Introduction
Studiet af væv, organer eller systemer in vitro er et forsøg på at forenkle de komplekse sammenhænge, der er mellem de forskellige cellulære undertyper, der omfatter flercellede organismer. Faktisk in vitro-undersøgelser gør det muligt at erhverve en detaljeret forståelse af enkelte cellepopulationer. Der er to store fordele ved udførelse af in vitro eksperimenter: 1) reducerede cellulære interaktioner, og 2) evnen til let at manipulere den cellulære miljø. Derfor har disse to fordele tilladt forskere til at forudsige adfærden af specifikke celletyper in vivo, hvilket fører til evnen til at regulere resultaterne af ydre påvirkninger i hele organismer. I den forstand, in vitro-cellekultur fungerer ofte som en bro, der forbinder grundforskning og anvendt biovidenskab. Ikke desto mindre, er der også flere ulemper ved at arbejde in vitro, det vigtigste er, at en vis reservation kan bo i den fysiologiskeal relevans af observerede fænotyper. Faktisk, når en enkelt celletype dyrkes i en beholder, kulturen taber til forskellig grad, dens celle-celle forbindelser med andre celletyper, dens bidrag til det humorale miljø fra vævet og organisme oprindelsesland, og ankre inden det væv, gjorde det muligt at opretholde en bestemt tredimensional struktur undertiden afgørende for cellefunktion.
Spørgsmålet om celle-celle relationer er blevet behandlet af udviklingen af blandede kultur teknikker. I denne fremgangsmåde er to eller flere cellepopulationer dyrket sammen i samme dyrkningsbeholder. Men disse blandede kulturer bærer vigtige ulemper. På den ene side, nogle celle undertyper ikke fysisk interagere med hinanden i vævet af oprindelse og udelukkende påberåbe parakrine kommunikation pådrog udskilles opløselige faktorer og nærliggende receptorer. Dette er tilfældet for flere inflammatoriske processer, der afhænger af proximal cytokin signalering. I blandet cultures, fysiske interaktioner er uundgåelig, og gøre det umuligt at studere parakrine kommunikation i fravær af celle-celle kontakter, der kan give ændrede resultater. På den anden side, at opnå cellespecifikke fortolkninger inde fra en blandet population bliver umuligt uden brug af skrappe separationsteknikker som i væsentlig grad kan påvirke resultaterne.
For at løse disse vigtige spørgsmål, er brugen af konditionerede medier blevet udviklet som en teknik der giver mulighed for opdelte kulturer og studiet af paracrine signalering. Denne metode kræver overførsel af supernatanten af en celletype, således opkaldt konditioneret medium, til brøndene indeholdende en anden population af celler. Endnu en vigtig ulempe er, at kortlivede molekyler ikke overleve længe nok i det konditionerede medium, der skal overføres til brøndene i den anden population af celler. Selv langlivede molekyler vil blive stærkt fortyndet med tiden som følge af diffusion. Endvidere er både cellebefolkninger deltager kun i envejs parakrin kommunikation snarere end i aktiv tovejskommunikation. Dette fører til fravær af feedback-signalering, der er afgørende i at genskabe nøjagtige flercellede relationer, som de eksisterer in vivo.
Som en konsekvens, og drevet af behovet for bedre at simulere originalen in vivo forhold i in vitro cellulære miljø har flere fremskridt i cellekultur teknikker opnået i årenes løb. En af de mest betydningsfulde fremskridt har været anvendelsen af gennemtrængelige understøtninger med mikroporøse membraner til afskaerme cellekulturer, der anvendes for første gang ved Grobstein i 1953 1. Sådanne gennemtrængelige understøtninger er tilpasset gennem årene for at rumme mange celletyper og bestemt til brug i flere forskellige applikationer. I dag eksisterer disse understøtninger som hule indsatser, der er designet til at hvile i brønde fra en flere brønde vævskulturplade eller i kredsløb;nende retter. I et co-dyrkningssystem, indeholder indsatsen én celletype henviser brønden eller skålen indeholder den anden cellulær population, hvilket tillader at studere bidraget fra to forskellige populationer af celler på deres humorale miljø (figur 1). Som følge heraf er cellulære polaritet (basolaterale vs apikale sekretion eller signalmodtagelse) udnyttes, hvilket giver insert co-kultursystemer en vigtig fordel i forhold til blandede kulturer og Konditioneret medium teknikker. Flere typer af membranmaterialer er tilgængelige, de mest almindelige er polyester (PET), polycarbonat (PC) eller collagen-coatede polytetrafluorethylen (PTFE), og de findes i forskellige pore- størrelser fra 0,4 um til 12,0 um. Disse sorter af materialer og porestørrelser tilbyder et spektrum af indsatser udøver variable egenskaber er relevante for optiske egenskaber, tykkelse membran og celle vedhæftning, der gør dem praktisk på forskellige niveauer til følgende formål ikke begrænset til:
-studyingcelledifferentiering, fosterudvikling, tumormetastaser og sårheling ved chemotaxic analyser gennem permeable membraner;
-evaluating penetration stof ved at vurdere deres transport gennem epitel eller endotel monolag dyrket på permeable støtter, og;
-performing celle co-kulturer til at analysere celle adfærd modulationer fremkaldt af udskilles opløselige faktorer i fravær af celle-celle kontakt.
Formålet med denne artikel er at beskrive generelle metodologiske retningslinjer til at opfylde den tredje funktion anført ovenfor, der er at evaluere cellulære ændringer medieret af udskilles opløselige faktorer i fravær af celle-celle kontakt ved hjælp af en indsats co-kultur-systemet. Flere forskellige forskningsområder gør brug af insert co-kultur systemer for at besvare spørgsmål relevante for effekten af udskilte opløselige faktorer på populationer af celler. Faktisk parakrin signalering, der modulerer cellulære adfærd på forskellige niveauer er relevant i alle vævog systemer, hvilket gør indsætte co-kultur systemer uundværlig for at sikre fremskridt på disse områder. Omvendt anvendelsen af indsatse kan bekræfte, at signaltransduktion er ved direkte celle-celle-kontakt og ikke af udskilte faktorer. En af de vigtigste anvendelser af indsatse er ved inflammationstilstande studier 2-14 hvor effekten af udskilte cytokiner er vurderet i forskellige cellulære spillere af immunitet. Især har studiet af inflammation i centralnervesystemet (CNS) i høj grad profiteret af insert co-kultur studier, som har lov til bedre at definere de forskellige parakrine roller neuroner og mikroglia i kørsel neuroinflammation 15-21. Disse systemer blev også udviklet til at studere den antiinflammatoriske potentiale af molekyler, der bygger på deres evne til at reducere eller inhibere sekretionen af pro-inflammatoriske faktorer 22-26. Forskning vedrørende kræft 27-31, navnlig mekanismerne bag angiogenese 32-34 og inflammatipå 35-42 i tumorigenese, nyder også godt af insert co-kultur-systemer. Desuden er opløselige faktorer er af afgørende betydning i de processer, der driver differentiering og flere undersøgelser har brugt indsatser til at besvare spørgsmål i det pågældende område 43-50. I CNS, eftersom neuralt væv har en meget begrænset fornyelse potentiale, studiet af neurotrophism og neurobeskyttelse er grundlæggende og er blevet bredt sikres ved hjælp af stamceller i co-dyrkningssystemer 51-56. Desuden er indsætter også udnyttes i så forskellige områder som nefrologi 57,58, endotel interaktioner og angiogenese 59-62, apoptose signalering 63-65, betændelse i fedme og metabolisk syndrom 22,23,66-67, indre øre beskyttelse hår celle 68,69, og selv i svamp virulens 70,71 og parasitologi 72,73.
Denne artikel giver generelle metodiske retningslinjer for at oprette en experiment med henblik på at evaluere cellulære ændringer medieret af udskilte opløselige faktorer der anvender en indsats co-kultursystem. I særdeleshed vil vi fokusere vores opmærksomhed på nerve celle co-kulturer og deres anvendelser i at studere neuroinflammatoriske proces. I betragtning af den meget store spektrum af eksperimenter, der indsætter gøre muligt at pilot, er det uudholdeligt at dække alle aspekter af denne cellekultur teknik. Som et eksempel, at en specifik protokol måle effekterne af cytokiner udskilt af lipopolysaccharid (LPS) -aktiverede N9 mikroglia på neuronale PC12-celler vil blive nærmere, der tilbyder en konkret forståelse af metodik insert co-kultur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NB: Hvert af de følgende trin bør udføres under sterile betingelser i en laminær strømning, som kræves til mammal cellekultur. Desuden de generelle retningslinjer for optimal dyrkning steril celle gælder f.eks., Kassere tips som helst de kan føre til krydskontaminering, at reducere mængden af tid celler udsættes for luften, når du udfører hele medieændringer, korrekt, men forsigtigt omrøring alle cellesuspensioner at sikre deres homogen pipettering, etc. Desuden, skær er en slags plastvarer, der kræver særlig håndtering. Først når indsatser er manipuleret, undgå at berøre den skrøbelige membran, som tårer nemt og kunne derfor bringe eksperimentet. Også, er det ikke egnet til at udføre vakuum aspiration af celledyrkningsmediet, da der er risiko for perforering af membranen eller dissociering adhærente celler. Dernæst skær hænge løst i flerbrøndspladens vævskulturplade og således må der udvises forsigtighed anvendes, når moving den plastvarer eller når pipettering at undgå dissociere adhærente celler. Derudover når der anvendes skær med store porestørrelser, er der en mulighed for, at celledyrkningsmediet siver gennem membranen, og derfor er det vigtigt at hyppigt overvåge niveauet af væske. Endelig skal det bemærkes, at den følgende protokol er beregnet til adhærente celler og kræver mindre modifikationer for at være egnet til suspensionsceller.
1. Generelle retningslinjer for udførelse af insert co-kultur eksperimenter
- Seedning celletype # 1 i indsatser
- Pak de indsatser fra deres emballage.
- Placer indsatser i et tomt flere brønde vævskulturplade af den rette dimension. For at gøre dette, greb den øverste kant af indsatsen med en pincet.
- For at forbedre vedhæftning og spredning af adhærente celler konditioneres skær med cellekulturmedium før podning. For at gøre dette, dækker hele overfladen af membranen med cellekultur medium under anvendelse af en mikropipette.
BEMÆRK: Gør dette til så mange indsatser efter behov. - Sæt låget på pladen og inkuberes i mindst 1 time eller O / N på samme betingelser (sædvanligvis 37 ° C, 5-10% CO2).
- Når indsatsene konditioneres, fjerne alle cellekulturmediet ved anvendelse af en mikropipette. Kassér den brugte medium.
- Seed celletype # 1 i frisk celledyrkningsmedium på samme måde som i en flerbrøndsplade. For at gøre dette, trækker en passende volumen af cellesuspensionen med en mikropipette og dispensere væsken i indsatsen.
BEMÆRK: Forbered så mange indsatser efter behov. - Efter såning alle indsatser Vip forsigtigt pladen til venstre og højre, derefter frem og tilbage for at fordele cellerne jævnt. Undgå at gøre cirkulære bevægelser, da dette vil bevirke, at cellerne akkumulerer i centrum af indsatserne.
- Sæt låget på pladen og inkuber som specificeret af som pr cellulære krav (sædvanligvis 37 ° C, 5-10% CO
- Seeding celletype # 2 i flere brønde vævskulturplader
- Seed celletype # 2 i frisk cellekulturmedium henhold til punkt 1.
- Forbered så mange brønde som krævet for antallet af skær. Rock plade som i trin 1.1.7) for at sikre, at cellerne er jævnt fordelt i brøndene.
- Sæt låget på pladen og inkuber under de samme betingelser (sædvanligvis 37 ° C, 5-10% CO2).
- Forfriskende medium i indsatser
- Med en mikropipette fjerne en del af eller hele celledyrkningsmediet, i indsatserne indeholdende celletype # 1. Kassér den brugte medium.
- Tegn en passende volumen frisk celledyrkningsmedium. hviler forsigtigt spidsen på den indre væg af indsatsen og langsomt afgive celledyrkningsmediet.
- Sæt låget på pladen og inkuberes som pr trin 1.1.4.
- Forfriskende medium i flere brønde vævskulturplader
- Ved hjælp af en micropiPette, fjerne en del af eller hele celledyrkningsmediet i brøndene indeholdende celletype # 2. Kassér den brugte medium.
- Tegn en passende volumen frisk celledyrkningsmedium. Hvile spidsen på den indre væg af brønden og langsomt afgive celledyrkningsmediet.
- Sæt låget på pladen og inkuberes efter i forvejen fastsatte cellekultur protokoller.
- Overførsel inserter indeholdende celletype # 1 til flere brønde vævskulturplader indeholdende celletype # 2.
BEMÆRK: Udfør dette trin, når begge celletyper har nået en passende vækst fase.- Forud for overførsel indsatserne i brønde, foretage de nødvendige medium ændringer, som tidligere beskrevet i trin 1.3) og 1.4).
BEMÆRK: På dette tidspunkt er det vigtigt at dispensere de passende volumener af medier i begge rum som angivet af indsatsen producentens anvisninger. - Ved hjælp af en pincet, greb den øverste kant af en indsats, der indeholder celle type # 1 og læg den forsigtigt i den passende brønd indeholdende celletype # 2.
- Efter overførsel alle skær, kontrollere tilstedeværelsen af luftbobler under membranen af indsatse.
BEMÆRK: Luftbobler forhindre udveksling over membranen af indsatsen og kan true hele eksperimentet. - Hvis der er luftbobler, meget forsigtigt løfte indsatsen fra de godt ved hjælp af en pincet og styrte tilbage i cellekulturmediet. Boblerne forsvinder. Hvis de er stadig til stede, prøv forsigtigt dyppe skær tilbage i celledyrkningsmediet i en vinkel.
BEMÆRK: Du må ikke slå eller røre indsatser for at undgå dissociere klæbende celler. - Efter at have fjernet alle de luftbobler og kontrollere, at de mængder af medier i begge rum, placere låget på pladen og inkuberes.
- Forud for overførsel indsatserne i brønde, foretage de nødvendige medium ændringer, som tidligere beskrevet i trin 1.3) og 1.4).
- Forfriskende medier i en co-kultur-systemet
BEMÆRK: Selvom membranen let tillader udveksling medier mellem indsats og godt, forfriskende mediet sker ibegge rum Da den tid der kræves for at nå ligevægt i de øvre og nedre rum ved diffusion alene kan være ganske lang.- Forfriskende medium i inserter indeholdende celletype # 1 sker på samme måde som i trin 1.3).
- Hvis du vil opdatere medium i brønde, der indeholder celletype # 2, forsigtigt skubbe indsatsen til siden for at skabe et rum bred nok til at rumme en pipettespids. Opdater mediet som i trin 1.4).
- Check for tilstedeværelsen af luftbobler og kontrollere de mængder, som pr trin 1.5.3) gennem 1.5.5).
2. Eksempel: måling af virkningerne af cytokiner udskilt af LPS-aktiverede N9 mikroglia på neuronale PC12-celler
BEMÆRK: Følgende trin er designet til specifikke kolbe, godt og parabol størrelser. Dog kan protokollen tilpasses for eventuelle plasticware dimensioner. For medier og sammensætning se Materialer tabel.
- Podning og differentiere PC12-celler i multibrønds vævskulturplader
- Varm rutine PC12 celledyrkningsmedium, PC12 differentiering medium og trypsin-EDTA i et 37 ° C vandbad.
- Brug PC12-celler ved 60-80% konfluens fra en 75 cm2 kolbe.
- Med en 15 mm Pasteur-pipette, udføre vakuum aspiration af hele celledyrkningsmediet i kolben.
- skylles forsigtigt cellemonolaget med 5 ml sterilt phosphatbufret saltvand og fjerne væsken med en Pasteur-pipette. Pas på ikke at dissociere celler på dette trin.
- Dæk cellemonolaget med 3 ml trypsin-EDTA og inkuberes i 2-3 min ved 37 ° C.
- Sørg for, at alle cellerne fritliggende under et mikroskop. Hvis meget få celler er flydende, inkuberes i en længere periode i højst 5 min.
- Der tilsættes 10 ml rutinemæssig PC12 cellekulturmedium for at inaktivere den trypsin-EDTA.
- Med en 10 ml pipette forsigtigt tritureres samtidig sikre, at de fleste celler adskilles fra bunden of kolben. Undgå at skabe luftbobler i cellesuspensionen.
- Med samme 10 ml pipette cellesuspensionen i et 50 ml centrifugerør.
- Centrifugeres i 1 min ved 3200 xg
- Supernatanten med en Pasteur-pipette samtidig sørge for ikke at forstyrre bundfaldet.
- Der tilsættes 10 ml rutinemæssige PC12 cellekulturmedium med en 10 ml pipette.
BEMÆRK: Denne volumen kan justeres, hvis pillen er usædvanligt små eller store. - Udriv med samme 10 ml pipette at homogenisere pellet. PC12-celler ofte klumper sig sammen, så mindst 20 pipettering op og downare nødvendigt.
BEMÆRK: Mens kraftig findeling er nødvendigt, undgå at skabe luftbobler i cellesuspensionen. - I et 1,5 ml rør, laves en passende fortynding af cellesuspensionen i trypanblåt. Tæl celler ved hjælp af et hæmocytometer efter i forvejen fastsatte protokoller 74.
- I en separat 50 ml rør, opdele cellesuspensionenmed PC12 differentiering medium til opnåelse af en fortyndet cellesuspension egnet til podning af brønde fra en 24-brønds plade (30.000 ¢ / cm2, 0,6 ml per brønd ifølge fabrikantens protokol).
BEMÆRK: Pladen 24-brønd skal tidligere belagt med collagen som angivet af tidligere etablerede protokoller 75. - Fordel 0,6 ml af cellesuspensionen pr brønd med en mikropipette.
- Når alle brønde er seedede, rock plade som i trin 1.1.7).
- For at tillade en korrekt differentiering af PC12-celler, inkuberes 24-brønds plader i 7-9 dage ved 37 ° C i en 5% CO2 fugtig atmosfære i PC12 differentiering medium 15,16 før udførelse co-kultur eksperimenter.
- Udføre udskiftning af medium hver anden dag ved at fjerne halvdelen af væsken og erstatte den med et lige volumen frisk PC12 differentiering medium.
- Seeding N9 mikroglia i indsatserne og behandling med LPS
- En dag før udførelse af co-kultur eksperimenter, der forbehandles PTFE 0,4 um porer skær med rutine N9 celledyrkningsmedium at optimere cellevedhæftning, efter trin 1.1.1) gennem 1.1.4)
- Varm rutine N9 celledyrkningsmedium og trypsin-EDTA i et 37 ° C vandbad.
- I mellemtiden vejer ca. 10 mg LPS i et 1,5 ml rør til senere brug.
BEMÆRK: Da LPS er en potent pro-inflammatorisk endotoksin og kræver særlige sikkerhedsforanstaltninger, briller, handsker og en åndedrætsværn anbefales kraftigt. - Brug N9-celler ved 80-90% konfluens fra en 75 cm2 kolbe.
- Følg trin 2.1.3) til 2.1.14). Brug altid rutine N9 cellekulturmedium i stedet for rutinemæssig PC12 celledyrkningsmedium. Bemærk også, at N9 mikroglia ikke klumper sig sammen så meget som PC12-celler gøre, så færre pipettering op og ned kan være nødvendig ved trin 2.1.13).
- I en separat 50 ml rør, opdele cellesuspensionen med N9 cellekulturmedium til obtain en fortyndet cellesuspension passende til såning skær designet til at holde i 24-brønds plader (60.000 ¢ / cm2, 0,05 ml pr insert ifølge fabrikantens protokol, for membranoverfladeareal se fabrikant information).
BEMÆRK: Disse indsatser er allerede belagt med kollagen af fabrikanten og er optimeret til celleadhæsion. - Fordel 0,05 ml af cellesuspensionen pr insert ved anvendelse af en mikropipette.
- Når alle indsatser er seedet, rock plade som i trin 1.1.7).
- Udfør seriefortyndinger af LPS under anvendelse N9 behandlingsmedium at få 4 ug / ml, 2 pg / ml og 1 ug / ml arbejdsopløsninger.
- Afpipetteres 0,05 ml af 4 ug / ml arbejdsopløsning i en sættet af indsatse med henblik på at opnå en endelig fortynding på 2 pg / ml.
- Gentag trin 2.2.10) for de andre to arbejdsdage løsninger i forskellige sæt skær, hvilket giver endelige fortyndinger på 1 pg / ml og 0,5 ug / ml.
- Icubate pladerne indeholdende inserterne i 24 timer ved 37 ° C i en 5% CO2 fugtig atmosfære for at tillade N9 mikroglia aktivering med LPS før udførelse af co-kultur eksperimenter.
- Co-dyrkning neuronale PC12 celler med N9 mikroglia
- Ved 7-9 dage differentiere PC12-celler, aktivere N9 mikroglia efter 24 timers inkubation med LPS ved varm N9 behandlingsmedium og PC12 behandlingsmedium i et 37 ° C vandbad.
- Udfør en total udskiftning af mediet for N9 mikroglia som i trin 1.3), at udskifte hele brugte medium med 0,1 ml N9 behandlingsmedium. Gør dette for hver insert.This er nødvendigt at fjerne alle spor af LPS, så kun aktiverede N9 mikroglia i indsatserne.
- Udfør en total udskiftning af mediet for neuronale PC12-celler som i trin 1.4). Overfør indsætter i 24-brønds plader som i trin 1.5) .Incubate N9-PC12 co-kulturer i 24 timer eller 48 timer ved 37 ° C i en 5% CO2 fugtig atmosfære.
- efter 24h eller 48 h, indsamles supernatanten og / eller cellerne i cytotoksicitet, enzymbundet immunosorbentassay (ELISA), Western blot, eller andre assays.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Anvendelsen af insert co-kultursystemer er særlig relevante i studiet af neuroinflammatoriske processer som udstillingsvindue parakrine relationer mellem forskellige cellulære spillere i CNS. Immunitet i CNS opnås hovedsageligt af residente celler kaldet mikroglia, der overvåger deres miljø i deres hvile forgrenet tilstand (figur 2A) og er i stand til sensing forstyrrelser, der kunne besvære meget kostbar homeostase nødvendig for korrekt neuronal funktion 76-78. Mikroglial aktivering, kendetegnet ved vedtagelsen af en amoeboid form (figur 2B) og multiplikation af cellepopulationen betegnes mikrogliose (figur 3), efterfulgt af frigivelsen af pro-inflammatoriske mediatorer, såsom cytokiner, udgør den ledende aspekt af neuroinflammation 79 . Cytokinfrigivelse tjener den ædle formål at beskytte neuroner mod skadelige angreb og er closely overvåget. Men når neuroinflammation undslipper denne stramme styring, det vedtager en destruktiv karakter og kan alvorligt skade CNS. Eftersom neurale væv har en meget begrænset fornyelse potentiale, CNS er så meget mere modtagelige for sådanne auto-destruktiv inflammatoriske responser. Undersøgelse af krydstale, der eksisterer mellem neuroner og mikroglia er bydende nødvendigt i at belyse de underliggende mekanismer neuroinflammation. I modsætning til blandede kulturer, insert co-kultur systemer gør det muligt investigator til at identificere hvilken celle population genererer de toksiske virkninger, og som man bliver påvirket.
Her, PC12-celler differentierede i 7-9 dage med nervevækstfaktor blev co-dyrket med LPS-aktiverede N9 mikroglia med det mål at quantifyingthe skadelige virkninger af inflammation stammende opløselige faktorer på neuroner. For at gøre dette, blev neuronale PC12 celler dyrket i 24-brønds plader, mens N9 mikroglia blev podet i indsatser. N9 microglien blev behandlet i 24 timer med LPS, en meget potent proinflammatorisk endotoksin omfattet i de ydre membraner af gram-negative bakterier. LPS vides at aktivere toll-like receptor 4 således fremkalde en robust inflammatorisk respons i et bredt udvalg af immuneffektorceller, herunder immortaliserede murine cellelinie N9 microglia 80,81. De følgende repræsentative resultater viser, at N9 mikroglia aktiveret med LPS har en tendens til at øge deres population (figur 3) og til at udskille opløselige proinflammatoriske cytokiner, såsom interleukin-6 (IL-6), interferon gamma (IFN-γ) og tumornekrosefaktor-alpha (TNF-α), som let krydse membranen af de co-kultur skær og forårsage cytotoksisk skade på neuronale PC12-celler vokser i det nedre rum.
Den forreste bekymring før overførsel af LPS-aktiverede N9 mikroglia til brøndene, der indeholder neuronale PC12 celler består i bekræftelse that PC12 er korrekt differentieret. Syv dages differentierede PC12-celler skal udvise tydelige neuronale fænotyper, såsom en fladere celle organ, som rager flere lange neuritter undertiden selv udviser varicosities (figur 4). Når dette kontrolpunkt er udført, kan N9 microglia inserter indeholdende frisk medium blottet for LPS overføres til brøndene indeholdende differentierede PC12. Efter en inkubationsperiode på 24 timer eller 48 timer, supernatanten i det nedre rum høstes og en cytotoksicitet assay baseret på lactatdehydrogenase release 15,16, samt en ELISA 15, at måle cytokiner udføres. Det er vigtigt at høste supernatanten i det nedre kammer for at måle de cytokiner, der har faktisk krydsede den permeable membran, og som kan aktivere receptorer på overfladen af PC12-celler. Resultater viser, at LPS-aktiverede N9 mikroglia fra det øvre rum generere en dosis- og tidsafhængig cytotoxic virkning på differentierede neuronale PC12-celler, der er i det nedre rum (figur 5). Den 0,5 ug / mL LPS betingelse er dog ikke signifikant cytotoksisk på 24 timer eller 48 timer. Cytotoksicitet fandtes at nå næsten 100% i 2 ug / ml LPS i 48 timer tilstand. Endvidere viser resultaterne, at koncentrationen af pro-inflammatoriske cytokiner IL-6, IFN-y og TNF-a i supernatanten stiger i takt med observerede cytotoksicitet. Specifikt IL-6 koncentrationer steg betydeligt efter 24 timer kun for 2 ug / ml betingelse, mens 1 pg / ml LPS giver også signifikant forhøjede niveauer af cytokinet efter 48 timer (figur 6). Microglia udskille IFN-γ, der når det nedre rum i en signifikant øget måde, når de behandles med 1 ug / ml og 2 pg / ml, og inkuberes med differentierede neuronale PC12-celler til enten 24 timer eller 48 timer (figur 7). Den 0,5 ug / mlLPS tilstand igen øger ikke IFN-y-niveauer signifikant. Endelig blev TNF-a-koncentrationer i det nedre rum kvantificeret ved ELISA og viste sig at være den mest forøget med LPS-aktivering af mikroglia og nåede niveauer næsten syv gange mere vigtigt end kontrollen tilstand (figur 8). Især både 24 timers og 48 timers inkubationsperioder forårsagede betydelige stigninger i TNF-α niveauer i supernatanten. Imidlertid 1 ug / ml LPS tilstand gav en signifikant stigning i TNF-α-niveauer efter 48 timer. Som helhed viser disse resultater, at udskilte pro-inflammatoriske cytokiner i det mindste delvist ansvarlige for de cytotoksiske virkninger observeret i differentierede neuronale PC12-celler efter en 24 timers eller 48 timers inkubationsperiode med mikroglia aktiveres af forskellige koncentrationer af LPS.
Indsæt co-kultur systemer af LPS-aktiverede N9 mikroglia og PC12 celler har vist sig atvære særligt nyttige i studiet af neuroinflammation og i udarbejdelsen af strategier til at modvirke den. Vores gruppe viste for nylig, at LPS-aktiverede N9 mikroglia dyrket i cellekultur indsætter udviser forøget transkription af pro-inflammatoriske cytokiner, som igen inducerer apoptose af nervevækstfaktor-opdelte PC12-celler ved at krydse mikroporer indsatsen 15, 16. I samme paradigme, forbehandling af mikroglial befolkning med polyphenoliske forbindelsen resveratrol (0,1 pM, 3 timer) forebyggede transkriptionen af pro-inflammatoriske cytokiner og således hæmmet apoptose af differentierede neuronale PC12-celler ved at blokere caspase-3-aktivering og derefter , DNA-spaltning. En anden gruppe har også vist de neurobeskyttende virkninger af E-vitamin i en N9-PC12 co-kultur 26. Udover N9-PC12 co-kulturer, har forskellige udødeliggjort cellelinjer eller primære kulturer også været ansat i en situation med neuroinflammation. For eksempelmurin mikroglia BV2 cellelinie blev co-dyrket med human neuroblastom SH-SY5Y-celler til at vise den anti-apoptotiske virkning af polyphenoliske luteolin tilsyneladende medieret af dets anti-inflammatoriske potentiale 17. Samt blev BV2 mikroglia aktiveret af tilskadekomne PC12-celler vist at udøve anti-apoptotiske virkninger i mesenchymstamceller 18. Gensidige signalering blev vist sig at være vigtige i den anti-apoptotiske mekanismer underliggende primære mikroglia neurobeskyttelse tillagt primære cerebellare granula neuroner 19. Endvidere primære hippocampale neuroner blev co-dyrket med primær mikroglia aktiveret af udskilt amyloidprecursorprotein for at vurdere frigivelsen af glutamat ved cystein udveksling og den efterfølgende svækkelse af synaptisk funktion 20. Endelig én gruppe viste også krydstale, der eksisterer mellem primære hippocampale neuroner og primære mikroglia vedrørende fractalkin signalering, et chemokin konstitutivt expressed af neuroner i CNS hvis receptoren findes på overfladen af mikroglia 21.
Figur 1. Skematisk gengivelse af en indsats co-dyrkningssystem. Den øvre rum er sammensat af den indsats, der er indehaver af et celletype og dens apikale humorale miljø. Det nedre kammer består af en brønd eller skål indeholdende den anden celletype. Indsatsen hviler på kanterne af flerbrøndspladens vævskultur plade eller skål. Indsatsen er beregnet til at ligge lige over bunden af brønden for ikke at røre populationen af celler vokser nedenfor. Mediet i det nederste rum er i kontakt med både den basale overflade af den første celletype og den apikale overflade af den anden celletype. Klik her for at se et større version af dette tal.
Figur 2. mikrofotografier af N9 mikroglia. (A) Ubehandlede hvilende N9 mikroglia i indstik udviser en forgrenet cellulær morfologi giver dem mulighed for aktivt at overvåge deres omgivelser. (B) N9 mikroglia i inserter behandlet med lipopolysaccharid (LPS) i 24 timer display en amoeboid form typisk for den aktiverede fænotype. Denne mikrofotografi blev taget lige før overførsel indsatsen indeholder disse aktiverede N9 mikroglia til brønde, der indeholder differentierede PC12 celler, som illustreret i figur 4. Scale bar = 25 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. mikrofotografier af differentierede neuronale PC12 celler. Syv-dages nerve growth factor-opdelte neuronal PC12 celler viser tydelige neuronale fænotyper såsom lange neuritter og varicosities. Denne mikrofotografi blev taget lige før overførsel indsatserne indeholder aktiverede N9 mikroglia som afbilledet i figur 2. Scale bar = 25 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. Cytotoksisk virkning af lipopolysaccharid (LPS) -aktiverede mikroglia på differentierede neuronale PC12-celler.N9 mikroglia blev aktiveret med forskellige koncentrationer af LPS i 24 timer, derefter overført til brønde indeholdende differentierede neuronale PC12-celler i 24 timer eller 48 timer. Cytotoksicitet blev evalueret under anvendelse af en lactat dehydrogenase release assay udført på supernatanten af det nedre kammer. Signifikante forskelle mellem grupper blev konstateret af envejs variansanalyse efterfulgt af Tukey post-hoc analyse med GraphPad Instat, version 3.06 til Windows (San Diego, CA; www.graphpad.com). Alle data, analyseret ved 95% konfidensintervallet, er udtrykt som middelværdi ± standardfejl på middelværdien fra 3 uafhængige forsøg, hvor 6 brønde blev overvejet. Stjerner angiver statistiske forskelle mellem behandling og kontrol tilstand (*** p <0,001). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6. Koncentration af i nterleukin-6 (IL-6) i supernatanten efter N9 aktivering med lipopolysaccharid (LPS). N9 mikroglia blev aktiveret med forskellige koncentrationer af LPS i 24 timer, og derefter overført til brønde indeholdende differentierede neuronale PC12 celler til 24 timers eller 48 timers. IL-6 koncentrationer i supernatanten af det nedre kammer blev vurderet ved anvendelse af et ELISA. Signifikante forskelle mellem grupper blev konstateret af envejs variansanalyse efterfulgt af Tukey post-hoc analyse med GraphPad Instat, version 3.06 til Windows (San Diego, CA; www.graphpad.com). Alle data, analyseret ved 95% konfidensintervallet, er udtrykt som middelværdi ± standardfejl på middelværdien fra 3 uafhængige forsøg, hvor 6 brønde blev overvejet. Stjerner angiver statistiske forskelle mellem behandlingen og control tilstand (*** p <0,001, ** p <0,01 og * p <0,05). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7. Koncentration af interferon gamma (IFN-γ) i supernatanten efter N9 aktivering med lipopolysaccharid (LPS). N9 mikroglia blev aktiveret med forskellige koncentrationer af LPS i 24 timer, og derefter overført til brønde indeholdende differentierede neuronale PC12-celler i 24 timer eller 48 timer. IFN-y koncentrationer i supernatanten af det nedre kammer blev vurderet ved anvendelse af et ELISA. Signifikante forskelle mellem grupper blev konstateret af envejs variansanalyse efterfulgt af Tukey post-hoc analyse med GraphPad Instat, version 3.06til Windows (San Diego, CA, www.graphpad.com). Alle data, analyseret ved 95% konfidensintervallet, er udtrykt som middelværdi ± standardfejl på middelværdien fra 3 uafhængige forsøg, hvor 6 brønde blev overvejet. Stjerner angiver statistiske forskelle mellem behandling og kontrol tilstand (** p <0,01 og * p <0,05). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 8. Koncentration af tumornekrosefaktor alfa (TNF-α) i supernatanten efter N9 aktivering med lipopolysaccharid (LPS). N9 mikroglia blev aktiveret med forskellige koncentrationer af LPS i 24 timer, og derefter overført til brønde indeholdende differentierede neuronale PC12 celler til 24 timer eller 48 timer. TNF-αkoncentrationer i supernatanten af det nedre kammer blev vurderet ved anvendelse af et ELISA. Signifikante forskelle mellem grupper blev konstateret af envejs variansanalyse efterfulgt af Tukey post-hoc analyse med GraphPad Instat, version 3.06 til Windows (San Diego, CA; www.graphpad.com). Alle data, analyseret ved 95% konfidensintervallet, er udtrykt som middelværdi ± standardfejl på middelværdien fra 3 uafhængige forsøg, hvor 6 brønde blev overvejet. Stjerner angiver statistiske forskelle mellem behandling og kontrol tilstand (*** p <0,001). Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det mest kritiske trin med nogen insertion co-dyrkningssystem eksperiment faktisk dvæler i at vælge den korrekte insert at bruge. Der skal træffes porestørrelse og membranmateriale i grundig konto, uden at glemme at overveje den type celler, som vil blive podet og formålet med forsøget. For eksempel kan chemotaxic analyser anvender den samme type membran end celle co-kulturer til analyse celleadfærd modulationer induceret af udskilte opløselige faktorer i fravær af celle-celle-kontakt. Men begge typer af eksperimenter kræver forskellige porestørrelser: større dem for det tidligere, for at tillade celle migration og mindre for sidstnævnte, at udelukke celle migration og celle-celle kontakt. Til vurdering af cellulære ændringer medieret af udskilte opløselige faktorer i fravær af celle-celle-kontakt, porestørrelser på 0,4 um eller 3 um er sædvanligvis hensigtsmæssig, da de giver mulighed for store molekyler, såsom proteiner, til at krydse, men forhindre de fleste celler i at gøre så. Membranemateriale i høj grad afhænger af celletypen og de teknikker, der skal anvendes ved afslutningen af den cellekultur-protokollen. Kort beskrevet PET membraner tilbyder god celle synlighed som de er klare, men er ikke collagen overtrukket, hvilket kan være et problem for adhærente celler, der kræves til støtte, der skal behandles. De har også det bedste kemisk resistens over for fikseringsmidler, der, sammen med deres gode optiske egenskaber, der gør dem ideelle til histologiske undersøgelser. På den anden side, PC membraner tilbyder fattige celle synlighed som de er gennemskinnelige og er ikke collagen overtrækkes. Men de har den højeste tæthed af porer og mest diversificerede tilgængeligheden af porestørrelser. Endelig PTFE membraner er klart, når våd, men kun tillade visualisering af celle- skitserer i mikroskopet. Som en stor fordel, er de collagenovertrukne, hvilket også gør dem lidt tykkere. Det er vigtigt at bemærke, at overtrækning af PET eller PC membran skær med collagen kan blokere porerne og hindre passagen af opløselige factors. Under alle omstændigheder, de fleste indsætte producenter tilbyder omfattende vejledninger til at hjælpe forskere med at vælge den rigtige indsats. I vores specifikke paradigme, har valg af plating tæthed, medier, serumkoncentration, dage af differentiering, dage af LPS-aktivering, koncentrationer af LPS, og belægning af kolber til PC12 celler blevet optimeret over års arbejde med disse co-kultur systemer 15 , 16. Bemærkelsesværdige blev udpladningsdensitet af N9 mikroglia i indsatserne valgt ved 60.000 ¢ / cm2 for at opnå 40-50% konfluens på tidspunktet for påbegyndelse af co-kultur og således at give dem plads til mangfoldige på deres aktivering med LPS. Andre betingelser, når optimerede kan også give tilfredsstillende resultater, såsom substituere collagen ved L-lysin i kolberne bestemt til nativt PC12 vedligeholdelse.
For at øge bæredygtigheden af resultaterne, kan udføres flere forskellige kontroller. Når jeg forsøger at bevise, at opløselige faktorerer ansvarlige for de observerede virkninger, bør blandede kulturer manifesterer direkte celle-celle kontakt og aircondition mellemstore eksperimenter gennemføres parallelt. Endvidere gør brug af antistoffer til at neutralisere et specifikt secerneret faktor vil hjælpe med at identificere molekylet ansvarlig for parakrine virkning, der opfattes. Når det er muligt, blokere en receptor eller en del af dens signalvej at lokalisere den nøjagtige identitet af receptoren aktiveres. Hvis et molekyle anvendes til at aktivere en cellepopulation før co-kultur eksperiment med en anden celletype, såsom i den tidligere beskrevne eksempel, er det vigtigt at tage hensyn til tilstedeværelsen af molekylet i systemet. Som en første mulighed, bør mediet fuldstændigt ændret inden co-kultur eksperiment for at sikre, at molekylet er fraværende fra helt systemet. Som en anden mulighed, bør tilføjes en tilstand, hvor alene molekylet inkuberes med den anden celletype for atvurdere dens virkning i fravær af den første celletype. Hvis der ikke er nogen virkning af molekylet på den anden celletype, vil der ikke være behov for at ændre mediet før co-kultur eksperiment. Ligeledes, hvis begge celletyper ikke dyrkes i den samme celle dyrkningsmediet, lignende forholdsregler skal træffes for at sikre, at forskellene i medium sammensætning ikke påvirker den ene eller den anden celle population. Selv om begge medier vil blive adskilt af indsatsen membranen i første omgang, er diffusion forpligtet til at sikre, at de vil blande over længere inkubationsperioder. Desuden kan der opstå flere problemer fra aberrerende afbrydelse af opløselige faktor-receptor relationer. Blandt flere fejlårsager, kan overdreven brug af enzymatisk dissociation og tilstedeværelsen af vigtige koncentrationer af serum interfererer med celleoverfladereceptorer. Andre fejlkilder ved insert co-kultursystemer indbefatter, men er ikke begrænset til 1) forkert celledyrkningsteknikker, såsom fjernelse totaliteten af cellendyrkningsmedium i for mange brønde samtidig forårsager celler til tørre, 2) et monolag, der er for sammenflydende i indsatsen, der er ansvarlig for aflukning indsatsen membran og forhindrer apikalt-secernerede molekyler at nå det nedre rum, og 3) forkert indstillet celle sammenløb, der forårsager en over- eller under-ekspression af opløselige faktorer, der fører til fysiologisk irrelevante resultater eller mangel af effekt.
Mens kun et scenario med insert co-kultur blev præsenteret her, er der talrige måder at gøre brug af denne meget alsidig teknik. Her, én celletype blev forbehandlet med et molekyle der er ansvarlig for at inducere sekretion af et opløseligt faktor, der ved overførsel af indsatsen til brønden, påvirker adfærden af den anden celletype. Det er også muligt at inkubere begge celletyper sammen i et co-kultursystem før adskille dem til at detektere den forøgede sårbarhed eller modstand på den ene eller begge cellepopulationer til et skjult behandling. HoWever, når de overvejer sin mest rudimentære form, kan denne teknik gør brug af to populationer af celler inkuberet sammen uden nogen form for behandling, med det mål at vurdere basal parakrine gensidig signalering.
Den vigtigste begrænsning ved denne teknik er, at meget kortlivede molekylære enheder såsom reaktive oxygenspecies ikke overlever den afstand, der adskiller cellepopulationen vokser i det øvre rum, og den i det nedre rum 82. Den seneste udvikling i samarbejde dyrkningsteknikker har forsøgt at besvare dette problem ved at bruge en mikrofabrikeret kultur substrat stand til at opretholde to cellepopulationer i mikroskala nærhed 83. Ud over at bære alle fordelene ved insert co-kultursystemer, såsom befolkningens-specifik påvisning af ændringer og tovejs signalering, var dette mikrofabrikeret skærm også påvist at muliggøre påvisning af kortrækkende interaktioner, som ikke var før detectable grund af henfald af opløselige faktorer over afstande. Denne cellekultur platform er den seneste nyskabelse i celle co-kultur og lover at hjælpe optrævle signalering mekanismer mellem celler, der blev overset før.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI-1640 medium | Sigma | R8755 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham | Sigma | D6421 | Warm in 37 °C water bath before use, must be supplemented with 0.365 gm/L L-glutamine |
| Horse serum | ATCC | 30-2040 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Fetal bovine serum | MultiCell | 80350 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Nerve Growth Factor-7S from murine submaxillary gland | Sigma | N0513 | Reconstitute the lyophilized powder in a solution of buffered saline or tissue culture medium containing 0.1–1.0% bovine serum albumin or 1-10% serum |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma | T3924 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli 055:B5 | Sigma | L2880 | Toxic |
| Cell culture inserts for use with 24-well plates | BD Falcon | 353095 | 0.4 μm pores |
| 24-well plates | TrueLine | TR5002 | Coat with collagen before use |
| Routine PC12 cell culture medium | Routine N9 cell culture medium | ||
| - 85% RPMI medium | - 90% DMEM-F12 medium | ||
| - 10% heat-inactivated horse serum | - 10% heat-inactivated horse serum | ||
| - 5% heat-inactivated fetal bovine serum | |||
| PC12 differentiation medium | N9 treatment medium | ||
| - 99% RPMI medium | - 99% DMEM-F12 medium | ||
| - 1% heat-inactivated fetal bovine serum | - 1% heat-inactivated fetal bovine serum | ||
| - 50 ng/mL nerve growth factor | |||
| PC12 treatment medium | |||
| - 99% RPMI medium | |||
| - 1% heat-inactivated fetal bovine serum |
References
- Grobstein, C. Morphogenetic interaction between embryonic mouse tissues separated by a membrane filter. Nature. 172 (4384), 869-870 (1953).
- Hoffman, R. A. Intraepithelial lymphocytes coinduce nitric oxide synthase in intestinalepithelial cells. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 278 (6), G886-G894 (2000).
- Zhang, W. C., et al. Regulatory T cells protect fine particulate matter-induced inflammatory responses in human umbilical vein endothelial cells. Mediators Inflamm. 2014, 869148 (2014).
- Vasileiadou, K., et al. alpha1-Acid glycoprotein production in rat dorsal air pouch in response to inflammatory stimuli, dexamethasone and honey bee venom. Exp. Mol. Pathol. 89 (1), 63-71 (2010).
- Talayev, V. Y., et al. The effect of human placenta cytotrophoblast cells on the maturation and T cell stimulating ability of dendritics cells in vitro. Clin. Exp. Immunol. 162 (1), 91-99 (2010).
- Elishmereni, M., et al. Physical interactions between mast cells and eosinophils: a novel mechanism enhancing eosinophil survival in vitro. Allergy. 66 (3), 376-385 (2011).
- Ishihara, Y., et al. Regulation of immunoglobulin G2 production by prostaglandin E(2) and platelet-activating factor. Infect. Immun. 68 (3), 1563-1568 (2000).
- Kranzer, K., Bauer, M., Lipford, G. B., Heeg, K., Wagner, H., Lang, R. CpG-oligodeoxynucleotides enhance T-cell receptor-triggered interferon- gamma production and up-regulation of CD69 via induction of antigen- presenting cell-derived interferon type I and interleukin-12. Immunology. 99 (2), 170-178 (2000).
- Vendetti, S., Chai, J. G., Dyson, J., Simpson, E., Lombardi, G., Lechler, R. Anergic T cells inhibit the antigen-presenting function of dendritic cells. J. Immunol. 165 (3), 1175-1181 (2000).
- Haller, D., Bode, C., Hammes, W. P., Pfeifer, A. M., Schiffrin, E. J., Blum, S. Non-pathogenic bacteria elicit a differential cytokine response by intestinal epithelial cell/leucocyte co-cultures. Gut. 47 (1), 79-87 (2000).
- Dono, M., et al. In vitro stimulation of human tonsillar subepithelial B cells: requirement for interaction with activated T cells. Eur. J. Immunol. 31 (3), 752-756 (2001).
- Yu, Y., et al. Enhancement of human cord blood CD34+ cell-derived NK cell cytotoxicity by dendritic cells. J. Immunol. 166 (3), 1590-1600 (2001).
- Watanabe, T., Tokuyama, S., Yasuda, M., Sasaki, T., Yamamoto, T. Changes of tissue factor-dependent coagulant activity mediated by adhesion between polymorphonuclear leukocytes and endothelial cells. Jpn J. Pharmacol. 86 (4), 399-404 (2001).
- Krampera, M., et al. Bone marrow mesenchymal stem cells inhibit the response of naive and memory antigen-specific T cells to their cognate peptide. Blood. 101 (9), 3722-3729 (2003).
- Bournival, J., Plouffe, M., Renaud, J., Provencher, C., Martinoli, M. G. Quercetin and sesamin protect dopaminergic cells from MPP+-induced neuroinflammation in a microglial (N9)-neuronal (PC12) coculture system. Oxid. Med. Cell. Longev. 2012, 921941 (2012).
- Bureau, G., Longpré, F., Martinoli, M. G. Resveratrol and quercetin, two natural polyphenols, reduce apoptotic neuronal cell death induced by neuroinflammation. J. Neurosci. Res. 86 (2), 403-410 (2008).
- Zhu, L., Bi, W., Lu, D., Zhang, C., Shu, X., Lu, D. Luteolin inhibits SH-SY5Y cell apoptosis through suppression of the nuclear transcription factor-κB, mitogen-activated protein kinase and protein kinase B pathways in lipopolysaccharide-stimulated cocultured BV2 cells. Exp. Ther. Med. 7 (5), 1065-1070 (2014).
- Luo, X., et al. BV2 enhanced the neurotrophic functions of mesenchymal stem cells after being stimulated with injured PC12. Neuroimmunomodulation. 16 (1), 28-34 (2009).
- Polazzi, E., Gianni, T., Contestabile, A. Microglial cells protect cerebellar granule neurons from apoptosis: evidence for reciprocal signaling. Glia. 36 (3), 271-280 (2001).
- Barger, S. W., Basile, A. S. Activation of microglia by secreted amyloid precursor protein evokes release of glutamate by cystine exchange and attenuates synaptic function. J. Neurochem. 76 (3), 846-854 (2001).
- Zujovic, V., Taupin, V. Use of cocultured cell systems to elucidate chemokine-dependent neuronal/microglial interactions: control of microglial activation. Methods. 29 (4), 345-350 (2003).
- Iwashita, M., et al. Valsartan, independently of AT1 receptor or PPARγ, suppresses LPS-induced macrophage activation and improves insulin resistance in cocultured adipocytes. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 302 (3), E286-E296 (2012).
- Oliver, E., et al. Docosahexaenoic acid attenuates macrophage-induced inflammation and improves insulin sensitivity in adipocytes-specific differential effects between LC n-3 PUFA. J. Nutr. Biochem. 23 (9), 1192-1200 (2012).
- Tang, S. Y., Cheah, I. K., Wang, H., Halliwell, B. Notopterygium forbesii Boiss extract and its active constituent phenethyl ferulate attenuate pro-inflammatory responses to lipopolysaccharide in RAW 264.7 macrophages. A "protective" role for oxidative stress. Chem. Res. Toxicol. 22 (8), 1473-1482 (2009).
- De Boer, A. A., Monk, J. M., Robinson, L. E. Docosahexaenoic acid decreases pro-inflammatory mediators in an in vitro murine adipocyte macrophage co-culture model. PLoS One. 9 (1), e85037 (2014).
- Li, Y., Liu, L., Barger, S. W., Mrak, R. E., Griffin, W. S. Vitamin E suppression of microglial activation is neuroprotective. J. Neurosci. Res. 66 (2), 163-170 (2001).
- Brizuela, L., et al. Osteoblast-derived sphingosine 1-phosphate to induce proliferation and confer resistance to therapeutics to bone metastasis-derived prostate cancer cells. Mol. Oncol. 8 (7), 1181-1195 (2014).
- Yuan, L., Chan, G. C., Fung, K. L., Chim, C. S. RANKL expression in myeloma cells is regulated by a network involving RANKL promoter methylation, DNMT1, microRNA and TNFα in the microenvironment. Biochim. Biophys. Acta. 1843, 1834-1838 (2014).
- Krtolica, A., Parrinello, S., Lockett, S., Desprez, P. Y., Campisi, J. Senescent fibroblasts promote epithelial cell growth and tumorigenesis: a link between cancer and aging. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 98 (21), 12072-12077 (2001).
- Lawrenson, K., Grun, B., Benjamin, E., Jacobs, I. J., Dafou, D., Gayther, S. A. Senescent fibroblasts promote neoplastic transformation of partially transformed ovarian epithelial cells in a three-dimensional model of early stage ovarian cancer. Neoplasia. 12 (4), 317-325 (2010).
- Liu, J., et al. BCR-ABL mutants spread resistance to non-mutated cells through a paracrine mechanism. Leukemia. 22 (4), 791-799 (2008).
- Giuliani, N., et al. Proangiogenic properties of human myeloma cells: production of angiopoietin-1 and its potential relationship to myeloma-induced angiogenesis. Blood. 102 (2), 638-645 (2003).
- Gupta, D., et al. Adherence of multiple myeloma cells to bone marrow stromal cells upregulates vascular endothelial growth factor secretion: therapeutic applications. Leukemia. 15 (12), 1950-1961 (2001).
- Anderson, I. C., Mari, S. E., Broderick, R. J., Mari, B. P., Shipp, M. A. The angiogenic factor interleukin 8 is induced in non-small cell lung cancer/pulmonary fibroblast cocultures. Cancer Res. 60 (2), 269-272 (2000).
- Hoechst, B., et al. A new population of myeloid-derived suppressor cells in hepatocellular carcinoma patients induces C4(+)CD25(+)Foxp3(+) T cells. Gastroenterology. 135 (1), 234-243 (2008).
- Karadag, A., Oyajobi, B. O., Apperley, J. F., Russell, R. G., Croucher, P. I. Human myeloma cells promote the production of interleukin 6 by primary human osteoblasts. Br. J. Haematol. 108 (2), 383-390 (2000).
- Garrido, S. M., Appelbaum, F. R., Willman, C. L., Banker, D. E. Acute myeloid leukemia cells are protected from spontaneous and drug- induced apoptosis by direct contact with a human bone marrow stromal cell line (HS-5). Exp. Hematol. 29 (4), 448-457 (2001).
- Heissig, B., Pasternak, G., Horner, S., Schwerdtfeger, R., Rossol, S., Hehlmann, R. CD14+ peripheral blood mononuclear cells from chronic myeloid leukemia and normal donors are inhibitory to short- and long-term cultured colony-forming cells. Leuk. Res. 24 (3), 217-231 (2000).
- Moore, M. B., Kurago, Z. B., Fullenkamp, C. A., Lutz, C. T. Squamous cell carcinoma cells differentially stimulate NK cell effector functions: the role of IL-18. Cancer Immunol Immunother. 52 (2), 107-115 (2003).
- Giuliana, N., et al. Human myeloma cells stimulate the receptor activator of nuclear factor- kappa B ligand (RANKL) in T lymphocytes: a potential role in multiple myeloma bone disease. Blood. 100 (13), 4615-4621 (2002).
- Ye, Z., Haley, S., Gee, A. P., Henslee-Downey, P. J., Lamb, L. S. Jr In vitro interactions between gamma deltaT cells, DC, and CD4+ T cells; implications for the immunotherapy of leukemia. Cytotherapy. 4 (3), 293-304 (2002).
- Zhang, X. M., Xu, Q. Metastatic melanoma cells escape from immunosurveillance through the novel mechanism of releasing nitric oxide to induce dysfunction of immunocytes. Melanoma Res. 11 (6), 559-567 (2001).
- Zhang, M., et al. The differentiation of human adipose-derived stem cells towards a urothelium-like phenotype in vitro and the dynamic temporal changes of related cytokines by both paracrine and autocrine signal regulation. PLoS One. 9 (4), e95583 (2014).
- Qu, C., et al. Chondrogenic differentiation of human pluripotent stem cells in chondrocyte co-culture. Int. J. Biochem. Cell. Biol. 45 (8), 1802-1812 (2013).
- Krassowska, A., et al. Promotion of haematopoietic activity in embryonic stem cells by the aorta-gonad-mesonephros microenvironment. Exp. Cell. Res. 312 (18), 3595-3603 (2006).
- Darcy, K. M., et al. Mammary fibroblasts stimulate growth, alveolar morphogenesis, and functional differentiation of normal rat mammary epithelial cells. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 36 (9), 578-592 (2000).
- Spector, J. A. Co-culture of osteoblasts with immature dural cells causes an increased rate and degree of osteoblast differentiation. Plast. Reconstr. Surg. 109 (2), 631-642 (2002).
- Khanolkar, A., Fu, Z., Underwood, L. J., Bondurant, K. L., Rochford, R., Cannon, M. J. CD4+ T cell-induced differentiation of EBV-transformed lymphoblastoid cells is associated with diminished recognition by EBV-specific CD8+ cytotoxic T cells. J. Immunol. 170 (6), 3187-3194 (2003).
- Fritsch, C. Epimorphin expression in intestinal myofibroblasts induces epithelial morphogenesis. J. Clin. Invest. 110 (11), 1629-1641 (2002).
- Abouelfetouh, A., Kondoh, T., Ehara, K., Kohumra, E. Morphological differentiation of bone marrow stromal cells into neuron-like cells after co-culture with hippocampal slice. Brain Res. 1029 (1), 114-119 (2004).
- Llado, J., Haenggeli, C., Maragakis, N., Snyder, E., Rothstein, J. Neural stem cells protect against glutamate-induced excitotoxicitiy and promote survival of injured motor neurons through the secretion of neurotrophic factors. Mol. Cell. Neurosci. 27 (3), 322-331 (2004).
- Fong, S. P., et al. Trophism of neural progenitor cells to embryonic stem cells: Neural induction and transplantation in a mouse ischemic stroke model. J. Neurosci. Res. 85 (9), 1851-1862 (2007).
- Gordon-Keylock, S. A., et al. Induction of hematopoietic differentiation of mouse embryonic stem cells by an AGM-derived stromal cell line is not further enhanced by overexpression of HOXB4. Stem Cells. 19 (11), 1687-1698 (2010).
- Yang, T., Tsang, K. S., Poon, W. S., Ng, H. K. Neurotrophism of bone marrow stromal cells to embryonic stem cells: noncontact induction and transplantation to a mouse ischemic stroke model. Cell transplant. 18 (4), 391-404 (2009).
- Kim, J. Y., et al. Umbilical cord blood mesenchymal stem cells protect amyloid-β42 neurotoxicity via paracrine. World J. Stem Cells. 4 (11), 110-116 (2012).
- Mauri, M., et al. Mesenchymal stem cells enhance GABAergic transmission in co-cultured hippocampal neurons. Mol. Cell Neurosci. 49 (4), 395-405 (2012).
- Ichikawa, J., et al. Increased crystal-cell interaction in vitro under co-culture of renal tubular cells and adipocytes by in vitro co-culture paracrine systems simulating metabolic syndrome. Urolithiasis. 42 (1), 17-28 (2014).
- Zuo, L., et al. A Paracrine mechanism involving renal tubular cells, adipocytes and macrophages promotes kidney stone formation in a simulated metabolic syndrome environment. J. Urol. 191 (6), 1906-1912 (2014).
- Fan, W., Zheng, J. J., McLaughlin, B. J. An in vitro model of the back of the eye for studying retinal pigment epithelial-choroidal endothelial interactions. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 38 (4), 228-234 (2002).
- Mierke, C. T., Ballmaier, M., Werner, U., Manns, M. P., Welte, K., Bischoff, S. C. Human endothelial cells regulate survival and proliferation of human mast cells. J. Exp. Med. 192 (6), 801-811 (2000).
- Beckner, M. E., Jagannathan, S., Peterson, V. A. Extracellular angio-associated migratory cell protein plays a positive role in angiogenesis and is regulated by astrocytes in coculture. Microvasc. Res. 63 (3), 259-269 (2002).
- Damon, D. H. VSM growth is stimulated in sympathetic neuron/VSM cocultures: role of TGF-beta2 and endothelin. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 278 (2), H404-H411 (2000).
- Anna De Berardinis, M., Ciotti, M. T., Amadoro, G., Galli, C., Calissano, P. Transfer of the apoptotic message in sister cultures of cerebellar neurons. Neuroreport. 12 (10), 2137-2140 (2001).
- Lange-Sperandio, B., Fulda, S., Vandewalle, A., Chevalier, R. L. Macrophages induce apoptosis in proximal tubule cells. Pediatr. Nephrol. 18 (4), 335-341 (2003).
- Vjetrovic, J., Shankaranarayanan, P., Mendoza-Parra, M. A., Gronemeyer, H. Senescence-secreted factors activate Myc and sensitize pretransformed cells to TRAIL-induced apoptosis. Aging Cell. 13 (3), 487-496 (2014).
- Fujiya, A., et al. The role of S100B in the interaction between adipocytes and macrophages. Obesity (Silver Spring). 22 (2), 371-379 (2014).
- Suganami, T., Nishida, J., Ogawa, Y. A paracrine loop between adipocytes and macrophages aggravates inflammatory changes: role of free fatty acids and tumor necrosis factor alpha. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 25 (10), 2062-2068 (2005).
- Yoshida, A., Kitajiri, S., Nakagawa, T., Hashido, K., Inaoka, T., Ito, J. Adipose tissue-derived stromal cells protect hair cells from aminoglycoside. Laryngoscope. 121 (6), 1281-1286 (2011).
- May, L. A., et al. Inner ear supporting cells protect hair cells by secreting HSP70. J. Clin. Invest. 123 (8), 3577-3587 (2013).
- Jarosz, L. M., Deng, D. M., vander Mei, H. C., Crielaard, W., Krom, B. P. Streptococcus mutans competence-stimulating peptide inhibits Candida albicans hypha formation. Eukaryot Cell. 8 (11), 1658-1664 (2009).
- Dagenais, T. R., Giles, S. S., Aimanianda, V., Latgé, J. P., Hull, C. M., Keller, N. P. Aspergillus fumigatus LaeA-mediated phagocytosis is associated with a decreased hydrophobin layer. Infect. Immun. 78 (2), 823-829 (2010).
- Spiliotis, M., Lechner, S., Tappe, D., Scheller, C., Krohne, G., Brehm, K. Transient transfection of Echinococcus multilocularis primary cells and complete in vitro regeneration of metacestode vesicles. Int. J. Parasitol. 38 (8-9), 1025-1039 (2008).
- Scholzen, A., Mittag, D., Rogerson, S. J., Cooke, B. M., Plebanski, M. Plasmodium falciparum-mediated induction of human CD25Foxp3 CD4 T cells is independent of direct TCR stimulation and requires IL-2, IL-10 and TGFbeta. PLoS Pathog. 5 (8), e1000543 (2009).
- Fedoroff, S., Richardson, A. Quantification of Cells in Culture. Protocols for Neural Cell Culture. , 4th ed, Humana. Totowa, NJ. 333-335 (2001).
- Fedoroff, S., Richardson, A. Primary Cultures of Sympathetic Ganglia. Protocols for Neural Cell Culture. , 4th ed, Humana. Totowa, NJ. 88-89 (2001).
- Kreutzberg, G. W. Microglia: a sensor for pathological events in the CNS. Trends Neurosci. 19 (8), 312-318 (1996).
- Hanisch, U. K., Kettenmann, H. Microglia: active sensor and versatile effector cells in the normal and pathologic brain. Nat. Neurosci. 10 (11), 1387-1394 (2007).
- Davalos, D., et al. ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. Nat. Neurosci. 8 (6), 752-758 (2005).
- Block, M. L., Zecca, L., Hong, J. S. Microglia-mediated neurotoxicity: uncovering the molecular mechanisms. Nat. Rev. Neurosci. 8 (1), 57-69 (2007).
- Qureshi, S. T., Larivière, L., Leveque, G., Clermont, S., Moore, K. J., Gros, P., Malo, D. Endotoxin-tolerant mice have mutations in Toll-like receptor 4 (Tlr4). J. Exp. Med. 189, 615-625 (1999).
- Sabroe, I., Jones, E. C., Usher, L. R., Whyte, M. K., Dower, S. K. Toll-like receptor (TLR)2 and TLR4 in human peripheral blood granulocytes: a critical role for monocytes in leukocyte lipopolysaccharide responses. J. Immunol. 168, 4701-4710 (2002).
- Winterbourn, C. C. Reconciling the chemistry and biology of reactive oxygen species. Nat. Chem. Bio. 4 (5), 278-286 (2008).
- Spencer, K. H., Kim, M. Y., Hughes, C. C., Hui, E. E. A screen for short-range paracrine interactions. Integr. Biol. (Camb). 6 (4), 382-387 (2014).
