Summary
Descriviamo la preparazione di fette timici che, in combinazione con la citometria di flusso, possono essere utilizzate per modellare selezione positiva e negativa di sviluppare cellule T. Fette timo possono anche essere adattati per l'analisi in situ della migrazione thymocyte, localizzazione, e la segnalazione tramite immunofluorescenza e microscopia a due fotoni.
Abstract
Timici procede selezione in un microambiente timico unico e altamente organizzata conseguente generazione di un auto-tolerant repertorio cellule T funzionali. Modelli in vitro per lo studio T lineage impegno e sviluppo hanno fornito informazioni preziose questo processo. Tuttavia, questi sistemi hanno la completa ambiente timica tridimensionale necessario per lo sviluppo delle cellule T e, quindi, sono approssimazioni incompleti di selezione timica in vivo. Alcune delle sfide legate allo sviluppo delle cellule T modellazione possono essere superate usando in modelli in situ che forniscono un microambiente del timo intatto che supporta pienamente la selezione timica di sviluppare cellule T. Timo culture fetta organotipica completano esistenti nelle tecniche in situ. fette timo preservare l'integrità delle regioni corticali e midollari del timo e forniscono una piattaforma per studiare lo sviluppo dei timociti sovrapposti di una fase di sviluppo definito o di endogena T cells all'interno di un microambiente del timo maturo. Data la capacità di generare ~ 20 fette al mouse, fette del timo presentano un vantaggio unico in termini di scalabilità per gli esperimenti ad alto rendimento. Inoltre, la relativa facilità nel generare le fette del timo e potenzialmente in grado di sovrapporre diversi sottoinsiemi del timo o altre popolazioni di cellule provenienti da diversi background genetici aumenta la versatilità di questo metodo. Qui si descrive un protocollo per la preparazione di fette del timo, l'isolamento e la sovrapposizione dei timociti, e la dissociazione di fette del timo per l'analisi di citometria di flusso. Questo sistema può anche essere adattato per studiare lo sviluppo delle cellule T non convenzionale e visualizzarne migrazione timociti, interazioni cellula-timociti stromali, e segnali TCR associati selezione timica mediante microscopia a due fotoni.
Introduction
Cellule T differenziano attraverso una serie di intermedi di sviluppo nel timo durante i quali incontrano diversi controlli che assicurano la generazione di un funzionali, self-tolerant repertorio cellule T 1-3. Selezione positiva favorisce la sopravvivenza dei timociti con i recettori delle cellule T (TCR) in grado di riconoscere, con una bassa a moderata affinità, peptide presentati da grandi molecole complesse di istocompatibilità (MHC) sulle cellule epiteliali del timo corticali (CTEC) 2,3. Selezione negativa e lo sviluppo delle cellule T regolatorie (T reg) contribuiscono alla creazione di auto-tolleranza attraverso l'eliminazione o la distrazione dei timociti che rispondono con forza di auto-peptide presentato da MHC 2,4. Immaturo CD4 + CD8 + doppio positivo (DP) timociti che esprimono TCR che passano il processo di selezione si differenziano in sottopopolazioni di cellule T mature, la maggior parte dei quali sono di classe I-restricted MHC citotossici CD8 +o MHC di classe II-ristretta singole cellule CD4 + helper positivi (SP) T, prima di uscire il timo per eseguire funzioni effettrici negli organi linfoidi secondari 1-3.
Aggiungendo alla complessità dello sviluppo delle cellule T è la migrazione dinamica e incontri cellulari di sviluppare timociti tutta la rete cellule stromali 5-9. Queste cellule stromali svolgono ruoli distinti nello sviluppo timocita e sono distribuiti in modo differenziale tra le regioni corticali e midollari timo dove positivo e selezione negativa si verificano 10. Anche se la selezione positiva si svolge principalmente nella corteccia, c'è accumulando prove che timociti DP migrano verso il midollo e continuano a richiedere i segnali TCR prima che si differenziano in cellule T mature che suggeriscono che il midollo può fornire segnali aggiuntivi necessari per il completamento della selezione positiva e lignaggio differenziazione 11,12. Ulteriore,nonostante la presenza di cellule specializzate midollari timiche epiteliali (MTEC) che esprimono e presentare gli antigeni tissutali-ristretto che facilitano l'eliminazione dei timociti autoreattivi 13,14, una grande percentuale di selezione negativa si verifica nella corteccia in risposta a espressa ubiquitariamente auto-peptide presentato da dendritiche cellule 15,16. Così, modelli accurati di sviluppo delle cellule T devono fornire un microambiente timico altamente organizzato, con corticale intatta e regioni midollari, che facilita l'interazione tra i timociti e cellule stromali, e supporta la migrazione thymocyte come queste cellule subiscono selezione positiva e negativa.
Per completare ex vivo analisi dei timociti come mezzo per studiare selezione positiva e negativa, un certo numero di in vitro, in situ, e in modelli in vivo di sviluppo delle cellule T sono stati sviluppati 17-22. E 'stato notoriamente difficile ricapitolareselezione positiva in vitro, ma co-coltura di popolazioni di cellule staminali o precursori delle cellule T con cellule stromali che esprimono Notch ligando, in particolare OP9-DL1 / 4 celle, ha la capacità di supportare T lignaggio impegno e la selezione positiva limitata che lo rende un prezioso modello in vitro per studio sullo sviluppo delle cellule T 23-25. Le limitazioni di questo sistema, tuttavia, includono il fatto che queste cellule hanno la macchine di trasformazione peptide unico trovato nelle cellule stromali del timo e il microambiente timico tridimensionale.
Anche se più tecnicamente ingombrante, in situ e in modelli in vivo di selezione timica può superare alcune delle barriere relative a sistemi in vitro. Reaggregate colture d'organo timo (RTOC) contengono miscele di timociti e cellule stromali del timo 18,26,27 definiti. Questi reaggregates cellule epiteliali del timo mantengono MHC di classe I e II espressione e in grado di supportare SVILUPPOnt di entrambi i sottogruppi di cellule T convenzionali, ma mancano ancora definite strutture corticali e midollari. Fetale cultura organo timica (FTOC) è un modello popolare di sviluppo delle cellule T che possono essere testa di serie con timociti attraverso la cultura impiccagione-drop dei lobi timici lymphodepleted o tramite iniezione di timociti in lymphoreplete lobi del timo e sostenere lo sviluppo efficiente di CD4 + e CD8 + cellule nel tempo nella cultura 18,28-31. Al l'inizio della cultura di lobi del timo fetale vi è una scarsità di mTECs, ma strutture corticali e midollari definiti può svilupparsi nel tempo a seconda delle condizioni. Una considerazione importante è che questo modello può preferenzialmente sostenere fetale contro lo sviluppo delle cellule T degli adulti. Infine, l'iniezione intratimica di precursori timici definiti in topi adulti è tecnicamente impegnativo, ma offre chiaramente un ambiente per sostenere Sviluppo delle cellule T in vivo. Questi in situ e in modelli in vivo sono ottimi strumenti to lo sviluppo delle cellule T di studio e il loro utilizzo devono essere considerati a titolo sperimentale-by-esperimento.
Fette timo, tuttavia, hanno recentemente emersi come un modello complementare versatile per studiare selezione timica in situ con la possibilità di ospitare unica, complessa, e gli esperimenti di throughput generalmente superiori. Fette timo mantengono l'integrità delle regioni corticali e midollari e forniscono un quadro di cellule stromali che supporta la migrazione thymocyte durante lo sviluppo, così come la selezione positiva e negativa efficiente 11,32-39. Sottoinsiemi thymocyte aggiunti in cima a fette timo migrano nel tessuto e alla loro appropriata nicchia microambientali 34,37. I timociti sovrapposti possono essere distinte dalle cellule endogene fetta del timo tramite marcatori congenic o etichette fluorescenti e possono essere mantenute in coltura per diversi giorni. culture timica fetta organotipica possono essere utilizzati per studiare i vari aspettidello sviluppo delle cellule T compresa la selezione del timo, il comportamento timociti (migrazione e interazioni cellulari), e la localizzazione thymocyte, tra gli altri. Data la capacità di generare ~ 20 fette del timo per il mouse, la scalabilità degli esperimenti è generalmente maggiore rispetto ad altri modelli in situ di selezione del timo. Sebbene la preparazione di fette timici richiede attrezzature specializzate, quali vibratome, e il tempo di vita di fette timici in coltura è limitata a causa della perdita di cellule nel tempo con morte cellulare e la mancanza di una membrana incapsulante, fette timici forniscono un eccellente modello per l'analisi di selezione del timo delle popolazioni sincronizzate di timociti all'interno di un microambiente timica maturo. Qui si descrive la preparazione di fette timici (compresa la raccolta il timo, l'incorporamento agarosio di lobi timo e vibratome sezionamento del tessuto incorporato), l'isolamento e la sovrapposizione di timociti, e la dissociazione di fette del timo per l'analisi di citometria di flusso.
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Protocol
I protocolli per tutti gli studi sugli animali sono stati approvati dal Comitato di cura degli animali presso il Centre de recherche - Hôpital Maisonneuve-Rosemont.
1. La raccolta del mouse Thymus per la preparazione di del timo fette e sospensioni singola cella
- Euthanize il mouse con CO 2 seguita da dislocazione cervicale.
- In una cappa a flusso laminare, pin lato ventrale del mouse fino ad una tavola di dissezione. Spruzzare il mouse con il 70% di etanolo. Rimuovere l'eventuale eccesso di alcol tamponando con una garza per evitare che l'etanolo di entrare nella cavità toracica e danneggiare il tessuto.
- Sollevare la pelle alla base dello sterno, con un paio di pinze e fare un taglio attraverso la pelle. Estendere il taglio della pelle verso l'alto per ogni zampa anteriore.
- Effettuare un ulteriore taglio alla base dello sterno per separare la membrana dalla gabbia toracica. Poi tagliare ogni lato della gabbia toracica verso la clavicola. Vibrazione della gabbia toracica sopra verso la testa esponendo la cavità toracica. I due lobiIl timo giacciono sopra il cuore.
- Rimuovere il tessuto connettivo intorno ai lobi timici con pinze, forbici micro-dissezione, e / o forbici curve affilate. Utilizzare un paio di belle punta ricurva pinze per sollevare i singoli lobi da sotto o via restante tessuto connettivo.
Nota: Non afferrare direttamente il timo. - Posizionare i lobi del timo in un tubo da 15 ml contenente PBS e mettere da parte in ghiaccio fino al momento dell'uso.
2. Agarosio Embedding e Vibratome Affettatura di lobi del timo
- Preparare 4% soluzione di agarosio per l'incorporamento sciogliendo 2 g basso punto di fusione agarosio in 50 ml di PBS sterile e microonde su un livello basso fino alla agarosio completa dissoluzione. Coprire matraccio con foglio di alluminio e posto in un bagno di acqua a 55 ° C fino al momento dell'uso.
- In una cappa di coltura di tessuti, preparare supporti completi RPMI-1640 che contiene il 10% di siero fetale bovino (FBS), 4 mM L glutammina, 1x penicillina / streptomicina e 10 micron2-mercaptoetanolo.
- Aggiungere 1,5 ml completo dei media RPMI-1640 per pozzetto di una piastra di coltura cellulare 6-bene e posizionare un inserto di coltura cellulare in ciascun pozzetto. Impostare la piastra da parte in un incubatore a 37 ° C fino al momento dell'uso.
- Preparare un bagno di acqua ghiacciata fangosa con acqua e ghiaccio in un secchio di ghiaccio.
- Rimuovere con attenzione tutti i restanti tessuto connettivo circostante ogni lobo del timo con pinze punta fine. Fare questo mentre il lobo timica è immerso in PBS in un piatto di coltura di tessuti, dopo il trasferimento su un fazzoletto di carta imbevuto wipe con PBS, o sotto un microscopio da dissezione.
- Lasciare che il agarosio raffreddare sotto i 40 ° C, quando il pallone è solo caldo al tatto, per evitare il surriscaldamento dei tessuti. Versare il raffreddato 4% agarosio in uno stampo tessuto ad un'altezza di ~ 1 cm.
- Utilizzare un paio di pinze per trasferire accuratamente il lobo timica ad un tessuto pulire e rotolare delicatamente per asciugare senza danneggiare il tessuto. Assicurarsi che il tessuto si asciuga completamente o sarà scivolare fuori dal agarosio durante affettatura.
- Inserire delicatamente il lobo in agarosio e posizionarlo orizzontalmente (per aumentare la superficie di ogni fetta) o verticalmente (per aumentare il numero di fette) nella parte inferiore dello stampo. Mettere lo stampo in acqua ghiacciata per 5-10 minuti per consentire l'agarosio solidificare.
- Durante questo tempo, preparare il vibratome affettare montando la vasca del buffer, il montaggio del disco di preparato, ed inserendo la lama vibratome. Posizionare un pezzo di nastro laboratorio su disco di preparato. Sterilizzare il pulito, spazio di lavoro assemblato con il 70% di etanolo.
- Una volta che i solidifica agarosio, capovolgere lo stampo e premere delicatamente al centro per liberare l'agarosio incorporato lobo.
- Utilizzare una lama tagliente per tagliare l'eccesso di agarosio che circonda il lobo lasciando ~ 2 mm agarosio su ogni lato e ~ 0,5 cm nella parte inferiore.
- Fissare ogni blocco di agarosio con una goccia di colla tessuto al pezzo di nastro sul disco dei campioni. blocchi multipli possono essere incollati sul nastro.
- Allineare la lama wi vibratometh la parte superiore del blocco di agarosio. Riempire la vaschetta del buffer con PBS sterile fino a quando il blocco (s) lama e agarosio sono completamente immersi.
- Sezione tessuto agarosio incorporato per ottenere fette di spessore di 400-500 micron. Impostare la vibratome di 0,225 millimetri / sec di velocità, 100 Hz, e 5 °.
- Utilizzare una spatola piegata per raccogliere le fette di timo in una piastra di coltura tissutale contenente PBS sterile in quanto sono tagliati. Scartare la prima e l'ultima fetta.
- Esaminare le fette sotto un microscopio ottico a 4X ingrandimento. Scegliere le fette con il tessuto del timo intatto e dintorni agarosio (Figura 1A).
- Trasferire le fettine al piatto preparato al punto 2.3 utilizzando un puntale di scivolare delicatamente la fetta timica dalla spatola piegata sul inserto coltura cellulare. Ogni inserto può ospitare ~ 3 fette. Assicurarsi che le fette non si tocchino tra loro o le pareti inserto di coltura cellulare.
- Mantenere la piastra a 37 ° C fino al momento dell'uso.
- Isolare lobi timici come descritto nella sezione 1. Dissociare manualmente i lobi per fare una sospensione di cellule singole usando una sterilizzato smerigliatrice 15 ml tessuto riempito con 5 ml di PBS sterile contenente 2% FBS. Trasferire le cellule in una provetta conica da 15 ml.
- Centrifugare le cellule a 545 xg per 5 minuti a 4 ° C. Eliminare il supernatante e risospendere le cellule in 1 ml di tampone di lisi ACK 1x (0,15 M NH 4 Cl, 10 mM KHCO 3, 0.1 mM Na 2 EDTA) a temperatura ambiente per 3 minuti per lisare i globuli rossi.
- Riempire il tubo 15 ml con PBS contenente 2% FBS. Centrifugare le cellule a 545 xg per 5 minuti a 4 ° C.
- Risospendere le cellule in 10 ml di PBS contenente 2% FBS e superare cellule attraverso un filtro a rete 255 micron.
- Contare le cellule utilizzando un emocitometro. Centrifugare le cellule a 545 xg per 5 minuti a 4 ° C e risospendere il pellet cellulare in PBS contenente 2% FBS in un Conczione di 1 x 10 7 cellule per ml.
- Etichettare le cellule con coloranti cellulari come carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) secondo i protocolli del produttore se non si utilizza timociti da topi che esprimono i marcatori congenic o giornalisti fluorescenti geneticamente codificate da distinguere da cellule endogene fetta.
- Dopo l'ultimo lavaggio delle cellule marcate, risospendere il pellet cellulare in mezzi RPMI-1640 completi a 1-3 x 10 6 cellule per 15 microlitri.
4. Sovrapposizione Timociti sul timica Fette
- Utilizzare una pipetta per aspirare il liquido che circonda le fette timo sull'inserto.
Nota: Fare attenzione a non danneggiare l'agarosio. Se l'agarosio è danneggiata, i timociti sovrapposti non attaccarsi alla superficie fetta causa della perdita di tensione superficiale. - Senza toccare la fetta con la punta della pipetta, sovrapposizione di 15 ml di timociti preparati nella sezione 3 su ogni fetta del timo.
- Incubare le PLAte a 37 ° C per 2 ore per permettere alle cellule di migrare nelle fette timici.
- Dopo 2 ore, risciacquare le fette timici 3 volte con 1 ml di PBS per rimuovere i timociti sovrapposti eccesso che non hanno ancora migrato nel tessuto.
- Incubare la piastra a 37 ° C fino a quando le fette timici sono pronti per essere raccolti, tipicamente 1-72 ore a seconda dell'esperimento.
5. La dissociazione di fette del timo per Citometria a Flusso
- Preparare una provetta per ogni fetta con l'aggiunta di 150 ml di PBS contenente 2% FBS.
- Aggiungere 1 ml di PBS contenente 2% FBS all'inserto coltura tissutale con le fette timici e mescolare delicatamente con una spatola piegata per staccare le fette dalla superficie dell'inserto coltura cellulare.
- Trasferire la fetta da l'inserto alla provetta con una spatola piegata.
- interrompere manualmente la fetta con un pestello microcentrifuga campione del tubo. Aggiungere 150 pl di PBS contenente 2% FBS ad un volume finale di 300ul.
- Filtrare il tessuto dissociato attraverso un filtro 40 micron in una nuova provetta. Le cellule filtrati sono pronte per essere macchiato per l'analisi di citometria di flusso 40.
- Filtrare celle una seconda volta prima di passarli su un citofluorimetro per assicurare che tutto l'agarosio viene rimosso e non ostruire il citometro a flusso.
- Acquisire le cellule su un citometro a flusso e analizzare i dati come è stato descritto in precedenza 40.
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Representative Results
Timica analisi supporto fette di diversi aspetti dello sviluppo delle cellule T come la selezione positiva e negativa. Per gli esperimenti di successo, la qualità della fetta timica è fondamentale. Così, fette timici dovrebbero essere esaminati per garantire l'integrità del tessuto timico e che l'agarosio che circonda la fetta timica è intatto (Figura 1A). La tensione superficiale può essere compromessa quando l'agarosio è danneggiato causando una significativa diminuzione del numero dei timociti che migrano nel tessuto. Così, fette timici con indicazioni di danni ai tessuti o nick / lacrime nella agarosio dovrebbero essere eliminati (Figura 1B).
TCR transgenico (tg) topi sono spesso impiegati per studiare selezione timica causa dell'espressione di un definito, TCR funzionale sulla superficie di ogni thymocyte che aumenta la frequenza di selezione positiva sopra Polycpopolazioni lonal. Al fine di cogliere ogni fase di selezione positiva, pre-selezione TCR tg timociti possono essere sovrapposti in cima a fette timo, e lo sviluppo di una matura, CD4 + o cellule CD8 + T SP seguiti nel tempo mediante citometria di flusso 40. Timociti isolati da MHC di classe I-limitai OT-I TCR tg Rag1 - / - β2m - / - topi vengono arrestati nella fase DP prima della selezione timica causa della necessità di β2m da associare e stabilizzare il MHC di classe I catena pesante 41 , 42. Quando sovrapposto su β2m - / - fette del timo, la preselezione OT-I TCR tg timociti rimangono nella fase DP e non generano significativi cellule CD8 + T SP (Figura 2a, a sinistra). Al contrario, quando sovrapposti su fette timici WT contenenti endogeni selezionando ligandi, la capacità di questo modello per supportare selezione positiva è dimostrato dallo sviluppo di cellule T CD8 + a 72 ore (Figura 2A, destra). Quantification dello sviluppo delle cellule T CD8 + come lettura di selezione positiva è mostrata nella Figura 2B.
fette del timo possono anche essere utilizzati per studiare selezione negativa. Una grande percentuale di selezione negativa si verifica in risposta ad antigeni onnipresente 16. Per modellare selezione negativa all'antigene onnipresente, timociti totale di OT-I TCR tg Rag1 - / - e wild-type (WT) i topi sono stati etichettati con CFSE e CTV rispettivamente, poi mescolati in un rapporto 1: 1 e sovrapposto su fette WT (Figura 3A). Dopo aver lavato via timociti in eccesso, le fette del timo sono stati collocati nei media RPMI-1640 completi con o senza 1 nM del cognate, agonista peptidico della OT-I TCR, SIINFEKL (OVA peptide). Tutto MHC di classe I cellule esprimenti presenta l'antigene, modellando la presentazione dell'antigene ubiquitariamente espressa nel timo. Dopo 24 h di incubazione a 37 ° C, la percentuale di OT-I TCR tg cells (% vive CFSE +) a cellule di controllo WT (% vive CTV +) è stato confrontato con citometria di flusso (Figura 3B). Una diminuzione della proporzione relativa di cellule OT-I TCR tg rappresenta soppressione di cellule OTI TCR tg in risposta a OVA peptide.
È importante notare che a causa di eterogeneità delle dimensioni delle fette timici e di cella a fette timici, si dovrebbe comprendere opportune analisi e controlli interni per normalizzare per queste variabili. Qui, le cellule WT mescolati con cellule OT-I TCR tg e sovrapposti cima fette sono stati usati come controllo interno da questa popolazione non dovrebbe essere significativamente influenzata dalla presenza o assenza di OVA peptide. L'entità della selezione negativa di cellule OTI TCR tg è stato quantificato sulla base di proporzioni piuttosto che numeri assoluti. Innanzitutto, il rapporto tra OT-I TCR tg (% vivo CFSE +) per WT (vivi% CTV +) celle su ogni fetta timica WT in presenza o assenza di OVA peptide è stato calcolato. Ciascuno di questi rapporti è stato poi diviso per il valore medio del rapporto tra OT-I TCR tg (% CFSE vivo +) per WT (vivi% CTV +) cellule su fette WT in assenza di OVA peptide. In media, 80% di cellule OT-I TCR tg sono esaurite in risposta all'antigene onnipresente come illustrato in Figura 3C.
Figura 1: Immagini rappresentative della fette timici preparati da un lobo del timo verticale incorporato. (A) fetta di buona qualità con il tessuto circostante incorporato e agarosio intatto. (B) fetta di qualità scadente con danni dovuti alla lacerazione del tessuto incorporato durante affettare. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2:. Citometria di flusso di selezione positiva a fette timo OT-I TCR tg Rag1 - / - β2m - / - timociti sono stati etichettati con CFSE e sovrapposti sul non-selezionando β2m - / - o selezionando fette WT. Dopo 72 ore di incubazione a 37 ° C, lo sviluppo delle cellule T CD8 + è stata analizzata mediante citometria a flusso. (A) i dati rappresentativi di superficie delle cellule CD4 e CD8 espressione sul CFSE dal vivo + TCRβ alti timociti da β2m - / - e fette WT. (B) Quantificazione dei CFSE + TCRβ alto sviluppo dal vivo delle cellule T CD8 + su fette WT rispetto ai controlli non-scelta. Ogni punto rappresenta una fetta del timo individuale e la linea rappresenta la media. (*** P <0.001, spaiato test t)ove.com/files/ftp_upload/54355/54355fig2large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3: analisi citofluorimetrica della selezione negativa in fette timici A 1:. 1 rapporto di totale CFSE marcato OT-I TCR tg Rag1 - / - e timociti WT CTV-marcati sono stati sovrapposti su fette WT in presenza o assenza del OVA peptide, SIINFEKL. Dopo 24 h di incubazione a 37 ° C, le proporzioni relative di cellule sovrapposte sono state analizzate mediante citometria di flusso. (A) Uno schema del set-up sperimentale che mostra una sovrapposizione di CTV marcato WT cellule (blu) mescolato 1: 1 con le cellule CFSE marcato OT-I TCR tg (verde) su una fetta timica WT in presenza o assenza di OVA peptide. (B) i dati rappresentativi che descrivono la percentuale di vivere CFSE + OT-ICellule TCR cellule TG e CTV + WT da fette che sono state incubate con o senza OVA peptide. (C) I dati sono stati normalizzati tra le fette, e viene mostrato il rapporto relativo di cellule CFSE dal vivo + OT-I TCR tg per vivere cellule CTV + WT. Le barre di errore indicano la deviazione standard. N = 3 per ogni condizione. (* p <0,05, test t spaiato). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Qui si descrive un protocollo per la preparazione di fette del timo e risultati rappresentativi di selezione positiva e negativa efficiente di sovrapposizione di preselezione MHC di classe I-limitato TCR timociti transgeniche di citometria a flusso. Questo sistema è stato utilizzato con successo simile per supportare selezione positiva di cellule MHC di classe II-ristrette T CD4 + di preselezione timociti DP 32, e, in presenza di agonisti antigene selezione negativa e thymic T sviluppo reg 11,12, 36,38,39,43,44. Questo protocollo può essere modificato per studiare selezione timica in presenza o assenza di inibitori, peptidi definiti, nonché dei timociti geneticamente modificati o popolazioni di cellule stromali. fette timo sono anche suscettibili di sovrapposizione di popolazioni cellulari diversi sottoinsiemi thymocyte. Ad esempio, è stato recentemente dimostrato che le cellule dendritiche sovrapposti su fette timici migrare efficientemente nel tessuto e può supportare selectio negativoN e T reg sviluppo 39,43. Gli studi fino ad oggi hanno utilizzato preselezione DP o timociti totali per studiare la selezione positiva e negativa. Sebbene lo sviluppo delle cellule T può procedere per almeno 4 giorni a fette timici, se interessati nell'iniziare esperimenti con una popolazione progenitore precedente, si deve tenere in considerazione che un limite di questo sistema è che la qualità delle fette timici inizia a diminuire dopo 1-2 giorni in coltura a causa di morte cellulare e la mancanza di una membrana incapsulante.
Il protocollo qui descritto può essere anche utilizzato per generare le fette da tessuto timico umano con sottili modifiche. Prima di incorporare in agarosio, il tessuto del timo umano deve essere tagliato in frammenti, più o meno le dimensioni di un timica lobo topo adulto. In particolare, i campioni timici umani sono ricchi di tessuto connettivo, e, rispetto al timo murino, è più difficile preparare fette di buona qualità. Nella nostra esperienza, piuttosto che del feto umano neonataleil tessuto del timo è più favorevole per la preparazione fetta. E 'stato dimostrato che i sottoinsiemi timociti umani localizzare correttamente in entrambi fette 37 timici umane e murine. selezione timica dei sovrapposti sottoinsiemi thymocyte umano, tuttavia, non è ancora stata riportata nel modello fetta del timo. L'efficienza di selezione positiva da una popolazione policlonale è bassa, a causa della bassa percentuale (~ 0,5-2%) dei timociti sovrapposti nella fetta timica, può essere difficile valutare tali piccole quantità di cellule selezionate positivamente. Può essere possibile introdurre un transgene TCR umano in cellule progenitrici delle cellule umane T prima di sovrapporre su fette del timo umano per aumentare l'efficienza selezione positiva. Questo, inoltre, non esclude la possibilità di monitorare i cambiamenti in endogeni popolazioni di cellule T in presenza o assenza di peptidi esogeni o altre popolazioni cellulari e inibitori di segnali TCR, tra gli altri.
Questo protocollo può anche essere annuncioApted per la visualizzazione della migrazione thymocyte, segnali TCR, e interazioni cellulari 12,32-38. Fino a poco tempo, la maggior parte degli studi sul comportamento thymocyte in situ sono state limitate alla corteccia come il midollo è situato nel timo, appena oltre il limite di rilevazione mediante microscopia a due fotoni. Al contrario, fette timici forniscono il vantaggio unico in quanto le fette hanno regioni corticali e midollari timici intatte e la superficie fetta consente l'accesso diretto al midollo da due fotoni di imaging. Inoltre, fette timici sovrapposti con cellule marcate con indicatori calcio coloranti come indolo possono essere utilizzati per monitorare i segnali TCR utilizzando livelli di calcio citosolico come indicatore di segnali TCR associati selezione positiva e negativa da microscopia a due fotoni 11,32,36, 38,39,44. Per preparare i campioni per la microscopia, le fette possono essere usate direttamente dopo il punto 4.5 del protocollo. In questo caso, si deve prestare attenzione a scegliere marcatori fluorescenti appropriate suitable per l'imaging.
Timo culture fetta di organi sono un ottimo strumento per studiare vari aspetti della mouse e lo sviluppo delle cellule T umane in situ. Tuttavia, successo applicazione di questa tecnica richiede una particolare attenzione alle fasi critiche nel protocollo. Per massimizzare il numero di fette timici ottenuti per esperimenti di throughput elevato, l'età del mouse utilizzato deve essere presa in considerazione la dimensione delle modifiche timo per tutta la durata del mouse. Usiamo tipicamente 4-8 settimane di età topi che generano ~ 20 fette del timo per il mouse. Tuttavia, fetali topi, neonatali o anziani thymi possono teoricamente essere utilizzati per generare un numero limitato di fette seconda delle esigenze sperimentali dell'utente. Per ottenere fette di buona qualità, è fondamentale per rimuovere tutto tessuto connettivo circostante lobi timici prima incorporamento in agarosio. Rimanendo tessuto connettivo non è tagliato in modo efficiente dalla lama vibratome durante affettare e può danneggiare il timolobi e fette risultanti. La maggior parte del tessuto connettivo deve essere rimossa durante il raccolto timo (passo 1.5) e permette ai lobi per essere rimosso dalla cavità toracica senza significative manipolazione del tessuto stesso. Dopo aver isolato i lobi, rimuovere con attenzione ogni residuo di tessuto connettivo, come indicato al punto 2.5. Inoltre, mantenendo l'integrità del agarosio che circonda il tessuto incorporato è imperativo per sovrapponendo timociti sulla superficie della fetta. Pertanto, è fondamentale per controllare sia la fetta timo e l'agarosio circostante nella scelta delle fette timici per uso nell'esperimento. Il vibratome in genere si trova al di fuori della cappa di coltura tissutale, aumentando il potenziale rischio di contaminazione. Pulizia della vibratome accuratamente tra esperimenti e spruzzando la zona di lavoro e vibratome con il 70% di etanolo prima del taglio può limitare il potenziale di contaminazione. E 'anche importante usare PBS sterile per passi 2.13 e 2.15 come indicato nella pROTOCOLLO. Infine, è anche fondamentale distinguere timociti sovrapposti che migrano nel tessuto dalle cellule che sono endogeni al timo. Ciò può essere ottenuto mediante l'etichettatura celle sovrapposte con coloranti fluorescenti come indicato al punto 3.7. In alternativa, timociti da topi che esprimono i marcatori congenic o giornalisti fluorescenti geneticamente codificati possono essere utilizzati 45,46. In generale, tuttavia, fette timici sono facili da manipolare e possono essere adattati alle specifiche esigenze sperimentali dell'utente, supportando ampia applicabilità che ha iniziato solo da esplorare.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vibratome | Leica Biosystems | VT1000S | |
| NuSieve GTG Agarose | Lonza | 50080 | Low melting temperature agarose |
| Embedding Mold (Truncated - T12) | Polyciences | 18986 | 22 mm x 22 mm square, truncated to 12 mm x 12 mm |
| Double Edge Prep Blades | Personna | 74-0002 | |
| Tissue Adhesive | 3M | 1469SB | |
| 0.4 µm Cell Culture Inserts | BD Falcon | 353090 | Of several brands tested, these maintained the cells atop the slices the best |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | ThermoFisher | 21600-010 | |
| RPMI-1640 with L-glutamine | Wisent | 350-000-CL | |
| Fetal Bovine Serum | Wisent | 080-110 | Heat inactivated |
| L-Glutamine, 200 mM | Wisent | 609-065-EL | |
| Penicillin/Streptomycin, 100x | Wisent | 450-201-EL | |
| 2-Mercaptoethanol | Alfa Aesar | A15890 | |
| 15 ml Tenbroeck Tissue Grinders | Wheaton | 357426 | |
| Nylon Mesh Filter | Component Supply | U-CMN-255 | |
| Microcentrifuge Tube Sample Pestle | Bel-Art | F19922-0000 | |
| 40 µm Nylon Cell Strainer | BD Falcon | 352340 | |
| Forceps Inox Tip | Dumont | RS-5047 | Fine tip curved forceps, size .17 x .10 mm |
| Micro Forceps | Dumont | RS-5090 |
References
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