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Biology

की सेल सेल संपर्क अभाव में दो सेलुलर प्रकार के एक सम्मिलित सह संस्कृति प्रणाली का विकास

Published: July 17, 2016 doi: 10.3791/54356
Automatic Translation
1, 1
1Dept. of Medical Biology, University of Québec

Introduction

इन विट्रो में ऊतकों, अंग या सिस्टम का अध्ययन बहुत जटिल कई सेलुलर उपप्रकार कि बहुकोशिकीय जीव समावेश के बीच मौजूदा संबंधों को सरल करने का प्रयास है। दरअसल, इन विट्रो अध्ययन में यह भी सेल आबादी की एक विस्तृत समझ हासिल करने के लिए संभव बनाते हैं। 1) कम हो सेलुलर बातचीत, और 2) आसानी से सेलुलर वातावरण में हेरफेर करने की क्षमता: वहाँ इन विट्रो प्रयोगों में आयोजित करने के दो प्रमुख फायदे हैं। इसलिए, इन दो फायदे की अनुमति दी है वैज्ञानिकों विवो में विशेष प्रकार की कोशिकाओं के व्यवहार की भविष्यवाणी करने के लिए, पूरे जीवों में बाह्य प्रभावों के परिणामों को विनियमित करने की क्षमता के लिए अग्रणी। इस संदर्भ में, इन विट्रो सेल संस्कृति अक्सर एक पुल बुनियादी और अनुप्रयुक्त जीवन विज्ञान से जोड़ने के रूप में काम करता है। फिर भी, वहाँ भी कर रहे हैं इन विट्रो में काम करने के कई नुकसान हैं, सबसे महत्वपूर्ण एक होने के नाते एक निश्चित आरक्षण शारीरिक में ध्यान केन्द्रित करना हो सकता है किमनाया phenotypes के अल प्रासंगिकता। दरअसल, जब एक एकल कोशिका प्रकार एक बर्तन में उगाया जाता है, संस्कृति, खो देता है एक विभिन्न हद तक, अन्य प्रकार की कोशिकाओं, ऊतकों और मूल के जीव, और भीतर एंकर से त्रिदोषन पर्यावरण के लिए अपने योगदान के साथ अपने सेल सेल कनेक्शन ऊतक कि यह सक्षम एक विशेष तीन आयामी संरचना कभी कभी सेल समारोह के लिए महत्वपूर्ण बनाए रखने के लिए।

सेल सेल रिश्तों का सवाल मिश्रित संस्कृति तकनीक के विकास के द्वारा संबोधित किया गया है। इस विधि में, दो या अधिक सेल आबादी एक ही संस्कृति के बर्तन में एक साथ बड़े हो रहे हैं। हालांकि, इन मिश्रित संस्कृतियों महत्वपूर्ण असुविधाओं सहन। एक तरफ, कुछ सेल उपप्रकार शारीरिक रूप से मूल के ऊतकों में एक दूसरे के साथ बातचीत और स्रावित घुलनशील कारकों और आसपास के रिसेप्टर्स द्वारा निरंतर पैराक्राइन संचार पर पूरी तरह भरोसा नहीं करते। यह कई भड़काऊ प्रक्रियाओं है कि समीपस्थ साइटोकाइन सिगनल पर निर्भर लिए मामला है। मिश्रित ग मेंultures, शारीरिक बातचीत अपरिहार्य हैं और यह असंभव सेल सेल संपर्कों कि बदल परिणाम निकल सकते हैं के अभाव में पैराक्राइन संचार अध्ययन करने के लिए बनाते हैं। दूसरी ओर, एक मिश्रित आबादी के भीतर से सेल विशिष्ट व्याख्याओं को प्राप्त करने के लिए कठोर जुदाई तकनीक उल्लेखनीय है कि परिणाम को प्रभावित कर सकता है के उपयोग के बिना अव्यावहारिक हो जाता है।

इन महत्वपूर्ण मुद्दों को हल करने के लिए, वातानुकूलित मीडिया के उपयोग के लिए एक तकनीक बंटे संस्कृतियों और पैराक्राइन संकेत के अध्ययन के लिए अनुमति के रूप में विकसित किया गया है। इस विधि से एक सेल प्रकार, इस प्रकार वातानुकूलित नाम माध्यम की सतह पर तैरनेवाला के हस्तांतरण, कोशिकाओं का एक और जनसंख्या युक्त कुओं की आवश्यकता है। फिर भी, एक महत्वपूर्ण दोष यह है कि अल्पकालिक अणुओं वातानुकूलित माध्यम में काफी देर तक जीवित नहीं है कोशिकाओं की दूसरी आबादी के कुओं में स्थानांतरित किया जा रहा है। यहाँ तक कि लंबे समय रहते अणुओं बहुत प्रसार के कारण समय के साथ पतला हो जाएगा। इसके अलावा, दोनों सेलआबादी केवल दिशाहीन पैराक्राइन संचार में के बजाय सक्रिय द्विदिश संचार में भाग लेते हैं। यह प्रतिक्रिया संकेतन है कि सही बहुकोशिकीय रिश्तों को पुनः बनाने में महत्वपूर्ण है के रूप में वे विवो में मौजूद का अभाव होता है।

एक परिणाम के रूप में है और जरूरत बेहतर इन विट्रो सेलुलर वातावरण में विवो परिस्थितियों में मूल अनुकरण करने से प्रेरित, सेल संस्कृति तकनीक में कई अग्रिम के वर्षों में हासिल की है। सबसे महत्वपूर्ण प्रगति में से एक 1953 में सेल संस्कृतियों compartmentalizing के लिए microporous झिल्ली, Grobstein द्वारा पहली बार के लिए इस्तेमाल के साथ पारगम्य समर्थन का उपयोग किया गया है 1। इस तरह के पारगम्य समर्थन करता है कई प्रकार की कोशिकाओं को समायोजित करने और इस्तेमाल किया जा करने के लिए पिछले कुछ वर्षों अनुरूप किया गया है कई विभिन्न अनुप्रयोगों में। आजकल, इन का समर्थन मौजूद है के रूप में खोखले सम्मिलित करता है कि एक multiwell टिशू कल्चर थाली से या circu में कुओं में आराम करने के लिए तैयार कर रहे हैंLAR व्यंजन। एक सह संस्कृति प्रणाली में, डालें अच्छी तरह से है, जबकि एक प्रकार की कोशिका में शामिल है या पकवान उनकी त्रिदोषन पर्यावरण (चित्रा 1) पर कोशिकाओं के दो अलग आबादी के योगदान का अध्ययन करने के लिए अनुमति देता है, अन्य सेलुलर आबादी शामिल है। नतीजतन, सेलुलर polarity (बनाम शिखर स्राव या संकेत स्वागत basolateral) संरक्षित है, इस प्रकार के मिश्रित संस्कृतियों और वातानुकूलित माध्यम तकनीक पर डालने के सह-संस्कृति प्रणालियों एक महत्वपूर्ण लाभ प्रदान। झिल्ली सामग्री के कई प्रकार के उपलब्ध हैं, सबसे आम लोगों पॉलिएस्टर जा रहा है (पीईटी), पॉली कार्बोनेट (पीसी) या कोलेजन लेपित polytetrafluoroethylene (PTFE), और वे अलग अलग रोमकूप आकार 0.4 माइक्रोन से 12.0 माइक्रोन से लेकर में मौजूद हैं। सामग्री और ध्यान में लीन होना आकार की इन किस्मों ऑप्टिकल गुण, झिल्ली मोटाई और सेल पालन कि उन्हें निम्नलिखित के लिए विभिन्न स्तरों पर व्यावहारिक बनाने के लिए प्रासंगिक चर सुविधाओं exerting सम्मिलित करता है की एक स्पेक्ट्रम की पेशकश करने के लिए सीमित नहीं का उपयोग करता है:
-पढ़ते पढ़तेसेल भेदभाव, भ्रूण विकास, ट्यूमर मेटास्टेसिस और पारगम्य झिल्ली के माध्यम से chemotaxic संसाधनों द्वारा घाव की मरम्मत;
उपकला या endothelial monolayers के माध्यम से उनके परिवहन का आकलन करने से दवा पैठ -evaluating पारगम्य समर्थन करता है पर सुसंस्कृत, और;
-किसी सेल सह संस्कृतियों सेल सेल संपर्क के अभाव में स्रावित घुलनशील कारकों से प्रेरित सेल व्यवहार modulations विश्लेषण करने के लिए।

इस लेख का उद्देश्य तीसरे समारोह ऊपर कहा गया है, सेल सेल संपर्क के अभाव में स्रावित घुलनशील कारकों एक डालने के सह संस्कृति प्रणाली का उपयोग करके मध्यस्थता सेलुलर परिवर्तन का मूल्यांकन करने के लिए है कि पूरा करने के लिए सामान्य पद्धति के दिशा-निर्देशों का वर्णन है। अनुसंधान के कई अलग अलग क्षेत्रों के आदेश कोशिकाओं की आबादी पर स्रावित घुलनशील कारकों के प्रभाव के लिए प्रासंगिक सवालों के जवाब देने में डालने के सह-संस्कृति प्रणालियों का इस्तेमाल करते हैं। दरअसल, पैराक्राइन संकेतन है कि विभिन्न स्तरों पर सेलुलर व्यवहार modulates सभी ऊतकों में प्रासंगिक हैऔर सिस्टम है, जो डालने सह संस्कृति सिस्टम बनाता है इन क्षेत्रों में प्रगति सुनिश्चित करने के लिए अपरिहार्य। इसके विपरीत, सम्मिलित का उपयोग करें कि संकेत पारगमन पुष्टि कर सकते हैं प्रत्यक्ष सेल सेल संपर्क से और स्रावित कारकों से नहीं है। सम्मिलित करता है की सबसे महत्वपूर्ण उपयोग के एक सूजन के अध्ययन 2-14 जहां स्रावित साइटोकिन्स के प्रभाव उन्मुक्ति के विभिन्न सेलुलर खिलाड़ियों में मूल्यांकन किया जाता है। विशेष रूप से, केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) में सूजन का अध्ययन बहुत डालने के सह-संस्कृति के अध्ययन है, जो बेहतर neuroinflammation 15-21 ड्राइविंग में न्यूरॉन्स और microglia की अलग पैराक्राइन भूमिकाओं को परिभाषित करने के लिए अनुमति दी है से फायदा गया है। इन पद्धतियों में भी अणुओं के विरोधी भड़काऊ संभावित है कि कम या समर्थक भड़काऊ कारकों 22-26 के स्राव को बाधित करने की क्षमता पर निर्भर करता है अध्ययन करने के लिए तैयार थे। अनुसंधान में विशेष रूप से कैंसर 27-31 से संबंधित, तंत्र angiogenesis 32-34 और inflammati अंतर्निहितtumorigenesis में 35-42 पर भी डालने सह संस्कृति प्रणाली से फायदा होता है। इसके अलावा, घुलनशील कारकों प्रक्रियाओं ड्राइव कि भेदभाव और कई अध्ययनों सम्मिलित का इस्तेमाल किया है कि विशेष रूप से क्षेत्र में 43-50 सवालों के जवाब देने में प्रधानमंत्री महत्व के हैं। सीएनएस में, तंत्रिका ऊतक के रूप में देख एक बहुत ही सीमित नवीकरण क्षमता, neurotrophism का अध्ययन किया है और neuroprotection मौलिक है और व्यापक रूप से सह-संस्कृति प्रणालियों 51-56 में स्टेम कोशिकाओं के उपयोग द्वारा सुनिश्चित किया गया है। इसके अलावा, आवेषण भी नेफ्रोलॉजी 57,58, endothelial बातचीत और angiogenesis 59-62, 63-65 apoptosis संकेत, मोटापा और उपापचयी सिंड्रोम 22,23,66-67 में सूजन, भीतरी कान बाल सेल संरक्षण के रूप में के रूप में विविध क्षेत्रों में उपयोग किया जाता है 68,69, और यहां तक कि कवक डाह 70,71 और परजीवी विज्ञान 72,73 में।

यह लेख एक experim स्थापित करने के क्रम में सामान्य पद्धति दिशा निर्देश प्रदान करताएक डालने के सह संस्कृति प्रणाली का उपयोग कर स्रावित घुलनशील कारकों द्वारा मध्यस्थता सेलुलर परिवर्तन के मूल्यांकन की दृष्टि से ईएनटी। विशेष रूप से, हम तंत्रिका कोशिका सह संस्कृतियों और neuroinflammatory प्रक्रिया के अध्ययन में उनके उपयोग करता है पर हमारा ध्यान केन्द्रित करेंगे। सम्मिलित करता है कि पायलट को संभव बनाने के प्रयोगों की बहुत विशाल स्पेक्ट्रम को देखते हुए, यह इस सेल संस्कृति तकनीक के हर पहलू को कवर करने के लिए असहनीय है। एक उदाहरण के रूप में, एक विशिष्ट प्रोटोकॉल को मापने के लिए lipopolysaccharide (LPS) द्वारा स्रावित साइटोकिन्स के प्रभाव न्यूरोनल PC12 कोशिकाओं पर N9 microglia -activated विस्तृत किया जाएगा, डालने सह संस्कृति पद्धति का एक ठोस समझ की पेशकश की।

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Protocol

नायब: निम्न चरणों में से प्रत्येक के लिए एक लामिना का प्रवाह हुड में बाँझ शर्तों के तहत किया जाना चाहिए के रूप में स्तनधारी सेल संस्कृति के लिए जरूरी है। इसके अलावा, इष्टतम बाँझ सेल की खेती के लिए सामान्य दिशा निर्देशों के लागू होते हैं, उदाहरण के लिए।, टिप्स किसी भी समय वे पार संक्रमण का कारण हो सकता समय कोशिकाओं की मात्रा को कम करने discarding हवा के संपर्क में रहे हैं जब पूरी मीडिया परिवर्तन प्रदर्शन, ठीक है, लेकिन धीरे सभी सरगर्मी सेल निलंबन उनकी समरूप pipetting, आदि सुनिश्चित करने के लिए इसके अलावा, सम्मिलित plasticware का एक प्रकार है कि विशेष से निपटने की आवश्यकता है। सबसे पहले, जब भी सम्मिलित छेड़छाड़ कर रहे हैं, नाजुक झिल्ली, जो आसानी से आँसू और इसलिए प्रयोग ख़तरे में डालना सकता छूने से बचें। इसके अलावा, यह नहीं उपयुक्त सेल संस्कृति के माध्यम से वैक्यूम आकांक्षा प्रदर्शन करने के लिए, के रूप में वहाँ झिल्ली perforating या पक्षपाती कोशिकाओं को अलग कर के एक जोखिम है। अगले, सम्मिलित multiwell टिशू कल्चर प्लेट में शिथिल लटका और, इस प्रकार, सावधानी जब मो नियोजित किया जाना चाहिएplasticware विंग या जब पक्षपाती कोशिकाओं को अलग कर से बचने के लिए pipetting। इसके अलावा, जब बड़े ध्यान में लीन होना आकार के साथ सम्मिलित करता है का उपयोग करते हुए, वहाँ एक संभावना है कि सेल संस्कृति के माध्यम झिल्ली के माध्यम से seeps और इसलिए, यह महत्वपूर्ण है कि अक्सर तरल के स्तर पर नजर रखने के लिए है। अंत में, ध्यान दें कि निम्नलिखित प्रोटोकॉल पक्षपाती कोशिकाओं के लिए बनाया गया है और निलंबन की कोशिकाओं के लिए उपयुक्त होने के क्रम में मामूली संशोधनों की आवश्यकता है।

1. डालने सह संस्कृति प्रयोगों के संचालन के लिए सामान्य दिशा-निर्देश

  1. आवेषण में सीडिंग सेल प्रकार # 1
    1. उनकी पैकेजिंग से सम्मिलित खोलना।
    2. उचित आयाम के एक खाली multiwell टिशू कल्चर प्लेट में सम्मिलित रखें। इसलिए पकड़ चिमटी का उपयोग कर डालने के ऊपरवाला किनारे करने के लिए,।
    3. लगाव में सुधार लाने और पक्षपाती कोशिकाओं के प्रसार, बोने से पहले सेल संस्कृति के माध्यम से सम्मिलित हालत के लिए। ऐसा करने के लिए, सेल संस्कृति mediu के साथ झिल्ली की पूरी सतह को कवरएक micropipette का उपयोग कर रहा हूँ।
      नोट: के रूप में आवश्यक के रूप में कई सम्मिलित लिए यह करो।
    4. थाली पर ढक्कन बदलें और एक ही परिस्थितियों में कम से कम 1 घंटा या हे / N के लिए सेते हैं (आमतौर पर 37 डिग्री सेल्सियस, 5-10% सीओ 2)।
    5. जब सम्मिलित वातानुकूलित हैं, एक micropipette का उपयोग सेल संस्कृति के माध्यम से सभी को हटा दें। इस्तेमाल किया मध्यम त्यागें।
    6. एक multiwell थाली में के रूप में एक ही तरीके से ताजा सेल संस्कृति माध्यम में # 1 बीज कोशिका प्रकार। ऐसा करने के लिए, एक micropipette के साथ सेल निलंबन का एक उचित मात्रा आकर्षित और डालने में तरल बांटना।
      ध्यान दें: के रूप में आवश्यक के रूप में कई सम्मिलित तैयार करें।
    7. सभी सम्मिलित बोने के बाद, धीरे प्लेट छोड़ दिया और सही, आदेश कोशिकाओं समान रूप से वितरित करने के लिए रॉक तो आगे और पीछे। , परिपत्र गति बनाने के रूप में यह कोशिकाओं को सम्मिलित करता है के केंद्र में जमा करने के लिए कारण होगा बचें।
    8. थाली पर ढक्कन प्लेस और के रूप में सेलुलर आवश्यकताओं (आमतौर पर 37 डिग्री सेल्सियस के अनुसार, 5-10% सीओ द्वारा निर्दिष्ट सेते
  2. सीडिंग सेल प्रकार # 2 multiwell टिशू कल्चर प्लेट में
    1. बीज कोशिका प्रकार # 2 ताजा सेल संस्कृति माध्यम में धारा 1 के अनुसार।
    2. के रूप में सम्मिलित करता है की संख्या के लिए आवश्यक के रूप में कई कुओं तैयार करें। कदम 1.1.7 के रूप में प्लेट) रॉक सुनिश्चित करने के लिए कि कोशिकाओं को समान रूप से कुओं में वितरित कर रहे हैं।
    3. प्लेट पर ढक्कन की जगह और एक ही परिस्थितियों में सेते हैं (आमतौर पर 37 डिग्री सेल्सियस, 5-10% सीओ 2)।
  3. आवेषण में ताज़ा मध्यम
    1. एक micropipette का प्रयोग, भाग या सेल संस्कृति के माध्यम से सभी को हटा दें, जिसमें # 1 सेल प्रकार सम्मिलित करता है। इस्तेमाल किया मध्यम त्यागें।
    2. ताजा सेल संस्कृति के माध्यम से एक उचित मात्रा ड्रा। धीरे डालने के भीतरी दीवार पर टिप आराम और धीरे धीरे सेल संस्कृति के माध्यम से बांटना।
    3. थाली पर ढक्कन प्लेस और कदम 1.1.4 के अनुसार सेते हैं।
  4. multiwell टिशू कल्चर प्लेट में ताज़ा मध्यम
    1. एक micropi का प्रयोगPette, भाग या युक्त सेल प्रकार # 2 कुओं में सेल संस्कृति के माध्यम से सभी को हटा दें। इस्तेमाल किया मध्यम त्यागें।
    2. ताजा सेल संस्कृति के माध्यम से एक उचित मात्रा ड्रा। अच्छी तरह से की भीतरी दीवार पर टिप के आराम और धीरे धीरे सेल संस्कृति के माध्यम से बांटना।
    3. थाली पर ढक्कन प्लेस और पहले से स्थापित सेल संस्कृति प्रोटोकॉल के अनुसार सेते हैं।
  5. युक्त multiwell टिशू कल्चर से युक्त सेल प्रकार # 2 प्लेटों के लिए # 1 सेल प्रकार सम्मिलित स्थानांतरण।
    नोट: जब दोनों प्रकार की कोशिकाओं के उचित विकास के चरण में पहुंच गया है इस कदम प्रदर्शन।
    1. कुओं में सम्मिलित स्थानांतरित करने से पहले, किसी भी आवश्यक मध्यम परिवर्तन, के रूप में पहले कदम 1.3) और 1.4 में वर्णित) बनाते हैं।
      नोट: इस बिंदु पर, यह के रूप में डालने के निर्माता के निर्देशों द्वारा निर्दिष्ट दोनों डिब्बों में मीडिया की उचित मात्रा में वितरित करने के लिए महत्वपूर्ण है।
    2. चिमटी का प्रयोग, पकड़ सेल टी युक्त एक डालने के ऊपरवाला बढ़त# 1 ype और धीरे में उचित अच्छी तरह से युक्त सेल टाइप 2 # जगह है।
    3. सभी सम्मिलित स्थानांतरित करने के बाद, सम्मिलित की झिल्ली के नीचे हवा के बुलबुले की उपस्थिति के लिए जाँच करें।
      नोट: एयर बुलबुले डालने की झिल्ली भर में किसी भी आदान-प्रदान को रोकने और पूरे प्रयोग ख़तरे में डालना कर सकते हैं।
    4. हवा के बुलबुले मौजूद हैं, तो बहुत धीरे चिमटी अच्छी तरह से उपयोग करने से डालने उठा और सेल संस्कृति माध्यम में वापस उतर रही है। बुलबुले गायब हो जाएगा। वे अभी भी मौजूद हैं, सम्मिलित करता है एक कोण पर सेल संस्कृति माध्यम में वापस सूई धीरे प्रयास करें।
      नोट: दस्तक या सम्मिलित हलचल पक्षपाती कोशिकाओं को अलग कर से बचने के लिए नहीं है।
    5. सभी हवाई बुलबुले को दूर करने और जाँच है कि दोनों डिब्बों में मीडिया की मात्रा, थाली पर ढक्कन जगह और सेते के बाद।
  6. एक सह संस्कृति प्रणाली में ताज़ा मीडिया
    नोट: झिल्ली आसानी से डालने के बीच मीडिया के आदान-प्रदान की अनुमति देता है और अच्छी तरह से, मध्यम ताज़ा में किया जाता हैसमय अकेले प्रसार द्वारा ऊपरी और निचले डिब्बों में संतुलन तक पहुँचने के लिए आवश्यक बाद से दोनों डिब्बों काफी लंबी हो सकती है।
    1. युक्त # 1 सेल प्रकार सम्मिलित में ताज़ा मध्यम 1.3 चरण) में उसी तरह के रूप में किया जाता है।
    2. युक्त सेल प्रकार # 2 कुओं में मध्यम से ताज़ा करने के लिए, धीरे से एक अंतरिक्ष विस्तृत एक विंदुक टिप को समायोजित करने के लिए पर्याप्त बनाने के लिए पक्ष के लिए डालने स्लाइड। 1.4 चरण में के रूप में मध्यम ताज़ा करें)।
    3. हवा के बुलबुले की उपस्थिति के लिए जाँच करें और 1.5.5 के माध्यम से प्रति कदम 1.5.3 और मात्रा) को सत्यापित)।

2. उदाहरण: न्यूरोनल PC12 कोशिकाओं पर LPS सक्रिय N9 microglia द्वारा स्रावित साइटोकिन्स के प्रभाव को मापने

नोट: निम्न चरणों में विशिष्ट फ्लास्क, अच्छी तरह से और डिश आकार के लिए तैयार कर रहे हैं। हालांकि, किसी भी प्रोटोकॉल plasticware आयामों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। मीडिया और संरचना के लिए देखें सामग्री तालिका।

  1. बोने और बहु ​​में PC12 कोशिकाओं फर्कअच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेटों
    1. गर्म दिनचर्या PC12 सेल संस्कृति के माध्यम से, PC12 भेदभाव मध्यम और एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में trypsin-EDTA।
    2. एक 75 सेमी 2 कुप्पी से 60-80% संगम पर PC12 कोशिकाओं का प्रयोग करें।
    3. एक 15 मिमी पाश्चर विंदुक के साथ, फ्लास्क में पूरे सेल संस्कृति के माध्यम से वैक्यूम आकांक्षा प्रदर्शन करते हैं।
    4. धीरे बाँझ फॉस्फेट बफर खारा के 5 मिलीलीटर के साथ सेल monolayer कुल्ला और एक पाश्चर विंदुक के साथ तरल हटा दें। सावधान इस कदम पर कोशिकाओं को अलग कर देना नहीं हो।
    5. trypsin-EDTA के 3 मिलीलीटर के साथ सेल monolayer कवर और 37 डिग्री सेल्सियस पर 2-3 मिनट के लिए सेते हैं।
    6. सुनिश्चित करें कि सभी कोशिकाओं को एक खुर्दबीन के नीचे अलग कर रहे हैं। बहुत कुछ कोशिकाओं चल रहे हैं, तो 5 मिनट की एक अधिकतम के लिए एक लंबी अवधि के लिए सेते हैं।
    7. आदेश trypsin-EDTA निष्क्रिय करने में नियमित PC12 सेल संस्कृति के माध्यम के 10 मिलीलीटर जोड़ें।
    8. एक 10 मिलीलीटर विंदुक के साथ, धीरे triturate जबकि यकीन है कि सबसे कोशिकाओं ओ नीचे से अलग कर रहे हैं बना रही हैकुप्पी च। सेल निलंबन में हवा के बुलबुले बनाने से बचें।
    9. वही 10 मिलीलीटर विंदुक के साथ, एक 50 मिलीलीटर centrifugation ट्यूब में सेल निलंबन हस्तांतरण।
    10. 3200 XG पर 1 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र
    11. पाश्चर विंदुक के साथ सतह पर तैरनेवाला त्यागें, जबकि ख्याल रखने गोली परेशान नहीं।
    12. एक 10 मिलीलीटर विंदुक के साथ दिनचर्या PC12 सेल संस्कृति के माध्यम के 10 मिलीलीटर जोड़ें।
      नोट: यह मात्रा यदि गोली असामान्य रूप से छोटा या बड़ा है समायोजित किया जा सकता है।
    13. वही 10 मिलीलीटर विंदुक के साथ Triturate गोली homogenize करने के लिए। PC12 कोशिकाओं अक्सर तो कम से कम 20 पेड़ों का झुरमुट ऊपर pipetting और आवश्यक downare।
      नोट: एक ओर जहां जोरदार triturating आवश्यक है, सेल निलंबन में हवा के बुलबुले बनाने से बचें।
    14. एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में trypan नीले रंग में सेल निलंबन के लिए एक उपयुक्त कमजोर पड़ने तैयार करते हैं। पहले से स्थापित प्रोटोकॉल 74 के अनुसार एक hemocytometer का उपयोग कोशिकाओं की गणना।
    15. एक अलग 50 मिलीलीटर ट्यूब में, सेल निलंबन विभाजितPC12 भेदभाव माध्यम से 24 अच्छी तरह से थाली से कुओं बोने (30,000 ¢ / 2 सेमी, अच्छी तरह से निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार प्रति 0.6 एमएल) के लिए एक पतला सेल निलंबन उचित प्राप्त करने के लिए।
      नोट: 24 अच्छी तरह से थाली में पहले के रूप में पहले से स्थापित प्रोटोकॉल का 75 द्वारा निर्दिष्ट कोलेजन के साथ लेपित किया जाना चाहिए।
    16. अच्छी तरह से प्रति एक micropipette का उपयोग सेल निलंबन के 0.6 मिलीलीटर बांटो।
    17. सभी कुओं वरीयता प्राप्त कर रहे हैं, कदम 1.1.7 में के रूप में थाली रॉक)।
    18. PC12 कोशिकाओं के समुचित भेदभाव, 24 अच्छी तरह प्लेटें 7-9 दिनों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर PC12 भेदभाव माध्यम 15,16 में एक 5% सीओ 2 आर्द्र वातावरण में सह संस्कृति प्रयोगों के प्रदर्शन से पहले सेते अनुमति देने के लिए।
    19. तरल के आधे से हटाने और ताजा PC12 भेदभाव माध्यम के एक बराबर मात्रा के साथ जगह से हर दूसरे दिन मध्यम परिवर्तन प्रदर्शन करना।
  2. आवेषण में N9 microglia बोने और LPS के साथ इलाज
    1. सह संस्कृति प्रयोगों के प्रदर्शन से पहले एक दिन, PTFE 0.4 माइक्रोन ताकना सम्मिलित दिनचर्या N9 सेल संस्कृति के माध्यम से सेल पालन अनुकूलन करने के लिए पूर्व का इलाज है, 1.1.4 के माध्यम से कदम 1.1.1) के बाद)
    2. गर्म दिनचर्या N9 सेल संस्कृति के माध्यम से और एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में trypsin-EDTA।
    3. इस बीच, बाद में उपयोग के लिए एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में एलपीएस के लगभग 10 मिलीग्राम वजन।
      नोट: चूंकि LPS एक शक्तिशाली समर्थक भड़काऊ endotoxin है और विशेष रूप से सुरक्षा सावधानियों, चश्मा, दस्ताने की आवश्यकता है, और एक कण श्वासयंत्र पुरजोर सिफारिश की है।
    4. एक 75 सेमी 2 कुप्पी से 80-90% संगम पर N9 कोशिकाओं का प्रयोग करें।
    5. 2.1.14 के लिए कदम 2.1.3) का पालन करें)। हमेशा की दिनचर्या N9 सेल संस्कृति के बजाय मध्यम दिनचर्या PC12 सेल संस्कृति के माध्यम का उपयोग करें। यह भी ध्यान रखें कि N9 microglia एक साथ पेड़ों का झुरमुट नहीं के रूप में ज्यादा PC12 कोशिकाओं के रूप में, तो कम pipetting और नीचे कदम 2.1.13 में आवश्यक हो सकता है)।
    6. एक अलग 50 मिलीलीटर ट्यूब में, ओ N9 सेल संस्कृति के माध्यम से सेल निलंबन विभाजितएक पतला सेल निलंबन 24 अच्छी तरह प्लेटें में धारण करने के लिए डिज़ाइन किया गया सम्मिलित करता है (60,000 ¢ / 2 सेमी, निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार डालने के प्रति 0.05 मिलीग्राम, झिल्ली सतह क्षेत्र के लिए निर्माता जानकारी देखें) बोने के लिए उपयुक्त btain।
      नोट: ये सम्मिलित पहले से ही निर्माता द्वारा कोलेजन के साथ लेपित हैं और कोशिका आसंजन के लिए अनुकूलित कर रहे हैं।
    7. एक micropipette का उपयोग डालने के प्रति सेल निलंबन के 0.05 मिलीलीटर बांटो।
    8. सभी सम्मिलित वरीयता प्राप्त कर रहे हैं, कदम 1.1.7 में के रूप में थाली रॉक)।
    9. N9 उपचार माध्यम का उपयोग कर 4 माइक्रोग्राम / एमएल, 2 माइक्रोग्राम / एमएल और 1 माइक्रोग्राम / एमएल काम कर समाधान प्राप्त करने के लिए एलपीएस के धारावाहिक dilutions प्रदर्शन करना।
    10. पिपेट 0.05 4 माइक्रोग्राम / एमएल काम कर रहे एक आवेषण के सेट में आदेश 2 माइक्रोग्राम / एमएल के एक अंतिम कमजोर पड़ने उपज में समाधान के मिलीलीटर।
    11. विभिन्न सेट सम्मिलित में अन्य दो काम कर समाधान के लिए कदम दोहराएँ 2.2.10), 1 ग्राम के अंतिम dilutions बेदखल / एमएल और 0.5 माइक्रोग्राम / क्रमशः मिलीलीटर।
    12. मेंएक 5% सीओ 2 आर्द्र वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए सम्मिलित युक्त प्लेटें cubate सह संस्कृति प्रयोगों के प्रदर्शन से पहले LPS के साथ N9 microglia सक्रियण की अनुमति है।
  3. सह खेती N9 microglia साथ न्यूरोनल PC12 कोशिकाओं
    1. PC12 कोशिकाओं फर्क के 7-9 दिनों में एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में गर्म N9 उपचार मध्यम और PC12 उपचार मध्यम से LPS के साथ ऊष्मायन के 24 घंटे के बाद N9 microglia को सक्रिय करें।
    2. N9 उपचार माध्यम की 0.1 मिलीलीटर द्वारा पूरे इस्तेमाल किया माध्यम की जगह 1.3 चरण) के रूप में N9 microglia के लिए एक कुल मध्यम परिवर्तन प्रदर्शन करना। हर insert.This के लिए यह करो एलपीएस के सभी निशान को दूर करने के लिए, सम्मिलित में ही सक्रिय N9 microglia छोड़ने आवश्यक है।
    3. 1.4 चरण में के रूप में न्यूरोनल PC12 कोशिकाओं के लिए एक कुल मध्यम परिवर्तन प्रदर्शन)। 24 अच्छी तरह से प्लेटों में सम्मिलित करता है एक 5% सीओ 2 आर्द्र वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटा या 48 घंटे के लिए 1.5 चरण में के रूप में स्थानांतरण) N9-PC12 सह संस्कृतियों .Incubate।
    4. 24 के बादमानव संसाधन या 48 घंटा, तैरनेवाला और / या cytotoxicity, एंजाइम से जुड़ी immunosorbent परख के लिए कोशिकाओं (एलिसा), पश्चिमी धब्बा, या अन्य assays फसल।

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Representative Results

डालने सह संस्कृति प्रणाली के उपयोग के neuroinflammatory प्रक्रियाओं है कि प्रदर्शन सीएनएस के विभिन्न सेलुलर खिलाड़ियों के बीच पैराक्राइन संबंधों के अध्ययन में विशेष रूप से प्रासंगिक है। सीएनएस में प्रतिरक्षण मुख्य रूप से है कि उनके आराम डालियां फैला राज्य (2A चित्रा) में अपने पर्यावरण पर नजर रखने और संवेदन गड़बड़ी करने में सक्षम हैं microglia बुलाया निवासी कोशिकाओं द्वारा पूरा किया है कि मुसीबत सकता है बहुत कीमती homeostasis उचित neuronal समारोह 76-78 के लिए आवश्यक है। Microglial सक्रियण, एक अमीबीय आकार (चित्रा 2 बी) और सेल की आबादी के गुणन के गोद लेने के द्वारा होती microgliosis (चित्रा 3), इस तरह के साइटोकिन्स के रूप में समर्थक भड़काऊ मध्यस्थों, की रिहाई के द्वारा पीछा किया करार दिया, neuroinflammation 79 के मुख्य पहलू का गठन किया । साइटोकाइन रिहाई हानिकारक हमले के खिलाफ न्यूरॉन्स की रक्षा करने का महान उद्देश्य में कार्य करता है और क्लोस हैइली नजर रखी। हालांकि, जब neuroinflammation इस तंग नियंत्रण पलायन, यह एक विनाशकारी प्रकृति को गोद ले और गंभीरता से सीएनएस घायल हो सकता है। यद्यपि के रूप में तंत्रिका ऊतकों एक बहुत ही सीमित नवीकरण की क्षमता है, सीएनएस ऐसे ऑटो विनाशकारी भड़काऊ प्रतिक्रियाओं के लिए सभी को और अधिक संभावना है। crosstalk अध्ययन, कि न्यूरॉन्स और microglia neuroinflammation की अंतर्निहित तंत्र elucidating में जरूरी है के बीच मौजूद है। मिश्रित संस्कृतियों के विपरीत, सम्मिलित सह संस्कृति प्रणालियों की पहचान करने के लिए जो सेल की आबादी विषाक्त प्रभाव पैदा कर रहा है और जो एक प्रभावित किया जा रहा है अन्वेषक सक्षम करें।

इधर, PC12 कोशिकाओं तंत्रिका वृद्धि कारक के साथ 7-9 दिनों के लिए विभेदित न्यूरॉन्स पर सूजन व्युत्पन्न घुलनशील कारकों की quantifyingthe हानिकारक प्रभावों के लक्ष्य के साथ LPS सक्रिय N9 microglia के साथ सह-सुसंस्कृत थे। ऐसा करने के लिए, न्यूरोनल PC12 कोशिकाओं 24 अच्छी तरह प्लेटें में खेती की जाती थी, जबकि N9 microglia सम्मिलित में वरीयता प्राप्त थे। N9 microgliएक LPS, एक बहुत शक्तिशाली समर्थक भड़काऊ endotoxin ग्राम नकारात्मक बैक्टीरिया की बाहरी झिल्ली में शामिल के साथ 24 घंटे के लिए इलाज किया गया। एलपीएस टोल की तरह रिसेप्टर 4 इस प्रकार अमर murine सेल लाइन N9 microglia 80,81 सहित प्रतिरक्षा प्रेरक कोशिकाओं की एक विस्तृत विविधता में एक मजबूत भड़काऊ प्रतिक्रिया जानने सक्रिय करने के लिए जाना जाता है। निम्नलिखित प्रतिनिधि परिणाम बताते हैं कि N9 microglia LPS के साथ सक्रिय उनकी जनसंख्या (चित्रा 3) बढ़ाने के लिए और इस तरह के इंटरल्यूकिन -6 (आईएल -6), इंटरफेरॉन गामा (IFN-γ) और के रूप में घुलनशील समर्थक भड़काऊ साइटोकिन्स, स्रावित करने की प्रवृत्ति है ट्यूमर परिगलन कारक अल्फा (TNF-α), कि आसानी से सह संस्कृति सम्मिलित करता है की झिल्ली को पार और कम डिब्बे में बढ़ न्यूरोनल PC12 कोशिकाओं को साइटोटोक्सिक नुकसान होता है।

न्यूरोनल PC12 कोशिकाओं से युक्त कुओं के लिए LPS सक्रिय N9 microglia स्थानांतरित करने से पहले सबसे बड़ी चिंता इस बात की पुष्टि Tha में होते हैंPC12 टी ठीक से भेदभाव कर रहे हैं। सात दिन भेदभाव PC12 कोशिकाओं में इस तरह के एक चापलूसी सेल शरीर है, जो कई लंबे neurites कभी कभी खुद varicosities (चित्रा 4) प्रदर्शित परियोजनाओं के रूप में स्पष्ट न्यूरोनल phenotypes प्रदर्शन करना चाहिए। एक बार इस चौकी किया जाता है, N9 microglia ताजा माध्यम LPS से रहित युक्त सम्मिलित भेदभाव PC12 युक्त कुओं में स्थानांतरित किया जा सकता है। 24 घंटा या 48 घंटे, कम डिब्बे काटा जाता है और एक cytotoxicity परख में सतह पर तैरनेवाला, लैक्टेट डिहाइड्रोजनेज रिहाई 15,16, साथ ही एक एलिसा 15 के आधार पर, साइटोकिन्स को मापने के लिए एक ऊष्मायन अवधि के बाद प्रदर्शन कर रहे हैं। यह आदेश साइटोकिन्स कि वास्तव में पारगम्य झिल्ली पार कर दी है और कहा कि PC12 कोशिकाओं की सतह पर रिसेप्टर्स को सक्रिय कर सकते मापने के लिए कम डिब्बे में सतह पर तैरनेवाला फसल के लिए महत्वपूर्ण है। परिणाम है कि ऊपरी डिब्बे से LPS सक्रिय N9 microglia एक खुराक और समय पर निर्भर CYT उत्पन्न प्रदर्शितभेदभाव न्यूरोनल PC12 कोशिकाओं कम डिब्बे (चित्रा 5) में स्थापित पर otoxic प्रभाव। 0.5 माइक्रोग्राम / एमएल LPS हालत हालांकि काफी नहीं है 24 घंटा या 48 घंटे में साइटोटोक्सिक। cytotoxicity के स्तर 2 माइक्रोग्राम / एमएल LPS 48 घंटा हालत में लगभग 100% तक पहुँच पाए गए। इसके अलावा, परिणाम बताते हैं कि समर्थक भड़काऊ साइटोकिन्स आईएल -6, IFN-γ और मनाया cytotoxicity साथ सतह पर तैरनेवाला बढ़ जाती है समवर्ती में TNF-α की एकाग्रता। विशेष रूप से, आईएल -6 सांद्रता काफी, केवल 2 माइक्रोग्राम / एमएल हालत के लिए 24 घंटे के बाद बढ़ रहे हैं जबकि एलपीएस के 1 माइक्रोग्राम / एमएल भी काफी 48 घंटा (चित्रा 6) के बाद साइटोकाइन का स्तर उठाया अर्जित करता है। Microglia छिपाना IFN-γ है कि एक काफी वृद्धि हुई ढंग से कम डिब्बे तक पहुँच जाता है जब वे 1 माइक्रोग्राम / एमएल और 2 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर के साथ व्यवहार कर रहे हैं, और या तो 24 घंटा या 48 घंटा (चित्रा 7) के लिए अलग-अलग न्यूरोनल PC12 कोशिकाओं के साथ incubated हैं। 0.5 माइक्रोग्राम / मिलीलीटरएलपीएस हालत एक बार फिर से IFN-γ के स्तर में काफी वृद्धि नहीं करता है। अंत में, कम डिब्बे में TNF-α सांद्रता एलिसा द्वारा मात्रा निर्धारित किया गया है और सबसे microglia की LPS सक्रियण द्वारा संवर्धित किया जाना है, तक पहुँचने का स्तर लगभग नियंत्रण हालत (8 चित्रा) से अधिक महत्वपूर्ण सात गुना पाए गए। विशेष रूप से, दोनों को 24 घंटा और 48 घंटा ऊष्मायन अवधि सतह पर तैरनेवाला में TNF-α के स्तर में महत्वपूर्ण वृद्धि हुई। हालांकि, 1 माइक्रोग्राम / एमएल LPS हालत केवल 48 घंटे के बाद TNF-α के स्तर की एक उल्लेखनीय वृद्धि झुकेंगे। एक पूरे के रूप में, इन परिणाम बताते हैं कि secreted समर्थक भड़काऊ साइटोकिन्स कम से कम एलपीएस के विभिन्न सांद्रता से सक्रिय microglia के साथ एक 24 घंटा या 48 घंटा ऊष्मायन अवधि के बाद अलग-अलग न्यूरोनल PC12 कोशिकाओं में मनाया साइटोटोक्सिक प्रभाव के लिए आंशिक रूप से जिम्मेदार हैं।

LPS-सक्रिय N9 microglia और PC12 कोशिकाओं के सह संस्कृति प्रणालियों के लिए दिखाया गया है डालेंneuroinflammation के अध्ययन में और रणनीतियों यह प्रतिक्रिया करने के लिए विस्तार में विशेष रूप से उपयोगी हो सकता है। हमारे समूह ने हाल ही में पता चला है कि LPS सक्रिय N9 microglia सेल संस्कृति में विकसित आवेषण समर्थक भड़काऊ साइटोकिन्स, जो बारी में डालने के 15, 16 के micropores पार करके तंत्रिका वृद्धि कारक भेदभाव PC12 कोशिकाओं के apoptosis प्रेरित की प्रदर्शनी प्रतिलेखन वृद्धि हुई है। एक ही प्रतिमान में, polyphenolic यौगिक resveratrol (0.1 सुक्ष्ममापी, 3 घंटा) के साथ microglial आबादी के पूर्व उपचार कस्पासे 3 सक्रियण अवरुद्ध और उसके बाद से समर्थक भड़काऊ साइटोकिन्स का प्रतिलेखन और विभेदित न्यूरोनल PC12 कोशिकाओं के इस प्रकार बाधा apoptosis रोका , डीएनए दरार। एक अन्य समूह भी एक N9-PC12 सह संस्कृति 26 में विटामिन ई के neuroprotective प्रभाव का प्रदर्शन किया है। N9-PC12 सह संस्कृतियों के अलावा, विभिन्न अमर सेल लाइनों या प्राथमिक संस्कृतियों भी neuroinflammation के संदर्भ में नियोजित किया गया है। उदाहरण के लिए,murine microglia BV2 सेल लाइन polyphenolic luteolin जाहिरा तौर पर अपने विरोधी भड़काऊ संभावित 17 द्वारा मध्यस्थता के विरोधी apoptotic प्रभाव दिखाने के लिए मानव neuroblastoma एसएच SY5Y कोशिकाओं के साथ सह-सुसंस्कृत था। साथ ही, घायल PC12 कोशिकाओं से सक्रिय BV2 microglia mesenchymal स्टेम सेल 18 में विरोधी apoptotic प्रभाव डालती को दिखाया गया। पारस्परिक सिगनल विरोधी apoptotic तंत्र अंतर्निहित प्राथमिक microglia neuroprotection प्राथमिक अनुमस्तिष्कीय दाना न्यूरॉन्स 19 पर प्रदत्त में महत्वपूर्ण होने के लिए प्रदर्शन किया गया। इसके अलावा, प्राथमिक hippocampal न्यूरॉन्स थे सह खेती की जाती आदेश सिस्टीन मुद्रा और synaptic समारोह 20 के बाद के कमजोर होने की ग्लूटामेट की रिहाई का मूल्यांकन करने में secreted amyloid अग्रदूत साबित प्रोटीन से सक्रिय प्राथमिक microglia के साथ। अंत में, एक समूह भी crosstalk कि प्राथमिक hippocampal न्यूरॉन्स और संबंधित प्राथमिक microglia के बीच मौजूद संकेत fractalkine करने के लिए, एक केमोकाइन अनिवार्यता से एक्सप्रेशंस से पता चलासीएनएस जिसका रिसेप्टर microglia 21 की सतह पर पाया जाता है में न्यूरॉन्स द्वारा sed।

आकृति 1
चित्रा 1. एक डालने प्रणाली सह संस्कृति की योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। ऊपरी डिब्बे डालने के लिए जो एक प्रकार की कोशिका और उसके शिखर त्रिदोषन पर्यावरण रखती है से बना है। कम डिब्बे एक अच्छी तरह से या पकवान दूसरी कोशिका प्रकार से युक्त होते हैं। डालने multiwell टिशू कल्चर प्लेट या डिश के किनारों पर टिकी हुई है। डालने सिर्फ अच्छी तरह से नीचे से ऊपर झूठ बोलने के लिए इतनी के रूप में नीचे बढ़ कोशिकाओं की आबादी को छूने के लिए नहीं बनाया गया है। कम डिब्बे में मध्यम दोनों पहली सेल प्रकार और दूसरी कोशिका प्रकार के शिखर सतह के बेसल सतह के साथ संपर्क में है। एक बड़ा vers देखने के लिए यहाँ क्लिक करेंयह आंकड़ा के आयन।

चित्र 2
चित्रा 2. N9 microglia की Microphotographs। सम्मिलित करता है (ए) में इलाज आराम कर N9 microglia उन्हें सक्रिय रूप से अपने पर्यावरण पर नजर रखने के लिए अनुमति देता है एक डालियां फैला सेलुलर आकारिकी दिखा रहे हैं। (बी) 24 घंटा प्रदर्शन एक अमीबीय आकार सक्रिय phenotype के ठेठ के लिए lipopolysaccharide (LPS) के साथ इलाज सम्मिलित में N9 microglia। इस माइक्रो बस के रूप में चित्रा 4। स्केल पट्टी में सचित्र विभेदित PC12 कोशिकाओं से युक्त कुओं के लिए इन सक्रिय N9 microglia युक्त डालने स्थानांतरित करने से पहले लिया गया था = 25 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 3. lipopolysaccharide (LPS) के साथ इलाज के बाद N9 microglia सेल घनत्व। अलग-अलग समय spans के लिए एलपीएस के विभिन्न सांद्रता के साथ N9 microglia इलाज का असर एक hemocytometer 69 का उपयोग कोशिकाओं की संख्या का आकलन करके मूल्यांकन किया गया था। समूहों के बीच महत्वपूर्ण अंतर विचरण का एक तरह से विश्लेषण, GraphPad Instat कार्यक्रम के साथ Tukey के बाद अनौपचारिक विश्लेषण, संस्करण 3.06 विंडोज के लिए (; www.graphpad.com सैन डिएगो, सीए) द्वारा पीछा करके पता लगाया गया था। सभी डेटा, 95% विश्वास अंतराल पर विश्लेषण किया है, व्यक्त कर रहे हैं के रूप में 3 स्वतंत्र प्रयोगों से मतलब है, जिसमें 10 कुओं का विचार किया गया ± मानक त्रुटि का अर्थ है। तारों के उपचार और नियंत्रण हालत के बीच मतभेद का संकेत सांख्यिकीय (** पी <0.01)। यहाँ एक larg देखने के लिए क्लिक करेंयह आंकड़ा की एर संस्करण।

चित्रा 4
चित्रा 4. विभेदित न्यूरोनल PC12 कोशिकाओं के Microphotographs। सात दिन तंत्रिका वृद्धि कारक भेदभाव न्यूरोनल PC12 कोशिकाओं इतने लंबे neurites और varicosities के रूप में स्पष्ट न्यूरोनल phenotypes दिखा। इस माइक्रो बस के रूप में चित्रा 2। स्केल पट्टी में कल्पना सक्रिय N9 microglia युक्त सम्मिलित स्थानांतरित करने से पहले लिया गया था = 25 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5. lipopolysaccharide की साइटोटोक्सिक प्रभाव (एलपीएस) विभेदित न्यूरोनल PC12 कोशिकाओं पर microglia -activated।N9 microglia 24 घंटे के लिए एलपीएस के विभिन्न सांद्रता के साथ सक्रिय थे, तो 24 घंटा या 48 घंटे के लिए अलग-अलग न्यूरोनल PC12 कोशिकाओं से युक्त कुओं के लिए स्थानांतरित कर दिया। Cytotoxicity एक लैक्टेट डिहाइड्रोजनेज रिहाई कम डिब्बे की सतह पर तैरनेवाला पर प्रदर्शन परख का उपयोग कर मूल्यांकन किया गया था। समूहों के बीच महत्वपूर्ण अंतर विचरण का एक तरह से विश्लेषण, GraphPad Instat कार्यक्रम के साथ Tukey के बाद अनौपचारिक विश्लेषण, संस्करण 3.06 विंडोज के लिए (; www.graphpad.com सैन डिएगो, सीए) द्वारा पीछा करके पता लगाया गया था। सभी डेटा, 95% विश्वास अंतराल पर विश्लेषण किया है, व्यक्त कर रहे हैं के रूप में 3 स्वतंत्र प्रयोगों से मतलब है, जिसमें 6 कुओं का विचार किया गया ± मानक त्रुटि का अर्थ है। तारों के उपचार और नियंत्रण हालत (*** पी <0.001) के बीच मतभेद सांख्यिकीय संकेत मिलता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।


चित्रा 6. मैं की एकाग्रता nterleukin -6 (आईएल -6) सतह पर तैरनेवाला lipopolysaccharide (LPS) द्वारा N9 सक्रियण निम्नलिखित में। N9 microglia एलपीएस के विभिन्न सांद्रता के साथ 24 घंटे के लिए सक्रिय थे, और उसके बाद के लिए अलग-अलग न्यूरोनल PC12 कोशिकाओं से युक्त कुओं को हस्तांतरित 24 घंटा या 48 घंटा। कम डिब्बे की सतह पर तैरनेवाला में आईएल -6 सांद्रता एक एलिसा का उपयोग कर मूल्यांकन किया गया। समूहों के बीच महत्वपूर्ण अंतर विचरण का एक तरह से विश्लेषण, GraphPad Instat कार्यक्रम के साथ Tukey के बाद अनौपचारिक विश्लेषण, संस्करण 3.06 विंडोज के लिए (; www.graphpad.com सैन डिएगो, सीए) द्वारा पीछा करके पता लगाया गया था। सभी डेटा, 95% विश्वास अंतराल पर विश्लेषण किया है, व्यक्त कर रहे हैं के रूप में 3 स्वतंत्र प्रयोगों से मतलब है, जिसमें 6 कुओं का विचार किया गया ± मानक त्रुटि का अर्थ है। तारों के उपचार और चुनाव के बीच सांख्यिकीय मतभेद का संकेतtrol हालत (*** पी <0.001, ** पी <0.01 और * पी ​​<0.05)। कृपया यहाँ यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।

चित्रा 7
Lipopolysaccharide (LPS) द्वारा N9 सक्रियण के बाद सतह पर तैरनेवाला में इंटरफेरॉन गामा (IFN-γ) की चित्रा 7. एकाग्रता। N9 microglia 24 घंटे के लिए एलपीएस के विभिन्न सांद्रता के साथ सक्रिय थे, और उसके बाद 24 घंटे के लिए अलग-अलग न्यूरोनल PC12 कोशिकाओं से युक्त कुओं को हस्तांतरित या 48 घंटा। कम डिब्बे की सतह पर तैरनेवाला में IFN-γ सांद्रता एक एलिसा का उपयोग कर मूल्यांकन किया गया। समूहों के बीच महत्वपूर्ण अंतर विचरण का एक तरह से विश्लेषण से पता लगाया गया था, GraphPad Instat कार्यक्रम के साथ Tukey के बाद अनौपचारिक विश्लेषण, संस्करण 3.06 के द्वारा पीछाविंडोज (; www.graphpad.com सैन डिएगो, सीए) के लिए। सभी डेटा, 95% विश्वास अंतराल पर विश्लेषण किया है, व्यक्त कर रहे हैं के रूप में 3 स्वतंत्र प्रयोगों से मतलब है, जिसमें 6 कुओं का विचार किया गया ± मानक त्रुटि का अर्थ है। तारों के उपचार और नियंत्रण हालत के बीच मतभेद का संकेत सांख्यिकीय (** पी <0.01 और * पी ​​<0.05)। कृपया यहाँ यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।

आंकड़ा 8
Lipopolysaccharide (LPS) द्वारा N9 सक्रियण के बाद सतह पर तैरनेवाला में ट्यूमर परिगलन कारक अल्फा (TNF-α) के 8 चित्रा एकाग्रता। N9 microglia 24 घंटे के लिए एलपीएस के विभिन्न सांद्रता के साथ सक्रिय थे, और उसके बाद के लिए अलग-अलग न्यूरोनल PC12 कोशिकाओं से युक्त कुओं को हस्तांतरित 24 घंटा या 48 एच। TNF-αकम डिब्बे की सतह पर तैरनेवाला में सांद्रता एक एलिसा का उपयोग कर मूल्यांकन किया गया। समूहों के बीच महत्वपूर्ण अंतर विचरण का एक तरह से विश्लेषण, GraphPad Instat कार्यक्रम के साथ Tukey के बाद अनौपचारिक विश्लेषण, संस्करण 3.06 विंडोज के लिए (; www.graphpad.com सैन डिएगो, सीए) द्वारा पीछा करके पता लगाया गया था। सभी डेटा, 95% विश्वास अंतराल पर विश्लेषण किया है, व्यक्त कर रहे हैं के रूप में 3 स्वतंत्र प्रयोगों से मतलब है, जिसमें 6 कुओं का विचार किया गया ± मानक त्रुटि का अर्थ है। तारों के उपचार और नियंत्रण हालत (*** पी <0.001) के बीच मतभेद सांख्यिकीय संकेत मिलता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

किसी को भी सम्मिलित सह संस्कृति प्रणाली प्रयोग के सबसे महत्वपूर्ण कदम वास्तव में इस्तेमाल करने के लिए उचित डालने के चयन में बसता है। ध्यान में लीन होना आकार और झिल्ली सामग्री कोशिकाओं है कि वरीयता प्राप्त किया जाएगा के प्रकार और प्रयोग के उद्देश्य पर विचार करने के लिए भूल के बिना, पूरी तरह से ध्यान में रखा जाना चाहिए। उदाहरण के लिए, chemotaxic assays सेल सह संस्कृतियों से झिल्ली का एक ही प्रकार का उपयोग सेल सेल संपर्क के अभाव में स्रावित घुलनशील कारकों से प्रेरित सेल व्यवहार modulations का विश्लेषण करने के लिए कर सकता है। सेल प्रवास और सेल सेल संपर्क रोकता करने के लिए पूर्व के लिए बड़े लोगों, सेल प्रवास अनुमति देने के लिए, और बाद के लिए छोटे लोगों,: हालांकि, प्रयोगों के दोनों प्रकार के अलग अलग रोमकूप आकार की आवश्यकता होती है। सेल सेल संपर्क के अभाव में स्रावित घुलनशील कारकों द्वारा मध्यस्थता सेलुलर परिवर्तन के मूल्यांकन के लिए, ताकना के 0.4 माइक्रोन या 3 माइक्रोन आकार आमतौर पर उचित रूप में वे इस तरह के प्रोटीन के रूप में बड़े अणुओं के लिए अनुमति देते हैं, कर रहे हैं, लेकिन पार करने से सबसे कोशिकाओं को रोकने के लिए इसलिए। झिल्लीसामग्री काफी हद तक सेल प्रकार पर निर्भर करता है और तकनीकों सेल संस्कृति प्रोटोकॉल के अंत में इस्तेमाल किया जाएगा। संक्षेप में, पीईटी झिल्ली अच्छा सेल दृश्यता की पेशकश के रूप में वे साफ कर रहे हैं, लेकिन कोलेजन लेपित नहीं कर रहे हैं, पक्षपाती कोशिकाओं है कि समर्थन के लिए इलाज किया जाना अपेक्षित के लिए एक समस्या हो सकती है। उन्होंने यह भी fixatives करने के लिए सबसे अच्छा रासायनिक प्रतिरोध है कि, उनके अच्छे गुण ऑप्टिकल के साथ-साथ, उन्हें ऊतकीय अध्ययन के लिए आदर्श बनाता है। दूसरी ओर, पीसी झिल्ली गरीब सेल दृश्यता की पेशकश के रूप में वे पारदर्शी हैं और कोलेजन लेपित नहीं कर रहे हैं। हालांकि, वे pores के सबसे अधिक घनत्व और ताकना आकार के सबसे विविध उपलब्धता के पास है। अंत में, PTFE झिल्ली स्पष्ट कर रहे हैं जब गीला लेकिन केवल सेल के दृश्य माइक्रोस्कोप में रूपरेखा अनुमति देते हैं। एक प्रमुख लाभ के रूप में, वे लेपित कोलेजन कर रहे हैं, जो भी उन्हें थोड़ा मोटा बनाता है। यह नोट करना कोलेजन के साथ कोटिंग पीईटी या पीसी झिल्ली सम्मिलित करता है pores में बाधा डालती है और घुलनशील कार्योत्तर के पारित होने में बाधा कर सकते हैं कि महत्वपूर्ण हैरुपये। किसी भी मामले में, सबसे डालने निर्माताओं उचित डालने के चयन में शोधकर्ताओं की सहायता के लिए व्यापक गाइड प्रदान करते हैं। हमारे विशिष्ट प्रतिमान में, PC12 कोशिकाओं के लिए चढ़ाना घनत्व, मीडिया, सीरम एकाग्रता, भेदभाव के दिन, एलपीएस सक्रियण के दिन, एलपीएस की सांद्रता, और बोतल की कोटिंग के विकल्पों इन सह संस्कृति प्रणालियों 15 के साथ काम करने के वर्षों में अनुकूलित किया गया है 16। उल्लेखनीय है, आवेषण में N9 microglia की चढ़ाना घनत्व क्रम में 60,000 ¢ / 2 सेमी में चुना गया था सह संस्कृति शुरू होने के क्षण में 40-50% संगम प्राप्त करने और इस प्रकार, करने के लिए, उन्हें अपने सक्रियण पर गुणा करने के लिए स्थान देने के लिए एलपीएस के द्वारा। अन्य शर्तें जब अनुकूलित भी इस तरह के मूल निवासी PC12 रखरखाव के लिए इरादा बोतल में एल Lysine द्वारा कोलेजन प्रतिस्थापन के रूप में संतोषजनक परिणाम, उपज हो सकती है।

आदेश में परिणाम की स्थिरता को बढ़ाने के लिए कई अलग अलग नियंत्रण किया जा सकता है। जब कि घुलनशील कारकों साबित करने की कोशिशकर रहे हैं मनाया प्रभाव के लिए जिम्मेदार, मिश्रित प्रत्यक्ष सेल सेल से संपर्क करें और वातानुकूलित माध्यम प्रयोगों प्रकट संस्कृतियों समानांतर में आयोजित किया जाना चाहिए। इसके अलावा, एंटीबॉडी का इस्तेमाल कर रही बेअसर करने के लिए एक विशिष्ट स्रावित कारक अणु पैराक्राइन प्रभाव है कि माना जाता है के लिए जिम्मेदार की पहचान करने में मदद मिलेगी। जब संभव हो, एक रिसेप्टर या उसके संकेतन मार्ग रिसेप्टर की सटीक पहचान सक्रिय किया जा रहा तुच्छ के एक हिस्से को ब्लॉक। एक अणु एक सेल की आबादी में इस तरह के उदाहरण पहले से वर्णित के रूप में एक दूसरे सेल प्रकार, के साथ सह-संस्कृति प्रयोग करने से पहले सक्रिय करने के लिए प्रयोग किया जाता है, तो यह ध्यान में सिस्टम में अणु की उपस्थिति लेने के लिए महत्वपूर्ण है। पहली बार एक विकल्प के रूप में, मध्यम पूरी तरह से क्रम में सह संस्कृति प्रयोग से पहले बदला जाना चाहिए कि यह सुनिश्चित करने अणु प्रणाली पूरी तरह से अनुपस्थित है। एक दूसरा विकल्प के रूप में, जहां अकेले अणु के क्रम में दूसरे सेल प्रकार के साथ incubated है एक शर्त जोड़ा जाना चाहिएपहले सेल प्रकार की अनुपस्थिति में उसके प्रभाव का आकलन करें। अगर कोई दूसरा सेल प्रकार पर अणु का कोई प्रभाव नहीं है, वहाँ सह संस्कृति प्रयोग से पहले मध्यम बदलने की जरूरत होगी। इसी तरह, अगर दोनों प्रकार की कोशिकाओं को एक ही सेल संस्कृति माध्यम में हो नहीं कर रहे हैं, इसी तरह की सावधानियों सुनिश्चित करें कि मध्यम संरचना में अंतर एक या अन्य सेल की आबादी को प्रभावित नहीं करते बनाने के लिए लिया जाना चाहिए। हालांकि दोनों मीडिया से पहली बार में डालने झिल्ली से अलग किया जाएगा, प्रसार सुनिश्चित करने के लिए कि वे अब ऊष्मायन अवधि में मिश्रण होगा बाध्य है। इसके अलावा, कई समस्याओं घुलनशील कारक रिसेप्टर रिश्तों की न्यायपालिका विघटन से पैदा कर सकते हैं। त्रुटि के कई कारणों के अलावा, एंजाइमी हदबंदी के अत्यधिक उपयोग और सीरम के महत्वपूर्ण सांद्रता की उपस्थिति कोशिका की सतह रिसेप्टर्स के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं। डालने सह संस्कृति प्रणाली में त्रुटि के अन्य कारणों में शामिल है, लेकिन 1 तक सीमित नहीं हैं) इस तरह के सेल की समग्रता को हटाने के रूप में अनुचित सेल संस्कृति तकनीक,सूखे के लिए कोशिकाओं के कारण एक ही समय में भी कई कुओं में संस्कृति के माध्यम से, 2) एक monolayer वह भी डालने में मिला हुआ है, डालने झिल्ली बंद सील और ऊर्ध्वस्थ होते-स्रावित अणुओं रोकने के लिए जिम्मेदार कम डिब्बे तक पहुँचने के लिए, और 3) misadjusted सेल संगम है, जो physiologically अप्रासंगिक परिणाम या किसी प्रभाव के अभाव के लिए अग्रणी घुलनशील कारकों में से एक अधिक या कम-अभिव्यक्ति का कारण बनता है।

जबकि डालने सह संस्कृति का केवल एक ही परिदृश्य यहां प्रस्तुत किया गया था, वहाँ यह बहुत बहुमुखी तकनीक का उपयोग करने के कई तरीके हैं। इधर, एक सेल प्रकार एक अणु एक घुलनशील पहलू यह है कि, अच्छी तरह से करने के लिए सम्मिलित स्थानांतरित करने पर, दूसरी सेल प्रकार के व्यवहार को प्रभावित करता है के स्राव उत्प्रेरण के लिए जिम्मेदार के साथ पहले से इलाज किया गया था। यह भी उन्हें अलग करने के एक गुप्त उपचार के लिए बढ़ा जोखिम या एक या दोनों सेल आबादी के प्रतिरोध का पता लगाने के लिए पहले एक सह संस्कृति प्रणाली में एक साथ दोनों प्रकार की कोशिकाओं सेते के लिए संभव है। होwever, जब इसकी सबसे मौलिक रूप को देखते हुए इस तकनीक किसी भी उपचार के बिना एक साथ incubated कोशिकाओं के दो आबादी के उपयोग के लक्ष्य को बेसल पैराक्राइन पारस्परिक संकेतन का आकलन करने के साथ कर सकते हैं।

इस तकनीक का सबसे महत्वपूर्ण सीमा यह है कि इस तरह के प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों के रूप में बहुत कम रहता आणविक संस्थाओं दूरी है कि सेल ऊपरी डिब्बे और कम डिब्बे 82 में से एक में बढ़ती हुई जनसंख्या को अलग से बच नहीं करते। सह संस्कृति तकनीक के क्षेत्र में नवीनतम विकास microscale निकटता 83 में दो सेल आबादी बनाए रखने में सक्षम एक microfabricated संस्कृति सब्सट्रेट का उपयोग करके इस समस्या का जवाब करने का प्रयास किया गया है। इस तरह के बदलाव और द्विदिश सिगनल की जनसंख्या-विशिष्ट पहचान के रूप में सम्मिलित सह संस्कृति प्रणाली, के लाभों के सभी असर के अलावा, इस microfabricated स्क्रीन भी संभव कम दूरी बातचीत का पता लगाने कि डी से पहले नहीं थे बनाने के लिए प्रदर्शन किया गयादूरी पर घुलनशील कारकों के क्षय के कारण etectable। यह सेल संस्कृति मंच सेल सह संस्कृति के क्षेत्र में नवीनतम नवीनता है और सुलझाना कोशिकाओं है कि पहले की अनदेखी कर रहे थे के बीच तंत्र संकेत मदद करने का वादा किया।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI-1640 medium Sigma R8755 Warm in 37 °C water bath before use
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham Sigma D6421 Warm in 37 °C water bath before use, must be supplemented with 0.365 gm/L L-glutamine
Horse serum ATCC 30-2040 Warm in 37 °C water bath before use
Fetal bovine serum MultiCell 80350 Warm in 37 °C water bath before use
Nerve Growth Factor-7S from murine submaxillary gland Sigma N0513 Reconstitute the lyophilized powder in a solution of buffered saline or tissue culture medium containing 0.1–1.0% bovine serum albumin or 1-10% serum
Trypsin-EDTA solution Sigma T3924 Warm in 37 °C water bath before use
Lipopolysaccharides from Escherichia coli 055:B5 Sigma L2880 Toxic
Cell culture inserts for use with 24-well plates BD Falcon 353095 0.4 μm pores
24-well plates TrueLine TR5002 Coat with collagen before use
Routine PC12 cell culture medium Routine N9 cell culture medium
-       85% RPMI medium -       90% DMEM-F12 medium
-       10% heat-inactivated horse serum -       10% heat-inactivated horse serum
-       5% heat-inactivated fetal bovine serum
PC12 differentiation medium N9 treatment medium
-        99% RPMI medium -       99% DMEM-F12 medium
-        1% heat-inactivated fetal bovine serum -       1% heat-inactivated fetal bovine serum
-        50 ng/mL nerve growth factor
PC12 treatment medium
-        99% RPMI medium
-        1% heat-inactivated fetal bovine serum

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References

  1. Grobstein, C. Morphogenetic interaction between embryonic mouse tissues separated by a membrane filter. Nature. 172 (4384), 869-870 (1953).
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Renaud, J., Martinoli, M. G.… More

Renaud, J., Martinoli, M. G. Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact. J. Vis. Exp. (113), e54356, doi:10.3791/54356 (2016).

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