Introduction
Studiet av vävnader, organ eller system in vitro är ett försök att förenkla mycket komplexa relationer som finns mellan de olika celltyper som utgör flercelliga organismer. Faktum är att i vitro studier gör det möjligt att förvärva en detaljerad förståelse av enkelcellpopulationer. Det finns två stora fördelar med att utföra in vitro-experiment: 1) reducerade cellulära interaktioner, och 2) förmågan att lätt manipulera den cellulära miljön. Därför har dessa två fördelar tillåtna forskare att förutsäga beteendet hos vissa celltyper in vivo, vilket leder till möjligheten att reglera resultatet av yttre influenser i hela organismer. I den meningen fungerar in vitro cellkultur ofta som en bro som förbinder grundforskning och tillämpad biovetenskap. Icke desto mindre finns det också flera nackdelar med att arbeta in vitro, den viktigaste är att en viss reservation får bo i den fysiologiskaal relevans observerade fenotyper. Det är när en enda celltyp odlas i ett kärl, kulturen förlorar, till olika grad, dess cell-cell kontakter med andra celltyper, dess bidrag till den humorala miljön från vävnaden och organism ursprung och ankare inom vävnaden som gjorde det möjligt att upprätthålla en viss tredimensionell struktur ibland avgörande för cellfunktion.
Frågan om cell-cell relationer har behandlats av utvecklingen av blandade odlingstekniker. I denna metod används två eller flera cellpopulationer som odlas tillsammans i samma odlingskärl. Dessa blandade kulturer bär viktiga olägenheter. Å ena sidan har vissa celltyper inte fysiskt interagerar med varandra i vävnaden av ursprung och enbart förlita sig på parakrina kommunikation drabbar utsöndrade lösliga faktorer och närliggande receptorer. Detta är fallet för flera inflammatoriska processer som är beroende av proximala cytokin signalering. I blandade cultures fysiska interaktioner är oundvikliga och gör det omöjligt att studera parakrina kommunikation i avsaknad av cell-cell kontakter som kan ge förändrade resultat. Å andra sidan, att uppnå cellspecifika tolkningar inifrån en blandad befolkning blir omöjligt utan användning av starka separationstekniker som väsentligt kan påverka resultaten.
För att lösa dessa viktiga frågor, har användningen av konditionerat medium utvecklats som en teknik som möjliggör compartmentalized kulturer och studiet av parakrina signalering. Denna metod kräver en överföring av supernatanten från en celltyp, således namnges konditionerat medium, till brunnarna innehållande en annan population av celler. Ännu, är en viktig nackdel att kortlivade molekyler inte överlever tillräckligt länge i det konditionerade mediet som skall överföras till brunnarna i den andra populationen av celler. Även långlivade molekyler kommer att bli mycket utspädd med tiden på grund av diffusion. Vidare både cellpopulationer endast delta i enkelriktad parakrin kommunikation snarare än i aktiv dubbelriktad kommunikation. Detta leder till frånvaro av återkopplingssignaleringen som är avgörande för att återskapa exakta flercelliga relationer som de existerar in vivo.
Som en följd av detta och drivs av behovet att bättre simulera originalet in vivo förhållanden i den cellulära miljön in vitro, har flera framsteg i cellodlingstekniker gjorts under årens lopp. En av de viktigaste framstegen har varit användningen av genomträngliga bärare med mikroporösa membran för compartmentalizing cellkulturer, som används för första gången av Grobstein 1953 1. Sådana genomträngliga stöd har skräddarsytts under åren för att rymma ett stort antal celltyper och användas i flera olika applikationer. Numera dessa bärare existerar som ihåliga insatser som är utformade för att vila i brunnar från en flerkällsvävnadsodlingsplatta eller i circunande rätter. I en samodlingssystemet, innehåller insatsen en celltyp, medan brunnen eller skålen innehåller den andra cellulära populationen, gör det möjligt att studera bidraget från två olika populationer av celler på deras humorala miljön (figur 1). Som ett resultat, är cellulär polaritet (basolaterala vs apikala sekre eller signalmottagning) konserveras, vilket ger insats co-odlingssystem en viktig fördel jämfört med blandade kulturer och konditionerat medium tekniker. Flera typer av membranmaterial är tillgängliga, men de vanligaste är polyester (PET), polykarbonat (PC) eller kollagen-överdragna polytetrafluoreten (PTFE), och de existerar i olika porstorlekar som sträcker sig från 0,4 ^ m till 12,0 | am. Dessa sorter av material och porstorlekar erbjuda ett spektrum av insatser utövar varierande egenskaper som är relevanta för optiska egenskaper, membrantjockleken och cellvidhäftning som gör dem praktiskt på olika nivåer för följande användningar inte begränsat till:
-studerarcelldifferentiering, embryonal utveckling, tumörmetastas och sårläkning genom chemotaxic analyser genom permeabla membran;
-evaluating läkemedelspenetration genom att bedöma deras transport genom epitelceller eller endotelceller monolager odlas på släppliga stöd, och;
-performing cell samkulturer att analysera cellbeteende modulationer inducerade av utsöndrade lösliga faktorer i frånvaro av cell-cellkontakt.
Syftet med denna artikel är att beskriva de allmänna metodologiska riktlinjer för att uppfylla den tredje funktionen som anges ovan, som är att utvärdera cellförändringar som medieras av utsöndrade lösliga faktorer i frånvaro av cell-cell kontakt med en insats samodlingssystemet. Flera olika forskningsområden utnyttja insats co-odlingssystem för att svara på frågor som är relevanta för effekten av utsöndrade lösliga faktorer populationer av celler. Faktum är parakrin signalering som modulerar cellulär beteende på olika nivåer är relevant i alla vävnaderoch system, vilket gör insats co-odlingssystem oumbärlig för att säkerställa framsteg inom dessa områden. Omvänt, är användningen av skär kan bekräfta att signaltransduktion genom direkt cell-cellkontakt och inte genom utsöndrade faktorer. En av de viktigaste användningsområdena för insatser är i inflammations studier 2-14 där effekten av utsöndrade cytokiner utvärderas i olika cellulära spelare av immunitet. I synnerhet har studier av inflammation i centrala nervsystemet (CNS) kraftigt nytta av insats co-kulturstudier, som har gjort det möjligt att bättre definiera olika parakrina roller neuroner och mikroglia driva neuroinflammation 15-21. Dessa system var också utformas för att studera den antiinflammatoriska potentialen av molekyler som är beroende av deras förmåga att reducera eller inhibera sekretion av pro-inflammatoriska faktorer 22-26. Forskning avseende cancer 27-31, i synnerhet de mekanismer som ligger bakom angiogenes 32-34 och inflammatipå 35-42 i tumörbildning, också nytta av insats co-odlingssystem. Dessutom, lösliga faktorer är av största betydelse i de processer som driver differentieringen och flera studier har använt insatser för att svara på frågor i denna speciella fält 43-50. I CNS, ser som nervvävnad har en mycket begränsad förnyelse potential, studiet av neurotrophism och neuroprotektion är grundläggande och har allmänt säkerställs genom användning av stamceller i samarbete odlingssystem 51-56. Dessutom är skär också utnyttjas i så skilda områden som Nephrology 57,58, endotelceller interaktioner och angiogenes 59-62, apoptos signalering 63-65, inflammation i fetma och metabola syndromet 22,23,66-67, innerörat hår cellskyddet 68,69, och även i svamp virulens 70,71 och parasitologi 72,73.
Den här artikeln innehåller allmänna metodologiska riktlinjer för att inrätta en experiment med hänsyn till utvärdering av cellförändringar som medieras av utsöndrade lösliga faktorer som använder en insats samodlingssystemet. Framför allt kommer vi att fokusera vår uppmärksamhet på nervcells co-kulturer och deras användning i att studera neuro process. Med tanke på den mycket brett spektrum av experiment som infogar göra det möjligt att piloten, är det outhärdligt att täcka varje aspekt av denna cellodlingsteknik. Som ett exempel, att ett särskilt protokoll mäta effekterna av cytokiner som utsöndras av lipopolysackarid (LPS) -activated N9 mikroglia på neuronala PC12-celler kommer att presenteras, som erbjuder en konkret förståelse av insats samodling metodik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NB: Vart och ett av följande steg bör utföras under sterila betingelser i ett dragskåp med laminärt flöde som krävs för däggdjurscellkultur. Dessutom de allmänna riktlinjerna för optimal steril cellodling tillämpas, till exempel., Kasta tips helst de kan leda till korskontaminering, minska mängden tids celler utsätts för luft när de utför hela medie förändringar ordentligt men försiktigt under omrörning cellsuspensioner för att säkerställa deras homogen pipettering, etc. Dessutom skär är ett slags plasten som kräver särskild hantering. Först när skär manipuleras, undvik att röra den bräckliga membran, som tårar enkelt och kan därför äventyra försöket. Dessutom är det inte lämpligt att utföra vakuumaspiration av cellodlingsmediet, eftersom det finns en risk för att perforera membranet eller dissociera vidhäftande celler. Därefter skär hänga löst i multibrunnvävnadskulturplatta och sålunda måste försiktighet iakttas när moving det plasten eller vid pipettering för att undvika dissociera vidhäftande celler. Dessutom när man använder skär med stora porstorlekar, finns det en möjlighet att cellodlingsmediet sipprar genom membranet och därför är det viktigt att hela tiden övervaka nivån av vätska. Slutligen, notera att följande protokoll är utformad för vidhäftande celler och kräver mindre ändringar i syfte att vara lämplig för suspensionsceller.
1. Allmänna riktlinjer för genomförande av insats samodling experiment
- Sådd celltyp # 1 i insatser
- Packa skären från deras förpackningar.
- Placera insatserna i en tom flerkällsvävnadsodlingsplatta av rätt dimension. För att göra detta, ta tag i översta kanten av insatsen med hjälp av pincett.
- För att förbättra vidhäftning och spridning av vidhäftande celler, fukta skär med cellodlingsmedium före sådd. För att göra detta, täcker hela ytan av membranet med cellodlings medium med en mikropipett.
OBS: Gör detta för så många insatser som krävs. - Sätt tillbaka locket på plattan och inkubera under åtminstone 1 h eller O / N under samma förhållanden (vanligtvis 37 ° C, 5 till 10% CO2).
- När skären konditioneras, ta bort alla cellodlingsmediet med användning av en mikropipett. Kassera den använda mediet.
- Frö celltyp # 1 med färskt cellodlingsmedium på samma sätt som i en flerkällsplatta. För att göra detta, dra en lämplig volym av cellsuspensionen med en mikropipett och fördela vätskan i insatsen.
OBS: Förbered så många insatser som krävs. - Efter sådd alla skären, försiktigt vicka plattan åt vänster och höger, sedan fram och tillbaka för att fördela cellerna jämnt. Undvik att göra cirkelrörelser, eftersom detta kommer att leda till att cellerna ansamlas i mitten av skären.
- Placera locket på plattan och inkubera som specificerats enligt cellulära krav (vanligtvis 37 ° C, 5-10% CO
- Sådd celltyp # 2 i multibrunnvävnadsodlingsplattor
- Seed celltyp # 2 i färskt cellodlingsmedium enligt avsnitt 1.
- Förbereda så många brunnar som krävs för antalet skär. Rock plattan som i steg 1.1.7) för att säkerställa att cellerna är jämnt fördelade i brunnarna.
- Placera locket på plattan och inkubera under samma förhållanden (vanligtvis 37 ° C, 5 till 10% CO2).
- Uppfriskande medium i skär
- Med användning av en mikropipett, avlägsna en del av eller hela cellkulturmediet, i skären innehållande celltyp # 1. Kassera den använda mediet.
- Rita en lämplig volym av färskt cellodlingsmedium. vila försiktigt spetsen på den inre väggen hos insatsen och långsamt dosera cellodlingsmediet.
- Placera locket på plattan och inkubera enligt steg 1.1.4.
- Uppfriskande medium i multibrunnvävnadsodlingsplattor
- Med användning av en micropiPette, avlägsna en del eller allt av cellodlingsmediet i brunnarna innehållande celltyp # 2. Kassera den använda mediet.
- Rita en lämplig volym av färskt cellodlingsmedium. Vila spetsen på den inre väggen av brunnen och sakta dispensera cellodlingsmediet.
- Placera locket på plattan och inkubera enligt tidigare fastställda cellodlingsprotokoll.
- Överföring skär innehållande celltyp # 1 till flerbrunnsvävnadsodlingsplattor innehållande celltyp # 2.
OBS: Utför detta steg när båda celltyperna har nått lämplig tillväxtfas.- Före överföring av insatserna i brunnar, gör nödvändiga medel förändringar, såsom tidigare beskrivits i steg 1,3) och 1,4).
OBS: Vid denna punkt, är det viktigt att dispensera de lämpliga volymer av media i båda avdelningarna såsom specificeras av insatsen tillverkarens instruktioner. - Med hjälp av pincett, gripa den översta kanten av en insats som innehåller cell tYP # 1 och försiktigt placera den i lämpliga väl innehållande celltyp # 2.
- Efter överföring alla skär, kontrollerar förekomsten av luftbubblor under membranet av skären.
OBS: Luftbubblor förhindrar varje utbyte över membranet av insatsen och kan äventyra hela experimentet. - Om luftbubblor är närvarande, mycket försiktigt lyfta insatsen från brunnen med hjälp av pincett och störta tillbaka in i cellodlingsmediet. Bubblorna försvinner. Om de fortfarande finns kvar, prova flacka skären tillbaka till cellodlingsmediet i en vinkel.
OBS: Slå inte på eller rör insatser för att undvika dissociera vidhäftande celler. - Efter att alla luftbubblor och kontrollera att de volymer av media i båda avdelningarna, placera locket på plattan och inkubera.
- Före överföring av insatserna i brunnar, gör nödvändiga medel förändringar, såsom tidigare beskrivits i steg 1,3) och 1,4).
- Uppfriskande medier i en co-kultur-system
OBS: Även om membranet tillåter lätt media utbyte mellan insats och väl, uppfriskande mediet sker ibåda facken sedan den tid som krävs för att nå jämvikt i de övre och nedre facken genom diffusion ensam kan vara ganska lång.- Uppfriskande medium i skär innehållande celltyp # 1 görs på samma sätt som i steg 1.3).
- Att uppdatera mediet i brunnar innehållande celltyp # 2, skjut försiktigt insatsen åt sidan för att skapa ett utrymme bred nog att rymma en pipettspets. Uppdatera mediet som i steg 1,4).
- Kontrollera om det finns luftbubblor och kontrollera volymer per steg 1.5.3) genom 1.5.5).
2. Exempel: mäta effekterna av cytokiner som utsöndras av LPS-aktiverade N9 mikroglia på neuronala PC12-celler
OBS! Följande steg är avsedda för specifika kolv väl och skålstorlekar. Däremot kan protokollet anpassas för eventuella plasten dimensioner. För media och sammansättning se Material tabell.
- Sådd och differentierande PC12-celler i multibrunnars vävnadsodlingsplattor
- Varm rutin PC12-cellkulturmedium, PC12 differentieringsmedium och trypsin-EDTA i en 37 ° C vattenbad.
- Använd PC12-celler vid 60-80% konfluens från en 75 cm 2 kolv.
- Med en 15 mm pasteurpipett, utföra vakuumaspiration av hela cellkulturmediet i kolven.
- Skölj försiktigt cellmonoskiktet med 5 ml steril fosfatbuffrad saltlösning och avlägsna vätskan med en Pasteur-pipett. Var noga med att inte skilja celler i detta steg.
- Täcka cellmonoskiktet med 3 ml trypsin-EDTA och inkubera i 2-3 min vid 37 ° C.
- Säkerställa att alla cellerna lossnat under ett mikroskop. Om mycket få celler är flytande, inkubera under en längre period för högst fem minuter.
- Tillsätt 10 ml av rutin PC12 cellodlingsmedium i syfte att inaktivera trypsin-EDTA.
- Med en 10 ml pipett försiktigt mal sönder samtidigt se till att de flesta celler skiljas från botten of kolven. Undvika att skapa luftbubblor i cellsuspension.
- Med samma 10 ml pipett, överför cellsuspensionen i ett 50 ml centrifugrör.
- Centrifugera under 1 min vid 3200 xg
- Kassera supernatanten med en pasteurpipett samtidigt noga med att inte störa pelleten.
- Tillsätt 10 ml av rutin PC12 cellodlingsmedium med en 10 ml pipett.
OBS: Denna volym kan justeras om pelleten är ovanligt liten eller stor. - Triturera med samma 10 ml pipett för att homogenisera pelleten. PC12-celler klumpar ofta ihop så åtminstone 20 pipettera upp och downare nödvändigt.
OBS: Även om kraftig finfördelning är nödvändig, undvika att skapa luftbubblor i cellsuspensionen. - I en 1,5 ml rör, förbereda en lämplig utspädning av cellsuspensionen i trypanblått. Räkna cellerna med hjälp av en hemocytometer enligt tidigare fastställda protokoll 74.
- I en separat 50 ml rör, delbart cellsuspensionenmed PC12 differentieringsmedium för att erhålla en utspädd cellsuspension lämplig för sådd brunnar från en platta med 24 brunnar (30.000 ¢ / cm 2, 0,6 ml per brunn enligt tillverkarens protokoll).
OBS! 24-brunnar måste tidigare belagts med kollagen som specificerats tidigare etablerade protokoll 75. - Fördela 0,6 ml av cellsuspensionen per brunn med användning av en mikropipett.
- När alla brunnar sås, vagga plattan som i steg 1.1.7).
- För att möjliggöra en korrekt differentiering av PC12-celler, inkubera 24 brunnar under 7-9 dagar vid 37 ° C i en 5% CO2 fuktig atmosfär i PC12 differentieringsmedium 15,16 innan du utför co-kultur experiment.
- Utför medel förändringar varannan dag genom att ta bort hälften av vätskan och ersätta den med en lika stor volym färskt PC12 differentieringsmedium.
- Sådd N9 mikroglia i skären och behandling med LPS
- En dag innan du utför co-kultur experiment förbehandla PTFE 0,4 um porer skär med rutin N9 cellodlingsmedium för att optimera cell vidhäftning efter steg 1.1.1) till 1.1.4)
- Varm rutin N9 cellodlingsmedium och trypsin-EDTA i en 37 ° C vattenbad.
- Under tiden, väger ca 10 mg LPS i ett 1,5 ml rör för senare användning.
OBS: Eftersom LPS är en potent pro-inflammatoriska endotoxin och kräver särskilda säkerhetsåtgärder, glasögon, handskar, och en partikel andningsskydd rekommenderas starkt. - Använd N9 celler vid 80-90% konfluens från en 75 cm 2 kolv.
- Följ steg 2.1.3) till 2.1.14). alltid använda rutin N9 cellodlingsmedium i stället för rutin PC12 cellodlingsmediet. Observera också att N9 mikroglia inte klumpar ihop så mycket som PC12-celler gör, så färre pipettera upp och ner kan vara nödvändigt i steg 2.1.13).
- I en separat 50 ml rör, dela cellsuspensionen med N9 cellodlingsmedium till obtain en utspädd cellsuspension lämplig för sådd skär utformade att hålla i 24-brunnsplattor (60000 ¢ / cm 2, 0,05 ml per skär enligt tillverkarens protokoll, för membranytarea se tillverkarens information).
OBS: Dessa skär är redan belagda med kollagen av tillverkaren och är optimerade för celladhesion. - Fördela 0,05 ml av cellsuspensionen per skär med användning av en mikropipett.
- När alla insatser är seedade, vagga plattan som i steg 1.1.7).
- Utföra seriella spädningar av LPS med hjälp N9 behandlingsmedium för erhållande av 4 mikrogram / ml, 2 | ig / ml och 1 | ig / ml arbetslösningar.
- Pipettera 0,05 ml av 4 | ig / ml arbetslösning i en uppsättningen av skär för att ge en slutlig spädning av 2 | ig / ml.
- Upprepa steg 2.2.10) för de andra två arbetslösningar i olika uppsättningar skär, vilket ger slut utspädningar av 1 mikrogram / ml och 0,5 mikrogram / ml.
- Icubate de plattor som innehöll de skär för 24 timmar vid 37 ° C i en 5% CO2 fuktig atmosfär för att möjliggöra N9 mikroglia aktivering med LPS innan du utför sam-kulturexperiment.
- Samodling neuronala PC12-celler med N9 mikroglia
- Vid 7-9 dagar att differentiera PC12-celler, aktivera N9 mikroglia efter 24 h inkubation med LPS av varm N9 behandlingsmedium och PC12 behandlingsmedium i en 37 ° C vattenbad.
- Gör en total medel förändring för N9 mikroglia som i steg 1,3), ersätta hela använda mediet med 0,1 ml N9 behandlingsmediet. Gör detta för varje insert.This är nödvändigt att ta bort alla spår av LPS, vilket innebär att endast aktiverade N9 mikroglia i insatserna.
- Utföra en total mediumbyte för neuronala PC12-celler som i steg 1,4). Överföra skären in i de 24-brunnars plattor som i steg 1,5) .Incubate de N9-PC12 samkulturer under 24 h eller 48 h vid 37 ° C i en 5% CO2 fuktig atmosfär.
- efter 24h eller 48 h, skörda supernatanten och / eller cellerna under cytotoxicitet, enzymkopplad immunabsorberande analys (ELISA), Western blöt, eller andra analyser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Användningen av skär co-odlingssystem är särskilt relevant i studien av neuroinflammatoriska processer som demonstrerar parakrina relationer mellan olika cellulära spelare i CNS. Immunitet i CNS främst åstadkommas genom bosatta celler som kallas mikroglia som övervakar deras miljö i sin vilande förgrenad tillstånd (figur 2A) och är kapabla att sensor störningar som kunde besvära mycket dyrbara homeostas nödvändig för korrekt neuronal funktion 76-78. Microglial aktivering, som kännetecknas av att anta en amöboid form (figur 2B) och förökningen av cellpopulationen benämns microgliosis (Figur 3), följt av frisättning av pro-inflammatoriska mediatorer, såsom cytokiner, utgör den främsta aspekten av neuroinflammation 79 . Cytokinfrisättning tjänar ädelt syfte att skydda neuroner mot skadliga angrepp och är closely övervakas. Men när neuroinflammation undgår denna strikt kontroll, antar det en destruktiv karaktär och kan allvarligt skada CNS. Eftersom neurala vävnader har en mycket begränsad förnyelsepotential, är CNS desto mer mottagliga för sådana auto-destruktiva inflammatoriska svar. Studera överhörning fastslagit att mellan nervceller och mikroglia är viktigt att belysa bakomliggande mekanismerna för neuroinflammationen. Till skillnad från blandade kulturer, infoga co-odlingssystem möjliggör utredaren att identifiera vilken cell population genererar toxiska effekter och som man påverkas.
Här, PC12-celler differentierade för 7-9 dagar med nervtillväxtfaktor samodlades med LPS-aktiverade N9 mikroglia med målet att quantifyingthe skadliga effekterna av inflammations härrörande lösliga faktorer på nervceller. För att göra detta, var neuronala PC12-celler odlas i 24-brunnsplattor medan N9 mikroglia såddes i insatser. N9 microglien behandlades under 24 h med LPS, en mycket potent proinflammatorisk endotoxin innefattade i de yttre membranen av gramnegativa bakterier. LPS är känt för att aktivera Toll-like receptors 4 sålunda framkalla ett robust inflammatoriskt svar i ett brett utbud av immuneffektorceller, inklusive den immortaliserade murina cellinjen N9 mikroglia 80,81. Följande representativa resultat visar att N9 mikroglia aktiverade med LPS har en tendens att öka deras populationen (figur 3) och att utsöndra lösliga pro-inflammatoriska cytokiner, såsom interleukin-6 (IL-6), interferon-gamma (IFN-γ) och tumörnekrosfaktor alfa (TNF-α), som lätt korsar membranet i samodlingen skär och orsaka cytotoxisk skada på neuronala PC12-celler som växer i den undre avdelningen.
Den främsta oro innan överföring av LPS-aktiverade N9 mikroglia till brunnarna innehållande neuronala PC12-celler består i att bekräfta that PC12 är korrekt differentierad. Sju dagar differentierade PC12-celler bör uppvisa uppenbara neuronala fenotyper såsom en flackare cellkroppen, som skjuter ut flera långa neuriter ibland själva visar varicosities (Figur 4). När denna kontrollpunkt utförs kan N9 mikroglia skär innehållande färskt medium saknar LPS överföras till brunnarna innehållande differentierade PC12. Efter en inkubationstid på 24 h eller 48 h, supematanten i det nedre utrymmet skördas och en cytotoxicitetsanalys, baserad på laktatdehydrogenas frisättning 15,16, samt en ELISA 15, för att mäta cytokiner utförs. Det är viktigt att skörda supernatanten i det nedre utrymmet för att mäta de cytokiner som faktiskt har passerat det permeabla membranet och som kan aktivera receptorer på ytan av PC12-celler. Resultat visar att LPS-aktiverade N9 mikroglia från den övre avdelningen generera ett dos- och tidsberoende cytotoxic effekt på differentierade neuronala PC12-celler som i den undre avdelningen (Figur 5). 0,5 mikrogram / ml LPS tillstånd är dock inte signifikant cytotoxisk vid 24 timmar eller 48 timmar. Nivåer av cytotoxicitet befanns uppgå till nästan 100% under 2 | j, g / ml LPS 48 hr skick. Dessutom visar resultaten att koncentrationen av pro-inflammatoriska cytokiner IL-6, IFN-y och TNF-a i supernatanten ökar samtidigt med observerad cytotoxicitet. Specifikt är IL-6-koncentrationer ökade signifikant efter 24 tim bara för 2 | j, g / ml villkor, medan 1 ^ g / ml av LPS också utbyten signifikant förhöjda nivåer av cytokinen efter 48 h (fig 6). Mikroglia utsöndrar IFN-γ som når det nedre utrymmet i en signifikant ökad sätt, när de behandlas med 1 | ig / ml och 2 ug / ml, och inkuberas med differentierade neuronala PC12-celler för antingen 24 h eller 48 h (figur 7). Den 0,5 ^ g / mlLPS tillstånd återigen ökar inte IFN-y nivåer betydligt. Slutligen var TNF-a-koncentrationer i den undre avdelningen kvantifieras genom ELISA och befanns vara den mest ökas genom LPS aktivering av mikroglia, når nivåer nästan sju gånger viktigare än kontroll tillstånd (figur 8). I synnerhet presenteras i båda 24 tim och 48 tim inkubationsperioder orsakade betydande ökningar av TNF-α nivåer i supernatanten. Emellertid gav en ^ g / ml LPS tillstånd en betydande ökning av TNF-α nivåer endast efter 48 h. Som helhet visar dessa resultat att utsöndrade proinflammatoriska cytokiner är åtminstone delvis ansvarig för de cytotoxiska effekter som observerats i differentierade neuronala PC12-celler efter en 24 h eller 48 h inkubationsperiod med mikroglia aktiveras av olika koncentrationer av LPS.
Sätt co-odlingssystem av LPS-aktiverade N9 mikroglia och PC12-celler har visat sigvara särskilt användbar i studiet av neuroinflammation och utarbeta strategier för att motverka den. Vår grupp visade nyligen att LPS-aktiverade N9 mikroglia odlas i cellkultur infogas uppvisar ökad transkription av pro-inflammatoriska cytokiner, som i sin tur framkallar apoptos av nervtillväxtfaktor-differentierade PC12-celler genom att korsa mikroporerna hos insatsen 15, 16. I samma paradigm, förbehandling av microglial populationen med polyfenoliska föreningen resveratrol (0,1 ^ M, 3 h) förhindrade transkriptionen av pro-inflammatoriska cytokiner och därmed hindras apoptos av differentierade neuronala PC12-celler genom att blockera kaspas-3-aktivering, och därefter , DNA-klyvning. En annan grupp har också visat de neuroprotektiva effekterna av vitamin E i en N9-PC12 co-kultur 26. Förutom N9-PC12 co-kulturer har olika odödliggjorda cellinjer eller primära kulturer också använts inom ramen för neuroinflammation. Till exempel, denmurina mikroglia BV2 cellinjen var samodlade med humant neuroblastom SH-SY5Y-celler för att visa den anti-apoptotiska effekten av poly-fenol luteolin synes medieras av dess antiinflammatoriska potential 17. Som väl var BV2 mikroglia aktiveras av skadade PC12-celler visat sig ha anti-apoptotiska effekter i mesenkymala stamceller 18. Ömsesidiga signalering visade sig vara viktigt i anti-apoptotiska mekanismer underliggande primära mikroglia neuroprotektion tilldelats primära cerebellära granulära neuroner 19. Dessutom primära hippocampus neuroner samodlades med primär mikroglia aktiveras av utsöndrat amyloidprekursorprotein för att utvärdera frisättningen av glutamat genom cystein utbyte och den efterföljande försvagning av synapserna 20. Slutligen, en grupp visade också överhörningen som existerar mellan primära hippocampus nervceller och primära mikroglia rör fraktalkin signalering, en kemokin konstitutivt Expressed av neuroner i CNS vars receptorn påträffas på ytan av mikroglia 21.
Figur 1. Schematisk representation av ett skär samodlingssystemet. Det övre facket är sammansatt av insatsen som håller en celltyp och dess apikala humorala miljön. Det nedre utrymmet består av en brunn eller skål innehållande den andra celltypen. Skäret vilar på kanterna av den flerkällsvävnadsodlingsplatta eller fat. Insatsen är utformad för att ligga strax ovanför botten av brunnen för att inte röra den population av celler växer nedan. Mediet i den undre avdelningen är i kontakt med både den basala ytan av den första celltypen och den apikala ytan av den andra celltypen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. mikrofotografier av N9 mikroglia. (A) Obehandlad vilande N9 mikroglia i skär uppvisar en förgrenad cellulär morfologi ger dem möjlighet att aktivt övervaka sin omgivning. (B) N9 mikroglia i skär behandlade med lipopolysackarid (LPS) under 24 h display en amöboid form typisk för den aktiverade fenotypen. Denna mikro togs precis innan du överför insatsen innehåller dessa aktiverade N9 mikroglia till brunnarna innehållande differentierade PC12-celler som visas i figur 4. Skalstreck = 25 pm. Klicka god här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. mikrofotografier av differentierade neuronala PC12-celler. Sju dagar nervtillväxtfaktor differentierade neuronala PC12-celler visar uppenbara neuronala fenotyper såsom långa neuriter och varicosities. Denna mikro togs precis innan överföring skären innehåller aktiverade N9 mikroglia som avbildas i figur 2. Skalstreck = 25 pm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Cytotoxisk effekt av lipopolysackarid (LPS) -activated mikroglia på differentierade neuronala PC12-celler.N9 mikroglia aktiverades med olika koncentrationer av LPS i 24 h, överfördes sedan till brunnar innehållande differentierade neuronala PC12-celler för 24 h eller 48 h. Cytotoxicitet utvärderades med användning av ett laktatdehydrogenas frisättningsanalys utfördes på supernatanten av den undre avdelningen. Signifikanta skillnader mellan grupperna har kontrollerat envägs variansanalys, följt av Tukeys post-hoc-analys med GraphPad Instat programmet, version 3,06 för Windows (San Diego, CA; www.graphpad.com). Alla data, som analyserades vid 95% konfidensintervall, är uttryckta som medelvärde ± standardfel för medelvärdet från 3 oberoende experiment, i vilka 6 brunnar betraktades. Asterisker indikerar statistiska skillnader mellan behandling och kontroll tillstånd (*** p <0,001). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6. Koncentration av i nterleukin-6 (IL-6) i supernatanten efter N9 aktivering av lipopolysackarid (LPS). N9 mikroglia aktiverades med olika koncentrationer av LPS under 24 timmar, och sedan överföras till brunnar innehållande differentierade neuronala PC12-celler för 24 h eller 48 h. IL-6-halter i supernatanten av den undre avdelningen bedömdes med hjälp av en ELISA. Signifikanta skillnader mellan grupperna har kontrollerat envägs variansanalys, följt av Tukeys post-hoc-analys med GraphPad Instat programmet, version 3,06 för Windows (San Diego, CA; www.graphpad.com). Alla data, som analyserades vid 95% konfidensintervall, är uttryckta som medelvärde ± standardfel för medelvärdet från 3 oberoende experiment, i vilka 6 brunnar betraktades. Asterisker indikerar statistiska skillnader mellan behandling och konkontroll tillstånd (*** p <0,001, ** p <0,01 och * p <0,05). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7. Koncentration av interferon-gamma (IFN-γ) i supernatanten efter N9 aktivering genom lipopolysackarid (LPS). N9 mikroglia aktiverades med olika koncentrationer av LPS under 24 timmar, och överförs sedan till brunnar innehållande differentierade neuronala PC12-celler under 24 h eller 48 tim. IFN-y-koncentrationer i supernatanten av den undre avdelningen bedömdes med hjälp av en ELISA. Signifikanta skillnader mellan grupperna konstaterades genom envägs variansanalys, följt av Tukeys post hoc-analys med GraphPad Instat programmet, version 3.06för Windows (San Diego, CA; www.graphpad.com). Alla data, som analyserades vid 95% konfidensintervall, är uttryckta som medelvärde ± standardfel för medelvärdet från 3 oberoende experiment, i vilka 6 brunnar betraktades. Asterisker indikerar statistiska skillnader mellan behandling och kontroll tillstånd (** p <0,01 och * p <0,05). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 8. Koncentration av tumömekrosfaktor alfa (TNF-α) i supernatanten efter N9 aktivering genom lipopolysackarid (LPS). N9 mikroglia aktiverades med olika koncentrationer av LPS under 24 timmar, och överförs sedan till brunnar innehållande differentierade neuronala PC12-celler för 24 timmar eller 48 timmar. TNF-αkoncentrationer i supernatanten av den undre avdelningen bedömdes med hjälp av en ELISA. Signifikanta skillnader mellan grupperna har kontrollerat envägs variansanalys, följt av Tukeys post-hoc-analys med GraphPad Instat programmet, version 3,06 för Windows (San Diego, CA; www.graphpad.com). Alla data, som analyserades vid 95% konfidensintervall, är uttryckta som medelvärde ± standardfel för medelvärdet från 3 oberoende experiment, i vilka 6 brunnar betraktades. Asterisker indikerar statistiska skillnader mellan behandling och kontroll tillstånd (*** p <0,001). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det mest kritiska steget i någon insert samodlingssystemet experiment faktiskt bor i att välja den korrekta insatsen att använda. Porstorlek och membranmaterialet måste tas till utförlig redogörelse, utan att glömma att överväga vilken typ av celler som kommer seedas och syftet med försöket. Exempelvis kan chemotaxic analyser använda samma typ av membran än cell samkulturer att analysera cellbeteende modulationer inducerade av utsöndrade lösliga faktorer i frånvaro av cell-cellkontakt. Emellertid båda typerna av experiment kräver olika porstorlekar: större för den förstnämnda, för att tillåta cellmigrering, och mindre för den senare, för att förhindra cellmigrering och cell-cellkontakt. För utvärderingen av cellulära förändringar medierade av utsöndrade lösliga faktorer i frånvaro av cell-cellkontakt, porstorlekar av 0,4 pm eller 3 ^ m är vanligtvis lämpliga eftersom de möjliggör för stora molekyler, såsom proteiner, att passera men hindrar de flesta celler från att göra så. Membranmaterialet beror till stor del på celltypen och de tekniker som skall användas vid slutet av cellodlings-protokollet. I korthet, PET membran erbjuder bra cell sikt eftersom de är tydliga men inte kollagen belagda, som kan vara ett problem för vidhäftande celler som krävs för det stöd som skall behandlas. De har också den bästa kemisk resistens mot fixerings att tillsammans med sina goda optiska egenskaper, gör dem idealiska för histologiska studier. Å andra sidan, PC-membran erbjuder dålig cell synlighet eftersom de är genomskinliga och är inte kollagen beläggas. Emellertid de besitter den högsta tätheten av porer och den mest diversifierade tillgängligheten av porstorlekar. Slutligen, PTFE membran är tydliga när det är vått, men bara tillåta visualisering av cell beskrivs i mikroskopet. Som en stor fördel, de kollagenbelagda, vilket också gör dem lite tjockare. Det är viktigt att notera att belägga PET eller PC membraninsatser med kollagen kan täppa till porerna och hindra passage av lösliga factors. I vilket fall som helst, de flesta insats tillverkare erbjuder heltäckande guider för att hjälpa forskare att välja rätt insatsen. I vår särskilda paradigm har val av bordläggningen densitet, media, serumkoncentrationen, dagar av differentiering, dagar av LPS aktivering koncentrationer av LPS, och beläggning av flaskor för PC12-celler har optimerats under åren att arbeta med dessa co-odlingssystem 15 , 16. Anmärkningsvärt, var plätering täthet av N9 mikroglia i skären vald 60000 ¢ / cm 2 för att erhålla 40-50% konfluens vid tidpunkten för påbörjandet av den co-kultur och sålunda för att ge dem utrymme att föröka på deras aktivering genom LPS. Övriga villkor när optimerade kan också ge tillfredsställande resultat, såsom att ersätta kollagen med L-lysin i kolvarna avsedda för infödda PC12 underhåll.
För att öka hållbarheten av resultaten kan flera olika kontroller utföras. När man försöker att bevisa att lösliga faktorerär ansvarig för de observerade effekterna bör blandade kulturer manifesterar direkt cell-cellkontakt och konditionerat medium experiment parallellt. Dessutom, för att göra användning av antikroppar neutralisera en specifik utsöndras faktor kommer att bidra till att identifiera molekylen som ansvarar för parakrina effekten som uppfattas. När det är möjligt, blockera en receptor eller en del av dess signalväg för att peka ut den exakta identiteten för receptorn att aktiveras. Om en molekyl används för att aktivera en cellpopulation före samodling experiment med en andra celltyp, såsom i exemplet som beskrivits tidigare, är det viktigt att ta hänsyn till huruvida det av molekylen i systemet. Som ett första alternativ bör mediet vara helt ändras innan samodling experiment i syfte att säkerställa att molekylen är frånvarande från systemet helt och hållet. Som ett andra alternativ, bör ett villkor tillsättas då molekylen ensam inkuberas med den andra celltypen för attbedöma dess effekt i frånvaro av den första celltypen. Om det inte finns någon effekt av molekylen på den andra celltypen, kommer det att finnas något behov av att ändra medium innan samodling experiment. Likaså om båda celltyperna inte odlas i samma cell odlingsmedium, liknande försiktighetsåtgärder måste vidtas för att se till att skillnaderna i medel sammansättning inte påverkar den ena eller andra cellpopulationen. Även om båda medierna kommer att separeras av insatsen membranet vid första, är diffusion skyldig att se till att de kommer att blanda över längre inkubationsperioder. Dessutom kan flera problem uppstå från avvikande störningar av lösliga faktor-receptorrelationer. Bland flera orsaker till fel, kan den överdrivna användningen av enzymatisk dissociation och förekomsten av koncentrationerna av serum störa cellytereceptorer. Andra orsaker till fel i insats co-odlingssystem innefattar, men är inte begränsade till 1) felaktig cellodlingstekniker, såsom att ta bort samtliga cellodlingsmedium i alltför många brunnar samtidigt orsakar celler för att torka, 2) ett monoskikt som är alltför sammanflytande i insatsen, som ansvarar för tätning av insatsen membranet och förhindra apikalt-utsöndrade molekyler att nå den undre avdelningen, och 3) feljusterad cell sammanflödet, vilket orsakar en över- eller underuttryck av lösliga faktorer som leder till fysiologiskt irrelevanta resultat eller frånvaro av någon effekt.
Medan endast ett scenario av insert samodling presenterades här, finns det många sätt att göra användning av denna mycket mångsidig teknik. Här, en celltyp var förbehandlade med en molekyl som ansvarar för att inducera utsöndringen av en löslig faktor som, vid överföring av insatsen till brunnen, påverkar beteendet hos den andra celltypen. Det är också möjligt att inkubera båda celltyperna tillsammans i ett samodlingssystem innan separera dem för att detektera ökad sårbarhet eller resistens en eller båda cellpopulationer till en senare behandling. hoWever, när man överväger sin mest rudimentära form kan denna teknik använda två populationer av celler inkuberade tillsammans utan någon behandling, med målet att bedöma basal parakrin ömsesidiga signalering.
Den viktigaste begränsningen av denna teknik är att mycket kortlivade molekylära enheter, såsom reaktiva syrespecies inte överlever det avstånd som separerar cellpopulationen som växer i den övre avdelningen och en i det nedre utrymmet 82. Den senaste utvecklingen i samarbete odlingstekniker har försökt svara på detta problem genom att använda en mikro odlingssubstratet kan hålla två cellpopulationer i mikroskala närhet 83. Förutom att bära alla de fördelar insatsen co-odlingssystem, såsom befolknings specifik detektion av förändringar och dubbelriktad signalering, var detta mikrofabricerade skärm också visat att göra det möjligt att upptäcka kortdistans interaktioner som inte var innan detectable på grund av sönderfallet av lösliga faktorer över avstånd. Detta cellodlings plattform är den senaste innovationen i cell co-kultur och lovar att hjälpa Unravel signaleringsmekanismer mellan celler som förbises tidigare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI-1640 medium | Sigma | R8755 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham | Sigma | D6421 | Warm in 37 °C water bath before use, must be supplemented with 0.365 gm/L L-glutamine |
| Horse serum | ATCC | 30-2040 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Fetal bovine serum | MultiCell | 80350 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Nerve Growth Factor-7S from murine submaxillary gland | Sigma | N0513 | Reconstitute the lyophilized powder in a solution of buffered saline or tissue culture medium containing 0.1–1.0% bovine serum albumin or 1-10% serum |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma | T3924 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli 055:B5 | Sigma | L2880 | Toxic |
| Cell culture inserts for use with 24-well plates | BD Falcon | 353095 | 0.4 μm pores |
| 24-well plates | TrueLine | TR5002 | Coat with collagen before use |
| Routine PC12 cell culture medium | Routine N9 cell culture medium | ||
| - 85% RPMI medium | - 90% DMEM-F12 medium | ||
| - 10% heat-inactivated horse serum | - 10% heat-inactivated horse serum | ||
| - 5% heat-inactivated fetal bovine serum | |||
| PC12 differentiation medium | N9 treatment medium | ||
| - 99% RPMI medium | - 99% DMEM-F12 medium | ||
| - 1% heat-inactivated fetal bovine serum | - 1% heat-inactivated fetal bovine serum | ||
| - 50 ng/mL nerve growth factor | |||
| PC12 treatment medium | |||
| - 99% RPMI medium | |||
| - 1% heat-inactivated fetal bovine serum |
References
- Grobstein, C. Morphogenetic interaction between embryonic mouse tissues separated by a membrane filter. Nature. 172 (4384), 869-870 (1953).
- Hoffman, R. A. Intraepithelial lymphocytes coinduce nitric oxide synthase in intestinalepithelial cells. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 278 (6), G886-G894 (2000).
- Zhang, W. C., et al. Regulatory T cells protect fine particulate matter-induced inflammatory responses in human umbilical vein endothelial cells. Mediators Inflamm. 2014, 869148 (2014).
- Vasileiadou, K., et al. alpha1-Acid glycoprotein production in rat dorsal air pouch in response to inflammatory stimuli, dexamethasone and honey bee venom. Exp. Mol. Pathol. 89 (1), 63-71 (2010).
- Talayev, V. Y., et al. The effect of human placenta cytotrophoblast cells on the maturation and T cell stimulating ability of dendritics cells in vitro. Clin. Exp. Immunol. 162 (1), 91-99 (2010).
- Elishmereni, M., et al. Physical interactions between mast cells and eosinophils: a novel mechanism enhancing eosinophil survival in vitro. Allergy. 66 (3), 376-385 (2011).
- Ishihara, Y., et al. Regulation of immunoglobulin G2 production by prostaglandin E(2) and platelet-activating factor. Infect. Immun. 68 (3), 1563-1568 (2000).
- Kranzer, K., Bauer, M., Lipford, G. B., Heeg, K., Wagner, H., Lang, R. CpG-oligodeoxynucleotides enhance T-cell receptor-triggered interferon- gamma production and up-regulation of CD69 via induction of antigen- presenting cell-derived interferon type I and interleukin-12. Immunology. 99 (2), 170-178 (2000).
- Vendetti, S., Chai, J. G., Dyson, J., Simpson, E., Lombardi, G., Lechler, R. Anergic T cells inhibit the antigen-presenting function of dendritic cells. J. Immunol. 165 (3), 1175-1181 (2000).
- Haller, D., Bode, C., Hammes, W. P., Pfeifer, A. M., Schiffrin, E. J., Blum, S. Non-pathogenic bacteria elicit a differential cytokine response by intestinal epithelial cell/leucocyte co-cultures. Gut. 47 (1), 79-87 (2000).
- Dono, M., et al. In vitro stimulation of human tonsillar subepithelial B cells: requirement for interaction with activated T cells. Eur. J. Immunol. 31 (3), 752-756 (2001).
- Yu, Y., et al. Enhancement of human cord blood CD34+ cell-derived NK cell cytotoxicity by dendritic cells. J. Immunol. 166 (3), 1590-1600 (2001).
- Watanabe, T., Tokuyama, S., Yasuda, M., Sasaki, T., Yamamoto, T. Changes of tissue factor-dependent coagulant activity mediated by adhesion between polymorphonuclear leukocytes and endothelial cells. Jpn J. Pharmacol. 86 (4), 399-404 (2001).
- Krampera, M., et al. Bone marrow mesenchymal stem cells inhibit the response of naive and memory antigen-specific T cells to their cognate peptide. Blood. 101 (9), 3722-3729 (2003).
- Bournival, J., Plouffe, M., Renaud, J., Provencher, C., Martinoli, M. G. Quercetin and sesamin protect dopaminergic cells from MPP+-induced neuroinflammation in a microglial (N9)-neuronal (PC12) coculture system. Oxid. Med. Cell. Longev. 2012, 921941 (2012).
- Bureau, G., Longpré, F., Martinoli, M. G. Resveratrol and quercetin, two natural polyphenols, reduce apoptotic neuronal cell death induced by neuroinflammation. J. Neurosci. Res. 86 (2), 403-410 (2008).
- Zhu, L., Bi, W., Lu, D., Zhang, C., Shu, X., Lu, D. Luteolin inhibits SH-SY5Y cell apoptosis through suppression of the nuclear transcription factor-κB, mitogen-activated protein kinase and protein kinase B pathways in lipopolysaccharide-stimulated cocultured BV2 cells. Exp. Ther. Med. 7 (5), 1065-1070 (2014).
- Luo, X., et al. BV2 enhanced the neurotrophic functions of mesenchymal stem cells after being stimulated with injured PC12. Neuroimmunomodulation. 16 (1), 28-34 (2009).
- Polazzi, E., Gianni, T., Contestabile, A. Microglial cells protect cerebellar granule neurons from apoptosis: evidence for reciprocal signaling. Glia. 36 (3), 271-280 (2001).
- Barger, S. W., Basile, A. S. Activation of microglia by secreted amyloid precursor protein evokes release of glutamate by cystine exchange and attenuates synaptic function. J. Neurochem. 76 (3), 846-854 (2001).
- Zujovic, V., Taupin, V. Use of cocultured cell systems to elucidate chemokine-dependent neuronal/microglial interactions: control of microglial activation. Methods. 29 (4), 345-350 (2003).
- Iwashita, M., et al. Valsartan, independently of AT1 receptor or PPARγ, suppresses LPS-induced macrophage activation and improves insulin resistance in cocultured adipocytes. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 302 (3), E286-E296 (2012).
- Oliver, E., et al. Docosahexaenoic acid attenuates macrophage-induced inflammation and improves insulin sensitivity in adipocytes-specific differential effects between LC n-3 PUFA. J. Nutr. Biochem. 23 (9), 1192-1200 (2012).
- Tang, S. Y., Cheah, I. K., Wang, H., Halliwell, B. Notopterygium forbesii Boiss extract and its active constituent phenethyl ferulate attenuate pro-inflammatory responses to lipopolysaccharide in RAW 264.7 macrophages. A "protective" role for oxidative stress. Chem. Res. Toxicol. 22 (8), 1473-1482 (2009).
- De Boer, A. A., Monk, J. M., Robinson, L. E. Docosahexaenoic acid decreases pro-inflammatory mediators in an in vitro murine adipocyte macrophage co-culture model. PLoS One. 9 (1), e85037 (2014).
- Li, Y., Liu, L., Barger, S. W., Mrak, R. E., Griffin, W. S. Vitamin E suppression of microglial activation is neuroprotective. J. Neurosci. Res. 66 (2), 163-170 (2001).
- Brizuela, L., et al. Osteoblast-derived sphingosine 1-phosphate to induce proliferation and confer resistance to therapeutics to bone metastasis-derived prostate cancer cells. Mol. Oncol. 8 (7), 1181-1195 (2014).
- Yuan, L., Chan, G. C., Fung, K. L., Chim, C. S. RANKL expression in myeloma cells is regulated by a network involving RANKL promoter methylation, DNMT1, microRNA and TNFα in the microenvironment. Biochim. Biophys. Acta. 1843, 1834-1838 (2014).
- Krtolica, A., Parrinello, S., Lockett, S., Desprez, P. Y., Campisi, J. Senescent fibroblasts promote epithelial cell growth and tumorigenesis: a link between cancer and aging. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 98 (21), 12072-12077 (2001).
- Lawrenson, K., Grun, B., Benjamin, E., Jacobs, I. J., Dafou, D., Gayther, S. A. Senescent fibroblasts promote neoplastic transformation of partially transformed ovarian epithelial cells in a three-dimensional model of early stage ovarian cancer. Neoplasia. 12 (4), 317-325 (2010).
- Liu, J., et al. BCR-ABL mutants spread resistance to non-mutated cells through a paracrine mechanism. Leukemia. 22 (4), 791-799 (2008).
- Giuliani, N., et al. Proangiogenic properties of human myeloma cells: production of angiopoietin-1 and its potential relationship to myeloma-induced angiogenesis. Blood. 102 (2), 638-645 (2003).
- Gupta, D., et al. Adherence of multiple myeloma cells to bone marrow stromal cells upregulates vascular endothelial growth factor secretion: therapeutic applications. Leukemia. 15 (12), 1950-1961 (2001).
- Anderson, I. C., Mari, S. E., Broderick, R. J., Mari, B. P., Shipp, M. A. The angiogenic factor interleukin 8 is induced in non-small cell lung cancer/pulmonary fibroblast cocultures. Cancer Res. 60 (2), 269-272 (2000).
- Hoechst, B., et al. A new population of myeloid-derived suppressor cells in hepatocellular carcinoma patients induces C4(+)CD25(+)Foxp3(+) T cells. Gastroenterology. 135 (1), 234-243 (2008).
- Karadag, A., Oyajobi, B. O., Apperley, J. F., Russell, R. G., Croucher, P. I. Human myeloma cells promote the production of interleukin 6 by primary human osteoblasts. Br. J. Haematol. 108 (2), 383-390 (2000).
- Garrido, S. M., Appelbaum, F. R., Willman, C. L., Banker, D. E. Acute myeloid leukemia cells are protected from spontaneous and drug- induced apoptosis by direct contact with a human bone marrow stromal cell line (HS-5). Exp. Hematol. 29 (4), 448-457 (2001).
- Heissig, B., Pasternak, G., Horner, S., Schwerdtfeger, R., Rossol, S., Hehlmann, R. CD14+ peripheral blood mononuclear cells from chronic myeloid leukemia and normal donors are inhibitory to short- and long-term cultured colony-forming cells. Leuk. Res. 24 (3), 217-231 (2000).
- Moore, M. B., Kurago, Z. B., Fullenkamp, C. A., Lutz, C. T. Squamous cell carcinoma cells differentially stimulate NK cell effector functions: the role of IL-18. Cancer Immunol Immunother. 52 (2), 107-115 (2003).
- Giuliana, N., et al. Human myeloma cells stimulate the receptor activator of nuclear factor- kappa B ligand (RANKL) in T lymphocytes: a potential role in multiple myeloma bone disease. Blood. 100 (13), 4615-4621 (2002).
- Ye, Z., Haley, S., Gee, A. P., Henslee-Downey, P. J., Lamb, L. S. Jr In vitro interactions between gamma deltaT cells, DC, and CD4+ T cells; implications for the immunotherapy of leukemia. Cytotherapy. 4 (3), 293-304 (2002).
- Zhang, X. M., Xu, Q. Metastatic melanoma cells escape from immunosurveillance through the novel mechanism of releasing nitric oxide to induce dysfunction of immunocytes. Melanoma Res. 11 (6), 559-567 (2001).
- Zhang, M., et al. The differentiation of human adipose-derived stem cells towards a urothelium-like phenotype in vitro and the dynamic temporal changes of related cytokines by both paracrine and autocrine signal regulation. PLoS One. 9 (4), e95583 (2014).
- Qu, C., et al. Chondrogenic differentiation of human pluripotent stem cells in chondrocyte co-culture. Int. J. Biochem. Cell. Biol. 45 (8), 1802-1812 (2013).
- Krassowska, A., et al. Promotion of haematopoietic activity in embryonic stem cells by the aorta-gonad-mesonephros microenvironment. Exp. Cell. Res. 312 (18), 3595-3603 (2006).
- Darcy, K. M., et al. Mammary fibroblasts stimulate growth, alveolar morphogenesis, and functional differentiation of normal rat mammary epithelial cells. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 36 (9), 578-592 (2000).
- Spector, J. A. Co-culture of osteoblasts with immature dural cells causes an increased rate and degree of osteoblast differentiation. Plast. Reconstr. Surg. 109 (2), 631-642 (2002).
- Khanolkar, A., Fu, Z., Underwood, L. J., Bondurant, K. L., Rochford, R., Cannon, M. J. CD4+ T cell-induced differentiation of EBV-transformed lymphoblastoid cells is associated with diminished recognition by EBV-specific CD8+ cytotoxic T cells. J. Immunol. 170 (6), 3187-3194 (2003).
- Fritsch, C. Epimorphin expression in intestinal myofibroblasts induces epithelial morphogenesis. J. Clin. Invest. 110 (11), 1629-1641 (2002).
- Abouelfetouh, A., Kondoh, T., Ehara, K., Kohumra, E. Morphological differentiation of bone marrow stromal cells into neuron-like cells after co-culture with hippocampal slice. Brain Res. 1029 (1), 114-119 (2004).
- Llado, J., Haenggeli, C., Maragakis, N., Snyder, E., Rothstein, J. Neural stem cells protect against glutamate-induced excitotoxicitiy and promote survival of injured motor neurons through the secretion of neurotrophic factors. Mol. Cell. Neurosci. 27 (3), 322-331 (2004).
- Fong, S. P., et al. Trophism of neural progenitor cells to embryonic stem cells: Neural induction and transplantation in a mouse ischemic stroke model. J. Neurosci. Res. 85 (9), 1851-1862 (2007).
- Gordon-Keylock, S. A., et al. Induction of hematopoietic differentiation of mouse embryonic stem cells by an AGM-derived stromal cell line is not further enhanced by overexpression of HOXB4. Stem Cells. 19 (11), 1687-1698 (2010).
- Yang, T., Tsang, K. S., Poon, W. S., Ng, H. K. Neurotrophism of bone marrow stromal cells to embryonic stem cells: noncontact induction and transplantation to a mouse ischemic stroke model. Cell transplant. 18 (4), 391-404 (2009).
- Kim, J. Y., et al. Umbilical cord blood mesenchymal stem cells protect amyloid-β42 neurotoxicity via paracrine. World J. Stem Cells. 4 (11), 110-116 (2012).
- Mauri, M., et al. Mesenchymal stem cells enhance GABAergic transmission in co-cultured hippocampal neurons. Mol. Cell Neurosci. 49 (4), 395-405 (2012).
- Ichikawa, J., et al. Increased crystal-cell interaction in vitro under co-culture of renal tubular cells and adipocytes by in vitro co-culture paracrine systems simulating metabolic syndrome. Urolithiasis. 42 (1), 17-28 (2014).
- Zuo, L., et al. A Paracrine mechanism involving renal tubular cells, adipocytes and macrophages promotes kidney stone formation in a simulated metabolic syndrome environment. J. Urol. 191 (6), 1906-1912 (2014).
- Fan, W., Zheng, J. J., McLaughlin, B. J. An in vitro model of the back of the eye for studying retinal pigment epithelial-choroidal endothelial interactions. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 38 (4), 228-234 (2002).
- Mierke, C. T., Ballmaier, M., Werner, U., Manns, M. P., Welte, K., Bischoff, S. C. Human endothelial cells regulate survival and proliferation of human mast cells. J. Exp. Med. 192 (6), 801-811 (2000).
- Beckner, M. E., Jagannathan, S., Peterson, V. A. Extracellular angio-associated migratory cell protein plays a positive role in angiogenesis and is regulated by astrocytes in coculture. Microvasc. Res. 63 (3), 259-269 (2002).
- Damon, D. H. VSM growth is stimulated in sympathetic neuron/VSM cocultures: role of TGF-beta2 and endothelin. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 278 (2), H404-H411 (2000).
- Anna De Berardinis, M., Ciotti, M. T., Amadoro, G., Galli, C., Calissano, P. Transfer of the apoptotic message in sister cultures of cerebellar neurons. Neuroreport. 12 (10), 2137-2140 (2001).
- Lange-Sperandio, B., Fulda, S., Vandewalle, A., Chevalier, R. L. Macrophages induce apoptosis in proximal tubule cells. Pediatr. Nephrol. 18 (4), 335-341 (2003).
- Vjetrovic, J., Shankaranarayanan, P., Mendoza-Parra, M. A., Gronemeyer, H. Senescence-secreted factors activate Myc and sensitize pretransformed cells to TRAIL-induced apoptosis. Aging Cell. 13 (3), 487-496 (2014).
- Fujiya, A., et al. The role of S100B in the interaction between adipocytes and macrophages. Obesity (Silver Spring). 22 (2), 371-379 (2014).
- Suganami, T., Nishida, J., Ogawa, Y. A paracrine loop between adipocytes and macrophages aggravates inflammatory changes: role of free fatty acids and tumor necrosis factor alpha. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 25 (10), 2062-2068 (2005).
- Yoshida, A., Kitajiri, S., Nakagawa, T., Hashido, K., Inaoka, T., Ito, J. Adipose tissue-derived stromal cells protect hair cells from aminoglycoside. Laryngoscope. 121 (6), 1281-1286 (2011).
- May, L. A., et al. Inner ear supporting cells protect hair cells by secreting HSP70. J. Clin. Invest. 123 (8), 3577-3587 (2013).
- Jarosz, L. M., Deng, D. M., vander Mei, H. C., Crielaard, W., Krom, B. P. Streptococcus mutans competence-stimulating peptide inhibits Candida albicans hypha formation. Eukaryot Cell. 8 (11), 1658-1664 (2009).
- Dagenais, T. R., Giles, S. S., Aimanianda, V., Latgé, J. P., Hull, C. M., Keller, N. P. Aspergillus fumigatus LaeA-mediated phagocytosis is associated with a decreased hydrophobin layer. Infect. Immun. 78 (2), 823-829 (2010).
- Spiliotis, M., Lechner, S., Tappe, D., Scheller, C., Krohne, G., Brehm, K. Transient transfection of Echinococcus multilocularis primary cells and complete in vitro regeneration of metacestode vesicles. Int. J. Parasitol. 38 (8-9), 1025-1039 (2008).
- Scholzen, A., Mittag, D., Rogerson, S. J., Cooke, B. M., Plebanski, M. Plasmodium falciparum-mediated induction of human CD25Foxp3 CD4 T cells is independent of direct TCR stimulation and requires IL-2, IL-10 and TGFbeta. PLoS Pathog. 5 (8), e1000543 (2009).
- Fedoroff, S., Richardson, A. Quantification of Cells in Culture. Protocols for Neural Cell Culture. , 4th ed, Humana. Totowa, NJ. 333-335 (2001).
- Fedoroff, S., Richardson, A. Primary Cultures of Sympathetic Ganglia. Protocols for Neural Cell Culture. , 4th ed, Humana. Totowa, NJ. 88-89 (2001).
- Kreutzberg, G. W. Microglia: a sensor for pathological events in the CNS. Trends Neurosci. 19 (8), 312-318 (1996).
- Hanisch, U. K., Kettenmann, H. Microglia: active sensor and versatile effector cells in the normal and pathologic brain. Nat. Neurosci. 10 (11), 1387-1394 (2007).
- Davalos, D., et al. ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. Nat. Neurosci. 8 (6), 752-758 (2005).
- Block, M. L., Zecca, L., Hong, J. S. Microglia-mediated neurotoxicity: uncovering the molecular mechanisms. Nat. Rev. Neurosci. 8 (1), 57-69 (2007).
- Qureshi, S. T., Larivière, L., Leveque, G., Clermont, S., Moore, K. J., Gros, P., Malo, D. Endotoxin-tolerant mice have mutations in Toll-like receptor 4 (Tlr4). J. Exp. Med. 189, 615-625 (1999).
- Sabroe, I., Jones, E. C., Usher, L. R., Whyte, M. K., Dower, S. K. Toll-like receptor (TLR)2 and TLR4 in human peripheral blood granulocytes: a critical role for monocytes in leukocyte lipopolysaccharide responses. J. Immunol. 168, 4701-4710 (2002).
- Winterbourn, C. C. Reconciling the chemistry and biology of reactive oxygen species. Nat. Chem. Bio. 4 (5), 278-286 (2008).
- Spencer, K. H., Kim, M. Y., Hughes, C. C., Hui, E. E. A screen for short-range paracrine interactions. Integr. Biol. (Camb). 6 (4), 382-387 (2014).
