Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Voorbereiding en Toepassingen van organotypische thymus Slice Culturen

doi: 10.3791/54355 Published: August 6, 2016
* These authors contributed equally

Summary

We beschrijven de bereiding van thymus segmenten die in combinatie met flowcytometrie, kan worden gebruikt om positieve en negatieve selectie van T-cellen ontwikkelen modelleren. Thymus segmenten kunnen ook worden aangepast voor de in situ analyse van thymocyten migratie, lokalisatie en signalering via immunofluorescentie en twee-foton microscopie.

Abstract

Thymus selectie verloopt in een unieke en zeer georganiseerde thymus micromilieu resulteert in de vorming van een functioneel, zelfverdraagzaam T cel repertoire. In vitro modellen voor T lineage betrokkenheid en ontwikkeling te bestuderen hebben waardevolle inzichten in dit proces. Maar deze systemen niet de volledige driedimensionale thymus milieu noodzakelijk voor T cel ontwikkeling en derhalve onvolledig benaderingen van in vivo thymus selectie. Enkele problemen met betrekking tot modellering T cel ontwikkeling kan worden overwonnen door in situ modellen die een intact micro thymus die volledig achter de thymus ontwikkelen winkelwagentje T cellen. Thymus slice organotypische culturen aanvulling op bestaande in-situ technieken. Thymus segmenten de integriteit van de thymus corticale en medullaire gebieden en een platform voor de ontwikkeling van overlay thymocyten van een bepaald ontwikkelingsstadium of endogene Tc bestuderenells binnen een volwassen thymus micromilieu. Gezien de mogelijkheid om ~ 20 sneetjes per muis genereren, thymus plakjes presenteren een uniek voordeel in termen van schaalbaarheid voor high throughput experimenten. Verder is de relatieve gemak bij het genereren thymus plakjes en potentieel verschillende subsets thymus en andere celpopulaties overlappen van verschillende genetische achtergronden vergroot de veelzijdigheid van deze methode. Hier beschrijven we een protocol voor de voorbereiding van de thymus plakjes, isolatie en bekleding van thymocyten en dissociatie van thymus plakken voor flowcytometrische analyse. Dit systeem kan ook worden aangepast om onconventionele T cel ontwikkeling te bestuderen en thymocyten migratie thymocyt-stromale cel interacties en TCR signalen geassocieerd met thymus selectie door twee-foton microscopie te visualiseren.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

T-cellen differentiëren door een reeks van ontwikkelings tussenproducten in de thymus gedurende welke zij verschillende checkpoints dat het genereren van een functioneel, zelfverdraagzaam T cel repertoire 1-3 garanderen tegenkomen. Positieve selectie bevordert de overleving van thymocyten met T-cel receptoren (TCR) kunnen herkennen, met een lage tot matige affiniteit, peptide gepresenteerd door major histocompatibility complexe moleculen (MHC) op corticale thymus epitheelcellen (CTEC) 2,3. Negatieve selectie en regulatoire T (T reg) ontwikkeling cel bijdragen aan de totstandkoming van zelf-tolerantie via het wegnemen of misbruik van thymocyten die sterk reageren op self-peptide gepresenteerd door MHC 2,4. Onrijpe CD4 + CD8 + dubbel positieve (DP) thymocyten expressie TCRs die het selectieproces overgaan differentiëren in rijpe T-cel subpopulaties, waarvan de meeste zijn MHC klasse I-beperkte CD8 + cytotoxischeof MHC klasse II beperkte CD4 + helper enkel positieve (SP) T-cellen, voor het verlaten van de thymus tot effector functies in de secundaire lymfoïde organen 1-3.

Wat de complexiteit van T cel ontwikkeling is de dynamische migratie en cellulaire ontmoetingen ontwikkelen thymocyten gehele stromale cel netwerk 5-9. Deze stromale cellen spelen verschillende rollen in thymocyten ontwikkeling en zijn verschillend verdeeld over de thymus corticale en medullaire regio's waar de positieve en negatieve selectie plaatsvinden 10. Hoewel positieve selectie vindt plaats in de eerste plaats in de cortex, er is een groeiend bewijs dat DP thymocyten migreren naar het merg en blijven TCR signalen voordat ze differentiëren in mature T-cellen suggereert dat het merg extra signalen kunnen verschaffen die nodig zijn voor de voltooiing van positieve selectie en lineage differentiatie 11,12. Verder,ondanks de aanwezigheid van gespecialiseerde medullaire thymus epitheelcellen (MTES) die expressie en huidige weefsel beperkte antigenen vergemakkelijken deletie van autoreactieve thymocyten 13,14, een groot deel van de negatieve selectie plaatsvindt in de cortex in reactie op alomtegenwoordig tot expressie zelf peptide door dendritische cellen 15,16. Zo moet nauwkeurige modellen van T-cel ontwikkeling een zeer georganiseerde thymus micromilieu te voorzien, met intacte corticale en medullaire regio's, dat de interactie tussen thymocyten en stromale cellen faciliteert en ondersteunt thymocyt migratie deze cellen ondergaan positieve en negatieve selectie.

Als aanvulling ex vivo analyse van thymocyten als middel bestuderen positieve en negatieve selectie, een aantal in vitro, in situ en in vivo modellen van T cel ontwikkeling ontwikkeld 17-22. Het is altijd moeilijk recapitulerenpositieve selectie in vitro, maar co-cultuur van stamcelpopulaties of T cel voorlopers met stromale cellen die Notch-ligand, met name OP9-DL1 / 4 cellen, heeft de mogelijkheid om T lineage inzet en beperkte positieve selectie ondersteunen waardoor het een waardevol in vitro model studie T cel ontwikkeling 23-25. Beperkingen van dit systeem omvatten echter het feit dat deze cellen het unieke peptide machines gevonden in thymus stromale cellen en de driedimensionale thymus micromilieu.

Hoewel technisch omslachtig, in situ en in vivo modellen van thymus selectie enkele obstakels met betrekking tot in vitro systemen te overwinnen. Reaggregate thymus orgel culturen (RTOC) bevatten gedefinieerde mengsels van thymocyten en thymus stromale cellen 18,26,27. Deze thymus epitheelcellen reaggregates behouden MHC klasse I en II expressie en kan Developme ondersteunennt van zowel conventionele T-cel subsets, maar nog steeds niet gedefinieerd corticale en medullaire structuren. Foetale thymus orgaankweek (FTOC) is een populair model T cel ontwikkeling die met thymocyten via hangende-druppel cultuur lymphodepleted thymus lobben of via injectie van thymocyten kan worden gezaaid in lymphoreplete thymus lobben en ondersteunen efficiënte ontwikkeling van CD4 + en CD8 + T cellen na verloop van tijd in cultuur 18,28-31. Aan het begin van de cultuur van de foetale thymus lobben is er een gebrek aan mTECs, maar gedefinieerd corticale en medullaire structuren kunnen ontwikkelen in de tijd afhankelijk van de omstandigheden. Een belangrijke overweging is dat dit model voorkeur kan ondersteunen foetale versus volwassen T cel ontwikkeling. Tenslotte intrathymic injectie van gedefinieerde thymus voorlopers in volwassen muizen is technisch uitdagend, maar geeft duidelijk een omgeving te steunen T cel ontwikkeling in vivo. Deze in situ en in vivo modellen zijn uitstekende hulpmiddelen to studie T cel ontwikkeling en het gebruik ervan moet worden beschouwd als een experiment-by-experiment basis.

Thymus segmenten hebben echter onlangs ontwikkeld tot een veelzijdige complementair model thymus de selectie in situ met de mogelijkheid om unieke, complexe en algemeen hogere throughput experimenten tegemoet. Thymus plakjes handhaven van de integriteit van de corticale en medullaire regio's en bieden een kader van stromale cellen die thymocyten migratie ondersteunt tijdens de ontwikkeling en efficiënte positieve en negatieve selectie 11,32-39. Thymocyt subsets toegevoegd boven op de thymus plakjes migreren in het weefsel en hun geschikte micro-omgeving niche 34,37. De overlay thymocyten kan worden onderscheiden van de thymus segment endogene cellen via congenic merkers of fluorescente labels en kunnen in kweek gedurende enkele dagen worden gehandhaafd. Thymus slice organotypische kweken kan worden gebruikt om verschillende aspecten bestuderenT cel ontwikkeling zoals thymus keuze, thymocyten gedrag (migratie en cellulaire interacties) en thymocyten lokalisatie, onder anderen. De mogelijkheid krijgen om ~ 20 thymus segmenten per muis genereren, de schaalbaarheid van experimenten in het algemeen groter dan andere in situ modellen van thymus selectie. Hoewel de bereiding van thymus segmenten vereist gespecialiseerde apparatuur, zoals de vibratome en de levensduur van thymus segmenten in cultuur beperkt blijven door celverlies tijd via celdood en het ontbreken van een inkapselend membraan, thymus segmenten vormen een uitstekend model voor de analyse van thymus selectie van gesynchroniseerde populaties van thymocyten binnen een volwassen thymus micromilieu. Hier beschrijven we de voorbereiding van de thymus plakjes (met inbegrip van het oogsten van de thymus, agarose inbedding van thymus lobben en vibratome snijden van het ingebedde weefsel), isolatie en overdeksel thymocyten en dissociatie van thymus plakken voor flowcytometrische analyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Protocollen voor alle dierproeven werden goedgekeurd door de Animal Care Comite op het Centre de recherche - Hôpital Maisonneuve-Rosemont.

1. Oogsten Muis Thymus voor de bereiding van de thymus Slices en Single Cell Schorsingen

  1. Euthanaseren de muis met CO 2 gevolgd door cervicale dislocatie.
  2. In een laminaire stroming kap, speld de muis buikzijde tot een dissectie board. Spuit de muis met 70% ethanol. Verwijder overtollig alcohol door deppen met een gaasje om te voorkomen dat ethanol uit het invoeren van de borstholte en schade aan het weefsel.
  3. Til de huid aan de basis van het borstbeen met een pincet en een snede door de huid. Verleng de snit van de huid naar boven aan elke voorpoot.
  4. Een aanvullend snede aan de onderkant van het borstbeen met het membraan scheiden van de ribbenkast. Snijd vervolgens elke zijde van de ribbenkast naar het sleutelbeen. Flip de ribbenkast over de richting van het hoofd waardoor de borstholte. De twee lobben vande thymus liggen boven het hart.
  5. Verwijder het bindweefsel rond de thymus lobben behulp van een tang, micro-dissectie schaar en / of scherp gebogen schaar. Gebruik een paar fijne tip gebogen tang om de individuele lobben tillen van onderaf of via de resterende bindweefsel.
    Opmerking: Raak de thymus niet direct te begrijpen.
  6. Plaats de thymus lobben in een 15 ml conische buis met PBS en zet apart op ijs totdat het nodig is.

2. Agarose Embedding en Vibratome snijden van thymus Lobes

  1. Bereid 4% agarose-oplossing voor het inbedden door het oplossen van 2 g laag-smeltpunt agarose in 50 ml steriele PBS en de magnetron op een lage stand totdat de agar volledig is opgelost. Bedek kolf met aluminiumfolie en in een waterbad van 55 ° C tot aan gebruik.
  2. In een weefselkweek kap bereiden compleet RPMI-1640 medium dat 10% foetaal runderserum bevat (FBS), 4 mM L- glutamine, 1 x penicilline / streptomycine, en 10 uM2-mercaptoethanol.
  3. Voeg 1,5 ml compleet RPMI-1640 media per goed op een 6-well celkweek plaat en plaats een celkweek insert in elk putje. Stel de plaat opzij in een incubator bij 37 ° C totdat het nodig is.
  4. Bereid een slushy ijswater bad met water en ijs in een ijsemmer.
  5. Verwijder voorzichtig alle resterende bindweefsel rond elk thymus kwab met behulp van fijne tip pincet. Doe dit terwijl de thymus kwab is ondergedompeld in PBS in een weefselkweek schotel, na de overdracht op een tissue doekje doordrenkt met PBS, of onder een dissectie microscoop.
  6. Laat de agarose afkoelen onder 40 ° C, wanneer de kolf net handwarm, zodat oververhitting van het weefsel. Giet de afgekoelde 4% agarose in een weefsel matrijs tot een hoogte van 1 cm ~.
  7. Gebruik een pincet de thymus kwab zorgvuldig overdragen aan een weefsel wipe en rol voorzichtig te drogen zonder beschadiging van het weefsel. Zorg ervoor dat het weefsel droogt volledig of het zal tijdens het snijden uit de agarose schuift.
  8. Schuif de nok in de agarose en plaats deze horizontaal (aan oppervlak van elk segment te verhogen) of verticaal (om het aantal segmenten te verhogen) aan de bodem van de vorm. Plaats de vorm in ijswater gedurende 5-10 minuten om de agarose te stollen.
  9. Gedurende deze tijd, bereidt de vibratome voor het snijden door het monteren van de bufferbak, assembleren de objectplaatje en plaatsen van de vibratome mes. Leg een stuk tape laboratorium op het monster disc. Steriliseer de schone, geassembleerd werkruimte met 70% ethanol.
  10. Zodra de agarose stolt, draai de mal en druk voorzichtig in het midden van de agarose ingebedde kwab vrij te geven.
  11. Gebruik een scherp mes om het overtollige agarose rondom de lob verlaten ~ 2 mm van agarose aan weerszijden en trim ~ 0,5 cm aan de onderzijde.
  12. Beveiligde elk agarose blok met een druppel weefsellijm het stuk tape op het objectplaatje. Meerdere blokken worden gelijmd op de band.
  13. Lijn de vibratome mes with bovenkant agarose blok. Vul het buffer lade met steriel PBS tot het mes en agarose blok (s) volledig worden ondergedompeld.
  14. Gedeelte agarose ingebed weefsel plakjes te verkrijgen met een dikte van 400-500 urn. Zet de vibratome tot 0,225 mm / sec snelheid, 100 Hz, en 5 °.
  15. Gebruik een gebogen spatel om de thymus plakjes verzamelen in een weefselkweek plaat met steriel PBS als ze zijn gesneden. Gooi de eerste en de laatste slice.
  16. Onderzoek de plakken onder een lichtmicroscoop op 4x vergroting. Kies de plakken met intacte thymus weefsel en de omringende agarose (figuur 1A).
  17. Breng de plakjes op de plaat in stap 2.3 bereid door met een pipet tip om schuif de thymus slice uit de gebogen spatel op de celkweek insert. Elke insert is geschikt voor ~ 3 plakjes. Controleer de segmenten elkaar niet of celkweek insert wanden raken.
  18. Handhaving van de plaat bij 37 ° C totdat het nodig is.
  1. Isoleer thymus lobben zoals in hoofdstuk 1. Distantiëren de lobben handmatig een enkele celsuspensie met een gesteriliseerde 15 ml weefselmaler gevuld met 5 ml steriel PBS dat 2% FBS maken. Overdracht van de cellen om een ​​15 ml conische buis.
  2. Centrifugeer de cellen bij 545 g gedurende 5 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 1 ml van 1x ACK lysis buffer (0,15 M NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0,1 mM Na2 EDTA) bij kamertemperatuur gedurende 3 minuten om rode bloedcellen te lyseren.
  3. De buis wordt tot 15 ml met PBS dat 2% FBS. Centrifugeer de cellen bij 545 g gedurende 5 min bij 4 ° C.
  4. Resuspendeer de cellen in 10 ml PBS dat 2% FBS en cellen passeren door een 255 urn zeef.
  5. Aantal cellen met een hemocytometer. Centrifugeer de cellen bij 545 g gedurende 5 min bij 4 ° C en resuspendeer de celpellet in PBS met 2% FBS bij een concentratie van 1 x 10 7 cellen per ml.
  6. Label de cellen met cellulaire kleurstoffen zoals carboxyfluoresceïne succinimidylester (CFSE) volgens de protocollen van de fabrikant wanneer geen thymocyten van muizen die congenic markers of genetisch gecodeerde fluorescente reporters te onderscheiden van segment endogene cellen.
  7. Na de laatste wasbeurt van de gelabelde cellen, resuspendeer de cel pellet in volledige RPMI-1640 media bij 1-3 x 10 6 cellen per 15 ul.

4. overlay Thymocyten op de thymus Slices

  1. Gebruik een pipet om alle vloeistof rond de thymus schijfjes op de insert te zuigen.
    Let op: Wees voorzichtig om te voorkomen dat schade aan de agarose. Wanneer de agarose is beschadigd, zal de overlay thymocyten niet hechten aan het oppervlak slice door verlies van oppervlaktespanning.
  2. Zonder het segment met de pipet tip, overlay 15 ul van thymocyten bereid in hoofdstuk 3 op elke thymus slice.
  3. Incubeer de plate bij 37 ° C gedurende 2 uur om de cellen te migreren naar de thymus plakjes.
  4. Na 2 uur, spoel de thymus segmenten 3 maal met 1 ml PBS om overmaat overlay thymocyten die nog niet gemigreerd in het weefsel te verwijderen.
  5. Incubeer de plaat bij 37 ° C totdat de thymus schijfjes gereed zijn geoogst, kenmerkend 1-72 uur, afhankelijk van het experiment.

5. dissociatie van thymus Slices voor flowcytometrie

  1. Bereid een microcentrifugebuis voor elk segment door toevoeging van 150 pl PBS met 2% FBS.
  2. Voeg 1 ml PBS met 2% FBS aan de weefselkweek insert met de thymus plakjes en roer met een gebogen spatel om de plakken los te maken van het oppervlak van de celkweek insert.
  3. Breng het segment van het inzetstuk aan de microcentrifugebuis met een gebogen spatel.
  4. Handmatig verstoren de plak met behulp van een microcentrifugebuis monster stamper. Voeg 150 ul PBS die 2% FBS tot een eindvolume 300pl.
  5. Filter de gedissocieerde weefsel door een 40 pm filter in een nieuwe microcentrifugebuis. De gefilterde cellen zijn klaar om te worden gekleurd voor flowcytometrische analyse 40.
  6. Filtercellen nogmaals alvorens ze op een flowcytometer zodat de agarose wordt verwijderd en gaat de stroom cytometer niet verstoppen.
  7. Het verwerven van de cellen op een flowcytometer en analyseren van gegevens zoals eerder beschreven 40.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Thymus plakjes ondersteuning analyse van de verschillende aspecten van de T-cel ontwikkeling, zoals positieve en negatieve selectie. Voor een succesvolle experimenten, de kwaliteit van de thymus slice staat voorop. Daarom moet thymus plakjes worden onderzocht om de integriteit van de thymusweefsel waarborgen en dat de agarose rond de thymus slice intact (Figuur 1A). Oppervlaktespanning kan worden aangetast wanneer de agarose beschadiging veroorzaakt een significante daling van het aantal thymocyten die migreren in het weefsel. Aldus thymus segmenten met aanwijzingen van weefselschade of inkepingen / scheuren van de agarose worden verwijderd (Figuur 1B).

TCR transgene (tg) muizen worden vaak toegepast om de selectie thymus vanwege de expressie van een bepaalde functionele TCR op het oppervlak van een thymocyten dat de frequentie van positieve selectie op polyc verhoogtlonal populaties. Om elke fase van positieve selectie vastleggen Voorselectie TCR tg thymocyten worden zich boven thymus segmenten en de ontwikkeling van volwassen CD4 + of CD8 + T-cellen SP tijd gevolgd door 40 flowcytometrie. Thymocyten geïsoleerd van MHC klasse I-beperkte OT-I TCR tg RAG1 - / - β2m - / - muizen zijn aangehouden in de DP tijdstip vóór thymus keuze vanwege de noodzaak β2m te associëren met en het stabiliseren van de MHC klasse I zware keten 41 , 42. Wanneer bedekt op β2m - / - thymus segmenten, de voorselectie OT-I TCR tg thymocyten blijven op de DP stadium geen significante CD8 + T-cellen SP (Figuur 2A links) genereren. Wanneer daarentegen bedekt op WT thymus segmenten met endogene liganden te selecteren, het vermogen van dit model positieve selectie ondersteuning blijkt uit CD8 + T cel ontwikkeling op 72 uur (Figuur 2A, rechts). Quantification van CD8 + T cel ontwikkeling als uitlezen van positieve selectie wordt getoond in figuur 2B.

Thymus segmenten kunnen ook worden gebruikt voor negatieve selectie bestuderen. Een groot deel van negatieve selectie ontstaat als reactie op alomtegenwoordige antigeen 16. Negatieve selectie modelleren alomtegenwoordige antigeen totale thymocyten van OT-I TCR tg RAG1 - / - en wildtype (WT) muizen werden gelabeld met CFSE en CTV respectievelijk, daarna gemengd in een 1: 1 verhouding en overlay op WT plakjes (Figuur 3A). Na het wassen overtollige thymocyten werden de thymus segmenten in volledig RPMI-1640 media geplaatst met of zonder 1 nM van de verwante, agonist peptide van de OT-I TCR, SIINFEKL (OVA peptide). Alle MHC klasse I tot expressie brengende cellen de antigeen presenteren, modelleren van de presentatie van antigeen alom tot expressie in de thymus. Na 24 uur incubatie bij 37 ° C, de percentage OT-I TCR tg cells (% levende CFSE +) WT controlecellen (% levende CTV +) vergeleken met flowcytometrie (Figuur 3B). Een afname van het relatieve aandeel van de OT-I TCR tg cellen vertegenwoordigt schrapping van OTI TCR tg cellen in reactie op OVA peptide.

Het is belangrijk op te merken dat als gevolg van heterogeniteit in de omvang van thymus segmenten en cel indienststelling thymus plakjes moet een geschikte analyse en interne controles omvatten te normaliseren voor deze variabelen. Hier, WT cellen gemengd met OT-I TCR tg cellen en overlay bovenop plakjes werden gebruikt als interne controle deze groep niet in belangrijke mate beïnvloed door de aanwezigheid of afwezigheid van OVA-peptide. De omvang van de negatieve selectie van OTI TCR tg cellen werd gekwantificeerd op basis van aandelen in plaats van absolute aantallen. Ten eerste is de verhouding tussen OT-I TCR tg (% levende CFSE +) WT (% levende CTV +) cellen op elke WT thymus segment in aanwezigheid of afwezigheid van OVA-peptide berekend. Elk van deze verhoudingen werd dan gedeeld door het gemiddelde van de verhouding tussen OT-I TCR tg (% levende CFSE +) WT (% levende CTV +) cellen op WT segmenten in de afwezigheid van OVA-peptide. Gemiddeld 80% van de OT-I TCR tg cellen werden uitgeput in respons op antigeen alomtegenwoordige zoals weergegeven in figuur 3C.

Figuur 1
Figuur 1: Representatieve beelden van de thymus plakjes bereid uit een verticaal geïntegreerde thymus kwab. (A) Goede kwaliteit slice met de ingebed weefsel en de omringende agarose intact. (B) Slechte kwaliteit slice met schade als gevolg van het scheuren van het ingebedde weefsel tijdens het snijden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

ove_content "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Figuur 2
Figuur 2:. Flow cytometrische analyse van positieve selectie thymus plakken OT-I TCR tg RAG1 - / - β2m - / - thymocyten werden gelabeld met CFSE en overlay op non-selectie β2m - / - of het selecteren WT segmenten. Na 72 uur incubatie bij 37 ° C, werd CD8 + T cel ontwikkeling geanalyseerd door flow cytometrie. (A) Representatieve gegevens van celoppervlak CD4 en CD8 expressie op levende CFSE + TcR hoge thymocyten van β2m - / - en WT plakjes. (B) Kwantificering van levende CFSE + TcR hoge CD8 + T cel ontwikkeling op WT segmenten in vergelijking met niet-selecteren van controles. Elke stip vertegenwoordigt een individuele thymus slice en de lijn geeft het gemiddelde. (*** P <0,001, ongepaarde t-test)ove.com/files/ftp_upload/54355/54355fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 3
Figuur 3: Flow cytometrische analyse van negatieve selectie in de thymus segmenten Een 1:. 1 verhouding totaal CFSE-gelabelde OT-I TCR tg RAG1 - / - en CTV-gelabelde WT thymocyten werden bedekt op WT segmenten in de aanwezigheid of afwezigheid van de OVA peptide SIINFEKL. Na 24 uur incubatie bij 37 ° C werden de relatieve verhoudingen van overlappende cellen geanalyseerd door flowcytometrie. (A) Een schema van de experimentele set-up die een overlay van CTV-gelabelde WT cellen (blauw) 1: 1 gemengd met CFSE-gelabelde OT-I TCR tg cellen (groen) op een WT thymus schijfje in de aanwezigheid of afwezigheid OVA peptide. (B) Representatieve gegevens beeltenis van het aandeel van de live CFSE + OT-ITCR tg cellen en CTV + WT cellen van segmenten die waren geïncubeerd met of zonder OVA peptide. (C) De gegevens werden genormaliseerd tussen segmenten, en de relatieve verhouding van de live CFSE + OT-I TCR tg cellen CTV + WT cellen leven wordt getoond. Error bars geven de standaarddeviatie. N = 3 voor elke omstandigheid. (* p <0,05, ongepaarde t-test). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Hier beschrijven we een protocol voor de bereiding van thymus segmenten en representatieve resultaten efficiënte positieve en negatieve selectie overlay preselectie MHC klasse-I beperkte TCR transgene thymocyten door flowcytometrie. Dit systeem is gebruikt met soortgelijke succes positieve selectie van MHC klasse II beperkte CD4 + T-cellen van voorselectie DP thymocyten 32 ondersteunen, en in aanwezigheid van agonist antigeen negatieve selectie en thymus T reg ontwikkeling 11,12, 36,38,39,43,44. Dit protocol kan worden aangepast om thymus selectie in aanwezigheid of afwezigheid van remmers, gedefinieerde peptiden bestuderen, evenals genetisch gemodificeerde thymocyten of stromale celpopulaties. Thymus schijfjes zijn ook vatbaar voor de overlay van andere dan thymocyten subsets celpopulaties. Zo werd recent aangetoond dat dendritische cellen bedekt op thymus segmenten efficiënt migreren in het weefsel en kan negatief selectio ondersteunenn en T reg ontwikkeling 39,43. Studies tot op heden hebben gebruikt voorselectie DP of totale thymocyten positieve en negatieve selectie te bestuderen. Hoewel T cel ontwikkeling kan plaatsvinden ten minste 4 dagen thymus plakken, als belanghebbende bij het initiëren van experimenten met een eerder progenitor populatie, moet rekening worden gehouden dat een beperking van dit systeem is dat de kwaliteit van de thymus segmenten begint te dalen na 1-2 dagen in kweek door celdood en het ontbreken van een inkapselend membraan.

De hierin beschreven protocol kan ook worden gebruikt voor het genereren van segmenten van menselijke thymusweefsel met subtiele wijzigingen. Voordat inbedding in agarose, moet het menselijk thymus weefsel worden gesneden in fragmenten, ongeveer de grootte van een volwassen muis thymus kwab. Met name, humane thymus monsters rijk aan bindweefsel, en ten opzichte van muizen thymus, is het moeilijk om goede kwaliteit plakjes bereiden. In onze ervaring, de foetus in plaats van menselijke neonatalethymus weefsel is meer bevorderlijk voor slice voorbereiding. Aangetoond is dat humane thymocyten subsets correct lokaliseren zowel humane als muis thymus segmenten 37. Thymus selectie van overlay menselijke thymocyten subsets, echter nog niet gemeld in de thymus slice model. De efficiëntie van positieve selectie uit een polyklonale populatie is laag, en vanwege de lage verhouding (~ 0,5-2%) van overlay thymocyten in de thymus segment, kan het moeilijk zijn om dergelijke kleine aantallen positief geselecteerde cellen te beoordelen. Kan het mogelijk zijn een humaan TCR transgen te introduceren in de humane T cel progenitorcellen vóór overlay menselijke thymus plakjes positieve selectie-efficiëntie te vergroten. Dit heeft ook geen beletsel voor de mogelijkheid van controle veranderingen in de endogene T-cel populaties in de aanwezigheid of afwezigheid van exogene peptiden of andere mobiele populaties en remmers van TCR signalen, onder anderen.

Dit protocol kan ook ad zijnApted voor visualisatie van thymocyten migratie TCR signalen en cellulaire interacties 12,32-38. Tot voor kort waren de meeste studies thymocyt gedrag in situ beperkt tot de cortex als het merg is centraal gelegen in de thymus, net voorbij de detectiegrens door twee-foton microscopie. Daarentegen thymus schijfjes over een uniek voordeel in dat de schijfjes intact thymus corticale en medullaire gebieden en de plak oppervlak biedt direct toegang tot het merg van twee-foton imaging. Bovendien kan thymus segmenten bedekt met cellen gelabeld met calcium indicator kleurstoffen zoals indol worden gebruikt TCR signalen via cytosolische calciumconcentraties als indicator van TCR behorende signalen met positieve en negatieve selectie door twee-foton microscopie 11,32,36 volgen, 38,39,44. Om monsters voor te bereiden voor microscopie, kan de plakjes direct gebruikt worden na stap 4.5 van het protocol. In dit geval moet erop worden toegezien dat de juiste fluorescerende markers kiezen suwerkt worden voor de beeldvorming.

Thymus slice orgaankweken zijn een uitstekend hulpmiddel om verschillende aspecten van muis en humane T cel ontwikkeling te bestuderen in situ. Echter succesvolle toepassing van deze techniek vereist speciale aandacht aan de kritische stappen in het protocol. Om het aantal segmenten thymus verkregen voor high throughput experimenten maximaliseren, moet de leeftijd van de muizen die in aanmerking worden genomen als de omvang van de thymus veranderingen gedurende de levensduur van de muis. We gebruiken meestal 4-8 weken oude muizen die genereren ~ 20 thymus plakjes per muis. Echter, foetale, neonatale en oudere muizen thymi kan theoretisch worden gebruikt om een ​​beperkt aantal segmenten afhankelijk van de experimentele behoeften van de gebruiker te genereren. Voor het verkrijgen van een goede kwaliteit plakken, is het van cruciaal belang voor alle bindweefsel rond de thymus lobben voorafgaand aan de inbedding in agarose te verwijderen. De resterende bindweefsel is niet efficiënt door de vibratome mes gesneden tijdens het snijden en kan de thymus beschadigenlobben en de daaruit voortvloeiende plakjes. Het grootste deel van bindweefsel worden verwijderd tijdens thymus oogst (stap 1.5) en laat de lobben van de borstholte te verwijderen zonder significante manipulatie van het weefsel zelf. Na het isoleren van de lobben, verwijder voorzichtig eventueel resterende bindweefsel zoals beschreven in stap 2.5. Bovendien, de integriteit van de agarose rond het ingebedde weefsel is noodzakelijk voor het bedekken thymocyten effectief op de slice oppervlak. Aldus is het essentieel om zowel de thymus segment en het omliggende agarose na te kijken bij het kiezen van de thymus plakken voor gebruik in het experiment. De vibratome bevindt zich gewoonlijk buiten weefselkweek kap, waardoor het risico van besmetting. Het reinigen van de vibratome grondig tussen experimenten en het sproeien van de werkruimte en vibratome met 70% ethanol voorafgaand aan het snijden kan de kans op besmetting te beperken. Het is ook belangrijk om steriel PBS gebruikt voor stappen 2,13 en 2,15 zoals vermeld in de pROTOCOL. Tenslotte is het ook cruciaal overlay thymocyten die migreren in het weefsel van de cellen die endogeen voor de thymus zijn onderscheiden. Dit kan worden bereikt door het merken van de cellen bedekt met fluorescerende kleurstoffen zoals vermeld in stap 3,7. Als alternatief kan thymocyten van muizen die congenic markers of genetisch gecodeerd fluorescerende reporters worden gebruikt 45,46. In het algemeen echter thymus plakjes gemakkelijk te manipuleren en kan worden aangepast aan de specifieke experimentele behoeften van de gebruiker, ondersteunende brede toepasbaarheid dat slechts begonnen worden onderzocht.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Vibratome Leica Biosystems VT1000S 
NuSieve GTG Agarose Lonza 50080 Low melting temperature agarose
Embedding Mold (Truncated - T12) Polyciences 18986 22 mm x 22 mm square, truncated to 12 mm x 12 mm
Double Edge Prep Blades Personna 74-0002
Tissue Adhesive 3M  1469SB
0.4 µm Cell Culture Inserts  BD Falcon 353090 Of several brands tested, these maintained the cells atop the slices the best
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline ThermoFisher 21600-010
RPMI-1640 with L-glutamine Wisent 350-000-CL
Fetal Bovine Serum Wisent 080-110 Heat inactivated
L-Glutamine, 200 mM Wisent 609-065-EL
Penicillin/Streptomycin, 100x Wisent 450-201-EL
2-Mercaptoethanol Alfa Aesar A15890
15 ml Tenbroeck Tissue Grinders Wheaton 357426
Nylon Mesh Filter Component Supply U-CMN-255
Microcentrifuge Tube Sample Pestle Bel-Art F19922-0000
40 µm Nylon Cell Strainer BD Falcon 352340
Forceps Inox Tip Dumont  RS-5047 Fine tip curved forceps, size .17 x .10 mm
Micro Forceps Dumont  RS-5090 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Carpenter, A. C., Bosselut, R. Decision checkpoints in the thymus. Nat Immunol. 11, 666-673 (2010).
  2. Starr, T. K., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Positive and negative selection of T cells. Annu Rev Immunol. 21, 139-176 (2003).
  3. Vrisekoop, N., Monteiro, J. P., Mandl, J. N., Germain, R. N. Revisiting thymic positive selection and the mature T cell repertoire for antigen. Immunity. 41, 181-190 (2014).
  4. Stritesky, G. L., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Selection of self-reactive T cells in the thymus. Annu Rev Immunol. 30, 95-114 (2012).
  5. Bousso, P., Bhakta, N. R., Lewis, R. S., Robey, E. Dynamics of thymocyte-stromal cell interactions visualized by two-photon microscopy. Science. 296, 1876-1880 (2002).
  6. Takahama, Y. Journey through the thymus: stromal guides for T-cell development and selection. Nat Rev Immunol. 6, 127-135 (2006).
  7. Halkias, J., Melichar, H. J., Taylor, K. T., Robey, E. A. Tracking migration during human T cell development. Cell Mol Life Sci. 71, 3101-3117 (2014).
  8. Yin, X., Chtanova, T., Ladi, E., Robey, E. A. Thymocyte motility: mutants, movies and migration patterns. Curr Opin Immunol. 18, 191-197 (2006).
  9. Ladi, E., Yin, X., Chtanova, T., Robey, E. A. Thymic microenvironments for T cell differentiation and selection. Nat Immunol. 7, 338-343 (2006).
  10. Klein, L., Kyewski, B., Allen, P. M., Hogquist, K. A. Positive and negative selection of the T cell repertoire: what thymocytes see (and don't see). Nat Rev Immunol. 14, 377-391 (2014).
  11. Ross, J. O., et al. Distinct phases in the positive selection of CD8+ T cells distinguished by intrathymic migration and T-cell receptor signaling patterns. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, E2550-E2558 (2014).
  12. Hu, Z., Lancaster, J. N., Sasiponganan, C., Ehrlich, L. I. CCR4 promotes medullary entry and thymocyte-dendritic cell interactions required for central tolerance. J Exp Med. 212, 1947-1965 (2015).
  13. Anderson, M. S., et al. Projection of an immunological self shadow within the thymus by the aire protein. Science. 298, 1395-1401 (2002).
  14. Takaba, H., et al. Fezf2 Orchestrates a Thymic Program of Self-Antigen Expression for Immune Tolerance. Cell. 163, 975-987 (2015).
  15. McCaughtry, T. M., Baldwin, T. A., Wilken, M. S., Hogquist, K. A. Clonal deletion of thymocytes can occur in the cortex with no involvement of the medulla. J Exp Med. 205, 2575-2584 (2008).
  16. Stritesky, G. L., et al. Murine thymic selection quantified using a unique method to capture deleted T cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 4679-4684 (2013).
  17. Anderson, G., Jenkinson, E. J. Review article: thymus organ cultures and T-cell receptor repertoire development. Immunology. 100, 405-410 (2000).
  18. Hare, K. J., Jenkinson, E. J., Anderson, G. In vitro models of T cell development. Semin Immunol. 11, 3-12 (1999).
  19. de Pooter, R., Zuniga-Pflucker, J. C. T-cell potential and development in vitro: the OP9-DL1 approach. Curr Opin Immunol. 19, 163-168 (2007).
  20. Lian, Z., et al. Intrathymically injected hemopoietic stem cells can differentiate into all lineage cells in the thymus: differences between c-kit+ cells and c-kit < low cells. Stem Cells. 15, 430-436 (1997).
  21. Manna, S., Bhandoola, A. Intrathymic Injection. Methods Mol Biol. 1323, 203-209 (2016).
  22. Goldschneider, I., Komschlies, K. L., Greiner, D. L. Studies of thymocytopoiesis in rats and mice. I. Kinetics of appearance of thymocytes using a direct intrathymic adoptive transfer assay for thymocyte precursors. J Exp Med. 163, 1-17 (1986).
  23. Schmitt, T. M., Zuniga-Pflucker, J. C. Induction of T cell development from hematopoietic progenitor cells by delta-like-1 in vitro. Immunity. 17, 749-756 (2002).
  24. de Pooter, R. F., Schmitt, T. M., Zuniga-Pflucker, J. C. In vitro generation of T lymphocytes from embryonic stem cells. Methods Mol Biol. 330, 113-121 (2006).
  25. Dervovic, D. D., Ciofani, M., Kianizad, K., Zuniga-Pflucker, J. C. Comparative and functional evaluation of in vitro generated to ex vivo CD8 T cells. J Immunol. 189, 3411-3420 (2012).
  26. White, A., Jenkinson, E., Anderson, G. Reaggregate thymus cultures. J Vis Exp. (18), (2008).
  27. Anderson, G., Owen, J. J., Moore, N. C., Jenkinson, E. J. Thymic epithelial cells provide unique signals for positive selection of CD4+CD8+ thymocytes in vitro. J Exp Med. 179, 2027-2031 (1994).
  28. Anderson, G., Jenkinson, E. J. Fetal thymus organ culture. CSH Protoc. (2007).
  29. Mazda, O., Watanabe, Y., Gyotoku, J., Katsura, Y. Requirement of dendritic cells and B cells in the clonal deletion of Mls-reactive T cells in the thymus. J Exp Med. 173, 539-547 (1991).
  30. Ceredig, R., Jenkinson, E. J., MacDonald, H. R., Owen, J. J. Development of cytolytic T lymphocyte precursors in organ-cultured mouse embryonic thymus rudiments. J Exp Med. 155, 617-622 (1982).
  31. Fairchild, P. J., Austyn, J. M. Developmental changes predispose the fetal thymus to positive selection of CD4+CD8 T cells. Immunology. 85, 292-298 (1995).
  32. Bhakta, N. R., Oh, D. Y., Lewis, R. S. Calcium oscillations regulate thymocyte motility during positive selection in the three-dimensional thymic environment. Nat Immunol. 6, 143-151 (2005).
  33. Le Borgne, M., et al. The impact of negative selection on thymocyte migration in the medulla. Nat Immunol. 10, 823-830 (2009).
  34. Ehrlich, L. I., Oh, D. Y., Weissman, I. L., Lewis, R. S. Differential contribution of chemotaxis and substrate restriction to segregation of immature and mature thymocytes. Immunity. 31, 986-998 (2009).
  35. Ueda, Y., et al. Mst1 regulates integrin-dependent thymocyte trafficking and antigen recognition in the thymus. Nat Commun. 3, 1098 (2012).
  36. Dzhagalov, I. L., Chen, K. G., Herzmark, P., Robey, E. A. Elimination of self-reactive T cells in the thymus: a timeline for negative selection. PLoS Biol. 11, e1001566 (2013).
  37. Halkias, J., et al. Opposing chemokine gradients control human thymocyte migration in situ. J Clin Invest. 123, 2131-2142 (2013).
  38. Au-Yeung, B. B., et al. Quantitative and temporal requirements revealed for Zap70 catalytic activity during T cell development. Nat Immunol. 15, 687-694 (2014).
  39. Melichar, H. J., Ross, J. O., Herzmark, P., Hogquist, K. A., Robey, E. A. Distinct temporal patterns of T cell receptor signaling during positive versus negative selection in situ. Sci Signal. 6, (2013).
  40. Hu, Q., Nicol, S. A., Suen, A. Y., Baldwin, T. A. Examination of thymic positive and negative selection by flow cytometry. J Vis Exp. (68), e4269 (2012).
  41. Mombaerts, P., et al. RAG-1-deficient mice have no mature B and T lymphocytes. Cell. 68, 869-877 (1992).
  42. Hogquist, K. A., et al. T cell receptor antagonist peptides induce positive selection. Cell. 76, 17-27 (1994).
  43. Weist, B. M., Kurd, N., Boussier, J., Chan, S. W., Robey, E. A. Thymic regulatory T cell niche size is dictated by limiting IL-2 from antigen-bearing dendritic cells and feedback competition. Nat Immunol. 16, 635-641 (2015).
  44. Melichar, H. J., Ross, J. O., Taylor, K. T., Robey, E. A. Stable interactions and sustained TCR signaling characterize thymocyte-thymocyte interactions that support negative selection. J Immunol. 194, 1057-1061 (2015).
  45. Hadjantonakis, A. K., Macmaster, S., Nagy, A. Embryonic stem cells and mice expressing different GFP variants for multiple non-invasive reporter usage within a single animal. BMC Biotechnol. 2, (2002).
  46. Schaefer, B. C., Schaefer, M. L., Kappler, J. W., Marrack, P., Kedl, R. M. Observation of antigen-dependent CD8+ T-cell/ dendritic cell interactions in vivo. Cell Immunol. 214, 110-122 (2001).
Voorbereiding en Toepassingen van organotypische thymus Slice Culturen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sood, A., Dong, M., Melichar, H. J. Preparation and Applications of Organotypic Thymic Slice Cultures. J. Vis. Exp. (114), e54355, doi:10.3791/54355 (2016).More

Sood, A., Dong, M., Melichar, H. J. Preparation and Applications of Organotypic Thymic Slice Cultures. J. Vis. Exp. (114), e54355, doi:10.3791/54355 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter