar as células a 545 xg durante 5 min a 4 ° C.
  4. Ressuspender as células em 10 ml de PBS contendo 2% de FBS e passar as células através de um filtro de malha de 255? M.
  5. Contagem de células utilizando um hemocitómetro. Centrifugar as células a 545 xg durante 5 min a 4 ° C, e ressuspender a pelete de células em PBS contendo 2% de FBS, para uma concentrção de 1 x 10 7 células por ml.
  6. Marcar as células com corantes celulares, tais como o éster de succinimidilo carboxifluoresceína (CFSE) de acordo com os protocolos do fabricante, se não utilizando timócitos de ratinhos que expressam marcadores cong�icas ou repórteres fluorescentes geneticamente codificados para distinguir a partir de células endógenas fatia.
  7. Após a lavagem final das células marcadas, ressuspender o sedimento de células em meio RPMI-1640 completo a 1-3 x 10 6 culas por 15 ul.

4. Sobreposição de timócitos para o timo Slices

  1. Usar uma pipeta para aspirar qualquer líquido que rodeia as fatias do timo sobre a inserção.
    Nota: Tome cuidado para não danificar a agarose. Se a agarose é danificado, os timócitos sobrepostas não irá aderir à superfície da fatia devido a perda da tensão de superfície.
  2. Sem tocar na fatia com a ponta da pipeta, sobreposição de 15 ul de timócitos preparados na seção 3 para cada fatia do timo.
  3. Incubar as plate a 37 ° C durante 2 horas para permitir que as células migrem para as fatias do timo.
  4. Após 2 h, lavar as fatias do timo 3 vezes com 1 ml de PBS para remover o excesso de timócitos sobrepostas que ainda não migraram para o tecido.
  5. Incubar a placa a 37 ° C até que as fatias do timo estão prontas para ser colhidas, tipicamente 1-72 horas, dependendo da experiência.

5. A dissociação de tímicos Slices para citometria de fluxo

  1. Preparar um tubo de microcentrífuga para cada fatia através da adição de 150 uL de PBS contendo 2% de FBS.
  2. Adicionar 1 ml de PBS contendo 2% FBS para a inserção de cultura de tecido com as fatias do timo e agitar suavemente com uma espátula dobrada para separar as fatias a partir da superfície da inserção de cultura de célula.
  3. Transferir a fatia a partir da inserção para o tubo de microcentrífuga utilizando uma espátula dobrada.
  4. interromper manualmente a fatia usando um pilão microcentrifuge amostra de tubo. Adicionar 150 uL de PBS contendo 2% de FBS para um volume final de 300ul.
  5. Filtra-se o tecido dissociado através de um filtro de 40 um para um novo tubo de microcentrifugação. As células filtradas está pronto para ser corada para análise de citometria de fluxo 40.
  6. Filtrar as células uma segunda vez antes de passá-los num citómetro de fluxo para garantir que toda a agarose é removida e não entupir o citómetro de fluxo.
  7. Adquirir as células num citómetro de fluxo e análise de dados, como foi anteriormente descrito 40.

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Representative Results

análise de suporte fatias do timo dos diferentes aspectos do desenvolvimento de células T, tais como selecção positiva e negativa. Para as experiências bem sucedidas, a qualidade da fatia tímico é primordial. Deste modo, as fatias do timo deve ser examinado para assegurar a integridade do tecido tímico e que a agarose em torno do timo fatia está intacto (Figura 1A). A tensão superficial pode ser comprometida quando a agarose é danificado causando uma diminuição significativa no número de timócitos que migram para o tecido. Deste modo, as fatias do timo com indicações de danos nos tecidos ou entalhes / lágrimas em agarose deve ser descartado (Figura 1B).

transgénicos (tg) do TCR ratinhos são muitas vezes utilizados para estudar selecção tímica devido à expressão de um TCR definido, funcional na superfície de todos os timócitos que aumenta a frequência de selecção positiva sobre polycpopulações lonal. A fim de capturar cada fase de selecção positiva, de pré-selecção timócitos TCR TG pode ser sobreposto em cima de fatias do timo, e o desenvolvimento de maturidade, CD4 + ou células T CD8 + SP ao longo do tempo seguido por citometria de fluxo 40. Os timócitos isolados de MHC de classe I-restringida OT-I TCR TG RAG1 - / - p2m - / - ratos são presos na fase de DP antes da selecção tímica, devido à necessidade de p2m para associar com e estabilizar a MHC de classe I de cadeia pesada 41 , 42. Quando colocado sobre p2m - / - fatias do timo, timócitos a pré-selecção OT-I TCR tg permanecem na fase DP e não geram células significativas CD8 + SP T (Figura 2A, à esquerda). Em contraste, quando sobrepostos em fatias do timo WT contendo ligandos endógenos seleccionando, a capacidade de suportar este modelo para selecção positiva é evidenciado pelo desenvolvimento de células T CD8 + a 72 h (Figura 2A, à direita). Quantification do desenvolvimento de células T CD8 + como uma leitura de selecção positiva é mostrado na Figura 2B.

fatias do timo também pode ser utilizado para estudar a selecção negativa. Uma grande proporção de selecção negativa ocorre em resposta ao antigénio ubíqua 16. Para modelar a selecção negativa ao antigénio ubíqua, timócitos totais de OT-I TCR TG RAG1 - / - e murganhos de tipo natural (WT) foram marcadas com CFSE e CTV, respectivamente, em seguida, misturados numa proporção de 1: 1 e sobrepostos em fatias WT (Figura 3A). Depois de lavar off timócitos em excesso, as fatias do timo foram colocadas em meio RPMI-1640 completo com ou sem 1 nM do cognato, peptídeo agonista da OT-I TCR, SIINFEKL (peptídeo OVA). Todos os MHC de classe I expressando células irá apresentar o antigénio, modelando a apresentação de antigénio expresso ubiquamente no timo. Após 24 h de incubação a 37 ° C, a proporção de OT-I TCR TG CELLS (% vivo CFSE +) para células de controlo (WT% vivo CTV +) foi comparada por citometria de fluxo (Figura 3B). Uma diminuição na proporção relativa de células AT-I TCR TG representa eliminação de células IOT TCR TG em resposta ao péptido OVA.

É importante notar que, devido à heterogeneidade no tamanho das fatias do timo, bem como a entrada nas células em fatias do timo, deve-se incluir análise adequada e controlos internos para normalizar para estas variáveis. Aqui, as células WT misturadas com células OT-I TCR TG e sobrepostos no topo fatias foram usadas como um controlo interno, tal como esta população não deve ser significativamente afectada pela presença ou ausência de péptido OVA. A extensão da seleção negativa de células OTI TCR tg foi quantificada com base na percentagem em vez de números absolutos. Em primeiro lugar, a relação entre OT-I TCR TG (% vivo CFSE +) para células WT (vivos CTV +%) em cada fatia do timo WT na presença ou foi calculada ausência de péptido OVA. Cada um destes rácios, em seguida, foi dividida pela média da razão entre OT-I TCR TG (% CFSE vivo +) para células WT (% vivos CTV +) em fatias WT na ausência de péptido OVA. Em média, 80% das células AT-I TCR TG foram reduzidos em resposta ao antigénio ubíquo como representado na Figura 3C.

figura 1
Figura 1: Imagens representativas de fatias do timo preparadas a partir de um lóbulo do timo verticalmente incorporado. (A) A boa fatia de qualidade com o tecido incorporado e em torno de agarose intacta. (B) fatia de má qualidade com danos devido ao rasgo do tecido embebido durante a cortar. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

ove_content "fo: manter-together.within-page =" 1 "> Figura 2
Figura 2:. A análise de citometria de fluxo de selecção positiva em fatias do timo OT-I TCR TG RAG1 - / - p2m - / - timócitos foram marcadas com CFSE e sobrepostos não seleccionar p2m - / - ou seleccionando fatias WT. Após 72 h de incubação a 37 ° C, o desenvolvimento de células T CD8 + foi analisada por citometria de fluxo. (A) Os dados representativos de expressão de superfície celular CD4 e CD8 em CFSE + TCRβ vivo elevadas timócitos de p2m - / - e fatias WT. (B) Quantificação de + TCRβ desenvolvimento de células vivas CFSE alta T CD8 + em fatias WT, em comparação com controlos não seleccionar. Cada ponto representa uma fatia do timo individual e a linha representa a média. (*** P <0,001, teste t não pareado)ove.com/files/ftp_upload/54355/54355fig2large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3: Análise de citometria de fluxo de selecção negativa em fatias do timo A 1:. Uma proporção de um total de CFSE marcado com OT-I TCR TG RAG1 - / - e timócitos WT CTV-marcadas foram sobrepostos em fatias WT na presença ou ausência do péptido OVA, SIINFEKL. Após 24 h de incubação a 37 ° C, as proporções relativas de células sobrepostas foram analisadas por citometria de fluxo. (A) Um esquema da montagem experimental que mostra uma sobreposição de CTV-rotulados WT células (azul) misturado 1: 1 com células CFSE marcado com OT-I TCR TG (verde) para uma fatia do timo WT na presença ou ausência de péptido OVA. (B) Os dados representativos que descrevem a proporção da vivo CFSE + OT-ICélulas TCR células tg e CTV + WT de fatias que foram incubadas com ou sem peptídeo OVA. (C) Os dados foram normalizados entre fatias, ea proporção relativa de células CFSE ao vivo + OT-I TCR tg para viver células CTV + WT é mostrado. As barras de erro indicam o desvio padrão. N = 3 para cada condição. (* p <0,05, teste t não pareado). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Aqui nós descrevemos um protocolo para a preparação de fatias do timo e resultados representativos de selecção positiva e negativa eficiente da pré-selecção do coberto MHC classe restrita-I TCR timócitos transgênicas por citometria de fluxo. Este sistema tem sido utilizado com sucesso similar para suportar a selecção positiva de células MHC de classe II restringidas CD4 + T a partir de pré-selecção DP timócitos 32, e, na presença do antigénio com o agonista, a selecção negativa e do timo t desenvolvimento Reg 11,12, 36,38,39,43,44. Este protocolo pode ser modificado para estudar selecção tímica na presença ou ausência de inibidores, os péptidos definidos, bem como de timócitos geneticamente modificados ou populações de células do estroma. fatias do timo também são passíveis de a sobreposição de produtos que não subconjuntos de timócitos populações de células. Por exemplo, foi recentemente mostrado que as células dendríticas sobrepostas em fatias do timo migram para o tecido de forma eficiente e pode suportar selectio negativon e T reg desenvolvimento 39,43. Estudos até à data têm usado pré-selecção DP ou timócitos totais para estudar selecção positiva e negativa. Embora o desenvolvimento de células T pode prosseguir durante pelo menos 4 dias em fatias do timo, se estiver interessado em iniciar as experiências com uma população de células progenitoras anteriormente, deve ser tido em consideração que uma limitação deste sistema é que a qualidade das fatias do timo começa a declinar depois 1-2 dias em cultura, devido a morte celular e a falta de uma membrana de encapsulação.

O protocolo aqui descrito pode também ser utilizado para a geração de fatias de tecido de timo humano com modificações subtis. Antes de incorporar em agarose, tecido de timo humano deve ser cortado em fragmentos, aproximadamente o tamanho de um timo lóbulo de ratinho adulto. Notavelmente, as amostras do timo humanas são ricos em tecido conjuntivo, e, em relação ao timo murino, que é mais difícil de preparar fatias de boa qualidade. Em nossa experiência, fetal, em vez de humana neonataltecido do timo é mais propício para a preparação fatia. Tem sido demonstrado que os subconjuntos de timócitos humanos localizar correctamente em ambas as fatias do timo humano e de ratinho 37. selecção tímica de subconjuntos de timócitos humanos sobrepostos, no entanto, ainda não foi relatada no modelo da fatia tímico. A eficiência da selecção positiva de uma população policlonal é baixo, e devido à baixa proporção (~ 0,5-2%) de timócitos sobreposta em fatia do timo, pode ser difícil avaliar tais pequenos números de células seleccionadas positivamente. Pode ser viável para introduzir um transgene humano de TCR em células progenitoras de células T humanas anteriores para sobrepor em fatias do timo humano para aumentar a eficiência de selecção positiva. Isso também não exclui a possibilidade de a monitorização das alterações em populações de células T endógenas na presença ou ausência de péptidos exógenos ou de outras populações de células e os inibidores de sinais de TCR, entre outros.

Este protocolo pode também ser adApted para a visualização de migração de timócitos, sinais de TCR, e interacções celulares 12,32-38. Até recentemente, a maioria dos estudos sobre o comportamento timócitos in situ têm sido limitados ao córtex como a medula tem uma localização central no timo, um pouco além do limite de detecção por microscopia de dois fótons. Em contraste, as fatias do timo fornecer a vantagem única em que as fatias têm regiões corticais e medulares do timo intactas e a superfície da fatia permite o acesso directo à medula pela imagem de dois fótons. Além disso, as fatias sobrepostas do timo com as células marcadas com corantes indicadores de cálcio tais como indol pode ser utilizado para monitorizar sinais de TCR, utilizando os níveis de cálcio citosólico como um indicador de TCR sinais associados com selecção positiva e negativa por microscopia de dois fotões 11,32,36, 38,39,44. Para preparar as amostras para microscopia, as fatias podem ser usadas directamente após a etapa 4.5 do protocolo. Neste caso, o cuidado deve ser tomado para escolher marcadores fluorescentes adequados suITable para a imagem latente.

Culturas fatia de órgãos do timo são uma excelente ferramenta para estudar vários aspectos do mouse e desenvolvimento de células T humanas in situ. No entanto, a aplicação bem sucedida desta técnica requer uma atenção especial aos passos críticos no protocolo. Para maximizar o número de cortes do timo obtidos para as experiências de alto rendimento, a idade do rato usado deve ser tomado em consideração que o tamanho das alterações do timo durante todo o tempo de vida do ratinho. Normalmente usamos ratos velhos 4-8 semana que geram ~ 20 fatias do timo por rato. No entanto, os ratinhos fetais, neonatais ou mais timos podem, teoricamente, ser usado para gerar um número limitado de fatias, dependendo das necessidades experimentais do utilizador. Para obter fatias de boa qualidade, é fundamental para remover todo o tecido conjuntivo que envolve os lóbulos do timo antes da inclusão em agarose. Restante tecido conjuntivo não é eficientemente cortado pela lâmina vibratome durante o corte e pode danificar o timolobos e fatias resultante. A maior parte do tecido conjuntivo deve ser removido durante a colheita do timo (passo 1.5) e permite que os lóbulos de ser removidos da cavidade torácica sem manipulação significativa do próprio tecido. Após isolar os lobos, remova cuidadosamente qualquer tecido conjuntivo residual conforme descrito no passo 2.5. Além disso, a manutenção da integridade da agarose em torno do tecido embebido é imperativo para sobrepor timócitos eficazmente na superfície da fatia. Assim, é crítico para inspeccionar tanto a fatia timo e a agarose circundante ao escolher as fatias do timo para uso na experiência. O vibratome está tipicamente localizado no exterior da capa de cultura de tecido, aumentando o risco potencial de contaminação. Limpar o vibratome exaustivamente entre experimentos e pulverizar a área de trabalho e vibratome com etanol 70% antes do corte pode limitar o potencial de contaminação. É também importante a utilização de PBS estéril para passos 2.13 e 2.15 como mencionado no protocolo. Finalmente, é também crucial para distinguir timócitos sobrepostas que migram para o tecido a partir das células que são endógenas para o timo. Isto pode ser conseguido por marcação das células do coberto com corantes fluorescentes, como mencionado no passo 3.7. Alternativamente, timócitos de ratinhos que expressam marcadores cong�icas ou repórteres fluorescentes geneticamente codificados podem ser usadas 45,46. Em geral, no entanto, as fatias do timo são fáceis de manipular e pode ser adaptado para as necessidades experimentais específicos do utilizador, que suportam uma ampla aplicabilidade que apenas começou a ser explorado.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Vibratome Leica Biosystems VT1000S 
NuSieve GTG Agarose Lonza 50080 Low melting temperature agarose
Embedding Mold (Truncated - T12) Polyciences 18986 22 mm x 22 mm square, truncated to 12 mm x 12 mm
Double Edge Prep Blades Personna 74-0002
Tissue Adhesive 3M  1469SB
0.4 µm Cell Culture Inserts  BD Falcon 353090 Of several brands tested, these maintained the cells atop the slices the best
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline ThermoFisher 21600-010
RPMI-1640 with L-glutamine Wisent 350-000-CL
Fetal Bovine Serum Wisent 080-110 Heat inactivated
L-Glutamine, 200 mM Wisent 609-065-EL
Penicillin/Streptomycin, 100x Wisent 450-201-EL
2-Mercaptoethanol Alfa Aesar A15890
15 ml Tenbroeck Tissue Grinders Wheaton 357426
Nylon Mesh Filter Component Supply U-CMN-255
Microcentrifuge Tube Sample Pestle Bel-Art F19922-0000
40 µm Nylon Cell Strainer BD Falcon 352340
Forceps Inox Tip Dumont  RS-5047 Fine tip curved forceps, size .17 x .10 mm
Micro Forceps Dumont  RS-5090 

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Sood, A., Dong, M., Melichar, H. J. Preparation and Applications of Organotypic Thymic Slice Cultures. J. Vis. Exp. (114), e54355, doi:10.3791/54355 (2016).

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