Introduction
Studiet av vev, organer eller systemer in vitro er et forsøk på å forenkle de svært komplekse relasjoner som eksisterer mellom de forskjellige cellulære undertypene som utgjør flercellede organismer. Faktisk, in vitro-studier gjør det mulig å få en detaljert forståelse av enkeltcellepopulasjoner. Det er to store fordeler ved å drive in vitro forsøk: 1) reduserte cellulære interaksjoner, og 2) evnen til lett å manipulere den cellulære miljø. Derfor har disse to fordeler lov forskere til å forutsi oppførselen til spesifikke celletyper in vivo, som fører til evnen til å regulere utfall av ytre påvirkninger i hele organismer. I den forstand, in vitro cellekultur fungerer ofte som en bro mellom grunnforskning og anvendt biovitenskap. Likevel er det også flere ulemper med å jobbe in vitro, det viktigste blir at en viss reservasjon kan bo i den fysiologiskeal relevansen av observerte fenotyper. Faktisk, når en enkelt celletype er dyrket i et fartøy, kulturen taper, til et variert omfang, dets celle-celle forbindelser med andre celletyper, sitt bidrag til humoral miljøet fra vevet og organisme av opprinnelse, og ankrene innenfor vevet som gjorde det mulig å opprettholde en bestemt tredimensjonal struktur ofte avgjørende for cellefunksjon.
Spørsmålet om celle-celle-forhold er løst ved utvikling av blandede kultur teknikker. I denne fremgangsmåten blir to eller flere cellepopulasjoner vokst sammen i det samme dyrkningsbeholder. Men disse blandede kulturer bærer viktige ulemper. På den ene siden er det noen celle subtyper ikke fysisk kontakt med hverandre i vevet av opprinnelse og stole utelukkende på parakrine kommunikasjon påført av utskilte løselige faktorer og nærliggende reseptorer. Dette er tilfellet for en rekke inflammatoriske prosesser som avhenger av proksimale cytokin signalering. I mixed cultures, fysiske interaksjoner er uunngåelig, og gjøre det umulig å studere parakrine kommunikasjon i fravær av celle-celle kontakter som kan gi endrede resultater. På den annen side, å oppnå celle-spesifikke tolkninger innenfra en blandet populasjon blir ugjørlig uten bruk av sterke separasjonsteknikker som kan i betydelig grad påvirke resultatene.
For å løse disse viktige problemene, har bruken av kondisjonert medium blitt utviklet som en teknikk tillater for romoppdelte kulturer og studiet av parakrine signalering. Denne metoden krever overføring av supernatanten fra en celletype, således heter kondisjonert medium, til brønner inneholdende en annen populasjon av celler. Likevel, er en viktig ulempe at kortlivede molekyler ikke overleve lenge nok i det kondisjonerte mediet til å bli overført til brønnene i den andre populasjon av celler. Selv langlivede molekyler vil bli sterkt fortynnet over tid på grunn av diffusjon. Videre har både cellepopulasjoner bare delta i enveis parakrint kommunikasjon heller enn i aktiv toveiskommunikasjon. Dette fører til fravær av tilbakesignaleringen som er viktig i å gjenskape nøyaktig flercellede forhold som de eksisterer in vivo.
Som en konsekvens og drevet av behovet for bedre å simulere den opprinnelige in vivo-forhold i in vitro-cellemiljø, har flere fremskritt i cellekulturteknikker blitt oppnådd i løpet av årene. En av de mest betydelige fremskritt har vært bruken av gjennomtrengelige bærere med mikroporøse membraner for compartmentalizing cellekulturer som brukes for første gang ved Grobstein i 1953 en. Slike gjennomtrengelige bærere er tilpasset i løpet av årene for å få plass til en rekke celletyper og som skal benyttes i flere forskjellige anvendelser. I dag, disse støtter eksistere som hule innstikk som er designet for å hvile i brønner fra en multiwell vev kultur plate eller i sirkulLar retter. I et ko-kultursystem, inneholder innsatsen en celletype, mens brønnen eller tallerken inneholder den andre cellulære populasjon, slik at for å undersøke bidraget av to forskjellige populasjoner av celler som på sin humoral miljø (figur 1). Som et resultat, er cellulær polaritet (basolateral vs apikal sekresjon eller signal) bevares, således givende insert ko-kultursystemer en viktig fordel i forhold til blandede kulturer og kondisjonert medium teknikker. Flere typer membranmaterialer er tilgjengelige, de vanligste er polyester (PET), polykarbonat (PC) eller kollagen-belagte polytetrafluoretylen (PTFE), og de finnes i forskjellige porestørrelser som varierer fra 0,4 pm til 12,0 pm. Disse varianter av materialer og porestørrelser gir et spektrum av innsatser som utøver variable egenskaper som er relevante for optiske egenskaper, membrantykkelse og cellene skulle vedhefte som gjør dem praktisk på forskjellige nivåer for følgende anvendelser som ikke er begrenset til:
-studyingcelledifferensiering, embryoutvikling, tumormetastase og sår reparasjon av kjemotaksisk analyser gjennom permeable membraner;
-evaluating stoffet penetrasjon ved å vurdere deres transport gjennom epitel eller endotelceller monolag dyrket på permeable støtter, og;
som gir gode celle ko-kulturer for å analysere celle atferd modulasjoner som induseres av utskilte løselige faktorer i fravær av celle-celle-kontakt.
Hensikten med denne artikkelen er å beskrive de generelle metodologiske retningslinjer for å oppfylle den tredje funksjon er angitt ovenfor, som er til å evaluere celleforandringer mediert av utskilte løselige faktorer i fravær av celle-celle-kontakt ved hjelp av et innsats ko-kultur-system. Flere forskjellige forskningsfelt gjøre bruk av innsatsen ko-kultursystemer for å svare på spørsmål som er relevante for virkningen av utskilte løselige faktorer på populasjoner av celler. Faktisk parakrint signale som modulerer cellulære atferd på ulike nivåer er relevant i alle vevog systemer, som gjør innsats co-kultur systemer uunnværlig for å sikre fremskrittene innen disse feltene. Omvendt, ved bruk av innsatser kan bekrefte at signaltransduksjon er ved direkte celle-celle-kontakt og ikke av utskilte faktorer. En av de viktigste anvendelser av innsatser er i inflammasjons studier 2-14, hvor effekten av utskilte cytokiner er evaluert i ulike cellulære spillere av immunitet. Spesielt har studiet av betennelse i sentralnervesystemet (CNS) i stor grad profitinnsats co-kulturstudier, som har lov til å bedre definere forskjellige parakrine roller nevroner og microglia i å drive nevroinflammasjon 15-21. Disse systemene ble også utviklet for å studere den antiinflammatoriske potensiale av molekyler som er avhengig av deres evne til å redusere eller hemme sekresjon av proinflammatoriske faktorer 22-26. Forskning knyttet til kreft 27-31, spesielt de mekanismene som ligger til grunn angiogenese 32-34 og inflammatipå 35-42 i tumorigenesis, også drar nytte av innsatsen co-kultur systemer. Videre løselige faktorer er av største betydning i de prosessene som driver differensiering og flere studier har brukt setter inn for å svare på spørsmål i det aktuelle feltet 43-50. I CNS, ettersom nervevev har en svært begrenset fornyelse potensial, studiet av neurotrophism og neuroprotection er grunnleggende og har vært mye sikres ved bruk av stamceller i co-kultur-systemer 51-56. I tillegg er inserts også benyttes i så ulike områder som nefrologi 57,58, endotelceller interaksjoner og angiogenese 59-62, apoptose signale 63-65, betennelse i fedme og metabolsk syndrom 22,23,66-67, indre øret hår cellebeskyttelse 68,69, og selv i sopp virulens 70,71 og parasittologi 72,73.
Denne artikkelen gir generelle metodologiske retningslinjer for å sette opp en experiment med henblikk på å evaluere celleforandringer mediert av utskilte løselige faktorer ved hjelp av et innsats ko-kultur-system. Spesielt vil vi fokusere på nervecelle co-kulturer og deres bruk i å studere neuroinflammatoriske prosessen. Gitt den svært store spekteret av eksperimenter som setter gjør mulig å pilot, er det uutholdelig å dekke alle aspekter av denne cellekultur teknikk. Som et eksempel, for en bestemt protokoll måle effektene av cytokiner som utskilles av lipopolysakkarid (LPS)-aktivert N9 mikroglia på neuronale PC12-celler vil bli detaljert, med en konkret forståelse av innsatsen ko-kultur metodikk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NB: Hver av de følgende trinn skal utføres under sterile forhold i en laminær hette som kreves for pattedyrcellekultur. I tillegg de generelle retningslinjene for optimal sterile celledyrking gjelder, f.eks., Forkaste tips som helst de kan føre til krysskontaminering, redusere mengden av tids celler blir eksponert for luft når du utfører hele medie endringer, riktig, men forsiktig omrøring alle cellesuspensjoner for å sikre deres homogen pipettering, etc. Videre innstikk er en slags plasticware som krever spesiell håndtering. Først når innsatser er manipulert, unngå å berøre den skjøre membran, som tårer lett og kan derfor sette forsøket. Dessuten er det ikke egnet å utføre vakuum aspirasjon av cellekulturmediet, da det er en risiko for perforering av membran eller dissosiering adherente celler. Deretter inserts henge løst i flere brønner vev kultur plate, og dermed må det utvises forsiktighet når motreråvare den plasticware eller når pipettering å unngå dissociating heftende celler. I tillegg, når det brukes innsatser med store porestørrelser, er det en mulighet for at cellekulturmediet siver gjennom membranen, og derfor er det viktig å ofte overvåke nivået av væsken. Til slutt, være oppmerksom på at den følgende protokoll er utformet for adherente celler og krever mindre modifikasjoner for å være egnet for suspensjonsceller.
1. Generelle retningslinjer for gjennomføring av innsats co-kultur eksperimenter
- Seeding celletype # 1 i inserts
- Pakk innleggene fra emballasjen.
- Plasser innsatsene i en tom for flere brønner vevskulturplate av riktig dimensjon. For å gjøre dette, grep den øverste kanten av innsatsen ved hjelp av pinsett.
- For å bedre feste og spredning av heftende celler, kondisjonere innsatser med cellekulturmedium før seeding. For å gjøre dette, dekker hele overflaten av membranen med cellekultur medium ved hjelp av en mikropipette.
MERK: Gjør dette for så mange innsatser etter behov. - Sett lokket på plate og inkuberes i minst en time eller O / N under samme forhold (vanligvis 37 ° C, 5-10% CO 2).
- Når innsatsene er betinget, fjerne alle cellekulturmedium med en mikropipette. Kast den brukte medium.
- Seed celle type # 1 i frisk cellekulturmedium på samme måte som i en for flere brønner plate. For å gjøre dette, tegne en passende volum av cellesuspensjonen med en mikropipette og dispensere væsken i innsatsen.
MERK: Forbered så mange innsatser etter behov. - Etter såing alle innleggene, rist den forsiktig plate til venstre og høyre, deretter frem og tilbake for å fordele cellene jevnt. Unngå å lage sirkulære bevegelser, da dette vil føre til at cellene til å akkumulere i sentrum av innleggene.
- Sett lokket på plate og inkuberes som angitt av som per cellulære krav (vanligvis 37 ° C, 5-10% CO
- Seeding celletype # 2 i flere brønner vevskulturplater
- Seed celletype som nr 2 i frisk cellekulturmedium i henhold til § 1.
- Fremstille så mange brønner som er nødvendig for det antall innsatser. Rock platen som i trinn 1.1.7) for å sikre at cellene er jevnt fordelt i brønnene.
- Plassere lokket på platen og inkuberes under de samme betingelser (vanligvis 37 ° C, 5-10% CO2).
- Forfriskende medium i inserts
- Ved hjelp av en mikropipette, fjerne en del av eller hele cellekulturmedium, i innsatsene som inneholder celle type # 1. Kast den brukte medium.
- Tegn et passende volum av frisk cellekulturmedium. Forsiktig hviler spissen på den indre vegg av innsatsen og langsomt avgi cellekulturmediet.
- Sett lokket på plate og inkuber som per trinn 1.1.4.
- Forfriskende medium i flere brønner vevskulturplater
- Ved hjelp av en micropipette, fjerne en del av eller hele cellekulturmediet i brønnene som inneholdt celletype # 2. Kast den brukte medium.
- Tegn et passende volum av frisk cellekulturmedium. Hviler spissen på den indre veggen av brønnen og langsomt avgi cellekulturmediet.
- Plassere lokket på platen og inkuber i henhold til tidligere etablerte cellekultur protokoller.
- Overføring innsatser inneholdende celletype # 1 til multibrønn vevskulturskåler inneholdende celletype # 2.
MERK: Utfør dette trinnet når begge celletyper har nådd den riktige vekstfasen.- Før overføring av innsatsene i brønner, gjør eventuelle nødvendige mellom endringer, som tidligere beskrevet i trinn 1.3) og 1.4).
MERK: På dette punktet, er det viktig å dispensere de riktige mengder media i begge avdelinger som angitt av innsatsen produsentens instruksjoner. - Ved hjelp av pinsett, grep den øverste kanten av et innstikk som inneholder celle type # 1 og forsiktig plassere den i riktig godt som inneholder celletype # 2.
- Etter å overføre alle innsatser, se på tilstedeværelsen av luftbobler under membranen av innsatser.
MERK: Luftbobler forhindre utveksling over membranen av innsatsen, og kan sette hele forsøket. - Hvis luftbobler er til stede, løfter veldig forsiktig innsatsen fra brønnen ved hjelp av pinsett og stupe inn i cellekulturmediet. Boblene vil forsvinne. Hvis de fremdeles er til stede, prøve slakke skrå innsatser tilbake inn i cellekulturmediet i en vinkel.
MERK: Ikke bank på eller røre setter inn for å unngå dissociating heftende celler. - Etter å ha fjernet alle luftbobler og sjekke at volumene av media i begge avdelinger, legg lokket på plate og inkuber.
- Før overføring av innsatsene i brønner, gjør eventuelle nødvendige mellom endringer, som tidligere beskrevet i trinn 1.3) og 1.4).
- Forfriskende medier i en co-kultur system
MERK: Selv om membranen tillater lett medie utveksling mellom innsatsen og godt, forfriskende mediet er gjort ibegge kamrene siden den tid som er nødvendig for å nå likevekt i de øvre og nedre kamre ved diffusjon alene kan være ganske lang.- Forfriskende medium i innsatser inneholdende celle type # 1 er gjort på samme måte som i trinn 1.3).
- Hvis du vil oppdatere medium i brønner som inneholder celletype # 2, skyv innsatsen til siden for å skape et rom stort nok til å romme en pipette. Oppdater mediet som i trinn 1.4).
- Sjekk for tilstedeværelsen av luftbobler og bekrefte volumene som per trinn 1.5.3) gjennom 1.5.5).
2. Eksempel: måle effekten av cytokiner utskilt av LPS-aktiverte N9 microglia på nevronale PC12-celler
MERK: Følgende trinn er konstruert for spesifikke kolbe, vel og oppvask størrelser. Imidlertid kan protokollen tilpasses for eventuelle plasticware dimensjoner. For media og sammensetning se Materialer tabell.
- Seeding og differensierende PC12 celler i multibrønns vevskulturplater
- Varm rutine PC12 cellekulturmedium, PC12 differensiering medium og trypsin-EDTA i et 37 ° C vannbad.
- Bruk PC12 celler på 60-80% samløpet fra en 75 cm 2 kolbe.
- Med en 15 mm Pasteur-pipette, utføre vakuumavsugning av hele cellekulturmedium i kolben.
- Skyll forsiktig cellemonolaget med 5 ml steril fosfatbufret saltløsning, og fjerne væsken med en Pasteur pipette. Vær forsiktig med å distansere celler på dette trinnet.
- Dekk cellemonolaget med 3 ml trypsin-EDTA og inkuberes i 2-3 min ved 37 ° C.
- Sørg for at alle cellene er frittliggende under et mikroskop. Dersom svært få celler er flytende, og inkuberes i en lengre periode for et maksimum på 5 min.
- Tilsett 10 ml rutine PC12 cellekulturmedium for å inaktivere trypsin-EDTA.
- Med en 10 ml pipette, forsiktig triturer samtidig sørge for at de fleste cellene er skilt fra bunnen of kolben. Unngå å skape luftbobler i cellesuspensjonen.
- Med det samme 10 ml pipette, overføres cellesuspensjonen i et 50 ml rør sentrifugering.
- Sentrifuger i 1 min ved 3200 xg
- Kast supernatanten med en Pasteur pipette mens du tar vare ikke å forstyrre pelleten.
- Tilsett 10 ml rutine PC12 cellekulturmedium med en 10 ml pipette.
MERK: Dette volumet kan justeres dersom pellet er usedvanlig liten eller stor. - Triturer med de samme 10 ml pipette for å homogenisere pellet. PC12-celler ofte klumpe seg sammen så minst 20 pipettering opp og downare nødvendig.
MERK: Mens sprek triturating er nødvendig, unngå å skape luftbobler i cellesuspensjonen. - I et 1,5 ml rør, fremstille en passende fortynning av cellesuspensjonen i trypanblått. Tell cellene ved hjelp av et hemocytometer i henhold til tidligere etablerte protokoller 74.
- I en separat 50 ml tube, splitte cellesuspensjonenmed PC12 differensiering medium for å oppnå en fortynnet cellesuspensjon egnet for såing brønner fra en 24-brønns plate (30,000 ¢ / cm 2, 0,6 ml per brønn i henhold til produsentens protokoll).
MERK: 24-brønns plate må tidligere belagt med kollagen som angitt av tidligere etablerte protokoller 75. - Fordele 0,6 ml av cellesuspensjon per brønn ved hjelp av en mikropipette.
- Når alle brønnene er seeded, rock plate som i trinn 1.1.7).
- For å tillate riktig differensiering av PC12-celler, inkuberes de 24-brønners plater i 7-9 dager ved 37 ° C i en 5% CO2 fuktig atmosfære i PC12 differensieringsmedium 15,16 før utføring ko-kultur-eksperimenter.
- Utføre mellom endringer annen hver dag ved å fjerne halvparten av væsken og erstatte det med et like stort volum ferskt medium PC12 differensiering.
- Seeding N9 microglia i innleggene og behandling med LPS
- En dag før du utfører co-kultur eksperimenter, pre-behandle PTFE 0,4 mikrometer-pore innsatser med rutine N9 celledyrkingsmedium for å optimalisere celle tilslutning, å følge trinn 1.1.1) gjennom 1.1.4)
- Varm rutine N9 cellekulturmedium og trypsin-EDTA i et 37 ° C vannbad.
- I mellomtiden, veier omtrent 10 mg LPS i et 1,5 ml rør for senere bruk.
MERK: Siden LPS er en potent pro-inflammatorisk endotoksin og krever spesielle sikkerhetsforanstaltninger, briller, hansker, og en støvmaske anbefales sterkt. - Bruk N9 celler på 80-90% samløpet fra en 75 cm 2 kolbe.
- Følg trinn 2.1.3) til 2.1.14). Bruk alltid rutine N9 cellekulturmedium i stedet for rutine PC12 cellekulturmedium. Merk også at N9 microglia ikke klumpe seg sammen så mye som PC12 celler gjøre, så færre pipettering opp og ned kan være nødvendig ved trinn 2.1.13).
- I en separat 50 ml tube, splitte cellesuspensjonen med N9 cellekulturmedium for å obtain en fortynnet cellesuspensjon egnet for såing innsatser er utformet for å holde i 24-brønners plater (60 000 ¢ / cm 2, 0,05 ml pr innsats i henhold til produsentens protokoll, for membranoverflateareal se produsentens informasjon).
MERK: Disse skjærene er allerede belagt med kollagen av produsenten og er optimalisert for celle adhesjon. - Fordel 0,05 ml av cellesuspensjonen pr innsatsen ved hjelp av en mikropipette.
- Når alle innsatser er seeded, rock plate som i trinn 1.1.7).
- Utføre serielle fortynninger av LPS ved å bruke N9 behandlingsmedium for å oppnå 4 ug / ml, 2 mg / ml og 1 mg / ml arbeidsløsninger.
- Pipetter 0,05 ml av 4 ug / ml arbeidsløsning i ett sett av innsatser for å gi en endelig fortynning på 2 ug / ml.
- Gjenta trinn 2.2.10) for de andre to arbeidsløsninger i forskjellige sett innsatser, hvilket gir endelige fortynninger på 1 ug / ml og 0,5 ug / ml henholdsvis.
- Icubate platene inneholdende de innsatser for 24 timer ved 37 ° C i en 5% CO2 fuktig atmosfære for å tillate N9 mikroglia aktivering med LPS før utføring av ko-kultur-eksperimenter.
- Co-dyrking nevronale PC12 celler med N9 microglia
- På 7-9 dager med differensiering PC12-celler, aktiverer N9 mikroglia etter 24 timers inkubasjon med LPS av varm N9 behandlingsmediet og PC12 behandling medium i et 37 ° C vannbad.
- Utfør en total medium endring for N9 microglia som i trinn 1.3), erstatte hele brukte medium med 0,1 ml N9 behandling medium. Gjør dette for hver insert.This er nødvendig for å fjerne alle spor av LPS, slik at bare aktivert N9 microglia i innleggene.
- Utføre en total forandring medium for nevronale PC12-celler som i trinn 1.4). Overfør innsatsene inn i 24-brønners plater som i trinn 1.5) .Incubate de N9-PC12-ko-kulturer i 24 timer eller 48 timer ved 37 ° C i en 5% CO2 fuktig atmosfære.
- etter 24time eller 48 timer, høste supernatanten og / eller cellene i cytotoksisitet, enzymbundet immunosorbent assay (ELISA), Western blot, eller andre analyser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bruken av innsats co-dyrkingssystemer er særlig relevant i studiet av neuroinflammatoriske prosesser som utstillingsvindu parakrine relasjoner mellom ulike cellulære spillere av CNS. Immunitet i CNS oppnås hovedsakelig ved å hørende celler kalt mikroglia som overvåker deres omgivelser i sin hvile forgrenede tilstand (figur 2A) og er i stand til sensor forstyrrelser som kan problemer med den meget verdifulle homeostase nødvendig for riktig neuronal funksjon 76-78. Microglial aktivering, karakterisert ved innføringen av en amoeboid form (figur 2B), og multiplikasjon av cellepopulasjonen betegnet microgliosis (figur 3), etterfulgt av frigjøring av proinflammatoriske mediatorer, slik som cytokiner, som utgjør den øverste del av nevroinflammasjon 79 . Cytokine release serverer den edle formål å beskytte nerveceller mot skadelige angrep og er closely overvåkes. Men når nevroinflammasjon unnslipper denne streng kontroll, vedtar det destruktive og kan alvorlig skade sentralnervesystemet. For så vidt som nervevev ha en meget begrenset fornyelse potensial, er CNS desto mer utsatt for slike auto-destruktive inflammatoriske responser. Studerer crosstalk, som eksisterer mellom nevroner og microglia er avgjørende i å belyse underliggende mekanismene for nevroinflammasjon. I motsetning til blandede kulturer, insert co-kultur systemer gjør etterforsker for å identifisere hvilke cellepopulasjon genererer toksiske effekter og hvilken som blir påvirket.
Her PC12 celler differensiert for 7-9 dager med nervevekstfaktor var co-kultivert med LPS-aktiverte N9 microglia med mål om quantifyingthe skadelige effekter av betennelse-avledet løselige faktorer på nerveceller. For å gjøre dette, ble nevronale PC12 celler dyrket i 24-brønners plater mens N9 microglia ble sådd i inserts. N9 microglien ble behandlet i 24 timer med LPS, en meget potent proinflammatorisk endotoksin omfattet i de ytre membraner av gram-negative bakterier. LPS er kjent for å aktivere toll-lignende reseptor 4 således å fremskaffe en robust inflammatorisk respons i en rekke forskjellige immuneffektorceller, herunder immortalisert murin cellelinje N9 mikroglia 80,81. De følgende representative resultater viser at N9 mikroglia aktivert med LPS har en tendens til å øke populasjonen (figur 3) og for å utskille oppløselige pro-inflammatoriske cytokiner, slik som interleukin-6 (IL-6), interferon gamma (IFN-γ) og tumornekrosefaktor alfa (TNF-α), som lett kan krysse membranen i ko-kultur innsatser og forårsake skade på cytotoksiske neuronale PC12-celler som vokser i det nedre kammeret.
Den fremste bekymring før du overfører LPS-aktiverte N9 microglia til brønnene som inneholder nerve PC12 celler består i å bekrefte that PC12 er riktig differensiert. Syv-dagers differensierte PC12-celler skal fremvise åpen nevronale fenotyper som en flatere cellen kroppen, hvilke prosjekter flere lange neurites noen ganger selv viser varicosities (figur 4). Når dette sjekkpunkt er utført, kan N9 microglia innsatser inneholdende friskt medium fri for LPS, overført til brønnene som inneholdt differensierte PC12. Etter en inkubasjonstid på 24 timer eller 48 timer, supernatanten i det nedre kammeret er høstet, og en cytotoksisitet assay basert på laktatdehydrogenase frigivelse 15,16, så vel som en ELISA 15, for å måle cytokiner utføres. Det er viktig å høste supernatanten i det nedre kammeret for å måle cytokiner som faktisk har krysset den gjennomtrengelige membran, og som kan aktivere reseptorer på overflaten av PC12-celler. Resultatene viser at LPS-aktiverte mikroglia N9 fra det øvre kammeret generere en dose- og tidsavhengig cytotoxic virkning på neuronale differensierte PC12-celler er angitt i det nedre kammeret (figur 5). 0,5 ug / ml LPS tilstand er imidlertid ikke signifikant cytotoksisk i 24 timer eller 48 timer. Nivåer av cytotoksisitet ble funnet å nå nesten 100% i 2 pg / ml LPS i 48 timer tilstand. Dessuten, viser resultatene at konsentrasjonen av pro-inflammatoriske cytokiner IL-6, IFN-y og TNF-a i supernatanten øker samtidig med observert cytotoksisitet. Spesielt er IL-6 konsentrasjoner betydelig øket etter 24 timer bare for 2 ug / ml tilstand, mens 1 ug / ml LPS også utbyttene betydelig økte nivåer av cytokinet etter 48 timer (figur 6). Mikroglia utskille IFN-γ som når det nedre rom i en signifikant øket måte når de blir behandlet med 1 pg / ml og 2 ug / ml, og inkuberes med differensierte neuronale PC12-celler til enten 24 timers eller 48 timer (figur 7). 0,5 ug / mlLPS tilstand nok en gang ikke øker IFN-y-nivåer betydelig. Til slutt ble det TNF-a-konsentrasjonen i det nedre kammeret kvantifisert ved hjelp av ELISA og ble funnet å være den mest forsterket av LPS-aktivering av mikroglia og nådde nivåer nesten syv ganger mer viktig enn kontroll tilstand (figur 8). Spesielt begge 24 timers og 48 timers inkubasjonsperioder forårsaket relevant økning i TNF-α nivåer i supernatanten. Imidlertid, 1 ug / ml LPS tilstand ga en betydelig økning av TNF-α nivåer først etter 48 timer. Som en helhet, viser disse resultater at utskilling av pro-inflammatoriske cytokiner er i det minste delvis ansvarlig for de cytotoksiske effektene som observeres i differensierte PC12-celler neuronale etter en 24 timers eller 48 timers inkubasjonstid med mikroglia aktivert ved forskjellige konsentrasjoner av LPS.
Sett co-kultur systemer av LPS-aktiverte N9 microglia og PC12-celler har vist seg åvære spesielt nyttige ved studiet av nevroinflammasjon og i utarbeide strategier for å motvirke den. Vår gruppe nylig viste at LPS-aktiverte mikroglia N9 dyrkes i cellekultur setter oppviser økt transkripsjon av pro-inflammatoriske cytokiner, som i sin tur induserer apoptose av nervevekstfaktor-differensierte PC12-celler ved passering av mikroporene til innsatsen 15, 16. I samme paradigmet, forbehandling av det microglial befolkningen med polyfenolforbindelsen resveratrol (0,1 uM, 3 timer) forhindret transkripsjonen av pro-inflammatoriske cytokiner og således hindret apoptose av differensierte neuronale PC12-celler ved å blokkere kaspase-3 aktivering og, deretter DNA cleavage. En annen gruppe har også demonstrert nervecellene effekter av vitamin E i en N9-PC12 co-kultur 26. I tillegg til N9-PC12 co-kulturer har ulike immortalisert cellelinjer eller primærkulturer også vært ansatt i en kontekst av nevroinflammasjon. For eksempel,murine mikroglia BV2 cellelinje ble ko-dyrket med human neuroblastom SH-SY5Y-celler for å vise den anti-apoptotiske virkning av polyfenolforbindelsen luteolin tilsynelatende mediert av sin anti-inflammatorisk potensiell 17. I tillegg ble det BV2 microglia aktiveres av skadde PC12 celler vist seg å utøve anti-apoptotiske virkninger i stamceller 18. Gjensidig signale ble vist å være viktig i anti-apoptotiske mekanismene bak primære microglia neuroprotection tillagt primærlillehjernen granule nevroner 19. Videre primære hippocampale nerveceller ble ko-dyrket med primær mikroglia aktiveres av utskilt amyloid forløper protein for å evaluere frigivelse av glutamat ved cystein utveksling, og den påfølgende svekkelse av synaptiske funksjon 20. Endelig, en gruppe viste også crosstalk som eksisterer mellom primær hippocampus nevroner og primær microglia knyttet til fractalkine signalering, en chemokin konstitutivt expressed ved nevroner i sentralnervesystemet som har reseptoren er funnet på overflaten av mikroglia 21.
Figur 1. Skjematisk fremstilling av en innsats ko-kultur-system. Det øvre kammer er sammensatt av innsatsen som har en celletype og dens apikale humoral miljø. Det nedre kammer består av en brønn eller skål inneholdende den andre celletype. Innsatsen hviler på kantene av flere brønner vevskultur plate eller tallerken. Innsatsen er laget for å ligge like over bunnen av brønnen slik at du ikke berører populasjon av celler vokser nedenfor. Mediet i det nedre kammeret er i kontakt med både basal overflaten av den første celletype og den apikale overflaten av andre celletype. Klikk her for å se et større version av denne figuren.
Figur 2. microphotographs av N9 microglia. (A) Ubehandlet hviler N9 microglia i inserts viser en ramified cellulær morfologi som tillater dem å aktivt overvåke deres miljø. (B) N9 mikroglia i innsatser behandlet med lipopolysakkarid (LPS) i 24 timer skjerm en amoeboid form som er typisk for den aktiverte fenotype. Denne mikro ble tatt like før du overfører innsatsen inneholder disse aktiverte N9 microglia til brønnene inneholder differensierte PC12-celler som vist i Figur 4. Scale bar = 25 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. microphotographs av differensierte nevronale PC12-celler. Syv-dagers nervevekstfaktor differensiert nevronale PC12 celler viser åpen nevronale fenotyper som lange neurites og åreknuter. Denne mikro ble tatt like før du overfører innleggene inneholder aktiverte N9 microglia som er avbildet i figur 2. Scale bar = 25 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. Cytotoksisk effekt av lipopolysakkarid (LPS)-aktivert mikroglia på differensierte PC12-celler neuronale.N9 mikroglia ble aktivert med forskjellige konsentrasjoner av LPS i 24 timer og så overført til brønner inneholdende differensierte PC12-celler neuronale i 24 timer eller 48 timer. Cytotoksisitet ble evaluert ved anvendelse av en laktatdehydrogenase frigjøringsanalyse utført på supernatanten fra det nedre kammeret. Signifikante forskjeller mellom gruppene ble konstatert ved en-veis analyse av varians, etterfulgt av Tukey post-hoc-analyse med GraphPad INSTAT programmet, versjon 3.06 for Windows (San Diego, CA, www.graphpad.com). Alle data, analysert ved 95% konfidensintervall, er uttrykt som gjennomsnitt ± standardavvik av gjennomsnittet fra 3 uavhengige eksperimenter som ble ansett 6 brønner. Stjernene viser statistiske forskjeller mellom behandling og kontroll tilstand (*** p <0,001). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6. Konsentrasjon av i nterleukin-6 (IL-6) i supernatanten følgende N9 aktivering med lipopolysakkarid (LPS). N9 mikroglia ble aktivert med forskjellige konsentrasjoner av LPS i 24 timer, og deretter overført til brønner inneholdende differensierte PC12-celler neuronale for 24 timer eller 48 timer. IL-6 konsentrasjoner i supernatanten fra det nedre kammeret ble vurdert ved hjelp av en ELISA. Signifikante forskjeller mellom gruppene ble konstatert ved en-veis analyse av varians, etterfulgt av Tukey post-hoc-analyse med GraphPad INSTAT programmet, versjon 3.06 for Windows (San Diego, CA, www.graphpad.com). Alle data, analysert ved 95% konfidensintervall, er uttrykt som gjennomsnitt ± standardavvik av gjennomsnittet fra 3 uavhengige eksperimenter som ble ansett 6 brønner. Stjernene viser statistiske forskjeller mellom behandling og conkontroll tilstand (*** p <0,001, ** p <0,01 og * p <0,05). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7. Konsentrasjon av interferon gamma (IFN-γ) i supernatanten følgende N9 aktivering med lipopolysakkarid (LPS). N9 mikroglia ble aktivert med forskjellige konsentrasjoner av LPS i 24 timer, og deretter overført til brønner inneholdende differensierte PC12-celler neuronale i 24 timer eller 48 timer. IFN-y-konsentrasjoner i supernatanten fra det nedre kammeret ble vurdert ved hjelp av en ELISA. Signifikante forskjeller mellom gruppene ble konstatert ved en-veis analyse av varians, etterfulgt av Tukey post-hoc-analyse med GraphPad INSTAT-programmet, versjon 3.06for Windows (San Diego, CA, www.graphpad.com). Alle data, analysert ved 95% konfidensintervall, er uttrykt som gjennomsnitt ± standardavvik av gjennomsnittet fra 3 uavhengige eksperimenter som ble ansett 6 brønner. Stjernene viser statistiske forskjeller mellom behandling og kontroll tilstand (** p <0,01 og * p <0,05). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 8. Konsentrasjon av tumornekrosefaktor alfa (TNF-α) i supernatanten følgende N9 aktivering med lipopolysakkarid (LPS). N9 mikroglia ble aktivert med forskjellige konsentrasjoner av LPS i 24 timer, og deretter overført til brønner inneholdende differensierte PC12-celler neuronale for 24 timer eller 48 timer. TNF-αkonsentrasjoner i supernatanten av det nedre kammeret ble vurdert ved hjelp av en ELISA. Signifikante forskjeller mellom gruppene ble konstatert ved en-veis analyse av varians, etterfulgt av Tukey post-hoc-analyse med GraphPad INSTAT programmet, versjon 3.06 for Windows (San Diego, CA, www.graphpad.com). Alle data, analysert ved 95% konfidensintervall, er uttrykt som gjennomsnitt ± standardavvik av gjennomsnittet fra 3 uavhengige eksperimenter som ble ansett 6 brønner. Stjernene viser statistiske forskjeller mellom behandling og kontroll tilstand (*** p <0,001). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den mest kritiske trinnet i enhver innsats co-kultur system eksperiment faktisk bor i valg av riktig innsatsen for å bruke. Porestørrelsen og membranmaterialet må tas i grundig betraktning, uten å glemme å ta hensyn til hvilke celler som skal bli podet og hensikten med forsøket. For eksempel kan kjemotaksisk assays bruke samme type membran enn celle ko-kulturer for å analysere celle atferd modulasjoner som induseres av utskilte løselige faktorer i fravær av celle-celle-kontakt. Imidlertid har begge typer forsøk krever forskjellige pore-størrelser: større seg for det tidligere, for å tillate cellemigrering, og små for den sistnevnte, for å utelukke cellemigrering og celle-celle-kontakt. For evaluering av cellulære endringer mediert av utskilte løselige faktorer i fravær av celle-celle kontakt, porestørrelser på 0,4 pm eller 3 um er vanligvis egnet som de gir mulighet for store molekyler, slik som proteiner, for å krysse men forhindre de fleste celler fra å gjøre så. Membranmateriale avhenger i stor grad av celletype og teknikker for å bli brukt ved slutten av cellekulturen protokollen. I korthet PET membraner gir god celle synlighet som de er klare, men er ikke kollagen belegges, som kan være et problem for adherente celler som er nødvendige for bæreren som skal behandles. De har også den beste kjemisk motstand mot fiksativ som, sammen med sine gode optiske egenskaper, som gjør dem ideelle for histologiske studier. På den annen side, PC-membraner har dårlig sikt celle som de er gjennomskinnelige, og er ikke kollagen belagt. Men har de den høyeste tettheten av porene og mest diversifiserte tilgjengeligheten av porestørrelser. Til slutt, PTFE-membraner er klare når den er våt, men bare tillate visualisering av celle skisserer i mikroskopet. Som en stor fordel, de er kollagen belagt, noe som også gjør dem litt tykkere. Det er viktig å merke seg at belegget PET eller PC membran innsatser med kollagen kan blokkere porene og hindrer passasje av oppløselig factors. I alle fall de fleste innsats produsenter tilbyr omfattende guider for å hjelpe forskere med å velge riktig innsatsen. I vår bestemt paradigme, har valg av plating tetthet, media, serumkonsentrasjon, dagene av differensiering, dager med LPS-aktivering, konsentrasjoner av LPS, og belegg av flasker for PC12-celler er optimalisert over år jobbet med disse co-kultur systemer 15 , 16. Verdt å merke seg, plating tettheten av N9 mikroglia i innsatsene ble valgt ved 60.000 ¢ / cm 2 for å oppnå 40-50% konfluens i øyeblikket av påbegynnes ko-kulturen, og dermed for å gi dem plass til å formere seg ved sin aktivering av LPS. Andre tilstander når optimalisert kan også gi tilfredsstillende resultater, for eksempel ved anvendelse av kollagen av L-lysin i kolbene beregnet for native PC12 vedlikehold.
For å øke bærekraften i resultatene, kan flere forskjellige kontroller utføres. Når jeg prøver å bevise at løselige faktorerer ansvarlig for de observerte effektene, bør blandede kulturer manifestert direkte celle-celle kontakt og klimaanlegg mellom eksperimenter gjennomføres parallelt. Videre gjør bruk av antistoffer for å nøytralisere et spesifikt utskilt faktor vil bidra til å identifisere molekylet ansvarlig for den parakrine effekten som blir oppfattet. Når det er mulig, å blokkere en reseptor eller en del av sin signalveien for å finne den nøyaktige identitet av reseptoren blir aktivert. Dersom et molekyl som brukes til å aktivere en cellepopulasjon før ko-kultur eksperiment med en annen celletype, slik som i det eksempel som er beskrevet tidligere, er det viktig å ta hensyn til tilstedeværelsen av molekylet i systemet. Som et første alternativ, bør mediet være helt endres før ko-kultur eksperiment for å sikre at molekylet er fraværende fra systemet helt. Som et andre alternativ, må en tilstand legges der molekylet alene inkuberes med den andre celletype for å kunnebedømme dens virkning i fravær av den første celletype. Hvis det ikke er noen effekt av molekylet på den annen celletype, vil det ikke være noe behov for å endre mediet før ko-kultur eksperiment. Likeledes, hvis begge celletyper som ikke er dyrket på samme cellekulturmedium, tilsvarende forholdsregler må tas for å være sikker på at forskjellene i medium sammensetning påvirker ikke det ene eller det andre cellepopulasjon. Selv om både media vil bli atskilt av innsatsen membranen først, er diffusjon bundet til å sikre at de vil blande over lengre ruge perioder. Dessuten kan det oppstå flere problemer mot avvikende avbrudd av oppløselige faktor-reseptor relasjoner. Blant flere årsaker til feil, kan overdreven bruk av enzymatisk dissosiasjon og tilstedeværelsen av viktige konsentrasjoner av serum interferere med celleoverflatereseptorer. Andre årsaker til feil i innsatsen ko-kultursystemer inkluderer, men er ikke begrenset til 1) feilaktig cellekulturteknikker, slik som fjerning av totaliteten av cellenkulturmedium i for mange brønner på samme tid forårsaker cellene til å tørke, 2) et monolag som er for konfluente i innsatsen, er ansvarlig for tetting av innsatsen membranen og hindre apikalt-utskilte molekyler for å nå det nedre rom, og 3) misadjusted celle samløpet, noe som fører til en over- eller under uttrykk av løselige faktorer som fører til fysiologisk irrelevante resultater eller fravær av noen effekt.
Mens bare en scenario av innsatsen co-kultur ble presentert her, er det mange måter å gjøre bruk av denne svært allsidig teknikk. Her, en celletype ble forbehandlet med et molekyl som er ansvarlig for å indusere sekresjon av et oppløselig faktor som, ved overføring av innsatsen til brønnen, påvirker oppførselen til andre celletype. Det er også mulig å inkubere begge celletyper sammen i en ko-kultursystem før separering av dem for å detektere den økede sårbarheten eller motstanden i den ene eller begge cellepopulasjoner i en bakt behandling. HoWever, når de vurderer sin mest elementære form, kan denne teknikken gjør bruk av to populasjoner av celler inkubert sammen uten behandling, med det mål å vurdere basal parakrint gjensidig signalering.
Den viktigste begrensning av denne teknikken er at svært kortvarig molekylære enheter som reaktive oksygenforbindelser ikke overlever den avstand som skiller den voksende cellepopulasjonen i det øvre kammeret og den i det nedre kammeret 82. Den siste utviklingen i co-kultur teknikker har forsøkt å svare på dette problemet ved å bruke en microfabricated dyrkingssubstratet i stand til å opprettholde to cellepopulasjoner i mikro nærhet 83. I tillegg til å bære alle de fordeler med innsatsen co-dyrkningssystemer, for eksempel populasjon-spesifikk påvisning av endringer og toveis signalering, ble dette microfabricated skjermen også vist for å gjøre mulig påvisning av kortdistanse interaksjoner som ikke var før detectable på grunn av nedbrytning av løselige faktorer enn avstander. Denne cellekultur-plattformen er den nyeste innovasjon i celle co-kultur og lover å hjelpe greie signale mekanismer mellom celler som ble oversett før.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI-1640 medium | Sigma | R8755 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham | Sigma | D6421 | Warm in 37 °C water bath before use, must be supplemented with 0.365 gm/L L-glutamine |
| Horse serum | ATCC | 30-2040 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Fetal bovine serum | MultiCell | 80350 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Nerve Growth Factor-7S from murine submaxillary gland | Sigma | N0513 | Reconstitute the lyophilized powder in a solution of buffered saline or tissue culture medium containing 0.1–1.0% bovine serum albumin or 1-10% serum |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma | T3924 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli 055:B5 | Sigma | L2880 | Toxic |
| Cell culture inserts for use with 24-well plates | BD Falcon | 353095 | 0.4 μm pores |
| 24-well plates | TrueLine | TR5002 | Coat with collagen before use |
| Routine PC12 cell culture medium | Routine N9 cell culture medium | ||
| - 85% RPMI medium | - 90% DMEM-F12 medium | ||
| - 10% heat-inactivated horse serum | - 10% heat-inactivated horse serum | ||
| - 5% heat-inactivated fetal bovine serum | |||
| PC12 differentiation medium | N9 treatment medium | ||
| - 99% RPMI medium | - 99% DMEM-F12 medium | ||
| - 1% heat-inactivated fetal bovine serum | - 1% heat-inactivated fetal bovine serum | ||
| - 50 ng/mL nerve growth factor | |||
| PC12 treatment medium | |||
| - 99% RPMI medium | |||
| - 1% heat-inactivated fetal bovine serum |
References
- Grobstein, C. Morphogenetic interaction between embryonic mouse tissues separated by a membrane filter. Nature. 172 (4384), 869-870 (1953).
- Hoffman, R. A. Intraepithelial lymphocytes coinduce nitric oxide synthase in intestinalepithelial cells. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 278 (6), G886-G894 (2000).
- Zhang, W. C., et al. Regulatory T cells protect fine particulate matter-induced inflammatory responses in human umbilical vein endothelial cells. Mediators Inflamm. 2014, 869148 (2014).
- Vasileiadou, K., et al. alpha1-Acid glycoprotein production in rat dorsal air pouch in response to inflammatory stimuli, dexamethasone and honey bee venom. Exp. Mol. Pathol. 89 (1), 63-71 (2010).
- Talayev, V. Y., et al. The effect of human placenta cytotrophoblast cells on the maturation and T cell stimulating ability of dendritics cells in vitro. Clin. Exp. Immunol. 162 (1), 91-99 (2010).
- Elishmereni, M., et al. Physical interactions between mast cells and eosinophils: a novel mechanism enhancing eosinophil survival in vitro. Allergy. 66 (3), 376-385 (2011).
- Ishihara, Y., et al. Regulation of immunoglobulin G2 production by prostaglandin E(2) and platelet-activating factor. Infect. Immun. 68 (3), 1563-1568 (2000).
- Kranzer, K., Bauer, M., Lipford, G. B., Heeg, K., Wagner, H., Lang, R. CpG-oligodeoxynucleotides enhance T-cell receptor-triggered interferon- gamma production and up-regulation of CD69 via induction of antigen- presenting cell-derived interferon type I and interleukin-12. Immunology. 99 (2), 170-178 (2000).
- Vendetti, S., Chai, J. G., Dyson, J., Simpson, E., Lombardi, G., Lechler, R. Anergic T cells inhibit the antigen-presenting function of dendritic cells. J. Immunol. 165 (3), 1175-1181 (2000).
- Haller, D., Bode, C., Hammes, W. P., Pfeifer, A. M., Schiffrin, E. J., Blum, S. Non-pathogenic bacteria elicit a differential cytokine response by intestinal epithelial cell/leucocyte co-cultures. Gut. 47 (1), 79-87 (2000).
- Dono, M., et al. In vitro stimulation of human tonsillar subepithelial B cells: requirement for interaction with activated T cells. Eur. J. Immunol. 31 (3), 752-756 (2001).
- Yu, Y., et al. Enhancement of human cord blood CD34+ cell-derived NK cell cytotoxicity by dendritic cells. J. Immunol. 166 (3), 1590-1600 (2001).
- Watanabe, T., Tokuyama, S., Yasuda, M., Sasaki, T., Yamamoto, T. Changes of tissue factor-dependent coagulant activity mediated by adhesion between polymorphonuclear leukocytes and endothelial cells. Jpn J. Pharmacol. 86 (4), 399-404 (2001).
- Krampera, M., et al. Bone marrow mesenchymal stem cells inhibit the response of naive and memory antigen-specific T cells to their cognate peptide. Blood. 101 (9), 3722-3729 (2003).
- Bournival, J., Plouffe, M., Renaud, J., Provencher, C., Martinoli, M. G. Quercetin and sesamin protect dopaminergic cells from MPP+-induced neuroinflammation in a microglial (N9)-neuronal (PC12) coculture system. Oxid. Med. Cell. Longev. 2012, 921941 (2012).
- Bureau, G., Longpré, F., Martinoli, M. G. Resveratrol and quercetin, two natural polyphenols, reduce apoptotic neuronal cell death induced by neuroinflammation. J. Neurosci. Res. 86 (2), 403-410 (2008).
- Zhu, L., Bi, W., Lu, D., Zhang, C., Shu, X., Lu, D. Luteolin inhibits SH-SY5Y cell apoptosis through suppression of the nuclear transcription factor-κB, mitogen-activated protein kinase and protein kinase B pathways in lipopolysaccharide-stimulated cocultured BV2 cells. Exp. Ther. Med. 7 (5), 1065-1070 (2014).
- Luo, X., et al. BV2 enhanced the neurotrophic functions of mesenchymal stem cells after being stimulated with injured PC12. Neuroimmunomodulation. 16 (1), 28-34 (2009).
- Polazzi, E., Gianni, T., Contestabile, A. Microglial cells protect cerebellar granule neurons from apoptosis: evidence for reciprocal signaling. Glia. 36 (3), 271-280 (2001).
- Barger, S. W., Basile, A. S. Activation of microglia by secreted amyloid precursor protein evokes release of glutamate by cystine exchange and attenuates synaptic function. J. Neurochem. 76 (3), 846-854 (2001).
- Zujovic, V., Taupin, V. Use of cocultured cell systems to elucidate chemokine-dependent neuronal/microglial interactions: control of microglial activation. Methods. 29 (4), 345-350 (2003).
- Iwashita, M., et al. Valsartan, independently of AT1 receptor or PPARγ, suppresses LPS-induced macrophage activation and improves insulin resistance in cocultured adipocytes. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 302 (3), E286-E296 (2012).
- Oliver, E., et al. Docosahexaenoic acid attenuates macrophage-induced inflammation and improves insulin sensitivity in adipocytes-specific differential effects between LC n-3 PUFA. J. Nutr. Biochem. 23 (9), 1192-1200 (2012).
- Tang, S. Y., Cheah, I. K., Wang, H., Halliwell, B. Notopterygium forbesii Boiss extract and its active constituent phenethyl ferulate attenuate pro-inflammatory responses to lipopolysaccharide in RAW 264.7 macrophages. A "protective" role for oxidative stress. Chem. Res. Toxicol. 22 (8), 1473-1482 (2009).
- De Boer, A. A., Monk, J. M., Robinson, L. E. Docosahexaenoic acid decreases pro-inflammatory mediators in an in vitro murine adipocyte macrophage co-culture model. PLoS One. 9 (1), e85037 (2014).
- Li, Y., Liu, L., Barger, S. W., Mrak, R. E., Griffin, W. S. Vitamin E suppression of microglial activation is neuroprotective. J. Neurosci. Res. 66 (2), 163-170 (2001).
- Brizuela, L., et al. Osteoblast-derived sphingosine 1-phosphate to induce proliferation and confer resistance to therapeutics to bone metastasis-derived prostate cancer cells. Mol. Oncol. 8 (7), 1181-1195 (2014).
- Yuan, L., Chan, G. C., Fung, K. L., Chim, C. S. RANKL expression in myeloma cells is regulated by a network involving RANKL promoter methylation, DNMT1, microRNA and TNFα in the microenvironment. Biochim. Biophys. Acta. 1843, 1834-1838 (2014).
- Krtolica, A., Parrinello, S., Lockett, S., Desprez, P. Y., Campisi, J. Senescent fibroblasts promote epithelial cell growth and tumorigenesis: a link between cancer and aging. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 98 (21), 12072-12077 (2001).
- Lawrenson, K., Grun, B., Benjamin, E., Jacobs, I. J., Dafou, D., Gayther, S. A. Senescent fibroblasts promote neoplastic transformation of partially transformed ovarian epithelial cells in a three-dimensional model of early stage ovarian cancer. Neoplasia. 12 (4), 317-325 (2010).
- Liu, J., et al. BCR-ABL mutants spread resistance to non-mutated cells through a paracrine mechanism. Leukemia. 22 (4), 791-799 (2008).
- Giuliani, N., et al. Proangiogenic properties of human myeloma cells: production of angiopoietin-1 and its potential relationship to myeloma-induced angiogenesis. Blood. 102 (2), 638-645 (2003).
- Gupta, D., et al. Adherence of multiple myeloma cells to bone marrow stromal cells upregulates vascular endothelial growth factor secretion: therapeutic applications. Leukemia. 15 (12), 1950-1961 (2001).
- Anderson, I. C., Mari, S. E., Broderick, R. J., Mari, B. P., Shipp, M. A. The angiogenic factor interleukin 8 is induced in non-small cell lung cancer/pulmonary fibroblast cocultures. Cancer Res. 60 (2), 269-272 (2000).
- Hoechst, B., et al. A new population of myeloid-derived suppressor cells in hepatocellular carcinoma patients induces C4(+)CD25(+)Foxp3(+) T cells. Gastroenterology. 135 (1), 234-243 (2008).
- Karadag, A., Oyajobi, B. O., Apperley, J. F., Russell, R. G., Croucher, P. I. Human myeloma cells promote the production of interleukin 6 by primary human osteoblasts. Br. J. Haematol. 108 (2), 383-390 (2000).
- Garrido, S. M., Appelbaum, F. R., Willman, C. L., Banker, D. E. Acute myeloid leukemia cells are protected from spontaneous and drug- induced apoptosis by direct contact with a human bone marrow stromal cell line (HS-5). Exp. Hematol. 29 (4), 448-457 (2001).
- Heissig, B., Pasternak, G., Horner, S., Schwerdtfeger, R., Rossol, S., Hehlmann, R. CD14+ peripheral blood mononuclear cells from chronic myeloid leukemia and normal donors are inhibitory to short- and long-term cultured colony-forming cells. Leuk. Res. 24 (3), 217-231 (2000).
- Moore, M. B., Kurago, Z. B., Fullenkamp, C. A., Lutz, C. T. Squamous cell carcinoma cells differentially stimulate NK cell effector functions: the role of IL-18. Cancer Immunol Immunother. 52 (2), 107-115 (2003).
- Giuliana, N., et al. Human myeloma cells stimulate the receptor activator of nuclear factor- kappa B ligand (RANKL) in T lymphocytes: a potential role in multiple myeloma bone disease. Blood. 100 (13), 4615-4621 (2002).
- Ye, Z., Haley, S., Gee, A. P., Henslee-Downey, P. J., Lamb, L. S. Jr In vitro interactions between gamma deltaT cells, DC, and CD4+ T cells; implications for the immunotherapy of leukemia. Cytotherapy. 4 (3), 293-304 (2002).
- Zhang, X. M., Xu, Q. Metastatic melanoma cells escape from immunosurveillance through the novel mechanism of releasing nitric oxide to induce dysfunction of immunocytes. Melanoma Res. 11 (6), 559-567 (2001).
- Zhang, M., et al. The differentiation of human adipose-derived stem cells towards a urothelium-like phenotype in vitro and the dynamic temporal changes of related cytokines by both paracrine and autocrine signal regulation. PLoS One. 9 (4), e95583 (2014).
- Qu, C., et al. Chondrogenic differentiation of human pluripotent stem cells in chondrocyte co-culture. Int. J. Biochem. Cell. Biol. 45 (8), 1802-1812 (2013).
- Krassowska, A., et al. Promotion of haematopoietic activity in embryonic stem cells by the aorta-gonad-mesonephros microenvironment. Exp. Cell. Res. 312 (18), 3595-3603 (2006).
- Darcy, K. M., et al. Mammary fibroblasts stimulate growth, alveolar morphogenesis, and functional differentiation of normal rat mammary epithelial cells. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 36 (9), 578-592 (2000).
- Spector, J. A. Co-culture of osteoblasts with immature dural cells causes an increased rate and degree of osteoblast differentiation. Plast. Reconstr. Surg. 109 (2), 631-642 (2002).
- Khanolkar, A., Fu, Z., Underwood, L. J., Bondurant, K. L., Rochford, R., Cannon, M. J. CD4+ T cell-induced differentiation of EBV-transformed lymphoblastoid cells is associated with diminished recognition by EBV-specific CD8+ cytotoxic T cells. J. Immunol. 170 (6), 3187-3194 (2003).
- Fritsch, C. Epimorphin expression in intestinal myofibroblasts induces epithelial morphogenesis. J. Clin. Invest. 110 (11), 1629-1641 (2002).
- Abouelfetouh, A., Kondoh, T., Ehara, K., Kohumra, E. Morphological differentiation of bone marrow stromal cells into neuron-like cells after co-culture with hippocampal slice. Brain Res. 1029 (1), 114-119 (2004).
- Llado, J., Haenggeli, C., Maragakis, N., Snyder, E., Rothstein, J. Neural stem cells protect against glutamate-induced excitotoxicitiy and promote survival of injured motor neurons through the secretion of neurotrophic factors. Mol. Cell. Neurosci. 27 (3), 322-331 (2004).
- Fong, S. P., et al. Trophism of neural progenitor cells to embryonic stem cells: Neural induction and transplantation in a mouse ischemic stroke model. J. Neurosci. Res. 85 (9), 1851-1862 (2007).
- Gordon-Keylock, S. A., et al. Induction of hematopoietic differentiation of mouse embryonic stem cells by an AGM-derived stromal cell line is not further enhanced by overexpression of HOXB4. Stem Cells. 19 (11), 1687-1698 (2010).
- Yang, T., Tsang, K. S., Poon, W. S., Ng, H. K. Neurotrophism of bone marrow stromal cells to embryonic stem cells: noncontact induction and transplantation to a mouse ischemic stroke model. Cell transplant. 18 (4), 391-404 (2009).
- Kim, J. Y., et al. Umbilical cord blood mesenchymal stem cells protect amyloid-β42 neurotoxicity via paracrine. World J. Stem Cells. 4 (11), 110-116 (2012).
- Mauri, M., et al. Mesenchymal stem cells enhance GABAergic transmission in co-cultured hippocampal neurons. Mol. Cell Neurosci. 49 (4), 395-405 (2012).
- Ichikawa, J., et al. Increased crystal-cell interaction in vitro under co-culture of renal tubular cells and adipocytes by in vitro co-culture paracrine systems simulating metabolic syndrome. Urolithiasis. 42 (1), 17-28 (2014).
- Zuo, L., et al. A Paracrine mechanism involving renal tubular cells, adipocytes and macrophages promotes kidney stone formation in a simulated metabolic syndrome environment. J. Urol. 191 (6), 1906-1912 (2014).
- Fan, W., Zheng, J. J., McLaughlin, B. J. An in vitro model of the back of the eye for studying retinal pigment epithelial-choroidal endothelial interactions. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 38 (4), 228-234 (2002).
- Mierke, C. T., Ballmaier, M., Werner, U., Manns, M. P., Welte, K., Bischoff, S. C. Human endothelial cells regulate survival and proliferation of human mast cells. J. Exp. Med. 192 (6), 801-811 (2000).
- Beckner, M. E., Jagannathan, S., Peterson, V. A. Extracellular angio-associated migratory cell protein plays a positive role in angiogenesis and is regulated by astrocytes in coculture. Microvasc. Res. 63 (3), 259-269 (2002).
- Damon, D. H. VSM growth is stimulated in sympathetic neuron/VSM cocultures: role of TGF-beta2 and endothelin. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 278 (2), H404-H411 (2000).
- Anna De Berardinis, M., Ciotti, M. T., Amadoro, G., Galli, C., Calissano, P. Transfer of the apoptotic message in sister cultures of cerebellar neurons. Neuroreport. 12 (10), 2137-2140 (2001).
- Lange-Sperandio, B., Fulda, S., Vandewalle, A., Chevalier, R. L. Macrophages induce apoptosis in proximal tubule cells. Pediatr. Nephrol. 18 (4), 335-341 (2003).
- Vjetrovic, J., Shankaranarayanan, P., Mendoza-Parra, M. A., Gronemeyer, H. Senescence-secreted factors activate Myc and sensitize pretransformed cells to TRAIL-induced apoptosis. Aging Cell. 13 (3), 487-496 (2014).
- Fujiya, A., et al. The role of S100B in the interaction between adipocytes and macrophages. Obesity (Silver Spring). 22 (2), 371-379 (2014).
- Suganami, T., Nishida, J., Ogawa, Y. A paracrine loop between adipocytes and macrophages aggravates inflammatory changes: role of free fatty acids and tumor necrosis factor alpha. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 25 (10), 2062-2068 (2005).
- Yoshida, A., Kitajiri, S., Nakagawa, T., Hashido, K., Inaoka, T., Ito, J. Adipose tissue-derived stromal cells protect hair cells from aminoglycoside. Laryngoscope. 121 (6), 1281-1286 (2011).
- May, L. A., et al. Inner ear supporting cells protect hair cells by secreting HSP70. J. Clin. Invest. 123 (8), 3577-3587 (2013).
- Jarosz, L. M., Deng, D. M., vander Mei, H. C., Crielaard, W., Krom, B. P. Streptococcus mutans competence-stimulating peptide inhibits Candida albicans hypha formation. Eukaryot Cell. 8 (11), 1658-1664 (2009).
- Dagenais, T. R., Giles, S. S., Aimanianda, V., Latgé, J. P., Hull, C. M., Keller, N. P. Aspergillus fumigatus LaeA-mediated phagocytosis is associated with a decreased hydrophobin layer. Infect. Immun. 78 (2), 823-829 (2010).
- Spiliotis, M., Lechner, S., Tappe, D., Scheller, C., Krohne, G., Brehm, K. Transient transfection of Echinococcus multilocularis primary cells and complete in vitro regeneration of metacestode vesicles. Int. J. Parasitol. 38 (8-9), 1025-1039 (2008).
- Scholzen, A., Mittag, D., Rogerson, S. J., Cooke, B. M., Plebanski, M. Plasmodium falciparum-mediated induction of human CD25Foxp3 CD4 T cells is independent of direct TCR stimulation and requires IL-2, IL-10 and TGFbeta. PLoS Pathog. 5 (8), e1000543 (2009).
- Fedoroff, S., Richardson, A. Quantification of Cells in Culture. Protocols for Neural Cell Culture. , 4th ed, Humana. Totowa, NJ. 333-335 (2001).
- Fedoroff, S., Richardson, A. Primary Cultures of Sympathetic Ganglia. Protocols for Neural Cell Culture. , 4th ed, Humana. Totowa, NJ. 88-89 (2001).
- Kreutzberg, G. W. Microglia: a sensor for pathological events in the CNS. Trends Neurosci. 19 (8), 312-318 (1996).
- Hanisch, U. K., Kettenmann, H. Microglia: active sensor and versatile effector cells in the normal and pathologic brain. Nat. Neurosci. 10 (11), 1387-1394 (2007).
- Davalos, D., et al. ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. Nat. Neurosci. 8 (6), 752-758 (2005).
- Block, M. L., Zecca, L., Hong, J. S. Microglia-mediated neurotoxicity: uncovering the molecular mechanisms. Nat. Rev. Neurosci. 8 (1), 57-69 (2007).
- Qureshi, S. T., Larivière, L., Leveque, G., Clermont, S., Moore, K. J., Gros, P., Malo, D. Endotoxin-tolerant mice have mutations in Toll-like receptor 4 (Tlr4). J. Exp. Med. 189, 615-625 (1999).
- Sabroe, I., Jones, E. C., Usher, L. R., Whyte, M. K., Dower, S. K. Toll-like receptor (TLR)2 and TLR4 in human peripheral blood granulocytes: a critical role for monocytes in leukocyte lipopolysaccharide responses. J. Immunol. 168, 4701-4710 (2002).
- Winterbourn, C. C. Reconciling the chemistry and biology of reactive oxygen species. Nat. Chem. Bio. 4 (5), 278-286 (2008).
- Spencer, K. H., Kim, M. Y., Hughes, C. C., Hui, E. E. A screen for short-range paracrine interactions. Integr. Biol. (Camb). 6 (4), 382-387 (2014).
