Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Utarbeidelse og Anvendelser av organotypiske Thymus- skive kulturer

doi: 10.3791/54355 Published: August 6, 2016
* These authors contributed equally

Summary

Vi beskriver fremstillingen av thymus skiver som, i kombinasjon med flowcytometri, kan brukes til å modellere positiv og negativ seleksjon for utvikling av T-celler. Thymus-skiver kan også bli tilpasset for in situ-analysen av thymocytt-migrasjon, lokalisering, og signalering via immunfluorescens og to-foton mikroskopi.

Abstract

Thymus utvalgs fortsetter i en unik og svært organisert thymus mikromiljø som resulterer i produksjon av en funksjonell, selv tolerant T celle repertoar. In vitro modeller for å studere T avstamning engasjement og utvikling har gitt verdifull innsikt i denne prosessen. Imidlertid er disse systemene mangler den komplette tredimensjonale tymisk miljø som er nødvendig for T-celle utvikling og derfor er ufullstendige tilnærmelser av in vivo tymisk valg. Noen av utfordringene knyttet til modellering T-celle utvikling kan overvinnes ved hjelp av in situ modeller som gir en intakt thymus mikromiljø som fullt ut støtter thymus utvalg for å utvikle T-celler. Thymus skive organotypiske kulturer utfylle eksisterende in situ teknikker. Thymus skiver bevare integriteten til thymus kortikale og marg regioner og gi en plattform for å studere utviklingen av overtrukket thymocytter av en definert utviklingsstadiet eller av endogen T calen innenfor en moden thymus mikromiljøet. Gitt muligheten til å generere ~ 20 skiver per mus, thymus skiver presentere en unik fordel med tanke på skalerbarhet for high throughput eksperimenter. Videre er relativt enkelt å generere thymus skiver og potensial til å legge på forskjellige thymus undergrupper eller andre cellepopulasjoner fra ulike genetiske bakgrunn øker allsidigheten til denne metoden. Her beskriver vi en protokoll for fremstilling av thymus-skiver, isolering og overlapping av thymocytter, og dissosiasjon av thymus-skiver for flowcytometrisk analyse. Dette systemet kan også tilpasses for å studere ikke-konvensjonelle T-celle utviklingen, så vel som å visualisere thymocytt-migrasjon, thymocytt-stromale celleinteraksjoner, og TCR-signaler i forbindelse med tymisk utvalg av to-foton mikroskopi.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

T-celler differensierer gjennom en rekke utviklingsmessige mellomprodukter i thymus i løpet av hvilken tid de støter på flere kontrollpunkter som sikrer dannelsen av en funksjonell, selv tolerant T-cellerepertoaret 1-3. Positiv utvelgelse fremmer overlevelsen av thymocyttene med T celle reseptorer (TCR) er i stand til å gjenkjenne, med lav til moderat affinitet, peptid presentert av store histocompatibility komplekse molekyler (MHC) på kortikale thymus epitelceller (cTEC) 2,3. Negativ seleksjon og regulatoriske T (T reg) celleutviklingen bidra til etablering av selvtoleranse via eliminering eller spredning av thymocytter som reagerer sterkt på selv peptid presentert av MHC 2,4. Umodne CD4 + CD8 + dobbel positive (DP) thymocytter uttrykker TCR som passerer utvelgelsesprosessen differensieres til modne T-celle subpopulasjoner, de fleste som er MHC klasse I-begrenset CD8 + cytotoksiskeeller MHC klasse II-begrenset CD4 + hjelpe enkle positive (SP) T-celler, før du avslutter thymus å utføre effektorfunksjoner i de sekundære lymfoide organer 1-3.

Å legge til kompleksiteten av T-celle utvikling er den dynamiske migrasjon og cellulære møter for utvikling av thymocytter i løpet av stromal cellenettverket 5-9. Disse stromale celler spille forskjellige roller i thymocytt utvikling og er differensiert fordelt mellom thymus kortikale og marg regioner hvor positiv og negativ seleksjon forekommer 10. Selv om positiv utvelgelse skjer først og fremst i hjernebarken, det er vist at DP thymocytter migrere til medulla og fortsette å kreve TCR signaler før de differensieres til modne T-celler som tyder på at marg kan gi ytterligere signaler nødvendig for gjennomføring av positiv utvelgelse og avstamning differensiering 11,12. Lengre,til tross for tilstedeværelsen av spesialiserte marg thymus epitelceller (MTEC) som uttrykker og presentere vev-begrenset antigener tilrettelegging sletting av autoreaktive thymocytter 13,14, oppstår en stor andel av negativ seleksjon i hjernebarken som svar på allestedsnærværende uttrykt selv peptid presentert av dendrittiske celler 15,16. Således må nøyaktige modeller av T-celle utvikling tilveiebringe en høyt organisert thymus-mikromiljøet, med intakt kortikal og medullære regioner, som muliggjør interaksjon mellom thymocytter og stromaceller, og støtter thymocytt migrasjon som disse cellene gjennomgå positiv og negativ seleksjon.

For å komplettere ex vivo-analyser av tymocytter som et middel til å studere positiv og negativ seleksjon, et antall in vitro, in situ, og in vivo-modeller for T-celle utvikling er blitt utviklet 17-22. Det har vært svært vanskelig å rekapitulerepositiv seleksjon in vitro, men coculture av stamcellepopulasjoner eller T-celle forløpere med stromale celler som uttrykker Notch ligand, særlig OP9-DL1 / 4 celler, har evnen til å støtte T avstamning engasjement og begrenset positiv utvelgelse som gjør det en uvurderlig in vitro modell for å studien T-celle utvikling 23-25. Begrensninger av dette systemet, innbefatter imidlertid det faktum at disse cellene mangler den unike peptidet behandling av maskiner som finnes i thymus stromale celler og den tredimensjonale tymisk mikromiljøet.

Selv om mer teknisk tungvint, in situ og in vivo modeller av thymus utvalg kan overvinne noen av de barrierer knyttet til in vitro-systemer. Reaggregate thymus organkulturer (RTOC) inneholder definerte blandinger av thymocytter og thymus stromale celler 18,26,27. Disse thymus epiteliale celle reaggregates opprett MHC klasse I og II uttrykk og kan støtte development av både konvensjonelle T-celle undergrupper, men mangler fortsatt definert kortikale og marg strukturer. Fetal thymus organ kultur (FTOC) er en populær modell av T-celle utvikling som kan bli seedet med thymocytter via hengende dråpe kultur lymphodepleted thymus lapper eller via injeksjon av thymocytter inn lymphoreplete thymus lapper og støtte effektiv utvikling av CD4 + og CD8 + T celler over tid i kultur 18,28-31. Ved oppstart av kulturen i foster thymus lapper det er en mangelen av mTECs, men definerte kortikale og marg strukturer kan utvikle seg over tid avhengig av forholdene. Et viktig hensyn er at denne modellen kan fortrinnsvis understøtte føtalt versus voksen T-celleutvikling. Endelig er intrathymisk injeksjon av definerte thymus forløpere i voksen mus teknisk utfordrende, men klart gir et miljø for å støtte T-celleutviklingen in vivo. Disse in situ og in vivo-modeller er gode verktøy to studie T-celle utviklingen og bruken bør vurderes på et eksperiment-by-eksperiment basis.

Thymus stykker har imidlertid nylig dukket opp som en allsidig, utfyllende modell for å studere tymisk utvalg in situ med mulighet for å få plass til unike, kompleks, og generelt høyere gjennomstrømning eksperimenter. Thymus skiver opprettholde integriteten av hjernebark og marg regioner og gir et rammeverk av stromale celler som støtter thymocytt migrasjon under utvikling samt effektive positiv og negativ seleksjon 11,32-39. Thymocytt undergrupper lagt oppå thymus skiver migrere inn i vevet og til deres passende microenvironmental nisje 34,37. De kledde thymocytter kan skilles fra thymus slice endogene celler via congenic markører eller fluorescerende etiketter og kan opprettholdes i kulturen i flere dager. Tymisk skive organotypiske kulturer kan anvendes for å studere forskjellige aspekterav T-celle utvikling, inkludert thymisk utvalg, thymocytt-atferd (migrering og cellulære reaksjoner), og thymocytt lokalisering, blant andre. Gitt muligheten til å generere ~ 20 thymus skiver per mus, skalerbarhet eksperimenter er generelt større enn andre in situ modeller av thymus utvalg. Selv om fremstillingen av tymiske skiver krever spesialisert utstyr, slik som vibratome, og levetiden av tymiske skiver i kultur er begrenset på grunn av tap av celler over tid via celledød og mangelen på et innkapslende membran, thymus skiver gir en utmerket modell for analyse av tymisk utvalg av synkroniserte populasjoner av tymocytter i en moden tymisk mikromiljøet. Her beskriver vi utarbeidelsen av thymus skiver (inkludert høsting av thymus, agarose innebygging av thymus lapper og vibratome seksjonering av den innebygde vev), isolasjon og overliggende av thymocytter, og dissosiasjon av thymus skiver for flowcytometrisk analyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Protokoller for alle dyrestudier ble godkjent av Animal Care utvalget ved Centre de recherche - Hôpital Maisonneuve-Mont.

1. Høsting Mouse Thymus for forberedelse av thymus Slices og enkelt celle utestengelse

  1. Avlive mus med CO 2 etterfulgt av halshugging.
  2. I en laminær hette, pin musen ventral siden opp til en disseksjon bord. Spray mus med 70% etanol. Fjerne eventuelt overskudd av alkohol ved dabbing med gasbind for å forhindre etanol kommer inn i brysthulen og skade på vev.
  3. Løfte huden på undersiden av brystbenet med en pinsett og et snitt gjennom huden. Utvid kutt i huden oppover til hver forbena.
  4. Foreta en ytterligere snitt på undersiden av brystbenet for å skille diafragmaet fra brystkassen. Deretter kuttet hver side av brystkassen mot krageben. Vend brystkassen over mot hodet utsette brysthulen. De to fliker avthymus ligge på toppen av hjertet.
  5. Fjerne bindevevet rundt thymus-lober ved hjelp av tenger, mikro-disseksjon saks, og / eller skarpe krummede saks. Bruke et par av fin spiss buet pinsett for å løfte de enkelte fliker fra undersiden, eller via resterende bindevev.
    Merk: Ikke ta tak i thymus direkte.
  6. Plasser thymus fliker i et 15 ml konisk rør som inneholder PBS og sett til side på is inntil nødvendig.

2. Agarose Inkludering og Vibratome Kutting av thymus Lobes

  1. Forbered 4% agarose løsning for innebygging ved å oppløse 2 g lavt smeltepunkt agarose i 50 ml sterilt PBS og mikrobølgeovnen på lav varme til agarose er helt oppløst. Dekk kolbe med aluminiumsfolie og plasser i et vannbad ved 55 ° C inntil de er klare for bruk.
  2. I en vevskultur hette, fremstille fullstendige RPMI-1640 medium som inneholder 10% føtalt bovint serum (FBS), 4 mM L-glutamin, 1x penicillin / streptomycin og 10 pM2-merkaptoetanol.
  3. Tilsett 1,5 ml komplett RPMI-1640 media per brønn i en 6-brønners cellekulturplate og sette inn en cellekulturinnsats i hver brønn. Setter platen til side i en inkubator ved 37 ° C inntil behov.
  4. Forbered en slushy isen vannbad med vann og is i en isbøtte.
  5. Fjern forsiktig all rester bindevev rundt hver thymus lapp ved hjelp av fin spiss tang. Gjør dette mens thymus lapp er nedsenket i PBS i en vev kultur fatet, etter overføring til en vev klut fuktet med PBS, eller under et dissekere mikroskop.
  6. La agarose å kjøle under 40 ° C, når kolben er bare varmt å ta på, for å unngå overoppheting av vev. Hell den avkjølte 4% agarose inn i et vev form til en høyde på 1 cm ~.
  7. Bruk en pinsett til å nøye overføre thymus lapp til en vev tørke og rull den forsiktig for å tørke den uten å skade vev. Sørg for at vevet tørker helt, eller det vil gli ut av agarose under kutting.
  8. Forsiktig sett lapp inn i agarose og plassere det enten horisontalt (for å øke overflatearealet av hver skive) eller vertikalt (for å øke antallet skiver) i bunnen av formen. Plassere formen i is-vann i 5-10 minutter for å tillate agarose å stivne.
  9. I løpet av denne tiden, forberede vibratome for kutting av montering av bufferbrettet, montering prøveplaten, og sette inn vibratome bladet. Legg et stykke laboratorium tape på prøveplaten. Sterilisere ren, samlet arbeidsplass med 70% etanol.
  10. Når agarose stivner, snu formen og trykk forsiktig på midten for å frigjøre agarose innebygde lapp.
  11. Bruk en skarp kniv for å trimme de overskytende agarose som omgir lobe forlater ~ 2 mm av agarose på hver side og ~ 0,5 cm ved bunnen.
  12. Fest hver agarose blokk med en dråpe vev lim til stykke tape på prøveplaten. Flere blokker kan limes på båndet.
  13. Juster vibratome bladet with toppen av agarose blokken. Fyll bufferbrettet med sterilt PBS til bladet og agarose blokken (e) er fullstendig oppslukt.
  14. Seksjon agarose innleiret vev for å oppnå skiver med en tykkelse på 400-500 pm. Sett vibratome til 0,225 mm / sek hastighet, 100 Hz frekvens, og 5 ° vinkel.
  15. Bruke et bøyd spatel for å samle den thymiske skivene i en vevskultur-plate inneholdende sterilt PBS som de er kuttet. Kast den første og siste stykket.
  16. Undersøk skiver under et lysmikroskop ved 4X forstørrelse. Velg skiver med intakt thymus vev og rundt agarose (figur 1A).
  17. Overfør skivene til plate forberedt i trinn 2,3 ved hjelp av en pipette til å forsiktig skyve thymus skive fra bøyd spatel på cellekulturinnsats. Hver Innsatsen kan romme ~ 3 skiver. Sørg for at skivene ikke berøre hverandre eller cellekulturinnsats vegger.
  18. Opprettholde platen ved 37 ° C inntil behov.
  1. Isoler thymus fliker som beskrevet i kapittel 1. Skill lapper manuelt for å lage en enkelt celle suspensjonen med en sterilisert 15 ml vev jeksel fylt med 5 ml sterilt PBS som inneholder 2% FBS. Overfør cellene til en 15 ml konisk rør.
  2. Sentrifuger cellene ved 545 xg i 5 minutter ved 4 ° C. Kast supernatanten og resuspender cellene i 1 ml 1x ACK lyseringsbuffer (0,15 M NH4CI, 10 mM KHCO 3, 0,1 mM Na2EDTA) ved romtemperatur i 3 minutter for å lysere røde blodceller.
  3. Fylle røret til 15 ml med PBS inneholdende 2% FBS. Sentrifuger cellene ved 545 xg i 5 minutter ved 4 ° C.
  4. Resuspender cellene i 10 ml PBS inneholdende 2% FBS og passerer cellene gjennom en 255 pm sikt filter.
  5. Telle celler ved hjelp av en hemocytometer. Sentrifuger cellene ved 545 xg i 5 minutter ved 4 ° C, og cellepelleten suspenderes i PBS inneholdende 2% FBS ved en konsentrasjonerasjon av 1 x 10 7 celler pr ml.
  6. Merk cellene med mobilnettet fargestoffer som carboxyfluorescein succinimidylester (CFSE) i henhold til produsentens protokoller hvis du ikke bruker thymocytter fra mus som uttrykker congenic markører eller genetisk kodet fluorescerende journalister å skille fra skive endogene celler.
  7. Etter den siste vask av de merkede celler, cellepelleten suspenderes i fullstendig RPMI-1640 medium ved 1-3 x 10 6 celler per 15 mikroliter.

4. Overliggende thymocytter på Thymus- Slices

  1. Bruke en pipette til å suge en hvilken som helst væske som omgir de thymiske stykker på innsatsen.
    Merk: Pass på å unngå å skade agarose. Dersom agarose blir skadet, vil de overliggende thymocyttene ikke fester seg til skiveoverflate på grunn av tap av overflatespenningen.
  2. Uten å berøre skive med pipettespissen, overlay 15 ul tymocytter utarbeidet i kapittel 3 på hver thymus skive.
  3. Inkuber plate ved 37 ° C i 2 timer for å tillate cellene å migrere inn i de thymiske skiver.
  4. Etter 2 timer, skyll thymus skiver 3 ganger med 1 ml PBS for å fjerne overflødig overtrukket thymocytter som ennå ikke har migrert inn i vevet.
  5. Inkuber platen ved 37 ° C inntil de thymus-skivene er klar til å bli høstet, typisk 1-72 timer, avhengig av forsøket.

5. Dissosiasjon av thymus Slices for flowcytometrisystemer

  1. Forbered en mikro tube for hver skive ved å legge 150 mL PBS som inneholder 2% FBS.
  2. Tilsett 1 ml PBS inneholdende 2% FBS for å vevskultur innsatsen med de thymiske skiver og rør forsiktig med en spatel bøyd for å koble skivene fra overflaten av cellekulturen innsatsen.
  3. Overfør skive fra innsatsen til mikrosentrifugerør ved hjelp av en bøyd slikkepott.
  4. forstyrre stykket ved hjelp av en mikroslangeprøve stampe manuelt. Tilsett 150 ul PBS inneholdende 2% FBS til et sluttvolum 300ul.
  5. Filtrer den dissosiert vev gjennom et 40 um filter inn i et nytt mikrosentrifugerør. De filtrerte cellene er klar til å bli farget for flowcytometrisk analyse 40.
  6. Filtrere cellene en gang før de sendes videre en strømnings-cytometer for å sikre at all den agarose blir fjernet og ikke tilstopper strømningscytometer.
  7. Erverve cellene på et strømningscytometer og analysere data som er tidligere beskrevet 40.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Tymisk skiver støtte analyse av ulike aspekter av T-celle utvikling som positiv og negativ seleksjon. For vellykkede eksperimenter, kvaliteten på thymus skive er det viktigste. Således bør tymiske skiver undersøkes for å sikre integriteten av thymus-vev, og at den agarose som omgir thymisk skive er intakte (figur 1A). Overflatespenning kan bli skadet når den agarose er skadet forårsaker en betydelig reduksjon i antallet thymocytter som migrerer inn i vevet. Dermed thymus skiver med indikasjoner på vevsskade eller kutt / rifter i agarose skal kastes (figur 1B).

TCR transgene (Tg) -mus blir ofte anvendt for å studere tymisk valg på grunn av ekspresjon av et definert, funksjonell TCR på overflaten av hver thymocytt som øker hyppigheten av positiv utvelgelse spissen polyclonal populasjoner. For å fange hvert trinn i positiv seleksjon, forhåndsvalg TCR tg thymocyttene kan overlappes på toppen thymic skiver, og utviklingen av modne, CD4 + eller CD8 + SP-T-celler fulgt over tid ved strømningscytometri 40. Thymocytter isolert fra MHC klasse I-begrenset OT-I TCR tg Rag1 - / - β2m - / - mus blir arrestert i DP trinn før tymisk valg på grunn av nødvendigheten av β2m å assosiere med og stabilisere MHC klasse I tung kjede 41 , 42. Når kledde på β2m - / - thymus skiver, pre-utvalget OT-I TCR tg thymocytter ligge på DP scenen og ikke genererer betydelige CD8 + SP T-celler (figur 2A, til venstre). I motsetning til dette, når den dekkes på WT tymiske skiver inneholdende endogene ligander valgt, er evnen av denne modellen for å støtte positiv utvelgelse fremgår av CD8 + T-celleutviklingen ved 72 timer (figur 2A, til høyre). Quantification av CD8 + T-celle utvikling som en utlesning av positiv utvelgelse er vist i figur 2B.

Thymus-skiver kan også brukes til å studere negativ seleksjon. En stor andel av negativ seleksjon forekommer som respons på antigen allestedsnærværende 16. For å modellere negativ seleksjon for å stedsnærværende antigen, total thymocytter fra OT-I TCR tg Rag1 - / - og villtype (WT) mus ble merket med CFSE og CTV, henholdsvis, og deretter blandet i et 1: 1 forhold og lagt over WT skiver (Figur 3A). Etter vasking av overflødige thymocytter, ble thymus skivene plasseres i et fullstendig RPMI-1640 medium med eller uten 1 nM av beslektet, agonist peptid av OT-I TCR, SIINFEKL (OVA peptidet). Alle MHC klasse I uttrykkende celler vil presentere antigen, modellering av presentasjonen av antigen uttrykt overalt i thymus. Etter 24 timers inkubering ved 37 ° C, andelen av OT-I TCR tg cells (% bor CFSE +) til WT kontrollceller (% bor CTV +) ble sammenlignet med flowcytometri (figur 3B). En reduksjon i den relative andel av OT-I TCR tg celler betegner delesjon av OTI TCR tg cellene i respons til OVA peptidet.

Det er viktig å merke seg at på grunn av heterogeniteten i størrelsen på tymiske skiver så vel som celleinntrengning inn i thymus skiver, må man inkludere passende analyse og intern kontroll for å normalisere for disse variablene. Her ble WT-celler blandet med OT-I TCR-tg-celler og som er lagt over toppen av skiver anvendt som en intern kontroll som denne populasjonen bør ikke bli betydelig påvirket av nærvær eller fravær av OVA peptidet. Omfanget av negativ seleksjon av OTI TCR tg celler ble kvantifisert basert på proporsjoner enn absolutte tall. Først forholdet mellom OT-I TCR tg (% bor CFSE +) til WT (% levende CTV +) celler på hver WT thymus skive i nærvær eller fravær av OVA peptidet ble beregnet. Hver av disse forhold ble deretter dividert med gjennomsnittet av forholdet mellom OT-I TCR tg (% bor CFSE +) for å WT (% levende CTV +) celler på WT skiver i fravær av OVA peptidet. I gjennomsnitt ble 80% av OT-I TCR-tg-celler utarmet med hensyn til respons på allestedsnærværende antigen som vist i figur 3C.

Figur 1
Figur 1: Representative bilder av thymus skiver tilberedt av et vertikalt integrert thymus lapp. (A) God kvalitet skive med den innebygde vev og rundt agarose intakt. (B) Dårlig kvalitet skive med skader på grunn av riving av den innebygde vev under kutting. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

ove_content "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Figur 2
Figur 2:. Flowcytometrisk analyse av positiv utvelgelse i thymus skiver OT-I TCR tg Rag1 - / - β2m - / - thymocytter ble merket med CFSE og kledde på ikke-velge β2m - / - eller velge WT skiver. Etter 72 timer med inkubering ved 37 ° C, ble CD8 + T-celle utvikling analysert ved flow-cytometri. (A) Representative data av celleoverflaten CD4 og CD8 uttrykk på live CFSE + TCRβ høye thymocytter fra β2m - / - og WT skiver. (B) Kvantifisering av levende CFSE + TCRβ høy CD8 + T-celle utvikling på WT skiver sammenlignet med ikke-velge kontroller. Hver prikk representerer en individuell thymus skive og linjen representerer gjennomsnittet. (*** P <0,001, uparet t-test)ove.com/files/ftp_upload/54355/54355fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3: Flow-cytometrisk analyse av negativ seleksjon i thymus skiver A. 1: 1 forhold av total CFSE-merkede OT-I TCR tg Rag1 - / - og CTV-merkede WT thymocytter ble lagt oppå WT skiver i nærvær eller fravær av OVA peptid, SIINFEKL. Etter 24 timers inkubering ved 37 ° C, ble de relative andeler av overliggende celler analysert ved flow-cytometri. (A) En skjematisk av det eksperimentelle oppsettet som viser en overlapping av CTV-merkede WT-celler (blå) blandet 1: 1 med CFSE-merkede OT-I TCR-tg-celler (grønt) på en WT tymisk skive i nærvær eller fravær OVA peptidet. (B) Representative data som viser andelen av levende CFSE + OT-ITCR tg celler og CTV + WT celler fra skiver som ble inkubert med eller uten OVA peptidet. (C) Data ble normalisert mellom skiver, og den relative forholdet mellom levende CFSE + OT-I TCR tg celler til å leve CTV + WT celler er vist. Feilfelt angir standardavvik. N = 3 for hver betingelse. (* p <0,05, uparet t-test). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Her beskriver vi en protokoll for fremstilling av tymiske skiver og representative resultater av effektiv positiv og negativ seleksjon av overleggspreseleksjon MHC klasse I-begrenset TCR-transgene thymocytter ved flowcytometri. Dette systemet har vært brukt med lignende suksess for å støtte positiv utvelgelse av MHC klasse II-begrenset CD4 + T-celler fra preseleksjon DP thymocytter 32, og, i nærvær av agonisten antigen, negativ seleksjon og thymus T reg utvikling 11,12, 36,38,39,43,44. Denne protokollen kan bli modifisert for å studere tymisk seleksjon i nærvær eller fravær av inhibitorer, definerte peptider, så vel som av genetisk modifiserte thymocytter eller stromale cellepopulasjoner. Thymus skiver er også mottagelig for overlapping av andre enn thymocytt undergrupper cellepopulasjoner. For eksempel ble det nylig vist at dendrittiske celler lagt på thymus skiver effektivt migrere inn i vevet og kan støtte negativ selection og T reg utvikling 39,43. Studier hittil har brukt forhåndsvalg DP eller totalt thymocytter å studere positiv og negativ seleksjon. Selv om T-celleutvikling kan fortsette i minst 4 dager i thymus skiver, hvis interessert i å initiere forsøk med en tidligere progenitor befolkning, bør det tas i betraktning at en begrensning ved dette system er at kvaliteten av de thymiske skivene begynner å avta etter 1-2 dager i kultur på grunn av celledød og mangel på et innkapslende membran.

Protokollen er beskrevet heri kan også anvendes for generering av skiver fra human thymus-vev med små modifikasjoner. Før innstøping i agarose, bør menneskelig thymus vev bli kuttet i fragmenter, omtrent på størrelse med en voksen mus thymus lapp. Spesielt, human thymus prøvene er rike på bindevev, og, i forhold til murin thymus, det er mer vanskelig å fremstille gode skiver. I vår erfaring, foster snarere enn neonatal menneskethymus vev er bedre til rette for skive forberedelse. Det er blitt vist at humane thymocyttpopulasjoner undergrupper lokalisere riktig på både humane og muse tymiske skiver 37. Thymus utvalg av kledde menneskelig thymocytt undergrupper, men har ennå ikke blitt rapportert i thymus skive modell. Effektiviteten av positiv utvelgelse fra en polyklonal populasjon er lav, og på grunn av den lave andelen (~ 0,5-2%) av overliggende thymocytter i thymisk skive, kan det være vanskelig å vurdere slike små mengder positivt selekterte celler. Det kan være hensiktsmessig å innføre et menneske TCR transgen i humane T-celle stamceller før overlappe på menneskelige thymus skiver å øke positiv utvelgelse effektivitet. Dette også utelukker ikke muligheten for å overvåke endringer i endogen T-cellepopulasjoner i nærvær eller fravær av eksogene peptider eller andre cellepopulasjoner og inhibitorer av TCR-signaler, blant andre.

Denne protokollen kan også være annonseApted for visualisering av thymocytt-migrasjon, TCR-signaler, og cellulære interaksjoner 12,32-38. Inntil nylig har de fleste studier av thymocytt oppførsel in situ vært begrenset til hjernebarken som medulla ligger sentralt i thymus, like utenfor grensen for deteksjon av to-foton mikroskopi. I kontrast, thymus skiver gi unik fordel i at skivene har intakte thymic kortikale og marg regioner og stykket overflaten gir direkte tilgang til medulla av to-foton imaging. I tillegg kan tymiske skiver overlappet med celler merket med kalsium indikatorfargestoffer som for eksempel indol brukes til å overvåke TCR signaler ved hjelp av cytosoliske kalsiumnivåer som en indikator på TCR-signaler i forbindelse med positiv og negativ seleksjon ved to-foton mikroskopi 11,32,36, 38,39,44. For å fremstille prøvene for mikroskopi, kan skivene benyttes direkte etter trinn 4.5 i protokollen. I dette tilfellet, bør man sørge for å velge hensiktsmessige fluorescerende markører suitable for bildebehandling.

Thymus skive orgel kulturer er et utmerket verktøy for å studere ulike aspekter av mus og human T-celle utvikling in situ. Imidlertid vellykkede anvendelse av denne teknikken krever spesiell oppmerksomhet på kritiske trinn i protokollen. For å maksimere antallet tymiske stykker som oppnås for høy gjennomstrømning eksperimenter, må en alder av mus anvendes det tas hensyn som størrelsen av de thymus endringer i løpet av levetiden til mus. Vi bruker vanligvis 4-8 uker gamle mus som genererer ~ 20 thymus skiver per mus. Imidlertid fetal, neonatale og voksne mus thymus kan teoretisk bli brukt til å generere et begrenset antall skiver, avhengig av de eksperimentelle behovene til brukeren. For å oppnå god kvalitet på skiver, er det viktig å fjerne alt bindevev som omgir thymus lapper før innstøping i agarose. Gjenværende bindevev er ikke effektivt kuttet av vibratome blad under skjæring og kan skade thymuslapper og resulterende skiver. Hovedtyngden av bindevev skal fjernes under thymus avling (trinn 1.5) og tillater flikene å bli fjernet fra brysthulen uten vesentlig manipulering av vevet selv. Etter å isolere lapper, fjern forsiktig eventuelle rester av bindevev som beskrevet i trinn 2.5. I tillegg opprettholder integriteten til agarose som omgir innleiret vev er viktig for overlegging av thymocytter effektivt på den skiveoverflate. Således er det viktig å kontrollere både thymus skive og den omgivende agarose ved valg av de thymus-skiver for anvendelse i forsøket. Vibratome er vanligvis plassert utenfor vev kultur hette, øker den potensielle risikoen for forurensning. Rengjøring av vibratome grundig i mellom eksperimenter og sprøyting arbeidsområdet og vibratome med 70% etanol før slicing kan begrense potensialet for forurensning. Det er også viktig å bruke steril PBS i trinn 2,13 og 2,15 som nevnt i protocol. Endelig er det også viktig å skille overtrukket tymocytter som vandrer inn i vevet fra cellene som er endogent for thymus. Dette kan oppnås ved å merke som er lagt over cellene med fluorescerende fargestoffer som er nevnt i trinn 3,7. Alternativt kan thymocytter fra mus som uttrykker congenic markører eller genetisk kodet fluorescerende reportere brukes 45,46. Generelt er det imidlertid, thymus skiver er lette å manipulere og kan tilpasses til de spesifikke eksperimentelle behovene til brukeren, som støtter bred anvendelse som bare har begynt å bli utforsket.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Vibratome Leica Biosystems VT1000S 
NuSieve GTG Agarose Lonza 50080 Low melting temperature agarose
Embedding Mold (Truncated - T12) Polyciences 18986 22 mm x 22 mm square, truncated to 12 mm x 12 mm
Double Edge Prep Blades Personna 74-0002
Tissue Adhesive 3M  1469SB
0.4 µm Cell Culture Inserts  BD Falcon 353090 Of several brands tested, these maintained the cells atop the slices the best
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline ThermoFisher 21600-010
RPMI-1640 with L-glutamine Wisent 350-000-CL
Fetal Bovine Serum Wisent 080-110 Heat inactivated
L-Glutamine, 200 mM Wisent 609-065-EL
Penicillin/Streptomycin, 100x Wisent 450-201-EL
2-Mercaptoethanol Alfa Aesar A15890
15 ml Tenbroeck Tissue Grinders Wheaton 357426
Nylon Mesh Filter Component Supply U-CMN-255
Microcentrifuge Tube Sample Pestle Bel-Art F19922-0000
40 µm Nylon Cell Strainer BD Falcon 352340
Forceps Inox Tip Dumont  RS-5047 Fine tip curved forceps, size .17 x .10 mm
Micro Forceps Dumont  RS-5090 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Carpenter, A. C., Bosselut, R. Decision checkpoints in the thymus. Nat Immunol. 11, 666-673 (2010).
  2. Starr, T. K., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Positive and negative selection of T cells. Annu Rev Immunol. 21, 139-176 (2003).
  3. Vrisekoop, N., Monteiro, J. P., Mandl, J. N., Germain, R. N. Revisiting thymic positive selection and the mature T cell repertoire for antigen. Immunity. 41, 181-190 (2014).
  4. Stritesky, G. L., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Selection of self-reactive T cells in the thymus. Annu Rev Immunol. 30, 95-114 (2012).
  5. Bousso, P., Bhakta, N. R., Lewis, R. S., Robey, E. Dynamics of thymocyte-stromal cell interactions visualized by two-photon microscopy. Science. 296, 1876-1880 (2002).
  6. Takahama, Y. Journey through the thymus: stromal guides for T-cell development and selection. Nat Rev Immunol. 6, 127-135 (2006).
  7. Halkias, J., Melichar, H. J., Taylor, K. T., Robey, E. A. Tracking migration during human T cell development. Cell Mol Life Sci. 71, 3101-3117 (2014).
  8. Yin, X., Chtanova, T., Ladi, E., Robey, E. A. Thymocyte motility: mutants, movies and migration patterns. Curr Opin Immunol. 18, 191-197 (2006).
  9. Ladi, E., Yin, X., Chtanova, T., Robey, E. A. Thymic microenvironments for T cell differentiation and selection. Nat Immunol. 7, 338-343 (2006).
  10. Klein, L., Kyewski, B., Allen, P. M., Hogquist, K. A. Positive and negative selection of the T cell repertoire: what thymocytes see (and don't see). Nat Rev Immunol. 14, 377-391 (2014).
  11. Ross, J. O., et al. Distinct phases in the positive selection of CD8+ T cells distinguished by intrathymic migration and T-cell receptor signaling patterns. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, E2550-E2558 (2014).
  12. Hu, Z., Lancaster, J. N., Sasiponganan, C., Ehrlich, L. I. CCR4 promotes medullary entry and thymocyte-dendritic cell interactions required for central tolerance. J Exp Med. 212, 1947-1965 (2015).
  13. Anderson, M. S., et al. Projection of an immunological self shadow within the thymus by the aire protein. Science. 298, 1395-1401 (2002).
  14. Takaba, H., et al. Fezf2 Orchestrates a Thymic Program of Self-Antigen Expression for Immune Tolerance. Cell. 163, 975-987 (2015).
  15. McCaughtry, T. M., Baldwin, T. A., Wilken, M. S., Hogquist, K. A. Clonal deletion of thymocytes can occur in the cortex with no involvement of the medulla. J Exp Med. 205, 2575-2584 (2008).
  16. Stritesky, G. L., et al. Murine thymic selection quantified using a unique method to capture deleted T cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 4679-4684 (2013).
  17. Anderson, G., Jenkinson, E. J. Review article: thymus organ cultures and T-cell receptor repertoire development. Immunology. 100, 405-410 (2000).
  18. Hare, K. J., Jenkinson, E. J., Anderson, G. In vitro models of T cell development. Semin Immunol. 11, 3-12 (1999).
  19. de Pooter, R., Zuniga-Pflucker, J. C. T-cell potential and development in vitro: the OP9-DL1 approach. Curr Opin Immunol. 19, 163-168 (2007).
  20. Lian, Z., et al. Intrathymically injected hemopoietic stem cells can differentiate into all lineage cells in the thymus: differences between c-kit+ cells and c-kit < low cells. Stem Cells. 15, 430-436 (1997).
  21. Manna, S., Bhandoola, A. Intrathymic Injection. Methods Mol Biol. 1323, 203-209 (2016).
  22. Goldschneider, I., Komschlies, K. L., Greiner, D. L. Studies of thymocytopoiesis in rats and mice. I. Kinetics of appearance of thymocytes using a direct intrathymic adoptive transfer assay for thymocyte precursors. J Exp Med. 163, 1-17 (1986).
  23. Schmitt, T. M., Zuniga-Pflucker, J. C. Induction of T cell development from hematopoietic progenitor cells by delta-like-1 in vitro. Immunity. 17, 749-756 (2002).
  24. de Pooter, R. F., Schmitt, T. M., Zuniga-Pflucker, J. C. In vitro generation of T lymphocytes from embryonic stem cells. Methods Mol Biol. 330, 113-121 (2006).
  25. Dervovic, D. D., Ciofani, M., Kianizad, K., Zuniga-Pflucker, J. C. Comparative and functional evaluation of in vitro generated to ex vivo CD8 T cells. J Immunol. 189, 3411-3420 (2012).
  26. White, A., Jenkinson, E., Anderson, G. Reaggregate thymus cultures. J Vis Exp. (18), (2008).
  27. Anderson, G., Owen, J. J., Moore, N. C., Jenkinson, E. J. Thymic epithelial cells provide unique signals for positive selection of CD4+CD8+ thymocytes in vitro. J Exp Med. 179, 2027-2031 (1994).
  28. Anderson, G., Jenkinson, E. J. Fetal thymus organ culture. CSH Protoc. (2007).
  29. Mazda, O., Watanabe, Y., Gyotoku, J., Katsura, Y. Requirement of dendritic cells and B cells in the clonal deletion of Mls-reactive T cells in the thymus. J Exp Med. 173, 539-547 (1991).
  30. Ceredig, R., Jenkinson, E. J., MacDonald, H. R., Owen, J. J. Development of cytolytic T lymphocyte precursors in organ-cultured mouse embryonic thymus rudiments. J Exp Med. 155, 617-622 (1982).
  31. Fairchild, P. J., Austyn, J. M. Developmental changes predispose the fetal thymus to positive selection of CD4+CD8 T cells. Immunology. 85, 292-298 (1995).
  32. Bhakta, N. R., Oh, D. Y., Lewis, R. S. Calcium oscillations regulate thymocyte motility during positive selection in the three-dimensional thymic environment. Nat Immunol. 6, 143-151 (2005).
  33. Le Borgne, M., et al. The impact of negative selection on thymocyte migration in the medulla. Nat Immunol. 10, 823-830 (2009).
  34. Ehrlich, L. I., Oh, D. Y., Weissman, I. L., Lewis, R. S. Differential contribution of chemotaxis and substrate restriction to segregation of immature and mature thymocytes. Immunity. 31, 986-998 (2009).
  35. Ueda, Y., et al. Mst1 regulates integrin-dependent thymocyte trafficking and antigen recognition in the thymus. Nat Commun. 3, 1098 (2012).
  36. Dzhagalov, I. L., Chen, K. G., Herzmark, P., Robey, E. A. Elimination of self-reactive T cells in the thymus: a timeline for negative selection. PLoS Biol. 11, e1001566 (2013).
  37. Halkias, J., et al. Opposing chemokine gradients control human thymocyte migration in situ. J Clin Invest. 123, 2131-2142 (2013).
  38. Au-Yeung, B. B., et al. Quantitative and temporal requirements revealed for Zap70 catalytic activity during T cell development. Nat Immunol. 15, 687-694 (2014).
  39. Melichar, H. J., Ross, J. O., Herzmark, P., Hogquist, K. A., Robey, E. A. Distinct temporal patterns of T cell receptor signaling during positive versus negative selection in situ. Sci Signal. 6, (2013).
  40. Hu, Q., Nicol, S. A., Suen, A. Y., Baldwin, T. A. Examination of thymic positive and negative selection by flow cytometry. J Vis Exp. (68), e4269 (2012).
  41. Mombaerts, P., et al. RAG-1-deficient mice have no mature B and T lymphocytes. Cell. 68, 869-877 (1992).
  42. Hogquist, K. A., et al. T cell receptor antagonist peptides induce positive selection. Cell. 76, 17-27 (1994).
  43. Weist, B. M., Kurd, N., Boussier, J., Chan, S. W., Robey, E. A. Thymic regulatory T cell niche size is dictated by limiting IL-2 from antigen-bearing dendritic cells and feedback competition. Nat Immunol. 16, 635-641 (2015).
  44. Melichar, H. J., Ross, J. O., Taylor, K. T., Robey, E. A. Stable interactions and sustained TCR signaling characterize thymocyte-thymocyte interactions that support negative selection. J Immunol. 194, 1057-1061 (2015).
  45. Hadjantonakis, A. K., Macmaster, S., Nagy, A. Embryonic stem cells and mice expressing different GFP variants for multiple non-invasive reporter usage within a single animal. BMC Biotechnol. 2, (2002).
  46. Schaefer, B. C., Schaefer, M. L., Kappler, J. W., Marrack, P., Kedl, R. M. Observation of antigen-dependent CD8+ T-cell/ dendritic cell interactions in vivo. Cell Immunol. 214, 110-122 (2001).
Utarbeidelse og Anvendelser av organotypiske Thymus- skive kulturer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sood, A., Dong, M., Melichar, H. J. Preparation and Applications of Organotypic Thymic Slice Cultures. J. Vis. Exp. (114), e54355, doi:10.3791/54355 (2016).More

Sood, A., Dong, M., Melichar, H. J. Preparation and Applications of Organotypic Thymic Slice Cultures. J. Vis. Exp. (114), e54355, doi:10.3791/54355 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter