Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Hazırlık ve Organotipik Timik Dilim Kültürler Uygulamaları

doi: 10.3791/54355 Published: August 6, 2016
* These authors contributed equally

Summary

Bu akış sitometrisi ile bir arada, T hücrelerinin gelişmekte olan pozitif ve negatif seçim modeli için kullanılabilir, timik dilimlerin hazırlanmasını tarif etmektedir. Timik dilimler de timosit göç, yerelleşme yerinde analizi için uyarlanmış ve immünfloresans ve iki foton mikroskobu ile sinyal olabilir.

Abstract

Fonksiyonel, kendini hoşgörülü T hücre repertuarının nesil sonuçlanan eşsiz ve son derece organize timik mikroçevresinin timik seçim ilerler. T soy bağlılığı ve gelişimini incelemek için in vitro modeller bu süreçte değerli bilgiler sağlamıştır. Bununla birlikte, bu sistemler, T hücresi gelişimi için gerekli olan tam üç boyutlu timik ortam eksikliği ve bu nedenle, in vivo olarak timus seçim eksik yaklaşık değerlerdir. Modelleme T hücre gelişimi ile ilgili sorunlardan bazıları tamamen T hücrelerini gelişmekte olan timus seçimi destekleyen sağlam bir timik mikro sağlamak yerinde modellerinde kullanılarak aşılabilir. Timik dilim Organotipik kültürler in situ teknikleri mevcut tamamlayacak. Timik dilim timik kortikal ve medüller bölgelerin bütünlüğünü korumak ve tanımlanmış bir gelişim aşamasında veya endojen T c Kaplanmış timositlerin gelişimini incelemek için bir platform sağlamakolgun timik mikroçevresinin içinde arşın. fare başına ~ 20 dilim oluşturmak için yeteneği göz önüne alındığında, timik dilim yüksek verimlilik deneyler için ölçeklenebilirlik açısından benzersiz bir avantaj sunuyoruz. Dahası, farklı genetik geçmişleri farklı timik alt kümelerini ya da diğer hücre popülasyonları bindirmek için timik dilimleri ve potansiyelini üreten göreli kolaylığı bu yöntemin çok yönlülüğünü artırır. Burada timik dilimleri, izolasyon ve timositlerin kaplaması ve akış sitometrik analiz için timik dilimlerin ayrışma hazırlanması için bir protokol açıklar. Bu sistem aynı zamanda timosit taşıma, timosit-stromal hücre etkileşimleri ve iki foton mikroskobu ile timik seçimi ile bağlantılı TCR sinyallerinin geleneksel olmayan T hücresi gelişimini incelemek ve görselleştirmek için adapte edilebilir.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

T hücreleri bir işlevsel, serbest-dayanıklı T hücresi repertuarının 1-3 üretimi sağlamak birçok kontrol noktaları karşılaşma, bu süre içinde timus gelişim ara bir dizi farklılık gösterir. Pozitif seçim kortikal timik epitelial hücreler (CTEC) -2,3 üzerindeki majör histokompatibilite kompleks molekülleri (MHC) tarafından sunulan, orta dereceli afınitede, peptide düşük, tanıyan T hücre reseptörleri (TCR) ile timositler hayatta kalmasını teşvik eder. Negatif seçim ve düzenleyici T (T reg) hücre gelişimi MHC 2,4 tarafından sunulan öz-peptid kuvvetle cevap timositlerin ortadan kaldırılması ya da saptırma yoluyla kendini tolerans kurulmasına katkıda bulunur. Olgunlaşmamış CD4 + CD8 + çift pozitif (DP) olgun T hücre alt içine seçim süreci geçmesi ayırt TCRler ifade timositleri, hangi MHC sınıf I kısıtlı CD8 + sitotoksik çoğunluğuveya MHC sınıf ikincil lenfoid organlara 1-3 efektör işlevleri gerçekleştirmek için timus çıkmadan önce, CD4 + yardımcı tek pozitif (SP) T hücrelerini II kısıtlı.

T hücre gelişiminin karmaşıklığı ekleme dinamik göç ve stromal hücre ağının 5-9 boyunca timositleri gelişen hücresel karşılaşır olduğunu. Bu stromal hücreler timosit gelişiminde belirgin rol oynayan ve farklı şekilde pozitif ve negatif seleksiyon 10 meydana timik kortikal ve medüller bölgeler arasında dağıtılır. Pozitif seçim öncelikle korteks yer alsa da, DP timositleri medulla göç ve medulla pozitif seçimi ve soy tamamlanması için gerekli ek sinyaller olabileceğini düşündürmektedir olgun T hücreleri içine ayırt önce TCR sinyallerini gerektirecek devam ettiğini biriken kanıtlar vardır farklılaşma 11,12. Bundan başka,reaktif timositleri 13,14 silinmesini kolaylaştırmak ifade uzman medüller timik epitelial hücreler (MTec) ve mevcut dokuya sınırlı antijenlerin varlığına rağmen, negatif seçim büyük bir kısmı her yerde bulunan bir kendinden peptit dendritik tarafından sunulan ifade yanıt olarak kortekste meydana hücreler 15,16. Böylece, T hücre gelişiminin doğru modelleri timositlerde ve stromal hücreleri arasındaki etkileşimi kolaylaştırır ve bu hücreler pozitif ve negatif seçim tabi olarak timosit göç destekler sağlam kortikal ve medüller bölgeler ile, son derece organize timik mikro sağlamalıdır.

Ex vivo olarak tamamlamak için, yerinde, pozitif ve negatif seçim in vitro bir dizi okuyan bir araç olarak timositlerin analiz eder ve T hücresi gelişiminin in vivo modellerde 17-22 geliştirilmiştir. Recapitulate etmek oldukça zor olmuşturPozitif in vitro seleksiyon, ama Notch ligandı ifade eden kök hücre popülasyonlarının veya stromal hücreler ile T hücre öncülerinin kokültürünün, özellikle OP9-DL1 / 4 hücreleri, in vitro modelde o paha biçilmez bir hale T soy bağlılığı ve sınırlı olumlu seçimi desteklemek için yeteneğine sahiptir çalışma T hücre gelişimi 23-25. Bu sistemin Sınırlamalar Bununla birlikte, bu hücreler timik stromal hücrelerinde bulunan benzersiz peptid işleme makine ve üç boyutlu timik mikro yoksun olduğu gerçeğini içerir.

Daha teknik hantal, in vitro sistemler ile ilgili bazı engelleri aşmak yerinde ve timus seçim vivo modellerde rağmen. Reaggregate timik organ kültürleri (RTOC) timositlerde ve timik stromal hücrelerin 18,26,27 karışımlarını tarif içerir. Bu timik epitel hücre Reaggregates MHC sınıf I ve II ifadesini korumak ve developme destekleyebilirnt konvansiyonel T hücre alt, ama yine de kortikal ve medüller yapıları tanımlanmıştır yoksundur. Fetal timik organ kültürü (FTOC) lymphoreplete timik loplara lymphodepleted timik lob veya timositlerin enjeksiyon yoluyla asılı bırakma kültürü ile timositler ile tohumlandı ve CD4 + ve CD8 + T etkin gelişimini desteklemek edilebilir T hücresi gelişiminin popüler bir modeldir kültür 18,28-31 zaman içinde hücre. Fetal timik lobların kültürünün başlangıcında mTECs bir yetersizlik var, ama tanımlanan kortikal ve medüller yapılar koşullara bağlı zamanla gelişebilir. Önemli bir husus, bu model, tercihan yetişkin T hücre gelişimi karşısında fetal destek olmasıdır. Son olarak, erişkin farelerde tanımlanan timik öncülerinin intrathymic enjeksiyonu teknik olarak zordur ama açıkça destekleyen bir ortam sağlar In vivo T hücresi gelişme. In situ ve in vivo modellerde Bu mükemmel araçlar t'nino çalışma T hücre gelişimi ve kullanımı bir deneme-by-deney temelinde ele alınmalıdır.

Timik dilimleri, ancak, son zamanlarda benzersiz, karmaşık ve genellikle daha yüksek verim denemeleri karşılamak için imkanı ile yerinde timik seçimi incelemek için çok yönlü, tamamlayıcı model olarak ortaya çıkmıştır. Timik dilim kortikal ve medüller bölgeler bütünlüğünü korumak ve geliştirme yanı sıra verimli pozitif ve negatif seleksiyon 11,32-39 sırasında timosit göç destekler stromal hücrelerin bir çerçeve sunmaktadır. Timik dilimleri üstünde eklenen timosit alt kümeleri dokuya ve bunların uygun microenvironmental niş 34,37 göç. üst üste timositleri konjenik işaretleri veya floresan etiketler ile timik dilim endojen hücrelerden ayırt edilebilir ve birkaç gün boyunca kültür içinde muhafaza edilebilir. Timik dilim Organotipik kültürler çeşitli yönlerini incelemek için kullanılabilirdiğerleri arasında timus seçimi, timosit davranışı (göç ve hücresel etkileşimleri) ve timosit lokalizasyonu da dahil olmak üzere T hücresi gelişiminin. Fare başına ~ 20 timus dilim oluşturmak için yeteneği göz önüne alındığında, deney ölçeklenebilirlik timus seçimi yerinde modellerinde diğerinden daha genel olarak daha fazladır. timik dilim hazırlanması uzman gibi vibratome gibi ekipmanları, ve hücre ölümü aracılığıyla zamanla hücre kaybı ve bir kapsül zarının olmaması nedeniyle sınırlıdır kültürde timik dilim yaşam süresi gerektirmesine rağmen, timik dilimleri mükemmel bir model sağlamak olgun timik mikroçevresinin içinde timositlerin senkronize popülasyonlarının timus seçimi analizi için. Burada akım sitometri analizi için timik dilim, izolasyon ve timositlerin bindirilirken, ve ayrışma (timus, timus lobları agaroz gömme ve gömülü doku vibratome bölümlendirilmeleri hasat dahil) timik dilimleri hazırlanmasını tarif etmektedir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Hôpital Maisonneuve-Rosemont - tüm hayvan çalışmaları için protokoller Centre de Recherche de Hayvan Bakım Komitesi tarafından onaylandı.

Timus Dilimleri Hazırlanması ve Tek hücre süspansiyonları 1. Hasat Fare Thymus

  1. Servikal dislokasyon CO2 ile fare öldürülür.
  2. Laminer akış kaputu, bir diseksiyon kurulu fare ventral tarafı pin up. % 70 etanol ile fare püskürtün. göğüs boşluğu giren ve doku zarar etanol önlemek için gazlı bez ile dabbing herhangi bir aşırı alkol çıkarın.
  3. Forseps bir çift ile sternum üssünde cildi kaldırın ve deri yoluyla bir kesim yapmak. Her ön ayakları yukarı derinin kesim uzatın.
  4. göğüs kafesinden diyaframı ayırmak için sternum alt kısmında ek bir kesim olun. Sonra klavikula doğru göğüs kafesinin her tarafını kesti. göğüs boşluğu açığa kafasına doğru göğüs kafesini ters çevirin. iki lobutimüs kalbin üstüne yalan.
  5. forseps, mikro-diseksiyon makas kullanarak timik lobları etrafında bağ dokusunu çıkarın ve / veya keskin kavisli makas. alttan veya bağ dokusu kalan aracılığıyla bireysel lobları kaldırmak için ince uçlu eğri forseps bir çift kullanın.
    Not: doğrudan timus tutmayın.
  6. PBS içeren 15 ml konik tüp içinde timik lobları yerleştirin ve gerektiği kadar buz üzerinde bir kenara koyun.

2. Agaroz gömülmesi ve Timus Lobların Vibratome Dilimleme

  1. Steril PBS, 50 ml 2 g, düşük erime noktalı agaroz eritilmesi ve agaroz tamamen eriyene kadar düşük bir ayar mikrodalga tarafından yerleştirmek için,% 4 agaroz çözeltisi hazırlayın. Kullanım için hazır olana kadar, 55 ° C'de bir su banyosu içinde, alüminyum folyo ve yer ile balon örtün.
  2. Bir doku kültürü kaputu tam% 10 fetal bovin serumu içeren RPMI-1640 ortamı (FBS), 4 mM L-glutamin, 1 x penisilin / streptomisin ve 10 uM hazırlanması2-merkaptoetanol.
  3. 6 oyuklu hücre kültürü plakasına oyuk başına 1.5 mi tam RPMI-1640 ortamı ekleyin ve iyice her bir hücre kültürü ekleme yerleştirin. kadar gerekli 37 ° C'de bir kuluçka kenara plaka ayarlayın.
  4. bir buz kovası, su ve buz ile bir sulu buzlu su banyosu hazırlayın.
  5. Dikkatle ince uçlu forseps kullanarak her timik lobu çevreleyen kalan tüm bağ dokusu kaldırmak. Bir doku üzerine transferi PBS ile ıslatılmış veya bir mikroskop altında mendilin sonra timik lob, bir doku kültürü çanak PBS batmış ise bunu yapın.
  6. Agaroz doku aşırı ısınmasını önlemek için, şişeyi dokunma sadece sıcak 40 ° C'nin altında soğumasını bekleyin. Yaklaşık 1 cm yüksekliğe kadar doku kalıba agaroz soğutuldu% 4 dökün.
  7. dikkatli bir doku silin ve doku zarar vermeden kurutmak için yavaşça rulo timik lob aktarmak için forseps bir çift kullanın. doku tamamen kurur emin olun veya dilimleme sırasında agaroz dışarı kayar.
  8. Dikkatle agaroz lob yerleştirin ve yatay olarak bir kalıbın tabanındaki (dilim sayısını artırmak için) dikey olarak (her dilimin yüzey alanını arttırmak için) ya da her iki konumlandırmak. Agaroz katılaşmaya izin vermek için 5-10 dakika boyunca, buzlu su kalıp yerleştirin.
  9. Bu süre boyunca, tampon kasası montaj numune diski monte ve vibratome bıçak sokulmasıyla dilimleme vibratome hazırlar. numune disk üzerinde laboratuvar bant bir parça yerleştirin. % 70 etanol ile temiz, monte çalışma alanını sterilize edin.
  10. Agaroz katılaşır sonra, yavaşça agaroz gömülü lob serbest bırakmak için kendi merkezinde kalıp ve basın ters.
  11. altta ~ 0.5 cm lob her tarafı ve agaroz ~ 2 mm bırakarak çevreleyen aşırı agaroz kesmek için keskin bir bıçak kullanın.
  12. numune disk üzerinde bant parçasına doku yapıştırıcı bir damla ile her agaroz blok sabitleyin. Birden fazla blok bant yapıştırılmış olabilir.
  13. Vibratome bıçak wi hizalayınAgaroz blok üst th. Bıçak ve agaroz blok (ler) tamamen dalmış kadar steril PBS ile tampon tepsisini doldurun.
  14. Bölüm agaroz gömülü doku 400-500 um bir kalınlığı olan dilimler elde edilmiştir. 0.225 mm / sn hızında, 100 Hz frekansında ve 5 ° açıya Vibratome ayarlayın.
  15. bunlar kesilir steril PBS içeren bir doku kültür plakasına timik dilim toplamak için bükülmüş bir spatula kullanın. İlk ve son dilim atın.
  16. 4X büyütme bir ışık mikroskobu altında dilimleri inceleyin. Bozulmamış timus dokusu ve çevresindeki agaroz (Şekil 1A) ile dilimleri seçin.
  17. yavaşça hücre kültürü eki üzerine eğilmiş spatula gelen timik dilim kaydırmak için pipet kullanarak adım 2.3 hazırlanan plaka dilimleri aktarın. Her insert ~ 3 dilim konaklayabilir. dilimler birbirlerine ya da hücre kültürü eklemek duvarlara dokunmayın emin olun.
  18. gerekli olana kadar, 37 ° C 'de plaka muhafaza edin.
  1. Bölüm 1'de tarif edildiği gibi% 2 FBS içeren steril PBS, 5 ml ile dolu bir steril 15 ml doku öğütücüsü kullanılarak tek bir hücre süspansiyonu yapmak için el loblar ayrıştırmaları timik loblar izole edin. 15 ml konik tüp hücreleri aktarın.
  2. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 545 x g'de santrifüjleyin hücreleri. Süpernatant atılır ve kırmızı kan hücreleri lize etmek için 3 dakika boyunca oda sıcaklığında 1 x ACK lisiz tamponu (0.15 M NH4CI, 10 mM KHCO 3, 0.1 mM Na2EDTA) içinde 1 ml tekrar süspansiyon hücreleri.
  3. PBS,% 2 FBS içeren 15 ml tüp doldurun. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 545 x g'de santrifüjleyin hücreleri.
  4. % 2 FBS içeren 10 ml PBS hücrelerin tekrar ve 255 um ağ filtre içerisinden hücreleri geçer.
  5. Bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 545 x g'de santrifüj hücreleri ve concentr% 2 FBS içeren PBS içinde hücre pelletiniml başına 1 x 10 7 hücre yapımı.
  6. Hücresel böyle carboxyfluorescein süksinimidil ester gibi boyalar (KAKE) dilim endojen hücrelerden ayırt etmek congenic işaretleri veya genetik olarak kodlanmış floresan gazetecilere ifade farelerden alınan timositleri kullanarak değilse üretici protokollerine göre hücreleri etiketleyin.
  7. Etiketli hücrelerin nihai yıkamadan sonra, 15 ul başına 1-3 x 10 6 hücre tam RPMI-1640 ortamı içinde hücre pelletini.

4. Timus Dilimleri üzerine timositlerdeki Kaplama

  1. uç üzerindeki timik dilimleri çevreleyen herhangi bir sıvı aspire bir pipet kullanın.
    Not: agaroz zarar vermemek için özen gösterin. agaroz bozuksa, Kaplanmış timositleri nedeniyle yüzey gerilimi kaybı dilim yüzeyine takmak olmaz.
  2. pipet, bindirme her timik dilim üzerine 3. bölümünde hazırlanan timositlerin 15 ul dilim dokunmadan.
  3. pla inkübe2 saat boyunca 37 ° C 'de te hücreleri timik dilimler halinde göç izin vermek.
  4. 2 saat sonra, henüz dokuya göç değil aşırı Kaplanmış timositleri çıkarmak için 1 ml PBS ile timik dilimleri 3 kez yıkayın.
  5. timik dilim hasat edilmeye hazır olana kadar deneye bağlı olarak genellikle 1-72 saat 37 ° C'de inkübe plakası.

Akım Sitometrisi için Timik Dilimleri 5. Ayrışma

  1. % 2 FBS içeren PBS 150 ul ilave edilerek, her bir dilim için bir mikrosantrifüj tüpü hazırlayın.
  2. timik dilimleri ile doku kültür eki% 2 FBS içeren PBS ile 1 ml ilave edilir ve yavaşça, hücre kültürü ucun yüzeyinden dilim ayırmak için bükülmüş bir spatula ile karıştırılmıştır.
  3. bükülmüş spatula ile mikrosantrifüj tüp Ovülden dilim aktarın.
  4. El ile bir mikrosantrifüj tüp numune havaneli kullanarak dilim bozabilir. bir son hacim 300-2% FBS içeren PBS 150 ul ekleul.
  5. Bir yeni bir mikrosantrifüj tüpü içine 40 um'lik bir filtreden ayrışan doku filtre. Süzülmüş hücreler akım sitometri analizi 40 lekeli hazırdır.
  6. sitometresinde tüm agaroz kaldırılır ve akış sitometresinin yapışmasına neden olmadığından emin olmak için bir akış iletmeden önce hücreleri ikinci kez Filtre.
  7. Bir akış sitometresinde hücreleri elde edilmesi ve daha önce 40 tarif edildiği gibi verileri analiz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Böyle pozitif ve negatif seçim olarak T hücre gelişiminin farklı yönlerini timus dilim destek analizi. Başarılı deneyler için, timus dilim kalitesi çok önemlidir. Böylece, timik dilim timus dokusunun bütünlüğünü sağlamak için muayene edilmelidir ve timus dilim çevreleyen agaroz bozulmamış (Şekil 1A) olduğunu. Agaroz doku içine göç timositlerin sayısında önemli bir azalmaya neden zarar gördüğünde Yüzey gerilimi tehlikeye girebilir. Böylece, doku hasarı veya çentikler endikasyonları ile timik dilim / agaroz gözyaşları (Şekil 1B) atılmalıdır.

TCR transjenik (Tg) fareleri çoğu zaman Poliol boyunca, pozitif seçim sıklığını arttırır her timosit yüzeyi üzerinde tanımlanmış bir fonksiyonel TCR'nin sentezlenmesi için timik noktası çalışma kullanılmaktadırlonal popülasyonu. Pozitif seçim her bir aşamasını yakalamak için, TCR tg timositleri timik dilim üstüne kaplanabilir ön seçim ve olgun gelişimi, CD4 + veya CD8 + T hücreleri, SP 40 akış sitometrisi ile, zaman içinde takip etti. OT-I TCR tg Rag1 I kısıtlı MHC sınıf izole timositleri - / - β2m - / - fareler yüzünden MHC sınıf ile ilişkilendirmek ve stabilize β2m gerekliliği DP sahneye önce timus seçimi de tutuklandı Ben ağır zincir 41 42. - / - Β2m üzerine yerleştirilmiş zaman timik dilimleri, ön seçim OT-I TCR tg timositleri DP aşamasında kalır ve belirgin CD8 + SP T hücreleri (Şekil 2A, sol) oluşturmaz. Endojen seçerek ligandlar içeren WT timik dilimleri üzerine işlenmiş Aksine, pozitif seçim desteklemek için bu modelin yeteneği (sağ Şekil 2A) 72 saatte CD8 + T hücre gelişimi ile kanıtlanır. quPozitif seçim bir okuma olarak CD8 + T hücresi gelişiminin antification Şekil 2B'de de gösterilmiştir.

Timik dilimler de olumsuz bir seçim incelemek için kullanılabilir. Negatif seçim büyük bir bölümü her yerde antijenin 16 tepki olarak ortaya çıkar. - / - Yerde antijenin, OT-I TCR tg Rag1 toplam timositleri negatif seçim modeli için ve vahşi tip (WT) fare, sırasıyla, daha sonra 1 'de karıştırılmıştır CFSE ve CTV'nin ile etiketlenmiştir: WT dilimleri üzerine 1 oranında kaplanmış (Şekil 3A). aşırı timositleri yıkandıktan sonra, timik dilim veya kognatı 1 nM OT-I TCR, SIINFEKL (OVA peptidi) agonist peptidi olmadan RPMI-1640 ortam içine yerleştirilmiştir. Ben ifade hücreleri tüm MHC sınıf timus yayg ifade antijen sunumu modelleme, antijen sunacak. 37 ° C, OT-I TCR tg cel oranında inkübasyon 24 saat sonraWT kontrol hücrelerine mi (% canlı CFSE +) (% canlı CTV +) akış sitometrisi (Şekil 3B) ile karşılaştırılmıştır. OT-I TCR tg hücre orantılı olarak bir azalma OVA peptidine yanıt olarak OTI TCR tg hücre silme temsil eder.

Nedeniyle timik dilim boyutu heterojenite yanı sıra timik dilimler halinde hücre giriş, kimse bu değişkenler için normalleştirmek için uygun analiz ve iç kontrolleri içermelidir dikkat etmek önemlidir. Burada, dilim üstüne OT-I TCR tg hücreleri ile karıştırıldı ve kaplanmış WT hücreleri, bu popülasyon anlamlı OVA peptidi varlığında veya yokluğunda etkilenir olmamalıdır gibi bir iç kontrol olarak kullanıldı. OTI TCR tg hücrelerin negatif seleksiyon ölçüde oranlarda ziyade mutlak numaraları dayalı ölçüldü. İlk olarak, WT OT-I TCR tg (% canlı KAKE +) arasındaki oran varlığında her WT timik dilim (% canlı CTV +) hücreleri OVA peptidinin yokluğu hesaplandı. Bu oranların her biri daha sonra OVA peptidinin yokluğunda WT dilimleri WT OT-I TCR tg (% canlı CFSE +) arasındaki oran (% canlı CTV +) hücrelerin ortalama bölündü. Şekil 3C'de gösterildiği gibi, ortalama olarak, OT-I TCR tg hücrelerin% 80 yerde antijene yanıt olarak tüketildi.

Şekil 1
Şekil 1: Bir dikey yerleştirilmiş timik lob hazırlanabilir timik dilimlerin Örnek ve görüntüler. (A) gömülü doku ve agaroz bozulmamış çevreleyen Kaliteli dilim. (B) nedeniyle dilimleme sırasında gömülü doku yırtılması zarar ile Kalitesiz dilim. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

ove_content "fo: keep-together.within sayfa =" 1 "> şekil 2
Şekil 2:. Timik dilimler pozitif seçim flow sitometri analizleri OT-I TCR tg Rag1 - / - β2m - / - timositleri β2m olmayan seçerek üzerine KAKE ile etiketlenmiş ve kaplanmıştır - / - veya WT dilimleri seçerek. 37 ° C'de inkübasyondan 72 saat sonra, CD8 + T hücresi gelişimi akış sitometrisi ile analiz edilmiştir. (A) Canlı KAKE β2m gelen + TCRβ yüksek timositleri hücre yüzey CD4 ve CD8 ifade Temsilcisi verileri - / - ve WT dilimler. Olmayan seçme kontrollere kıyasla WT dilimleri canlı CFSE + TCRβ yüksek CD8 + T hücre gelişimi (B) belirlenmesi. Her nokta bir birey timik dilim temsil eder ve hat ortalama temsil eder. (*** P <0.001, eşleşmemiş t testi)ove.com/files/ftp_upload/54355/54355fig2large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3,
Şekil 3: timik dilim negatif seçim akış sitometrik analizi bir 1:. Toplam CFSE etiketli OT-I TCR tg Rag1 1 oranında - / - ve CTV etiketli WT timositleri varlığında veya yokluğunda WT dilim kaplanmıştır OVA peptid SIINFEKL. 37 ° C'de inkübasyondan 24 saat sonra, üst üste binen hücrelerin nispi oranları akış sitometrisi ile analiz edilmiştir. (A), deney düzeneği CTV etiketli WT hücreleri (mavi) kaplamasını gösteren 1 karışık şematik: varlığında veya yokluğunda, bir WT timik dilime CFSE etiketli OT-I TCR tg hücreler (yeşil) 1 OVA peptidinin. (B) canlı KAKE + OT-I oranını gösteren Temsilcisi veriOVA peptid olmadan kuluçkalanmıştır dilim TCR tg hücreleri ve CTV + ağırlıkça hücreleri. (C) Veri dilimleri arasında normalize edildi ve CTV + WT hücreleri canlı canlı KAKE + OT-I TCR tg hücrelerin göreceli oranı gösterilmektedir. Hata çubukları standart sapmayı belirtir. Her durum için N = 3. (* p <0.05, eşleşmemiş t testi). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Burada timik dilimleri ve akış sitometrisi ile Kaplanmış ön seçim MHC sınıf I kısıtlamalı TCR transjenik timositlerin etkin pozitif ve negatif seçim için temsili sonuçlar hazırlanması için bir protokol açıklar. Bu sistem, agonist antijen, negatif seçim ve timus regülatör T geliştirme 11,12 mevcudiyetinde, ön seçim DP timositleri 32 MHC sınıf II kısıtlı CD4 + T hücrelerinin pozitif seçim destek benzer başarı ile kullanılabilir, ve edilmiştir 36,38,39,43,44. Bu protokol, genetik olarak tadil edilmiş timositlerde ve stroma hücresi popülasyonlarının, hem de önleyicileri, tanımlanan peptid varlığında veya yokluğunda timik noktası incelemek için modifiye edilebilir. Timus dilimleri de timosit alt-dışındaki hücre popülasyonlarının kaplaması için uygun. Örneğin, yakın zamanda etkin bir şekilde dokuya göç eder ve negatif bir selectio destekleyebilir timik dilimleri üzerine işlenmiş dendritik hücreler gösterilmiştirn ve T reg geliştirme 39,43. Günümüze kadar yapılan çalışmalar olumlu ve olumsuz seçim incelemek için ön seçim DP veya toplam timositleri kullandık. T hücre gelişimi timik dilimler halinde en az 4 gün süreyle devam rağmen bir önceki progenitör nüfusa sahip deneyler başlatılması ilgilenen varsa, sistemin bir sınırlama timik dilim kalitesi sonra düşmeye başlar olduğunu dikkate alınmalıdır bağlı hücre ölümü ve bir kapsülleyici membran olmadığı için kültür 1-2 gün.

Burada tarif edilen protokol, ince değişiklikler insan timus dokusundan dilimleri üretmek için kullanılabilir. Agaroz içine yerleştirilmeden önce, insan timus dokusu, parça halinde bir yetişkin fare timus lob yaklaşık boyutu kesilmelidir. Özellikle, insan timik numuneler iyi kalitede dilimleri hazırlamak için daha zordur, fare timus göre, bağ dokusu bakımından zengindir ve. Bizim tecrübelerimize göre, fetal ziyade yenidoğan insantimik doku dilim hazırlanması için daha elverişli. İnsan timosit alt-gruplar, hem insan ve fare timus dilimleri 37 doğru lokalize olduğu gösterilmiştir. üst üste insan timosit alt-timus seçimi, ancak, henüz timik kesit modeli içinde bildirilmemiştir. Bir poliklonal halktan olumlu seçim verimliliği düşüktür ve bağlı timik dilim Kaplanmış timositlerin düşük oranda (~% 0.5-2) için, olumlu seçili hücrelerin böylesine az sayıda değerlendirmek zor olabilir. Pozitif seçim verimliliği artırmak için insan timik dilim bindirmek için önce insan T hücre progenitör hücrelerin bir insan TCR transgen tanıtmak için uygun olabilir. Bu, diğerleri arasında eksogen peptitler veya diğer hücre popülasyonları ve TCR sinyallerinin inhibitörlerinin varlığında ya da yokluğunda, endojen T hücresi popülasyonunda değişiklikleri izleme imkanı engellemez.

Bu protokol aynı zamanda reklam olabilirtimosit göç, TCR sinyalleri ve hücresel etkileşimleri 12,32-38 görüntülenmesi için Apted. Medulla merkezi timus yer almaktadır olarak yakın zamana kadar, yerinde timosit davranış çalışmaların çoğunda sadece iki foton mikroskobu ile tespit sınırının ötesinde, korteks sınırlı kalmıştır. Buna karşılık, timik dilim dilim bozulmamış timik kortikal ve medüller bölgelere sahip olduğu benzersiz bir avantaj sağlar ve dilim yüzeyi iki foton görüntüleme ile medulla doğrudan erişim sağlar. Buna ek olarak, örneğin indol kalsiyum göstergesi boyalar ile etiketlenmiş hücreler ile kaplanmış timik dilimler, iki foton mikroskopi 11,32,36 pozitif ve negatif seçim ile birlikte, TCR sinyallerinin bir göstergesi olarak sitosolik kalsiyum seviyelerini kullanarak TCR sinyali kontrol etmek için kullanılabilir, 38,39,44. mikroskop için numune hazırlamak için, dilimler protokolün adım 4.5 hemen sonra kullanılabilir. Bu durumda, bakım su uygun floresan işaretlerini seçmek için alınması gerekengörüntüleme itable.

Timik dilim organ kültürleri yerinde fare ve insan T hücre gelişiminin çeşitli yönlerini incelemek için mükemmel bir araçtır. Ancak, bu tekniğin başarılı uygulama protokolü kritik adımları özel dikkat gerektirir. Yüksek verimlilik deneyler için elde edilen timik dilim sayısını maksimize etmek için, kullanılan fare yaş fare ömrü boyunca timus değişikliklerin boyutu olarak dikkate alınmalıdır. Biz genellikle ~ fare başına 20 timus dilim oluşturmak 4-8 ​​haftalık fareler kullanın. Bununla birlikte, fetal neonatal veya daha büyük farenin Thymi teorik kullanıcının deneysel gereksinimlerine bağlı olarak dilim sınırlı bir sayı üretmek için kullanılabilir. kaliteli dilimleri elde etmek için, öncesinde agaroz gömme timik lobu çevresindeki tüm bağ dokusu kaldırmak için her şeyden önemlidir. bağ dokusu kalan verimli dilimleme sırasında vibratome bıçak tarafından kesilir değildir ve timus zarar verebilirloblar ve elde edilen dilimler. Bağ dokusu toplu timus hasat sırasında çıkarılan (1.5 adım a) ve loblar dokusunda önemli manipulasyon olmadan göğüs boşluğundan çıkarılmasını sağlar edilmelidir. Adım 2.5 özetlendiği gibi lobları izole sonra, dikkatle herhangi bir kalıntı bağ dokusu kaldırmak. Buna ek olarak, gömülü dokuyu çevreleyen agaroz bütünlüğünü korumak dilim yüzeyinde etkili bir timositleri aktarma için zorunludur. Bu nedenle, deneyde kullanım için timik dilimleri seçerken timus dilim ve çevresindeki agaroz hem kontrol etmek çok önemlidir. vibratome genellikle kontaminasyon riskini artırarak, doku kültürü kaputu dışında yer almaktadır. deneyler arasında iyice Vibratome temizlenmesi ve önceki dilimleme için% 70 etanol ile çalışma alanı ve Vibratome püskürtme kirlenme potansiyelini sınırlayabilir. p de belirtildiği gibi adımlarda 2,13 ve 2.15 steril PBS kullanmak da önemlidirrotocol. Son olarak, timus endojen hücrelerden dokuya göç Kaplanmış timositleri ayırt etmek de önemlidir. Bu aşama 3.7 'de belirtildiği gibi floresan boyalar ile kaplanmış hücrelerin etiketlenmesi ile elde edilebilir. Seçenek olarak ise, konjenik işaretleri veya genetik olarak kodlanmış floresan haberci ifade farelerden timositleri 45,46 kullanılabilir. Bununla birlikte, genelde, timik dilim manipüle edilmesi kolaydır ve sadece araştırılmaya başlanmıştır olan geniş bir uygulama destekleyici kullanıcının özel deney ihtiyaçlarına adapte edilebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Vibratome Leica Biosystems VT1000S 
NuSieve GTG Agarose Lonza 50080 Low melting temperature agarose
Embedding Mold (Truncated - T12) Polyciences 18986 22 mm x 22 mm square, truncated to 12 mm x 12 mm
Double Edge Prep Blades Personna 74-0002
Tissue Adhesive 3M  1469SB
0.4 µm Cell Culture Inserts  BD Falcon 353090 Of several brands tested, these maintained the cells atop the slices the best
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline ThermoFisher 21600-010
RPMI-1640 with L-glutamine Wisent 350-000-CL
Fetal Bovine Serum Wisent 080-110 Heat inactivated
L-Glutamine, 200 mM Wisent 609-065-EL
Penicillin/Streptomycin, 100x Wisent 450-201-EL
2-Mercaptoethanol Alfa Aesar A15890
15 ml Tenbroeck Tissue Grinders Wheaton 357426
Nylon Mesh Filter Component Supply U-CMN-255
Microcentrifuge Tube Sample Pestle Bel-Art F19922-0000
40 µm Nylon Cell Strainer BD Falcon 352340
Forceps Inox Tip Dumont  RS-5047 Fine tip curved forceps, size .17 x .10 mm
Micro Forceps Dumont  RS-5090 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Carpenter, A. C., Bosselut, R. Decision checkpoints in the thymus. Nat Immunol. 11, 666-673 (2010).
  2. Starr, T. K., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Positive and negative selection of T cells. Annu Rev Immunol. 21, 139-176 (2003).
  3. Vrisekoop, N., Monteiro, J. P., Mandl, J. N., Germain, R. N. Revisiting thymic positive selection and the mature T cell repertoire for antigen. Immunity. 41, 181-190 (2014).
  4. Stritesky, G. L., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Selection of self-reactive T cells in the thymus. Annu Rev Immunol. 30, 95-114 (2012).
  5. Bousso, P., Bhakta, N. R., Lewis, R. S., Robey, E. Dynamics of thymocyte-stromal cell interactions visualized by two-photon microscopy. Science. 296, 1876-1880 (2002).
  6. Takahama, Y. Journey through the thymus: stromal guides for T-cell development and selection. Nat Rev Immunol. 6, 127-135 (2006).
  7. Halkias, J., Melichar, H. J., Taylor, K. T., Robey, E. A. Tracking migration during human T cell development. Cell Mol Life Sci. 71, 3101-3117 (2014).
  8. Yin, X., Chtanova, T., Ladi, E., Robey, E. A. Thymocyte motility: mutants, movies and migration patterns. Curr Opin Immunol. 18, 191-197 (2006).
  9. Ladi, E., Yin, X., Chtanova, T., Robey, E. A. Thymic microenvironments for T cell differentiation and selection. Nat Immunol. 7, 338-343 (2006).
  10. Klein, L., Kyewski, B., Allen, P. M., Hogquist, K. A. Positive and negative selection of the T cell repertoire: what thymocytes see (and don't see). Nat Rev Immunol. 14, 377-391 (2014).
  11. Ross, J. O., et al. Distinct phases in the positive selection of CD8+ T cells distinguished by intrathymic migration and T-cell receptor signaling patterns. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, E2550-E2558 (2014).
  12. Hu, Z., Lancaster, J. N., Sasiponganan, C., Ehrlich, L. I. CCR4 promotes medullary entry and thymocyte-dendritic cell interactions required for central tolerance. J Exp Med. 212, 1947-1965 (2015).
  13. Anderson, M. S., et al. Projection of an immunological self shadow within the thymus by the aire protein. Science. 298, 1395-1401 (2002).
  14. Takaba, H., et al. Fezf2 Orchestrates a Thymic Program of Self-Antigen Expression for Immune Tolerance. Cell. 163, 975-987 (2015).
  15. McCaughtry, T. M., Baldwin, T. A., Wilken, M. S., Hogquist, K. A. Clonal deletion of thymocytes can occur in the cortex with no involvement of the medulla. J Exp Med. 205, 2575-2584 (2008).
  16. Stritesky, G. L., et al. Murine thymic selection quantified using a unique method to capture deleted T cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 4679-4684 (2013).
  17. Anderson, G., Jenkinson, E. J. Review article: thymus organ cultures and T-cell receptor repertoire development. Immunology. 100, 405-410 (2000).
  18. Hare, K. J., Jenkinson, E. J., Anderson, G. In vitro models of T cell development. Semin Immunol. 11, 3-12 (1999).
  19. de Pooter, R., Zuniga-Pflucker, J. C. T-cell potential and development in vitro: the OP9-DL1 approach. Curr Opin Immunol. 19, 163-168 (2007).
  20. Lian, Z., et al. Intrathymically injected hemopoietic stem cells can differentiate into all lineage cells in the thymus: differences between c-kit+ cells and c-kit < low cells. Stem Cells. 15, 430-436 (1997).
  21. Manna, S., Bhandoola, A. Intrathymic Injection. Methods Mol Biol. 1323, 203-209 (2016).
  22. Goldschneider, I., Komschlies, K. L., Greiner, D. L. Studies of thymocytopoiesis in rats and mice. I. Kinetics of appearance of thymocytes using a direct intrathymic adoptive transfer assay for thymocyte precursors. J Exp Med. 163, 1-17 (1986).
  23. Schmitt, T. M., Zuniga-Pflucker, J. C. Induction of T cell development from hematopoietic progenitor cells by delta-like-1 in vitro. Immunity. 17, 749-756 (2002).
  24. de Pooter, R. F., Schmitt, T. M., Zuniga-Pflucker, J. C. In vitro generation of T lymphocytes from embryonic stem cells. Methods Mol Biol. 330, 113-121 (2006).
  25. Dervovic, D. D., Ciofani, M., Kianizad, K., Zuniga-Pflucker, J. C. Comparative and functional evaluation of in vitro generated to ex vivo CD8 T cells. J Immunol. 189, 3411-3420 (2012).
  26. White, A., Jenkinson, E., Anderson, G. Reaggregate thymus cultures. J Vis Exp. (18), (2008).
  27. Anderson, G., Owen, J. J., Moore, N. C., Jenkinson, E. J. Thymic epithelial cells provide unique signals for positive selection of CD4+CD8+ thymocytes in vitro. J Exp Med. 179, 2027-2031 (1994).
  28. Anderson, G., Jenkinson, E. J. Fetal thymus organ culture. CSH Protoc. (2007).
  29. Mazda, O., Watanabe, Y., Gyotoku, J., Katsura, Y. Requirement of dendritic cells and B cells in the clonal deletion of Mls-reactive T cells in the thymus. J Exp Med. 173, 539-547 (1991).
  30. Ceredig, R., Jenkinson, E. J., MacDonald, H. R., Owen, J. J. Development of cytolytic T lymphocyte precursors in organ-cultured mouse embryonic thymus rudiments. J Exp Med. 155, 617-622 (1982).
  31. Fairchild, P. J., Austyn, J. M. Developmental changes predispose the fetal thymus to positive selection of CD4+CD8 T cells. Immunology. 85, 292-298 (1995).
  32. Bhakta, N. R., Oh, D. Y., Lewis, R. S. Calcium oscillations regulate thymocyte motility during positive selection in the three-dimensional thymic environment. Nat Immunol. 6, 143-151 (2005).
  33. Le Borgne, M., et al. The impact of negative selection on thymocyte migration in the medulla. Nat Immunol. 10, 823-830 (2009).
  34. Ehrlich, L. I., Oh, D. Y., Weissman, I. L., Lewis, R. S. Differential contribution of chemotaxis and substrate restriction to segregation of immature and mature thymocytes. Immunity. 31, 986-998 (2009).
  35. Ueda, Y., et al. Mst1 regulates integrin-dependent thymocyte trafficking and antigen recognition in the thymus. Nat Commun. 3, 1098 (2012).
  36. Dzhagalov, I. L., Chen, K. G., Herzmark, P., Robey, E. A. Elimination of self-reactive T cells in the thymus: a timeline for negative selection. PLoS Biol. 11, e1001566 (2013).
  37. Halkias, J., et al. Opposing chemokine gradients control human thymocyte migration in situ. J Clin Invest. 123, 2131-2142 (2013).
  38. Au-Yeung, B. B., et al. Quantitative and temporal requirements revealed for Zap70 catalytic activity during T cell development. Nat Immunol. 15, 687-694 (2014).
  39. Melichar, H. J., Ross, J. O., Herzmark, P., Hogquist, K. A., Robey, E. A. Distinct temporal patterns of T cell receptor signaling during positive versus negative selection in situ. Sci Signal. 6, (2013).
  40. Hu, Q., Nicol, S. A., Suen, A. Y., Baldwin, T. A. Examination of thymic positive and negative selection by flow cytometry. J Vis Exp. (68), e4269 (2012).
  41. Mombaerts, P., et al. RAG-1-deficient mice have no mature B and T lymphocytes. Cell. 68, 869-877 (1992).
  42. Hogquist, K. A., et al. T cell receptor antagonist peptides induce positive selection. Cell. 76, 17-27 (1994).
  43. Weist, B. M., Kurd, N., Boussier, J., Chan, S. W., Robey, E. A. Thymic regulatory T cell niche size is dictated by limiting IL-2 from antigen-bearing dendritic cells and feedback competition. Nat Immunol. 16, 635-641 (2015).
  44. Melichar, H. J., Ross, J. O., Taylor, K. T., Robey, E. A. Stable interactions and sustained TCR signaling characterize thymocyte-thymocyte interactions that support negative selection. J Immunol. 194, 1057-1061 (2015).
  45. Hadjantonakis, A. K., Macmaster, S., Nagy, A. Embryonic stem cells and mice expressing different GFP variants for multiple non-invasive reporter usage within a single animal. BMC Biotechnol. 2, (2002).
  46. Schaefer, B. C., Schaefer, M. L., Kappler, J. W., Marrack, P., Kedl, R. M. Observation of antigen-dependent CD8+ T-cell/ dendritic cell interactions in vivo. Cell Immunol. 214, 110-122 (2001).
Hazırlık ve Organotipik Timik Dilim Kültürler Uygulamaları
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sood, A., Dong, M., Melichar, H. J. Preparation and Applications of Organotypic Thymic Slice Cultures. J. Vis. Exp. (114), e54355, doi:10.3791/54355 (2016).More

Sood, A., Dong, M., Melichar, H. J. Preparation and Applications of Organotypic Thymic Slice Cultures. J. Vis. Exp. (114), e54355, doi:10.3791/54355 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter