Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

تطوير نظام إدراج المشارك ثقافة نوعين الخلوية في غياب خلية خلية الاتصال

Published: July 17, 2016 doi: 10.3791/54356
Automatic Translation
1, 1
1Dept. of Medical Biology, University of Québec

Introduction

دراسة الأنسجة والأعضاء أو الأنظمة في المختبر هي محاولة لتبسيط العلاقات المعقدة جدا القائمة بين عدة أنواع فرعية الخلوية التي تضم الكائنات متعددة الخلايا. في الواقع، في الدراسات المختبرية تجعل من الممكن الحصول على فهم مفصل للسكان خلية واحدة. هناك نوعان من المزايا الرئيسية لإجراء التجارب في المختبر: 1) انخفاض التفاعلات الخلوية، و2) القدرة على التعامل بسهولة البيئة الخلوية. العلماء ومن هنا، سمحت هذه المزايا اثنين للتنبؤ السلوك من أنواع معينة من الخلايا في الجسم الحي، مما أدى إلى القدرة على تنظيم النتائج من التأثيرات خارجي في الكائنات كلها. في هذا المعنى، في المختبر زراعة الخلايا غالبا ما يعمل كجسر يربط علوم الحياة الأساسية والتطبيقية. ومع ذلك، هناك أيضا العديد من عيوب العمل في المختبر، واحد أهمها أن تحفظ معين قد يسكن في فيزيولوجيآل أهمية الظواهر المرصودة. في الواقع، عندما يزرع نوع خلية واحدة في وعاء، تفقد الثقافة، إلى حد مختلف، وصلات خلية خلية مع أنواع الخلايا الأخرى، ومساهمتها في البيئة السائلة من الأنسجة والكائنات الأصلية، والمراسي داخل النسيج الذي مكنها من التمسك هيكل ثلاثي الأبعاد خاص حاسما في بعض الأحيان من أجل وظيفة الخلية.

وقد تم تناول مسألة العلاقات خلية خلية من خلال تطوير تقنيات زراعة المختلطة. في هذه الطريقة، وتزرع اثنين أو أكثر من السكان الخلية معا في سفينة الثقافة نفسها. ومع ذلك، هذه الثقافات مختلطة تحمل المضايقات الهامة. من جهة، وبعض أنواع فرعية الخلية لا تتفاعل جسديا مع بعضها البعض في الأنسجة المنشأ والاعتماد فقط على الاتصالات نظير الصماوي التي لحقت العوامل القابلة للذوبان يفرز ومستقبلات المجاورة. هذا هو الحال لعدة عمليات الالتهابات التي تعتمد على إشارات خلوى القريبة. في ج مختلطةultures، والتفاعلات المادية التي لا يمكن تجنبها وتجعل من المستحيل لدراسة الاتصالات نظير الصماوي في غياب الاتصالات خلية خلية التي يمكن أن تسفر عن نتائج المتغيرة. من ناحية أخرى، وتحقيق التفسيرات خلايا محددة من داخل الخليط السكاني يصبح غير مجد دون استخدام تقنيات الفصل القاسية التي يمكن أن تؤثر بشكل كبير على النتائج.

لحل هذه القضايا الهامة، وقد تم تطوير استخدام وسائل الإعلام مشروطة كأسلوب السماح للثقافات مجزأة ودراسة الإشارات نظير الصماوي. يتطلب هذا الأسلوب نقل طاف من نوع خلية واحدة، وبالتالي اسمه مكيفة المتوسطة، إلى الآبار التي تحتوي على مجموعة أخرى من الخلايا. ومع ذلك، ولكن هناك عائقا مهما هو أن جزيئات قصيرة الأجل لا البقاء على قيد الحياة لفترة كافية في المتوسط ​​مكيفة على أن يتم تحويلها إلى آبار السكان الثاني من الخلايا. سيتم حتى جزيئات طويلة العمر تضعف إلى حد كبير مع مرور الوقت بسبب نشرها. وعلاوة على ذلك، سواء خليةالسكان يشارك فقط في مجال الاتصالات نظير الصماوي أحادي الاتجاه وليس في اتصال ثنائي الاتجاه النشط. وهذا يقود إلى عدم وجود إشارات ردود الفعل التي أمر حيوي في إعادة العلاقات متعددة الخلايا دقيقة لأنها موجودة في الجسم الحي.

ونتيجة لذلك وبدافع الحاجة لمحاكاة أفضل الأصلي في ظروف المجراة في المختبر في البيئة الخلوية، وقد تم تحقيق العديد من التطورات في تقنيات زراعة الخلايا على مر السنين. كان واحدا من التقدم الأكثر أهمية استخدام دعامات قابلة للاختراق مع الأغشية الصغيرة التي يسهل اختراقها لcompartmentalizing مزارع الخلايا، وتستخدم لأول مرة من قبل Grobstein في عام 1953 1. وقد جرى تصميم هذه الدعامات منفذة على مر السنين لاستيعاب العديد من أنواع الخلايا واستخدامها في العديد من التطبيقات المختلفة. في الوقت الحاضر، وهذه تدعم وجود تدرج كما جوفاء التي تم تصميمها للراحة في الآبار من لوحة زراعة الأنسجة multiwell أو في التعأطباق لار. في نظام الثقافة المشتركة، وإدراج يحتوي على نوع من الخلايا واحدة في حين البئر أو طبق يحتوي على السكان الخلوية الأخرى، مما يسمح لدراسة مساهمة اثنين من مجموعات مختلفة من الخلايا في بيئة الخلطية منها (الشكل 1). ونتيجة لذلك، يتم الحفاظ على الاستقطاب الخلوي (basolateral مقابل إفراز قمي أو استقبال إشارة)، مما يمنح أنظمة إدراج ثقافة مشتركة ميزة مهمة ضد الثقافات المختلطة وتقنيات المتوسطة مكيفة. تتوفر عدة أنواع من المواد غشاء، وأكثرها شيوعا هو البوليستر (PET)، والبولي (PC) أو المغلفة الكولاجين تترافلوروإيثيلين (PTFE)، وكانت موجودة في أحجام المسام مختلفة تتراوح من 0.4 ميكرومتر إلى 12.0 ميكرون. هذه الأصناف من المواد وأحجام المسام تقدم تشكيلة واسعة من إدراج ممارسة ملامح متغيرة ذات الصلة إلى الخصائص البصرية، وسمك الغشاء والالتزام الخلية التي جعلها عملية على مختلف المستويات ليلي يستخدم سبيل المثال لا الحصر:
-studyingتمايز الخلايا، التطور الجنيني، الانبثاث ورم وإصلاح الجرح بواسطة فحوصات chemotaxic من خلال نفاذية الأغشية.
-evaluating تغلغل المخدرات عن طريق تقييم وسائل النقل من خلال الطبقات الوحيدة الظهارية أو البطانية مثقف على دعامات قابلة للاختراق، و.
-إجراء خلية المشترك الثقافات لتحليل التحويرات سلوك الخلايا الناجم عن العوامل القابلة للذوبان يفرز في حالة عدم وجود خلية خلية الاتصال.

والغرض من هذه المقالة هو وصف المبادئ التوجيهية المنهجية العامة لأداء وظيفة الثالثة المذكورة أعلاه، وهذا هو لتقييم التغيرات الخلوية بوساطة العوامل القابلة للذوبان يفرز في حالة عدم وجود خلية خلية الاتصال باستخدام نظام إدراج ثقافة مشتركة. العديد من المجالات المختلفة للبحث الاستفادة من أنظمة إدراج ثقافة مشتركة من أجل الإجابة على الأسئلة ذات الصلة لتأثير العوامل القابلة للذوبان يفرز على السكان من الخلايا. في الواقع، يشير نظير الصماوي الذي ينظم السلوك الخلوي على مختلف المستويات هي ذات الصلة في جميع الأنسجةوالنظم، مما يجعل الأنظمة شارك في ثقافة إدراج لا غنى عنها لضمان التقدم في هذه المجالات. على العكس من ذلك، استخدام إدراج ان اؤكد ان نقل الإشارة هو عن طريق الاتصال المباشر خلية خلية وليس العوامل يفرز. واحدة من أهم استخدامات تدرج في الدراسات التهاب 2-14 حيث يتم تقييم تأثير السيتوكينات يفرز في مختلف اللاعبين الخلوي للمناعة. على وجه الخصوص، وقد استفادت الدراسة من التهاب في الجهاز العصبي المركزي (CNS) كثيرا من الدراسات إدراج الثقافة المشتركة، التي سمحت لتحديد أفضل الأدوار نظير الصماوي متميزة من الخلايا العصبية والخلايا الدبقية الصغيرة في القيادة neuroinflammation 15-21. وقد وضعت هذه الأنظمة أيضا لدراسة إمكانية المضادة للالتهابات من الجزيئات التي تعتمد على قدرتها على تقليل أو منع إفراز العوامل المؤيدة للالتهابات 22-26. الأبحاث المتعلقة بسرطان 27-31، ولا سيما الآليات الكامنة وراء الأوعية الدموية 32-34 وinflammatiعلى 35-42 في تكون الأورام، يستفيد أيضا من أنظمة إدراج ثقافة مشتركة. وعلاوة على ذلك، والعوامل القابلة للذوبان هي ذات أهمية قصوى في العمليات التي تقود التمايز والعديد من الدراسات قد استخدمت تدرج للإجابة على الأسئلة في هذا المجال بشكل خاص 43-50. في الجهاز العصبي المركزي، كما نرى الأنسجة العصبية لديها امكانات تجديد محدودة للغاية، ودراسة neurotrophism والعصبية هي الأساسية، وقد ضمنت على نطاق واسع عن طريق استخدام الخلايا الجذعية في أنظمة شارك في ثقافة 51-56. وبالإضافة إلى ذلك، تستخدم تدرج أيضا في مجالات متنوعة مثل أمراض الكلى 57،58، والتفاعلات البطانية والأوعية الدموية 59-62، موت الخلايا المبرمج يشير 63-65، والتهاب في السمنة ومتلازمة الأيض 22،23،66-67، الأذن الداخلية حماية خلايا الشعر 68،69، وحتى في فطر الفوعة 70،71 و 72،73 الطفيليات.

تقدم هذه المقالة المبادئ التوجيهية المنهجية العامة من أجل اقامة experimوالأنف والحنجرة في ضوء تقييم التغيرات الخلوية بوساطة العوامل القابلة للذوبان يفرز باستخدام نظام إدراج ثقافة مشتركة. على وجه الخصوص، سوف نركز اهتمامنا على الخلايا العصبية المشترك الثقافات واستخداماتها في دراسة عملية neuroinflammatory. وبالنظر إلى طيف واسع جدا من التجارب التي تدرج تجعل من الممكن التجريبية، فإنه أمر لا يطاق لتغطية كل من هذه التقنية زراعة الخلايا الجانب. وكمثال على ذلك، بروتوكول معين لقياس آثار السيتوكينات التي يفرزها lipopolysaccharide في (LPS) -activated الخلايا الدبقية الصغيرة N9 على الخلايا PC12 العصبية سيتم تفصيله، وتقديم فهم ملموس منهجية إدراج ثقافة مشتركة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ملاحظة: كل من الخطوات التالية يجب أن تتم تحت ظروف معقمة في غطاء تدفق الصفحي على النحو المطلوب لزراعة الخلايا الثديية. وبالإضافة إلى ذلك، فإن المبادئ التوجيهية العامة للزراعة الخلايا العقيمة المثلى تنطبق، على سبيل المثال.، ونبذ نصائح أي وقت أنها قد تؤدي إلى التلوث، وتقليل كمية من الخلايا الوقت تتعرض للهواء عند إجراء تغييرات وسائل الإعلام كلها، صحيح ولكن اثارة بلطف كل تعليق خلية لضمان pipetting لمن متجانس، الخ وعلاوة على ذلك، وتدرج هي نوع من بلستيكور التي تتطلب معالجة خاصة. أولا، كلما يتم التلاعب إدراج، وتجنب لمس الأغشية الهشة التي الدموع بسهولة، وبالتالي يمكن أن يعرض للخطر التجربة. أيضا، أنها ليست مناسبة لإجراء الشفط من خلية ثقافة المتوسط، كما أن هناك خطر ثقب الغشاء أو عدم الربط الخلايا الملتصقة. بعد ذلك، إدراج تعليق فضفاضة في لوحة زراعة الأنسجة multiwell، وبالتالي لا بد من استخدام الحذر عند موفينج وبلستيكور أو عندما pipetting للتجنب فصل الخلايا الملتصقة. وبالإضافة إلى ذلك، عند استخدام إدراج مع أحجام المسام الكبيرة، هناك احتمال أن خلية ثقافة المتوسط ​​يتسرب من خلال الغشاء، وبالتالي، من المهم كثيرا لمراقبة مستوى السائل. وأخيرا، لاحظ أن البروتوكول التالي تم تصميم لخلايا ملتصقة ويتطلب تعديلات طفيفة لكي تكون مناسبة للخلايا تعليق.

1. مبادئ توجيهية عامة لإجراء التجارب إدراج ثقافة مشتركة

  1. بذر نوع من الخلايا # 1 في إدراج
    1. بسط إدراج من عبواتها.
    2. وضع تدرج في multiwell لوحة زراعة الأنسجة فارغة من البعد المناسب. للقيام بذلك، وقبضة حافة العلوية من إدراج باستخدام الملقط.
    3. لتحسين مرفق وانتشار الخلايا الملتصقة، شرط يدرج مع خلية ثقافة المتوسط ​​قبل البذر. للقيام بذلك، وتغطي كامل سطح الغشاء مع جامعة المدينة العالمية خلية ثقافةم باستخدام micropipette.
      ملاحظة: هل هذا لأكبر عدد ممكن من إدراج كما هو مطلوب.
    4. استبدال الغطاء عن لوحة واحتضان لمدة لا تقل عن 1 ساعة أو O / N في ظل نفس الظروف (عادة 37 درجة مئوية، 5-10٪ CO 2).
    5. عندما يتم مكيفة للإدراج، إزالة كافة مستنبت الخلية باستخدام micropipette. تجاهل الوسيلة المستخدمة.
    6. بذور نوع من الخلايا # 1 في الطازجة مستنبت الخلية بنفس الطريقة كما هو الحال في لوحة multiwell. للقيام بذلك، ورسم حجم مناسب لتعليق الخلية مع micropipette والاستغناء السائل في إدراج.
      ملاحظة: إعداد العديد من الملاحق على النحو المطلوب.
    7. بعد البذر جميع إدراج، صخرة بلطف لوحة اليسار واليمين، ثم ذهابا وإيابا من أجل توزيع الخلايا بالتساوي. تجنب الوقوع في حركات دائرية، وهذا سوف يسبب الخلايا لتتراكم في وسط إدراج.
    8. وضع غطاء على لوحة واحتضان كما هو محدد من قبل وفقا لمتطلبات الخلوية (عادة 37 درجة مئوية، 5-10٪ CO
  2. بذر نوع من الخلايا # 2 في زراعة الأنسجة لوحات multiwell
    1. بذور نوع من الخلايا # 2 في جديدة خلية ثقافة المتوسط ​​وفقا للمادة 1.
    2. إعداد العديد من الآبار على النحو المطلوب لعدد من الملاحق. موسيقى الروك لوحة كما في الخطوة 1.1.7) للتأكد من أن الخلايا يتم توزيعها بالتساوي في الآبار.
    3. وضع غطاء على لوحة واحتضان في ظل نفس الظروف (عادة 37 درجة مئوية، 5-10٪ CO 2).
  3. متوسطة منعش في إدراج
    1. باستخدام micropipette، وإزالة كل أو جزء من خلية ثقافة المتوسط، في إدراج تحتوي على نوع من الخلايا # 1. تجاهل الوسيلة المستخدمة.
    2. رسم حجم مناسب من جديد مستنبت الخلية. راحة بلطف طرف على الجدار الداخلي للإدراج والاستغناء ببطء مستنبت الخلية.
    3. وضع غطاء على لوحة واحتضان وفقا خطوة 1.1.4.
  4. متوسطة منعش في لوحات زراعة الأنسجة multiwell
    1. باستخدام micropipette، إزالة جزء أو كل خلية ثقافة المتوسط ​​في الآبار التي تحتوي على نوع من الخلايا # 2. تجاهل الوسيلة المستخدمة.
    2. رسم حجم مناسب من جديد مستنبت الخلية. ضع طرف على الجدار الداخلي للبئر والاستغناء ببطء مستنبت الخلية.
    3. وضع غطاء على لوحة واحتضان وفقا لبروتوكولات زراعة الخلايا المحددة سابقا.
  5. نقل إدراج تحتوي على نوع من الخلايا # 1 لوحات زراعة الأنسجة multiwell تحتوي على نوع من الخلايا # 2.
    ملاحظة: إجراء هذه الخطوة عند كل أنواع الخلايا قد وصلت إلى مرحلة النمو المناسبة.
    1. قبل نقل إدراج في الآبار، إجراء أية تغييرات المتوسطة الضرورية، كما هو موضح سابقا في خطوات 1.3) و 1.4).
      ملاحظة: عند هذه النقطة، فمن المهم أن الاستغناء عن كميات مناسبة من وسائل الإعلام في كل من المقصورات على النحو الذي يحدده إرشادات الشركة المصنعة إدراج و.
    2. باستخدام الملقط، وقبضة حافة العلوية لإدراج تحتوي على الخلايا التائيةYPE # 1 ووضع برفق في المناسبة التي تحتوي أيضا نوع من الخلايا # 2.
    3. بعد نقل جميع الملاحق، والتحقق من وجود فقاعات الهواء تحت غشاء إدراج.
      ملاحظة: فقاعات الهواء تمنع أي تبادل عبر الغشاء من إدراج ويمكن أن تؤثر سلبا على التجربة برمتها.
    4. إذا فقاعات الهواء موجودة، ورفع بلطف شديد إدراج من ملاقط جيدا باستخدام ويغرق مرة أخرى في خلية ثقافة المتوسط. فقاعات سوف تختفي. إذا كانت لا تزال موجودة، حاول بلطف غمس إدراج مرة أخرى في مستنبت الخلية في زاوية.
      ملاحظة: لا تدق أو إثارة إدراج لتجنب فصل الخلايا الملتصقة.
    5. بعد إزالة جميع فقاعات الهواء والتحقق من أن وحدات التخزين من وسائل الإعلام في كل من المقصورات، ووضع غطاء على لوحة واحتضان.
  6. وسائل الإعلام منعشة في نظام المشاركة في الثقافة
    ملاحظة: على الرغم من أن غشاء يسمح بسهولة التبادلات الاعلامية بين إدراج وبصحة جيدة، منعش والمتوسطة هو الحال فيكل من المقصورات منذ الوقت اللازم للوصول إلى التوازن في المقصورات العلوية والسفلية عن طريق الانتشار وحدها يمكن أن تكون طويلة جدا.
    1. يتم المتوسطة منعش في إدراج تحتوي على نوع من الخلايا # 1 في بنفس الطريقة كما في الخطوة 1.3).
    2. لتحديث المتوسطة في الآبار التي تحتوي على نوع من الخلايا # 2، الشريحة بلطف الإدراج إلى جنب لخلق مساحة واسعة بما فيه الكفاية لاستيعاب طرف ماصة. تحديث المتوسطة كما في الخطوة 1.4).
    3. تحقق من وجود فقاعات الهواء والتحقق من الكميات حسب الخطوات 1.5.3) من خلال 1.5.5).

2. مثال: قياس آثار السيتوكينات التي يفرزها الخلايا الدبقية الصغيرة N9 تنشيط LPS-على الخلايا العصبية PC12

ملاحظة: تم تصميم الخطوات التالية لقارورة محددة، بشكل جيد والأحجام طبق. ومع ذلك، فإن البروتوكول يمكن تخصيص أي أبعاد بلستيكور. وسائل الإعلام والتكوين انظر المواد الجدول.

  1. البذر والتفريق خلايا PC12 في متعددةجيدا لوحات زراعة الأنسجة
    1. دافئ الروتيني مستنبت خلايا PC12، PC12 التمايز المتوسطة والتربسين-EDTA في حمام مائي 37 درجة مئوية.
    2. استخدام خلايا PC12 في 60-80٪ التقاء من 75 سم 2 قارورة.
    3. مع 15 ملم ماصة باستير، نفذ الشفط من خلية ثقافة المتوسط ​​بأكمله في قارورة.
    4. شطف بلطف أحادي الطبقة الخلية مع 5 مل من العقيمة الفوسفات مخزنة المالحة وإزالة السائل مع ماصة باستور. يجب الحرص على عدم فصل الخلايا في هذه الخطوة.
    5. تغطية أحادي الطبقة الخلية مع 3 مل من التربسين-EDTA واحتضان لمدة 2-3 دقائق عند 37 درجة مئوية.
    6. ضمان فصل كل الخلايا تحت المجهر. إذا عدد قليل جدا من الخلايا العائمة، واحتضان لفترة أطول لمدة أقصاها 5 دقائق.
    7. إضافة 10 مل من الروتين مستنبت خلايا PC12 من أجل إبطال نشاط التربسين-EDTA.
    8. مع ماصة 10 مل، يسحن بلطف حين التأكد من أن معظم الخلايا فصلها من القاع سو القارورة. تجنب خلق فقاعات الهواء في تعليق خلية.
    9. مع نفس ماصة 10 مل، ونقل تعليق الخلية في أنبوب الطرد المركزي 50 مل.
    10. أجهزة الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في 3200 x ج
    11. تجاهل طاف مع ماصة باستور مع الحرص على عدم تعكير صفو بيليه.
    12. إضافة 10 مل من الروتين مستنبت خلايا PC12 مع ماصة 10 مل.
      ملاحظة: هذا الحجم يمكن تعديلها إذا كان بيليه هو صغير بشكل غير عادي أو كبير.
    13. يسحن مع نفس ماصة 10 مل لتجانس بيليه. خلايا PC12 غالبا ما تتجمع معا حتى لا يقل عن 20 pipetting صعودا وdownare اللازم.
      ملاحظة: في حين ضروري الطحن قوية، وتجنب خلق فقاعات الهواء في تعليق خلية.
    14. في أنبوب 1.5 مل، وإعداد التخفيف المناسبة لتعليق الخلية باللون الأزرق التريبان. عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات وفقا للبروتوكولات المعمول بها سابقا 74.
    15. في أنبوب 50 مل منفصل، تقسيم تعليق خليةمع متوسط ​​PC12 التمايز للحصول على المخفف تعليق خلية مناسبا لبذر الآبار من 24 لوحة جيدا (30000 ¢ / سم 2، 0.6 مل لكل بئر وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة).
      ملاحظة: 24 لوحة جيدا يجب أن تكون مغلفة سابقا مع الكولاجين كما هو محدد من قبل البروتوكولات المعمول بها سابقا 75.
    16. توزيع 0.6 مل من تعليق خلية لكل بئر باستخدام micropipette.
    17. عندما تكون جميع الآبار المصنفة، صخرة لوحة كما في الخطوة 1.1.7).
    18. للسماح للتمييز الصحيح من خلايا PC12، احتضان 24 لوحات جيدا ل7-9 أيام عند 37 درجة مئوية في جو رطب 5٪ CO 2 في PC12 التمايز المتوسطة 15،16 قبل إجراء التجارب ثقافة مشتركة.
    19. إجراء تغييرات متوسطة كل يوم عن طريق إزالة نصف من السائل واستبدالها مع حجم مساو من جديد المتوسطة PC12 التمايز.
  2. بذر الخلايا الدبقية الصغيرة N9 في إدراج وعلاج مع LPS
    1. يوم واحد قبل تنفيذ التجارب ثقافة مشتركة، قبل علاج PTFE 0.4 ميكرون إدراج المسام مع روتيني N9 خلية ثقافة المتوسط ​​لتحسين الالتزام الخلية بعد خطوات 1.1.1) من خلال 1.1.4)
    2. دافئ الروتيني N9 مستنبت الخلية والتربسين- EDTA في حمام مائي 37 درجة مئوية.
    3. وفي الوقت نفسه، تزن حوالي 10 ملغ من LPS في أنبوب 1.5 مل لاستخدامها لاحقا.
      ملاحظة: منذ LPS هو قوي الذيفان الداخلي الموالية للالتهابات ويتطلب احتياطات السلامة معينة، والنظارات والقفازات، وينصح جهاز للتنفس الصناعي الجسيمات بقوة.
    4. استخدام الخلايا N9 في 80-90٪ التقاء من 75 سم 2 قارورة.
    5. اتبع الخطوات 2.1.3) ل2.1.14). دائما استخدام الروتيني المتوسطة N9 زراعة الخلايا بدلا من روتين مستنبت خلايا PC12. نلاحظ أيضا أن الخلايا الدبقية الصغيرة N9 لا تتجمع معا بقدر ما تفعل الخلايا PC12، لذلك أقل pipetting صعودا وهبوطا قد يكون من الضروري في خطوة 2.1.13).
    6. في أنبوب 50 مل منفصل، تقسيم تعليق خلية مع مستنبت الخلية N9 إلى obtain تعليق خلية المخفف المناسب لبذر إدراج مصممة على عقد في 24 لوحات جيدا (60،000 ¢ / سم 2، 0.05 مل لكل إدراج وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة، لمساحة سطح غشاء الاطلاع على معلومات الشركة المصنعة).
      والمغلفة هذه إدراج بالفعل مع الكولاجين من قبل الشركة المصنعة والأمثل لالتصاق الخلية: ملاحظة.
    7. توزيع 0.05 مل من تعليق خلية في إدراج باستخدام micropipette.
    8. عند كافة إدراج المصنف، صخرة لوحة كما في الخطوة 1.1.7).
    9. أداء التخفيفات المسلسل من LPS باستخدام N9 العلاج المتوسطة للحصول على 4 ميكروغرام / مل، 2 ميكروغرام / مل و 1 ميكروغرام / مل حلول العمل.
    10. ماصة 0.05 مل من مل من محلول 4 ميكروغرام / العمل في واحد من مجموعة من الملاحق من أجل أن تسفر عن تخفيف النهائي من 2 ميكروغرام / مل.
    11. كرر الخطوة 2.2.10) لمدة الحلول العاملة الأخرى في مختلف إدراج مجموعات، مما أسفر عن التخفيفات النهائية من 1 ميكروغرام / مل و 0.5 ميكروغرام / مل على التوالي.
    12. فيcubate لوحات تحتوي على إدراج لمدة 24 ساعة على 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 جو رطب للسماح N9 الخلايا الدبقية الصغيرة تنشيط مع LPS قبل إجراء التجارب ثقافة مشتركة.
  3. الخلايا PC12 العصبية مع الخلايا الدبقية الصغيرة N9 زراعة المشارك
    1. في 7-9 أيام من تمييز خلايا PC12، وتفعيل الخلايا الدبقية الصغيرة N9 بعد 24 ساعة من الحضانة مع LPS التي كتبها دافئ N9 المتوسطة العلاج وPC12 المتوسطة العلاج في حمام مائي 37 درجة مئوية.
    2. إجراء التغيير الكلي المتوسط ​​لالخلايا الدبقية الصغيرة N9 كما في الخطوة 1.3)، لتحل محل الوسيلة المستخدمة بأكمله بنسبة 0.1 مل من N9 المتوسطة العلاج. هل هذا كل insert.This أمر ضروري لإزالة كل آثار LPS، ولم يتبق سوى تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة N9 في إدراج.
    3. إجراء تغيير المتوسطة الكلي لخلايا PC12 العصبية كما في الخطوة 1.4). نقل إدراج في 24 لوحات جيدا كما في الخطوة 1.5) .Incubate على N9-PC12 المشترك الثقافات لمدة 24 ساعة أو 48 ساعة على 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 جو رطب.
    4. بعد 24ساعة أو 48 ساعة، حصاد طاف و / أو الخلايا من أجل سمية الخلايا، فحص انزيم مرتبط المناعي (ELISA)، لطخة غربية، أو فحوصات أخرى.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

استخدام نظم شارك في ثقافة إدراج يرتدي أهمية خاصة في دراسة العمليات neuroinflammatory التي تظهر العلاقات نظير الصماوي بين اللاعبين الخلوية المختلفة للجهاز العصبي المركزي. ويتم إنجاز الحصانة في الجهاز العصبي المركزي بشكل رئيسي من قبل خلايا مقيمة تسمى الخلايا الدبقية الصغيرة التي ترصد بيئتهم يستريح في دولة متشعبة (الشكل 2A)، وتكون قادرة على الاضطرابات الاستشعار يمكن ان تسبب متاعب للتوازن ثمين جدا ضروري لوظيفة الخلايا العصبية السليمة 76-78. وصف تنشيط دبقية، والتي تتميز اعتماد شكل أميبية (الشكل 2B) وتكاثر السكان خلية كثرة الدبيقيات (الشكل 3)، يليه الافراج عن وسطاء الموالية للالتهابات، مثل السيتوكينات، يشكل جانبا كبير من neuroinflammation 79 . يخدم الافراج خلوى الغرض النبيل في حماية الخلايا العصبية ضد الاعتداءات الضارة وغير كلوسمراقبة اعل. ومع ذلك، عندما يهرب neuroinflammation هذه رقابة مشددة، فإنه يعتمد على طبيعة المدمرة وقد تجرح بجدية الجهاز العصبي المركزي. بقدر ما لها الأنسجة العصبية إمكانية تجديد محدودة جدا، والجهاز العصبي المركزي مما يزيد من عرضة لمثل هذه الاستجابات الالتهابية السيارات المدمرة. دراسة الحديث المتبادل، التي تربط بين الخلايا العصبية والخلايا الدبقية الصغيرة أمر حتمي في توضيح الآليات الكامنة وراء neuroinflammation. على عكس ثقافات متباينة، وأنظمة إدراج ثقافة مشتركة تمكن المحقق لتحديد أي سكان الخلية هو توليد آثار سامة واحد الذي يتأثر.

هنا، كانت خلايا PC12 متباينة ل7-9 أيام مع عامل نمو الأعصاب شارك في تربيتها مع الخلايا الدبقية الصغيرة N9 تنشيط LPS مع هدف quantifyingthe الآثار الضارة من العوامل القابلة للذوبان المستمدة من التهاب في الخلايا العصبية. للقيام بذلك، زرعت الخلايا PC12 العصبية في لوحات 24 بشكل جيد في حين كانت المصنفة الخلايا الدبقية الصغيرة N9 في إدراج. N9 microgliوعولج لمدة 24 ساعة مع LPS، والذيفان الداخلي قوي جدا الموالية للالتهابات تتألف في الأغشية الخارجية للبكتيريا سالبة الجرام. ومن المعروف LPS لتفعيل مثل عدد مستقبلات 4 وبالتالي انتزاع الاستجابة الالتهابية قوية في طائفة واسعة من الخلايا المستجيب المناعة، بما في ذلك خط الخلية الفئران خلد N9 الخلايا الدبقية الصغيرة 80،81. تظهر نتائج ممثل التالية التي الخلايا الدبقية الصغيرة N9 تفعيلها مع LPS لديهم ميل لزيادة عدد سكانها (الشكل 3)، وتفرز للذوبان السيتوكينات الموالية للالتهابات، مثل انترلوكين 6 (IL-6)، انترفيرون جاما (IFN-γ) و عامل نخر الورم ألفا (TNF-α)، التي تعبر بسهولة الغشاء من إدراج ثقافة مشتركة وتسبب الضرر السامة للخلايا إلى خلايا PC12 العصبية المتزايدة في المقصورة أقل.

والشغل الشاغل قبل نقل الخلايا الدبقية الصغيرة N9 تنشيط LPS إلى الآبار التي تحتوي على الخلايا PC12 العصبية يتكون في تأكيد ثار PC12 يتم التمييز بشكل صحيح. سبعة أيام خلايا PC12 متباينة يجب أن تظهر الظواهر العصبية واضحة مثل خلايا الجسم تملق، الذي مشاريع عدة neurites التي طويلة أنفسهم أحيانا تظهر دوالي (الشكل 4). مرة واحدة يتم تنفيذ هذا الحاجز، وتدرج الخلايا الدبقية الصغيرة N9 تحتوي متوسطة جديدة خالية من LPS يمكن نقلها إلى الآبار التي تحتوي PC12 متباينة. بعد فترة حضانة المرض من 24 ساعة أو 48 ساعة، وطاف في المقصورة أقل يتم حصادها وفحص السمية الخلوية، استنادا إلى اللاكتات الإفراج نازعة 15،16، فضلا عن ELISA 15، لقياس السيتوكينات يتم تنفيذها. ومن المهم أن حصاد طاف في المقصورة أقل من أجل قياس السيتوكينات التي عبرت بالفعل نفاذية الغشاء والتي قد تنشيط المستقبلات على سطح الخلايا PC12. وتظهر النتائج أن تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة LPS-N9 من المقصورة العليا تولد CYT dose- وتعتمد على الوقتتأثير otoxic على الخلايا PC12 العصبية المختلفة المبينة في المقصورة أقل (الشكل 5). 0.5 ميكروغرام / مل LPS الشرط ولكن ليس بشكل كبير السامة للخلايا في 24 ساعة أو 48 ساعة. تم العثور على مستويات السمية الخلوية للوصول إلى ما يقرب من 100٪ في 2 ميكروغرام / مل LPS 48 حالة ساعة. وعلاوة على ذلك، أظهرت النتائج أن تركيز السيتوكينات الموالية للالتهابات IL-6، IFN-γ وTNF-α في الزيادات طاف بالتزامن مع سمية الخلايا المرصودة. على وجه التحديد، وزادت IL-6 تركيزات بشكل ملحوظ بعد 24 ساعة فقط ل2 ميكروغرام حالة / مل، في حين أن 1 ميكروغرام / مل من LPS أيضا عوائد رفع مستويات خلوى بعد 48 ساعة (الشكل 6). الخلايا الدبقية الصغيرة تفرز الإنترفيرون γ التي تصل إلى مقصورة أقل في حدوث زيادة كبيرة في الطريقة عندما يتم التعامل معهم مع 1 ميكروغرام / مل و 2 ميكروجرام / مل، ويتم تحضين مع خلايا PC12 العصبية متباينة إما 24 ساعة أو 48 ساعة (الشكل 7). 0.5 ميكروغرام / ملLPS حالة مرة أخرى لا تزيد من مستويات الإنترفيرون γ بشكل كبير. وأخيرا، تم كميا تركيزات TNF-α في المقصورة أقل من إليسا ووجد أن أكثر تضاف اليها تفعيل LPS الخلايا الدبقية الصغيرة، ومستويات تصل الى نحو سبعة أضعاف أكثر أهمية من السيطرة على حالة (الشكل 8). على وجه الخصوص، تسببت على حد سواء 24 ساعة و 48 حضانة ساعة فترات زيادات مهمة في مستويات TNF ألفا في طاف. ومع ذلك، أسفرت 1 ميكروغرام / مل حالة LPS ارتفاع كبير في مستويات TNF ألفا فقط بعد 48 ساعة. ككل، وتشير هذه النتائج إلى أن يفرز السيتوكينات الموالية للالتهابات ما لا يقل عن مسؤولة جزئيا عن الآثار السامة للخلايا لوحظ في الخلايا PC12 العصبية متباينة بعد 24 ساعة أو 48 ساعة فترة الحضانة مع الخلايا الدبقية الصغيرة تفعيلها من خلال تركيزات مختلفة من LPS.

إدراج أنظمة ثقافة مشتركة من الخلايا الدبقية الصغيرة وPC12 الخلايا N9 تنشيط LPS-وقد ثبت أنتكون مفيدة بشكل خاص في دراسة neuroinflammation وفي وضع استراتيجيات لمواجهة ذلك. وأظهرت مجموعتنا مؤخرا أن تنشيط LPS-N9 الخلايا الدبقية الصغيرة التي تزرع في المزارع الخلوية إدراج المعرض زيادة النسخ من السيتوكينات الموالية للالتهابات، مما يدفع بدوره إلى موت الخلايا المبرمج للخلايا PC12 عن اختلاف عامل نمو الأعصاب عن طريق عبور micropores من إدراج 15 و 16. في نفس النموذج، ما قبل المعالجة من السكان دبقية مع ريسفيراترول polyphenolic مركب (0.1 ميكرومتر، 3 ساعة) منعت النسخ من السيتوكينات الموالية للالتهابات وموت الخلايا المبرمج وبالتالي إعاقة الخلايا PC12 العصبية متباينة من خلال منع كاسباس 3 التنشيط، وبعد ذلك ، الحمض النووي الانقسام. وقد أظهرت مجموعة أخرى أيضا آثار اعصاب من فيتامين E في N9-PC12 ثقافة مشتركة 26. بالإضافة إلى N9-PC12 المشترك الثقافات، كما تم توظيف مختلف خطوط الخلايا خلد أو الثقافات الأولية في سياق neuroinflammation. على سبيل المثال،كان الفئران الخلايا الدبقية الصغيرة خط الخلية BV2 المشارك مثقف مع العصبية الخلايا البشرية SH-SY5Y لإظهار تأثير مضاد للأفكارك من وتيولين polyphenolic بوساطة ما يبدو من إمكاناتها 17 المضادة للالتهابات. كذلك، عرضت الخلايا الدبقية الصغيرة BV2 تفعيلها من خلال خلايا PC12 المصابة لممارسة تأثيرات مضادة للأفكارك في الخلايا الجذعية الوسيطة 18. وقد تجلى الإشارات المتبادلة إلى أن تكون مهمة في آليات مكافحة أفكارك الكامنة الخلايا الدبقية الصغيرة الأولية العصبية المخولة الخلايا العصبية الحبيبية للدماغ الابتدائية 19. وعلاوة على ذلك، كانت الخلايا العصبية الحصين الابتدائية المشتركة المزروعة مع الخلايا الدبقية الصغيرة الأولية تفعيلها من خلال اميلويد يفرز البروتين السلائف من أجل تقييم الإفراج عن الغلوتامات عن طريق تبادل السيستين وإضعاف لاحق وظيفة متشابك 20. وأخيرا، أظهرت مجموعة واحدة أيضا الحديث المتبادل القائم بين الخلايا العصبية الحصين الابتدائية والخلايا الدبقية الصغيرة الأولية المتعلقة fractalkine يشير، على chemokine اكسبريس جوهريالحوار الاقتصادي الاستراتيجي من قبل الخلايا العصبية في الجهاز العصبي المركزي التي وجدت على سطح الخلايا الدبقية الصغيرة 21 المستقبلة.

شكل 1
الشكل 1. تمثيل تخطيطي للنظام إدراج ثقافة مشتركة. وتتألف المقصورة العليا من إدراج الذي يحمل نوع خلية واحدة والبيئة الخلطية قمي لها. تتكون مقصورة أقل من بئر أو الطبق الذي يحتوي على ثاني نوع من الخلايا. إدراج تقع على حواف لوحة زراعة الأنسجة multiwell أو الطبق. تم تصميم إدراج الكذب فقط فوق قاع البئر حتى لا تلمس السكان من الخلايا التي تنمو تحت. المتوسط ​​في مقصورة أقل على اتصال مع كل من سطح القاعدية من نوع من الخلايا الأول والسطح القمي من نوع الخلية الثانية. الرجاء انقر هنا لعرض أكبر فرسأيون من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2. Microphotographs من الخلايا الدبقية الصغيرة N9. (A) غير المعالجة يستريح الخلايا الدبقية الصغيرة N9 في إدراج يحمل التشكل الخلوي متشعب يتيح لهم مراقبة بنشاط بيئتهم. (ب) الخلايا الدبقية الصغيرة N9 في إدراج تعامل مع lipopolysaccharide في (LPS) لمدة 24 ساعة عرض شكل أميبية نموذجي من النمط الظاهري تفعيلها. وقد اتخذ هذا مجهرية فقط قبل نقل إدراج تحتوي على هذه الخلايا الدبقية الصغيرة N9 تنشيط إلى الآبار التي تحتوي على خلايا PC12 متباينة كما هو موضح في شريط مقياس الشكل 4. = 25 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3. N9 كثافة الخلايا الدبقية الصغيرة بعد العلاج مع lipopolysaccharide في (LPS). وجرى تقييم تأثير علاج الخلايا الدبقية الصغيرة N9 مع تركيزات مختلفة من LPS لفترات زمنية مختلفة عن طريق تقدير عدد الخلايا باستخدام عدادة الكريات 69. تم التأكد من فروق ذات دلالة إحصائية بين المجموعات عن طريق تحليل التباين الأحادي، تليها تحليل توكي ما بعد خاصة مع برنامج GraphPad المعهد الوطني للإحصاء، الإصدار 3.06 ل Windows (سان دييغو، CA، www.graphpad.com). ، يتم التعبير عن جميع البيانات وتحليلها في فاصل الثقة 95٪ كما يعني ± الخطأ المعياري للمتوسط ​​من 3 تجارب المستقلة التي كانت تعتبر 10 بئرا. وتشير العلامات النجمية فروق ذات دلالة إحصائية بين حالة علاجها ومكافحتها (** ف <0.01). الرجاء انقر هنا لعرض تأنسخة إيه من هذا الرقم.

الشكل (4)
إظهار الرقم 4. Microphotographs الخلايا PC12 العصبية متباينة. متباينة عامل لمدة سبعة أيام نمو الأعصاب الخلايا PC12 العصبية الظواهر العصبية واضحة مثل neurites التي طويلة ودوالي. وقد اتخذ هذا مجهرية فقط قبل نقل إدراج تحتوي على تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة N9 كما في الصورة في شريط مقياس الشكل 2. = 25 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5
الرقم 5. تأثير السامة للخلايا من lipopolysaccharide في (LPS) -activated الخلايا الدبقية الصغيرة على الخلايا PC12 العصبية متباينة. تم تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة N9 مع تركيزات مختلفة من LPS لمدة 24 ساعة، ثم نقل إلى الآبار التي تحتوي على الخلايا PC12 العصبية متباينة لمدة 24 ساعة أو 48 ساعة. تم تقييم السمية الخلوية باستخدام الإفراج اللاكتات نازعة الفحص التي أجريت على طاف من حجرة أقل. تم التأكد من فروق ذات دلالة إحصائية بين المجموعات عن طريق تحليل التباين الأحادي، تليها تحليل توكي ما بعد خاصة مع برنامج GraphPad المعهد الوطني للإحصاء، الإصدار 3.06 ل Windows (سان دييغو، CA، www.graphpad.com). ، يتم التعبير عن جميع البيانات وتحليلها في فاصل الثقة 95٪ كما يعني ± الخطأ المعياري للمتوسط ​​من 3 تجارب المستقلة التي اعتبرت 6 آبار. النجمة تشير إلى فروق ذات دلالة إحصائية بين العلاج والسيطرة حالة (*** P <0.001). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

ther.within الصفحات = "1"> الشكل (6)
الشكل 6. تركيز ط nterleukin-6 (IL-6) في طاف بعد تفعيل N9 من lipopolysaccharide في (LPS). تم تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة N9 مع تركيزات مختلفة من LPS لمدة 24 ساعة، ثم نقل إلى الآبار التي تحتوي على الخلايا PC12 العصبية متباينة ل 24 ساعة أو 48 ساعة. وجرى تقييم IL-6 تجمعات في طاف من حجرة أقل باستخدام ELISA. تم التأكد من فروق ذات دلالة إحصائية بين المجموعات عن طريق تحليل التباين الأحادي، تليها تحليل توكي ما بعد خاصة مع برنامج GraphPad المعهد الوطني للإحصاء، الإصدار 3.06 ل Windows (سان دييغو، CA، www.graphpad.com). ، يتم التعبير عن جميع البيانات وتحليلها في فاصل الثقة 95٪ كما يعني ± الخطأ المعياري للمتوسط ​​من 3 تجارب المستقلة التي اعتبرت 6 آبار. وتشير العلامات النجمية فروق ذات دلالة إحصائية بين العلاج ويخدعحالة المحول المتعدد العادي (*** P <0.001 **، ف <0.01 و * ع <0.05). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 7
الرقم 7. تركيز انترفيرون غاما (IFN-γ) في طاف بعد تفعيل N9 من lipopolysaccharide في (LPS). تم تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة N9 مع تركيزات مختلفة من LPS لمدة 24 ساعة، ثم نقل إلى الآبار التي تحتوي على الخلايا PC12 العصبية متباينة لمدة 24 ساعة أو 48 ساعة. تم تقييم تركيزات IFN-γ في طاف من حجرة أقل باستخدام ELISA. تم التأكد من فروق ذات دلالة إحصائية بين المجموعات عن طريق تحليل التباين الأحادي، تليها تحليل توكي ما بعد خاصة مع برنامج GraphPad المعهد الوطني للإحصاء، الإصدار 3.06ل Windows (سان دييغو، CA، www.graphpad.com). ، يتم التعبير عن جميع البيانات وتحليلها في فاصل الثقة 95٪ كما يعني ± الخطأ المعياري للمتوسط ​​من 3 تجارب المستقلة التي اعتبرت 6 آبار. وتشير العلامات النجمية فروق ذات دلالة إحصائية بين حالة علاجها ومكافحتها (** ف <0.01 و * ع <0.05). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

شكل 8
الرقم 8. تركيز عامل نخر الورم ألفا (TNF-α) في طاف بعد تفعيل N9 من lipopolysaccharide في (LPS). تم تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة N9 مع تركيزات مختلفة من LPS لمدة 24 ساعة، ثم نقل إلى الآبار التي تحتوي على الخلايا PC12 العصبية متباينة ل 24 ساعة أو 48 ساعة. TNF-αتم تقييم التركيزات في طاف من حجرة أقل باستخدام ELISA. تم التأكد من فروق ذات دلالة إحصائية بين المجموعات عن طريق تحليل التباين الأحادي، تليها تحليل توكي ما بعد خاصة مع برنامج GraphPad المعهد الوطني للإحصاء، الإصدار 3.06 ل Windows (سان دييغو، CA، www.graphpad.com). ، يتم التعبير عن جميع البيانات وتحليلها في فاصل الثقة 95٪ كما يعني ± الخطأ المعياري للمتوسط ​​من 3 تجارب المستقلة التي اعتبرت 6 آبار. النجمة تشير إلى فروق ذات دلالة إحصائية بين العلاج والسيطرة حالة (*** P <0.001). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الخطوة الأكثر أهمية في أي نظام تجربة إدراج ثقافة مشتركة يسكن فعلا في اختيار إدراج المناسب لاستخدامها. يجب أن تؤخذ حجم المسام والمواد غشاء بعين الاعتبار شامل، دون أن ننسى أن تنظر في نوع من الخلايا التي سيتم المصنف، والغرض من هذه التجربة. على سبيل المثال، قد المقايسات chemotaxic استخدام نفس النوع من غشاء الخلية من المشترك الثقافات لتحليل التحويرات سلوك الخلايا الناجم عن العوامل القابلة للذوبان يفرز في حالة عدم وجود خلية خلية الاتصال. ومع ذلك، كلا النوعين من التجارب تتطلب أحجام مختلفة المسام: أكبر منها عن السابق، للسماح للهجرة الخلايا، وأصغر لهذا الأخير، لمنع الهجرة خلية وخلية خلية الاتصال. لتقييم التغيرات الخلوية بوساطة العوامل القابلة للذوبان يفرز في حالة عدم وجود خلية خلية الاتصال، المسام الأحجام من 0.4 ميكرون أو 3 ميكرون مناسبة عادة لأنها تسمح لجزيئات كبيرة، مثل البروتينات، لعبور ولكن منع معظم الخلايا من القيام وبالتالي. غشاءالمواد يعتمد إلى حد كبير على نوع من الخلايا والتقنيات لاستخدامها في نهاية بروتوكول زراعة الخلايا. لفترة وجيزة، والأغشية PET توفر الرؤية خلية جيدة لأنها واضحة ولكنها ليست المغلفة الكولاجين، الذي يمكن أن يكون مشكلة للخلايا ملتصقة هو مطلوب لدعم لعلاجها. كما أن لديهم أفضل الكيميائية المقاومة للمثبتات ذلك، جنبا إلى جنب مع خصائص بصرية جيدة، ويجعلها مثالية للدراسات النسيجية. من ناحية أخرى، والأغشية الكمبيوتر نقدم ضعف الرؤية الخلية كما هي شفافة وغير المغلفة الكولاجين. ومع ذلك، فإنها تمتلك أعلى كثافة من المسام وتوافر الأكثر تنوعا من أحجام المسام. وأخيرا، أغشية PTFE واضحة عندما تكون رطبة ولكن يسمح فقط التصور من الخلايا الخطوط العريضة في المجهر. كما ميزة كبيرة، والكولاجين المغلفة لها، مما يجعل لهم أيضا سمكا قليلا. من المهم أن نلاحظ أن طلاء PET أو غشاء PC إدراج مع الكولاجين يمكن عرقلة المسام وتعيق مرور المواد القابلة للذوبان الواقعروبية. في أي حال، معظم الشركات المصنعة إدراج توفر أدلة شاملة لمساعدة الباحثين في اختيار إدراج السليم. في النموذج المحدد، وقد تم تحسين الاختيارات من كثافة الطلاء، وسائل الإعلام، وتركيز مصل الدم، وأيام من التمايز، وأيام من تفعيل LPS، وتركيزات LPS، وطلاء قوارير للخلايا PC12 على مدى سنوات من العمل مع أنظمة شارك في ثقافة هذه 15 16. الجدير بالذكر، تم اختيار كثافة الطلاء من الخلايا الدبقية الصغيرة N9 في إدراج في 60،000 ¢ / سم 2 من أجل الحصول على 40-50٪ التقاء في لحظة البدء في ثقافة مشتركة، وبالتالي، لمنحهم مساحة لمضاعفة على تفعيلها من LPS. شروط أخرى عندما الأمثل ويمكن أيضا تسفر عن نتائج مرضية، مثل استبدال الكولاجين التي كتبها L يسين في قوارير المخصصة للصيانة PC12 الأم.

من أجل زيادة استدامة النتائج، عدة ضوابط مختلفة لا يمكن أن يؤديها. عندما تحاول أن تثبت أن العوامل القابلة للذوبانهي المسؤولة عن الآثار الملاحظة، ينبغي إجراء الثقافات المختلطة يظهر الاتصال المباشر خلية خلية والتجارب المتوسطة مكيفة بشكل متواز. وعلاوة على ذلك، مما يجعل استخدام أجسام مضادة لتحييد سوف عاملا يفرز محددة تساعد في تحديد جزيء مسؤول عن تأثير نظير الصماوي التي ينظر إليها. عندما يكون ذلك ممكنا، منع مستقبلات أو جزء من مسار الإشارات لتحديد هوية الدقيقة للمستقبلات يجري تفعيلها. إذا تم استخدام جزيء لتفعيل السكان خلية واحدة قبل التجربة ثقافة مشتركة مع نوع من الخلايا الثاني، كما هو الحال في المثال سبق وصفها، من المهم أن تأخذ بعين الاعتبار وجود جزيء في النظام. كخيار أول، يجب تغيير المتوسطة تماما قبل التجربة ثقافة مشتركة من أجل ضمان أن جزيء غائب من النظام تماما. كخيار ثان، وينبغي أن يضاف شرط حيث يتم تحضين جزيء وحدها مع نوع من الخلايا الثاني لتقييم أثره في غياب أول نوع من الخلايا. إذا كان هناك أي تأثير للجزيء على نوع من الخلايا الثانية، لن تكون هناك حاجة لتغيير المتوسطة قبل التجربة ثقافة مشتركة. وبالمثل، إذا لم تزرع كل من أنواع الخلايا في نفس خلية ثقافة المتوسط، يجب اتخاذ احتياطات مشابهة للتأكد من أن الاختلافات في التركيب المتوسط ​​لا تؤثر على واحد أو السكان خلية أخرى. على الرغم من أن سيتم فصل كل من وسائل الإعلام من قبل غشاء إدراج في البداية، لا بد نشر للتأكد من أنها سوف مزج على مدى فترات حضانة أطول. وعلاوة على ذلك، يمكن أن تنشأ العديد من المشاكل من انقطاع الشاذة من العلاقات عامل مستقبلات للذوبان. بين عدة أسباب الخطأ، والاستخدام المفرط للتفكك الأنزيمية وجود تركيزات هامة من المصل يمكن أن تتداخل مع مستقبلات سطح الخلية. وتشمل الأسباب الأخرى للخطأ في أنظمة إدراج ثقافة مشتركة، ولكن لا تقتصر على 1) تقنيات زراعة الخلايا غير لائق، مثل إزالة مجمل الخليةمستنبت في الكثير من الآبار في نفس الوقت مما تسبب في الخلايا لتجف، 2) أحادي الطبقة التي متموجة أيضا في إدراج، المسؤولة عن اغلاق غشاء إدراج ومنع جزيئات يفرزها apically لتصل إلى المقصورة أقل، و 3) misadjusted التقاء خلية، والذي يسبب تعبيرا تحت المفرط أو العوامل القابلة للذوبان مما يؤدي إلى نتائج غير ذات صلة من الناحية الفسيولوجية أو عدم وجود أي تأثير.

في حين قدم واحدة فقط سيناريو إدراج ثقافة مشتركة هنا، وهناك العديد من الطرق للاستفادة من هذه التقنية متعددة جدا. هنا، كان واحدا نوع من الخلايا ما قبل المعاملة مع جزيء مسؤول عن تحريض إفراز عامل ذوبان أنه عند نقل إدراج إلى البئر، ويؤثر على سلوك نوع من الخلايا الثاني. ومن الممكن أيضا لاحتضان كل من أنواع الخلايا معا في نظام المشاركة في الثقافة قبل فصل لهم للكشف عن زيادة التعرض أو مقاومة من السكان واحد أو كلا الخلايا لعلاج خفية. هوويفر، عند النظر في شكلها الأكثر بدائية، وهذا الأسلوب يمكن الاستفادة من اثنين من السكان الخلايا المحتضنة معا دون أي علاج، وذلك بهدف تقييم القاعدية إشارات متبادلة نظير الصماوي.

الحد أهم من هذه التقنية هو أن الكيانات قصيرة الأجل جدا الجزيئية مثل أنواع الاكسجين التفاعلية لا تنجو من المسافة التي تفصل بين سكان الخلية نموا في المقصورة العليا واحدة في أقل المقصورة 82. وقد حاولت أحدث تطور في تقنيات شارك في الثقافة للإجابة على هذه المشكلة عن طريق استخدام الركيزة ثقافة microfabricated قادرة على الحفاظ على اثنين من سكان الخلية في القرب الميكروسكيل 83. بالإضافة إلى تحمل كافة مزايا أنظمة إدراج ثقافة مشتركة، مثل الكشف عن السكان محددة من التغييرات وإشارات ثنائية الاتجاه، وقد تجلى هذا شاشة microfabricated أيضا لتجعل من الممكن الكشف عن التفاعلات قصيرة المدى التي لم تكن من قبل دetectable بسبب اضمحلال العوامل القابلة للذوبان على مسافات. هذه المنصة ثقافة الخلية هي أحدث الابتكارات في خلية ثقافة مشتركة وعود لمساعدة كشف إشارات آليات بين الخلايا التي تم تجاهلها من قبل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI-1640 medium Sigma R8755 Warm in 37 °C water bath before use
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham Sigma D6421 Warm in 37 °C water bath before use, must be supplemented with 0.365 gm/L L-glutamine
Horse serum ATCC 30-2040 Warm in 37 °C water bath before use
Fetal bovine serum MultiCell 80350 Warm in 37 °C water bath before use
Nerve Growth Factor-7S from murine submaxillary gland Sigma N0513 Reconstitute the lyophilized powder in a solution of buffered saline or tissue culture medium containing 0.1–1.0% bovine serum albumin or 1-10% serum
Trypsin-EDTA solution Sigma T3924 Warm in 37 °C water bath before use
Lipopolysaccharides from Escherichia coli 055:B5 Sigma L2880 Toxic
Cell culture inserts for use with 24-well plates BD Falcon 353095 0.4 μm pores
24-well plates TrueLine TR5002 Coat with collagen before use
Routine PC12 cell culture medium Routine N9 cell culture medium
-       85% RPMI medium -       90% DMEM-F12 medium
-       10% heat-inactivated horse serum -       10% heat-inactivated horse serum
-       5% heat-inactivated fetal bovine serum
PC12 differentiation medium N9 treatment medium
-        99% RPMI medium -       99% DMEM-F12 medium
-        1% heat-inactivated fetal bovine serum -       1% heat-inactivated fetal bovine serum
-        50 ng/mL nerve growth factor
PC12 treatment medium
-        99% RPMI medium
-        1% heat-inactivated fetal bovine serum

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Grobstein, C. Morphogenetic interaction between embryonic mouse tissues separated by a membrane filter. Nature. 172 (4384), 869-870 (1953).
  2. Hoffman, R. A. Intraepithelial lymphocytes coinduce nitric oxide synthase in intestinalepithelial cells. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 278 (6), G886-G894 (2000).
  3. Zhang, W. C., et al. Regulatory T cells protect fine particulate matter-induced inflammatory responses in human umbilical vein endothelial cells. Mediators Inflamm. 2014, 869148 (2014).
  4. Vasileiadou, K., et al. alpha1-Acid glycoprotein production in rat dorsal air pouch in response to inflammatory stimuli, dexamethasone and honey bee venom. Exp. Mol. Pathol. 89 (1), 63-71 (2010).
  5. Talayev, V. Y., et al. The effect of human placenta cytotrophoblast cells on the maturation and T cell stimulating ability of dendritics cells in vitro. Clin. Exp. Immunol. 162 (1), 91-99 (2010).
  6. Elishmereni, M., et al. Physical interactions between mast cells and eosinophils: a novel mechanism enhancing eosinophil survival in vitro. Allergy. 66 (3), 376-385 (2011).
  7. Ishihara, Y., et al. Regulation of immunoglobulin G2 production by prostaglandin E(2) and platelet-activating factor. Infect. Immun. 68 (3), 1563-1568 (2000).
  8. Kranzer, K., Bauer, M., Lipford, G. B., Heeg, K., Wagner, H., Lang, R. CpG-oligodeoxynucleotides enhance T-cell receptor-triggered interferon- gamma production and up-regulation of CD69 via induction of antigen- presenting cell-derived interferon type I and interleukin-12. Immunology. 99 (2), 170-178 (2000).
  9. Vendetti, S., Chai, J. G., Dyson, J., Simpson, E., Lombardi, G., Lechler, R. Anergic T cells inhibit the antigen-presenting function of dendritic cells. J. Immunol. 165 (3), 1175-1181 (2000).
  10. Haller, D., Bode, C., Hammes, W. P., Pfeifer, A. M., Schiffrin, E. J., Blum, S. Non-pathogenic bacteria elicit a differential cytokine response by intestinal epithelial cell/leucocyte co-cultures. Gut. 47 (1), 79-87 (2000).
  11. Dono, M., et al. In vitro stimulation of human tonsillar subepithelial B cells: requirement for interaction with activated T cells. Eur. J. Immunol. 31 (3), 752-756 (2001).
  12. Yu, Y., et al. Enhancement of human cord blood CD34+ cell-derived NK cell cytotoxicity by dendritic cells. J. Immunol. 166 (3), 1590-1600 (2001).
  13. Watanabe, T., Tokuyama, S., Yasuda, M., Sasaki, T., Yamamoto, T. Changes of tissue factor-dependent coagulant activity mediated by adhesion between polymorphonuclear leukocytes and endothelial cells. Jpn J. Pharmacol. 86 (4), 399-404 (2001).
  14. Krampera, M., et al. Bone marrow mesenchymal stem cells inhibit the response of naive and memory antigen-specific T cells to their cognate peptide. Blood. 101 (9), 3722-3729 (2003).
  15. Bournival, J., Plouffe, M., Renaud, J., Provencher, C., Martinoli, M. G. Quercetin and sesamin protect dopaminergic cells from MPP+-induced neuroinflammation in a microglial (N9)-neuronal (PC12) coculture system. Oxid. Med. Cell. Longev. 2012, 921941 (2012).
  16. Bureau, G., Longpré, F., Martinoli, M. G. Resveratrol and quercetin, two natural polyphenols, reduce apoptotic neuronal cell death induced by neuroinflammation. J. Neurosci. Res. 86 (2), 403-410 (2008).
  17. Zhu, L., Bi, W., Lu, D., Zhang, C., Shu, X., Lu, D. Luteolin inhibits SH-SY5Y cell apoptosis through suppression of the nuclear transcription factor-κB, mitogen-activated protein kinase and protein kinase B pathways in lipopolysaccharide-stimulated cocultured BV2 cells. Exp. Ther. Med. 7 (5), 1065-1070 (2014).
  18. Luo, X., et al. BV2 enhanced the neurotrophic functions of mesenchymal stem cells after being stimulated with injured PC12. Neuroimmunomodulation. 16 (1), 28-34 (2009).
  19. Polazzi, E., Gianni, T., Contestabile, A. Microglial cells protect cerebellar granule neurons from apoptosis: evidence for reciprocal signaling. Glia. 36 (3), 271-280 (2001).
  20. Barger, S. W., Basile, A. S. Activation of microglia by secreted amyloid precursor protein evokes release of glutamate by cystine exchange and attenuates synaptic function. J. Neurochem. 76 (3), 846-854 (2001).
  21. Zujovic, V., Taupin, V. Use of cocultured cell systems to elucidate chemokine-dependent neuronal/microglial interactions: control of microglial activation. Methods. 29 (4), 345-350 (2003).
  22. Iwashita, M., et al. Valsartan, independently of AT1 receptor or PPARγ, suppresses LPS-induced macrophage activation and improves insulin resistance in cocultured adipocytes. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 302 (3), E286-E296 (2012).
  23. Oliver, E., et al. Docosahexaenoic acid attenuates macrophage-induced inflammation and improves insulin sensitivity in adipocytes-specific differential effects between LC n-3 PUFA. J. Nutr. Biochem. 23 (9), 1192-1200 (2012).
  24. Tang, S. Y., Cheah, I. K., Wang, H., Halliwell, B. Notopterygium forbesii Boiss extract and its active constituent phenethyl ferulate attenuate pro-inflammatory responses to lipopolysaccharide in RAW 264.7 macrophages. A "protective" role for oxidative stress. Chem. Res. Toxicol. 22 (8), 1473-1482 (2009).
  25. De Boer, A. A., Monk, J. M., Robinson, L. E. Docosahexaenoic acid decreases pro-inflammatory mediators in an in vitro murine adipocyte macrophage co-culture model. PLoS One. 9 (1), e85037 (2014).
  26. Li, Y., Liu, L., Barger, S. W., Mrak, R. E., Griffin, W. S. Vitamin E suppression of microglial activation is neuroprotective. J. Neurosci. Res. 66 (2), 163-170 (2001).
  27. Brizuela, L., et al. Osteoblast-derived sphingosine 1-phosphate to induce proliferation and confer resistance to therapeutics to bone metastasis-derived prostate cancer cells. Mol. Oncol. 8 (7), 1181-1195 (2014).
  28. Yuan, L., Chan, G. C., Fung, K. L., Chim, C. S. RANKL expression in myeloma cells is regulated by a network involving RANKL promoter methylation, DNMT1, microRNA and TNFα in the microenvironment. Biochim. Biophys. Acta. 1843, 1834-1838 (2014).
  29. Krtolica, A., Parrinello, S., Lockett, S., Desprez, P. Y., Campisi, J. Senescent fibroblasts promote epithelial cell growth and tumorigenesis: a link between cancer and aging. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 98 (21), 12072-12077 (2001).
  30. Lawrenson, K., Grun, B., Benjamin, E., Jacobs, I. J., Dafou, D., Gayther, S. A. Senescent fibroblasts promote neoplastic transformation of partially transformed ovarian epithelial cells in a three-dimensional model of early stage ovarian cancer. Neoplasia. 12 (4), 317-325 (2010).
  31. Liu, J., et al. BCR-ABL mutants spread resistance to non-mutated cells through a paracrine mechanism. Leukemia. 22 (4), 791-799 (2008).
  32. Giuliani, N., et al. Proangiogenic properties of human myeloma cells: production of angiopoietin-1 and its potential relationship to myeloma-induced angiogenesis. Blood. 102 (2), 638-645 (2003).
  33. Gupta, D., et al. Adherence of multiple myeloma cells to bone marrow stromal cells upregulates vascular endothelial growth factor secretion: therapeutic applications. Leukemia. 15 (12), 1950-1961 (2001).
  34. Anderson, I. C., Mari, S. E., Broderick, R. J., Mari, B. P., Shipp, M. A. The angiogenic factor interleukin 8 is induced in non-small cell lung cancer/pulmonary fibroblast cocultures. Cancer Res. 60 (2), 269-272 (2000).
  35. Hoechst, B., et al. A new population of myeloid-derived suppressor cells in hepatocellular carcinoma patients induces C4(+)CD25(+)Foxp3(+) T cells. Gastroenterology. 135 (1), 234-243 (2008).
  36. Karadag, A., Oyajobi, B. O., Apperley, J. F., Russell, R. G., Croucher, P. I. Human myeloma cells promote the production of interleukin 6 by primary human osteoblasts. Br. J. Haematol. 108 (2), 383-390 (2000).
  37. Garrido, S. M., Appelbaum, F. R., Willman, C. L., Banker, D. E. Acute myeloid leukemia cells are protected from spontaneous and drug- induced apoptosis by direct contact with a human bone marrow stromal cell line (HS-5). Exp. Hematol. 29 (4), 448-457 (2001).
  38. Heissig, B., Pasternak, G., Horner, S., Schwerdtfeger, R., Rossol, S., Hehlmann, R. CD14+ peripheral blood mononuclear cells from chronic myeloid leukemia and normal donors are inhibitory to short- and long-term cultured colony-forming cells. Leuk. Res. 24 (3), 217-231 (2000).
  39. Moore, M. B., Kurago, Z. B., Fullenkamp, C. A., Lutz, C. T. Squamous cell carcinoma cells differentially stimulate NK cell effector functions: the role of IL-18. Cancer Immunol Immunother. 52 (2), 107-115 (2003).
  40. Giuliana, N., et al. Human myeloma cells stimulate the receptor activator of nuclear factor- kappa B ligand (RANKL) in T lymphocytes: a potential role in multiple myeloma bone disease. Blood. 100 (13), 4615-4621 (2002).
  41. Ye, Z., Haley, S., Gee, A. P., Henslee-Downey, P. J., Lamb, L. S. Jr In vitro interactions between gamma deltaT cells, DC, and CD4+ T cells; implications for the immunotherapy of leukemia. Cytotherapy. 4 (3), 293-304 (2002).
  42. Zhang, X. M., Xu, Q. Metastatic melanoma cells escape from immunosurveillance through the novel mechanism of releasing nitric oxide to induce dysfunction of immunocytes. Melanoma Res. 11 (6), 559-567 (2001).
  43. Zhang, M., et al. The differentiation of human adipose-derived stem cells towards a urothelium-like phenotype in vitro and the dynamic temporal changes of related cytokines by both paracrine and autocrine signal regulation. PLoS One. 9 (4), e95583 (2014).
  44. Qu, C., et al. Chondrogenic differentiation of human pluripotent stem cells in chondrocyte co-culture. Int. J. Biochem. Cell. Biol. 45 (8), 1802-1812 (2013).
  45. Krassowska, A., et al. Promotion of haematopoietic activity in embryonic stem cells by the aorta-gonad-mesonephros microenvironment. Exp. Cell. Res. 312 (18), 3595-3603 (2006).
  46. Darcy, K. M., et al. Mammary fibroblasts stimulate growth, alveolar morphogenesis, and functional differentiation of normal rat mammary epithelial cells. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 36 (9), 578-592 (2000).
  47. Spector, J. A. Co-culture of osteoblasts with immature dural cells causes an increased rate and degree of osteoblast differentiation. Plast. Reconstr. Surg. 109 (2), 631-642 (2002).
  48. Khanolkar, A., Fu, Z., Underwood, L. J., Bondurant, K. L., Rochford, R., Cannon, M. J. CD4+ T cell-induced differentiation of EBV-transformed lymphoblastoid cells is associated with diminished recognition by EBV-specific CD8+ cytotoxic T cells. J. Immunol. 170 (6), 3187-3194 (2003).
  49. Fritsch, C. Epimorphin expression in intestinal myofibroblasts induces epithelial morphogenesis. J. Clin. Invest. 110 (11), 1629-1641 (2002).
  50. Abouelfetouh, A., Kondoh, T., Ehara, K., Kohumra, E. Morphological differentiation of bone marrow stromal cells into neuron-like cells after co-culture with hippocampal slice. Brain Res. 1029 (1), 114-119 (2004).
  51. Llado, J., Haenggeli, C., Maragakis, N., Snyder, E., Rothstein, J. Neural stem cells protect against glutamate-induced excitotoxicitiy and promote survival of injured motor neurons through the secretion of neurotrophic factors. Mol. Cell. Neurosci. 27 (3), 322-331 (2004).
  52. Fong, S. P., et al. Trophism of neural progenitor cells to embryonic stem cells: Neural induction and transplantation in a mouse ischemic stroke model. J. Neurosci. Res. 85 (9), 1851-1862 (2007).
  53. Gordon-Keylock, S. A., et al. Induction of hematopoietic differentiation of mouse embryonic stem cells by an AGM-derived stromal cell line is not further enhanced by overexpression of HOXB4. Stem Cells. 19 (11), 1687-1698 (2010).
  54. Yang, T., Tsang, K. S., Poon, W. S., Ng, H. K. Neurotrophism of bone marrow stromal cells to embryonic stem cells: noncontact induction and transplantation to a mouse ischemic stroke model. Cell transplant. 18 (4), 391-404 (2009).
  55. Kim, J. Y., et al. Umbilical cord blood mesenchymal stem cells protect amyloid-β42 neurotoxicity via paracrine. World J. Stem Cells. 4 (11), 110-116 (2012).
  56. Mauri, M., et al. Mesenchymal stem cells enhance GABAergic transmission in co-cultured hippocampal neurons. Mol. Cell Neurosci. 49 (4), 395-405 (2012).
  57. Ichikawa, J., et al. Increased crystal-cell interaction in vitro under co-culture of renal tubular cells and adipocytes by in vitro co-culture paracrine systems simulating metabolic syndrome. Urolithiasis. 42 (1), 17-28 (2014).
  58. Zuo, L., et al. A Paracrine mechanism involving renal tubular cells, adipocytes and macrophages promotes kidney stone formation in a simulated metabolic syndrome environment. J. Urol. 191 (6), 1906-1912 (2014).
  59. Fan, W., Zheng, J. J., McLaughlin, B. J. An in vitro model of the back of the eye for studying retinal pigment epithelial-choroidal endothelial interactions. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 38 (4), 228-234 (2002).
  60. Mierke, C. T., Ballmaier, M., Werner, U., Manns, M. P., Welte, K., Bischoff, S. C. Human endothelial cells regulate survival and proliferation of human mast cells. J. Exp. Med. 192 (6), 801-811 (2000).
  61. Beckner, M. E., Jagannathan, S., Peterson, V. A. Extracellular angio-associated migratory cell protein plays a positive role in angiogenesis and is regulated by astrocytes in coculture. Microvasc. Res. 63 (3), 259-269 (2002).
  62. Damon, D. H. VSM growth is stimulated in sympathetic neuron/VSM cocultures: role of TGF-beta2 and endothelin. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 278 (2), H404-H411 (2000).
  63. Anna De Berardinis, M., Ciotti, M. T., Amadoro, G., Galli, C., Calissano, P. Transfer of the apoptotic message in sister cultures of cerebellar neurons. Neuroreport. 12 (10), 2137-2140 (2001).
  64. Lange-Sperandio, B., Fulda, S., Vandewalle, A., Chevalier, R. L. Macrophages induce apoptosis in proximal tubule cells. Pediatr. Nephrol. 18 (4), 335-341 (2003).
  65. Vjetrovic, J., Shankaranarayanan, P., Mendoza-Parra, M. A., Gronemeyer, H. Senescence-secreted factors activate Myc and sensitize pretransformed cells to TRAIL-induced apoptosis. Aging Cell. 13 (3), 487-496 (2014).
  66. Fujiya, A., et al. The role of S100B in the interaction between adipocytes and macrophages. Obesity (Silver Spring). 22 (2), 371-379 (2014).
  67. Suganami, T., Nishida, J., Ogawa, Y. A paracrine loop between adipocytes and macrophages aggravates inflammatory changes: role of free fatty acids and tumor necrosis factor alpha. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 25 (10), 2062-2068 (2005).
  68. Yoshida, A., Kitajiri, S., Nakagawa, T., Hashido, K., Inaoka, T., Ito, J. Adipose tissue-derived stromal cells protect hair cells from aminoglycoside. Laryngoscope. 121 (6), 1281-1286 (2011).
  69. May, L. A., et al. Inner ear supporting cells protect hair cells by secreting HSP70. J. Clin. Invest. 123 (8), 3577-3587 (2013).
  70. Jarosz, L. M., Deng, D. M., vander Mei, H. C., Crielaard, W., Krom, B. P. Streptococcus mutans competence-stimulating peptide inhibits Candida albicans hypha formation. Eukaryot Cell. 8 (11), 1658-1664 (2009).
  71. Dagenais, T. R., Giles, S. S., Aimanianda, V., Latgé, J. P., Hull, C. M., Keller, N. P. Aspergillus fumigatus LaeA-mediated phagocytosis is associated with a decreased hydrophobin layer. Infect. Immun. 78 (2), 823-829 (2010).
  72. Spiliotis, M., Lechner, S., Tappe, D., Scheller, C., Krohne, G., Brehm, K. Transient transfection of Echinococcus multilocularis primary cells and complete in vitro regeneration of metacestode vesicles. Int. J. Parasitol. 38 (8-9), 1025-1039 (2008).
  73. Scholzen, A., Mittag, D., Rogerson, S. J., Cooke, B. M., Plebanski, M. Plasmodium falciparum-mediated induction of human CD25Foxp3 CD4 T cells is independent of direct TCR stimulation and requires IL-2, IL-10 and TGFbeta. PLoS Pathog. 5 (8), e1000543 (2009).
  74. Fedoroff, S., Richardson, A. Quantification of Cells in Culture. Protocols for Neural Cell Culture. , 4th ed, Humana. Totowa, NJ. 333-335 (2001).
  75. Fedoroff, S., Richardson, A. Primary Cultures of Sympathetic Ganglia. Protocols for Neural Cell Culture. , 4th ed, Humana. Totowa, NJ. 88-89 (2001).
  76. Kreutzberg, G. W. Microglia: a sensor for pathological events in the CNS. Trends Neurosci. 19 (8), 312-318 (1996).
  77. Hanisch, U. K., Kettenmann, H. Microglia: active sensor and versatile effector cells in the normal and pathologic brain. Nat. Neurosci. 10 (11), 1387-1394 (2007).
  78. Davalos, D., et al. ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. Nat. Neurosci. 8 (6), 752-758 (2005).
  79. Block, M. L., Zecca, L., Hong, J. S. Microglia-mediated neurotoxicity: uncovering the molecular mechanisms. Nat. Rev. Neurosci. 8 (1), 57-69 (2007).
  80. Qureshi, S. T., Larivière, L., Leveque, G., Clermont, S., Moore, K. J., Gros, P., Malo, D. Endotoxin-tolerant mice have mutations in Toll-like receptor 4 (Tlr4). J. Exp. Med. 189, 615-625 (1999).
  81. Sabroe, I., Jones, E. C., Usher, L. R., Whyte, M. K., Dower, S. K. Toll-like receptor (TLR)2 and TLR4 in human peripheral blood granulocytes: a critical role for monocytes in leukocyte lipopolysaccharide responses. J. Immunol. 168, 4701-4710 (2002).
  82. Winterbourn, C. C. Reconciling the chemistry and biology of reactive oxygen species. Nat. Chem. Bio. 4 (5), 278-286 (2008).
  83. Spencer, K. H., Kim, M. Y., Hughes, C. C., Hui, E. E. A screen for short-range paracrine interactions. Integr. Biol. (Camb). 6 (4), 382-387 (2014).

Tags

البيولوجيا الخلوية، العدد 113، المشارك الثقافة، إدراج، transwell، زراعة الخلايا، والعوامل القابلة للذوبان يفرز، PC12، N9، lipopolysaccharide في، السيتوكينات، الخلايا الدبقية الصغيرة، الخلايا العصبية، neuroinflammation
تطوير نظام إدراج المشارك ثقافة نوعين الخلوية في غياب خلية خلية الاتصال
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Renaud, J., Martinoli, M. G.… More

Renaud, J., Martinoli, M. G. Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact. J. Vis. Exp. (113), e54356, doi:10.3791/54356 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter