Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Внешнее возбуждение Нейроны Использование электрических и магнитных полей в одно- и двумерных культур

Published: May 7, 2017 doi: 10.3791/54357
Automatic Translation
1, 2, 3, 3, 3
1Laboratory of Genetics, The Salk Institute for Biological Studies, 2Department of Physics and SEAS, Harvard University, 3Department of Physics of Complex Systems, Weizmann Institute of Science

Summary

Нейронные культуры являются хорошей моделью для изучения новых методов стимуляции мозга через их влияние на отдельных нейронах или популяцию нейронов. Здесь представлены различные методы для стимуляции узорчатых нейрональных культур под действием электрического поля, создаваемого непосредственно электродами ванны или индуцированного магнитным полем изменяющейся во времени.

Abstract

Нейрон будет срабатывать потенциал действия, когда его мембранный потенциал превышает определенный порог. В типичной активности головного мозга, это происходит в результате химических материалов для его синапсов. Однако нейроны также могут быть возбуждены с помощью наложенного электрического поля. В частности, недавние клинические приложения активируют нейроны, создавая электрическое поле снаружи. В связи с этим представляет интерес исследовать, как нейрон реагирует на внешнее поле и то, что вызывает потенциал действия. К счастью, точное и контролируемое применение внешнего электрического поля возможно для эмбриональных нервных клеток, которые вырезают, диссоциированных и выращенных в культурах. Это позволяет исследовать эти вопросы в высокой воспроизводимости системы.

В данной работе некоторые из методов, используемых для контролируемого применения внешнего электрического поля на нейрональных культурах рассматриваются. Сети могут быть одномерными, то есть с рисунком в Lineaг форма или позволяла расти на всей плоскости подложки, и, таким образом двумерный. Кроме того, возбуждение может быть создано путем непосредственного применения электрического поля с помощью электродов, погруженных в жидкости (ванна электродах) или путем индукции электрического поля с помощью пульта дистанционного создания магнитных импульсов.

Introduction

Взаимодействие между нейронами и внешними электрическими полями имеют фундаментальные последствия, а также практические. Хотя известно со времен Вольты , что внешне приложенное электрическое поле может возбуждать ткани, механизмы , ответственные за производство потенциала результирующего действия в нейронах только недавно начали быть разгаданы 1, 2, 3, 4. Это включает в себя поиск ответов на вопросы о механизме , который вызывает деполяризацию мембранного потенциала, роль свойств мембраны и ионные каналы, и даже область в нейроне , который реагирует на электрическое поле 2, 5. Терапевтическая нейростимуляция 6, 7, 8, 9,

Измерение взаимодействия в головном мозге в естественных условиях добавляет важный компонент к этому пониманию, но затрудняются неточностью и низкой управляемостью измерений внутри черепа. В противоположность этому, измерения в культурах легко могут быть выполнены в большом объеме с высокой точностью, отличный сигнал-шум и высокой степенью воспроизводимости и контроля. Использование культур большое разнообразие нейрональных свойств коллективного поведения сети может быть выяснено 11, 12, 13, 14, 15, 16. Кроме того , это хорошо управляемая система , как ожидается , высокая эффективность в выяснении механизма , с помощью которой работают другие методы стимуляции, например , как открытие канала при оптической стимуляции в optogenetically активных нейронов 17, 18, 19 отвечает за создание потенциала действия.

Здесь акцент делается на описание развития и понимания инструментов, которые могут эффективно возбуждают нейрон с помощью внешнего электрического поля. В данной работе описано получение двумерных и одномерных узорчатых гиппокампа культур, стимуляция с использованием различных конфигураций и ориентацию, непосредственно приложенного электрического поля с помощью ванны электродов и, наконец, стимуляция двумерно и узорной одномерные культур с помощью изменяющихся во времени магнитное поле, которое индуцирует электрическое поле5 , 20 , 21 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Этика заявление: Процедуры, связанные с обращением животных были проведены в соответствии с руководящими принципами Animal Care и использованием комитета Institutional (IACUC) из Института Вейцмана, и соответствующего израильского законодательство. Институт Вейцмана аккредитована Ассоциацией по оценке и аккредитации лабораторных животных Care International (AAALAC). Institutional Animal Care и использование Комитет Вейцмана одобрил это исследование, проведенное с нейронами гиппокампа.

1. Получение Двумерная (2D) и одномерной (1D) гиппокампа культур

  1. Приготовление покровные для 2D культур.
    1. Подготовьте гальванические среды (ПМ), состоящая из: 0,9 мл минимальных основных сред (MEM) + 3G, 0,05 мл фетальной сыворотки теленка (FCS), 0,05 мл инактивированной нагревания лошадиной сыворотки (HS HI) и 1 мкл B27 дополнения. Примечание: АЕТ + 3G содержит для каждых 500 мл MEM х 1, 1 мл гентамицина, 5 мл стабилизированной L-глутамина 100х (см
    2. Готовят боратный буфер, состоящий из 1,9 г буры (декагидрата тетрабората натрия) в 200 мл двойной дистиллированной воды (DDW) (смесь при 60 ° C) и 1,24 г борной кислоты в 200 мл DDW. Окончательный раствор титруют до рН 8,5, используя 1 М HCl. Примечание. Конечным раствором является 400 мл 0,1 М боратного буфера.
    3. Погрузите покровные стекла в 65% -ную азотную кислоту на 2 часа. Промыть три раза в DDW, затем три раза промыть этанолом с абсолютным аналитическим реагентом (ABS AR).
    4. Кратковременно пропускайте каждое покровное стекло через пламя горелки Бунзена два или три раза в течение 1-2 с и затем оставляйте для инкубации в течение ночи в 24-луночных планшетах с 1 мл 0,01% -ного раствора поли-L-лизина, разбавленного 1: 5 в боратном буфере ( 0,1 М, рН 8,4). Затем промывают покровные стекла в DDW три раза и оставляют с 1 мл РМ на лунку в стандартном 37 ° С, 5% CO 2 -инкубаторе в течение ночи.
  2. Подготовка покровных для 1D культур.
    1. Очистить gLass покровные путем погружения в базовой пираньи растворе, состоящем из 75 мл DDW, 25 мл 25% раствора аммиака и 25 мл 30% -ной перекиси водорода. Место раствор с покровные стекла на нагревательной пластине при ~ 50 ° C в течение 30 мин, а затем высушить покровные стекла с азотом.
    2. Coat покровные первый с тонкой хромовой пленкой (99,999%) толщиной 6 Å, за которым следует 30 слоем золота (99,999%), с использованием либо из паровой фазы или осаждение. Распылением
      1. Для того, чтобы достичь скорости распыления 0,05 - 1 A / S использовать для распыления машину с 2 электронных пучков и вакуумной системы 260 л / с с мишенью размерами 2" и 4" . Используйте этап вращения, который может пойти от 0 - 100 выстрелов в минуту (RPM). Используйте постоянный ток (DC) распыления мощности 0 - 750 Вт.
      2. Используйте вращение 30 оборотов в минуту и ​​аргона 99,999%, чтобы получить плазму при давлении 10 мТорр в камере.
      3. Работает электропитание распыления пушки при 40 Вт распыла мощности постоянного тока для хрома, что приводит к ~ 0,12 уровень охвата A / S, и при 10 Вт DC мощность распыления для золота, что приводит к ~ 0,28 Å / с.
    3. Растворить 0,1 г 1-octadecanethiol в 100 мл этанола AR АБС с помощью ультразвука в течение 30 мин. Поместите Cr-Au покровные с покрытием в течение 2 ч в этом растворе, а затем промывают этанолом AR ABS и сухим азотом.
    4. Готовят раствор 100 фосфатным буферным солевым раствором Дульбекко мл , (D-PBS) и 3,5 г три-блок - сополимера (см Таблицу материалов / Реагенты) при перемешивании в течение 1 - 2 ч при 600 - 700 оборотов в минуту. Поместите покровные в растворе в течение 1 ч. Сухие покровные с азотом.
    5. Механически протравить желаемый рисунок, царапая био-режекции слой 22. Делайте это с помощью пера плоттера, где перо заменяется травильной иглой. Царапины шаблона через металлические слои, чтобы достичь базового стекла. Управление этим процессом с помощью компьютера, чтобы достигнуть желаемого рисунка реплицируется. Образцы, образованные этим способом, демонстрируют д на фиг.2 и фиг.3.
    6. Подготовьте био-совместимый слой 100 мл D-PBS, 3,5 г три-блок-сополимерной, 35,7 мкл / мл фибронектина и 29 мкл / мл ламинин.
      1. Стерилизовать покровные в ультрафиолетовом свете, по крайней мере, 10 мин. Инкубируйте покровные в подготовленном биологически совместимом растворе в течение ночи.
        Примечание: Био-совместимый слой будет формировать только там, где био-отторжение слой был стравливается в предыдущем шаге.
      2. На следующий день мыть покровные два раза с P-DBS. Выдержите покровные в личку на ночь. Покровные теперь готовы к клеточной обшивке.
  3. Выполнение рассечения в соответствии со стандартными процедурами , которые были опубликованы ранее широко 23, 24.
    1. Вкратце, экстракт гиппокампа или коры головного мозга из эмбрионов крыс, как правило , в день E19, или от мышей, как правило , в день E17 23,класс = "внешние ссылки"> 24.
    2. Диссоциируют клетки сначала в растворе папаина в течение 20 - 30 мин, с последующей механическим растиранием 24 со стеклянными пипетками , чьи советы огнь отполированы.
      Примечание: Если клетки происходят из генетически модифицированного мышея после чего ткань из каждого эмбриона должна быть сохранена в отдельных 1,5 мл пластиковой пробирки в течение всего процесса.
    3. Граф клеток с трипановым синим перед посевом.
      Примечание: Для получения генетически модифицированных животных подсчета должно быть сделано отдельно для каждого эмбриона.
    4. Для 2D культур нейронов мыши семян на 750000 и крысах нейронов на 850000 клеток на лунку. Для 1D, семян на 650000 клеток на лунку. Встряхнуть тарелку немного сразу после посева, чтобы обеспечить однородное покрытие покровного.
  4. Поддержание нейрональных культур.
    1. Подготовьте изменение среды (см), состоящие из (на мл):. 0,9 мл АЮТ + 3G, 0,1 мл HI HS, 10 мкла 5-фтор-2'-дезоксиуридина (ФУДРО) с уридином 100м </ Li>
    2. Подготовьте окончательный носитель (FM), состоящую из (на мл): 0,9 мл МЕМ + 3G и 0,1 мл HI HS.
    3. Заменить ПМ с 1-1,5 мл СМ после 4 дней в пробирке (DIV). В 6 DIV, заменить 50% СМ со свежим CM. При DIV 8, изменить среду в 1,5 мл FM, с последующим изменением FM каждые 2 дня 50%. Примерно через неделю спонтанная синхронная активность возникает.
  5. Визуализация спонтанной или вызванной активности в нейрональных культурах с флуоресцентными красителями.
    1. Готовят раствор 50 мкг кальция чувствительного флуоресцентного красителя (см таблицу Материалы / Реагенты) в 50 мкл ДМСО (диметилсульфоксид).
    2. Подготовьте внеклеточный раствор записи (EM) , содержащий (в мМ) 10 HEPES, 4 KCl, CaCl 2 , 2, 1 MgCl2, 139 NaCl, 10 Д-глюкоза, сахароза 45 (рН 7,4).
    3. Инкубируйте нейронов культуры в 2 мл ЭМ с 8 мкл раствора красителя кальция чувствительного флуоресцентного в течение 1 ч. Защита от света и осторожно поворачивайте, чтобы обеспечить homogenОЕ распространение красителя в клетки.
    4. Заменить раствор свежего EM перед визуализацией. Флуоресцентные изображения продемонстрировано на рисунке 4.
    5. Изображение в флуоресцентного микроскопа с оптическими фильтрами для флуоресценции кальция визуализации (пик возбуждения при длине волны 488 нм, пик эмиссии при 520 нм), используя камеру и программное обеспечение, способное количественной оценки интенсивности любой области, представляющей интерес (ROI) в пределах поля зрения микроскоп.

2. Электрическая стимуляция культур

Примечание: Базовая установка для электрической стимуляции показана на рисунке 1. Крышка скольжение, на котором нейронная культура выращивалась в течение 14 дней помещают в чашке Петри под флуоресцентным микроскопом. Электрическая активность нейронов визуализируют с помощью чувствительных красителей кальция в то время как напряжение подается через две пары электродов ванны, которые расположены за пределами культуры. Электроды приводятся в движение, какГенератор ignal, выход которого усилен двухканальным усилителем. Регулирование напряжения для стимуляции является предпочтительным по сравнению с более стандартным регулятором тока 25 , 26 , поскольку векторы электрического поля определяются непосредственно, что обеспечивает прямое векторное сложение и комбинацию. Это требует тщательной проверки однородности электрического поля, которое может быть выполнено по всему образцу для контроля напряжения. При использовании контроля напряжения следует соблюдать осторожность, чтобы избежать каких-либо замыканий на землю, и необходимо проверить однородность электрического поля (см. 2.2 ниже).

  1. Для электростимуляции с однородным электрическим полем используйте пару параллельных электродных проволок.
    1. Используйте электроды из платины толщиной порядка 0,005 '' (127 μm). При использовании с покровными стеклами 13 мм убедитесь, что расстояние между двумя электродами составляет около 11 мм и установите электродс 1 мм над культурой.
      Примечание: Для того, чтобы держатель электрода (Фигуры 5А и 6А) использовать политетрафторэтилен (PTFE). Дрель узких отверстий через PTFE, чтобы вставить электроды. Устройство должно быть выше, чем внеклеточный раствор так, чтобы верхний конец, где электроды подвергаются, никогда не вступают в контакт с раствором. Для изоляции, используют эпоксидный клей на любой части электродных выводов, которые могут быть подвержены.
    2. Используйте квадратную форму импульса при рабочем цикле 50%, без постоянной составляющей, чтобы избежать электролиза. Vary длительности импульса от 10 мкс до 4 мс, чтобы вызвать эффективную стимуляцию без сжигания культуры. Убедитесь , что амплитуда находится в пределах ± 22 V (см рисунок 5). Прямоугольный импульс можно наблюдать на осциллографе, соединенных параллельно с электродами.
      Примечание: Для облегчения программирования любого желаемой формы сигнала, использовать коммерческое программное обеспечение для редактирования формы сигнала (см список материалов
  2. Для проверки однородности поля используют зонд электрода. Использование сетки, по меньшей мере, 1 мм х 1 мм, чтобы зонд быть перемещен в области между электродами и измерить электрический потенциал.
    1. Измерение электрического потенциала. использование Уравнение 1 рассчитать электрическое поле. Используйте один из электродов в качестве опорного электрода. Измерьте электрическое поле с различной длительностью импульсов от 100 мкс до 4 мс (смотри рисунок 5В для примера 100 мкс длительности импульса) , чтобы убедиться в том , что поле однородно в диапазоне стимулирующих длительностей.
      Примечание: Смотрите Рисунок 5D для примера измеренной однородности электрического поля , когда длительность импульса 1 мс.
  3. Используйте 2 перпендикулярные пары электродов ванны для получения более сложных форм электрического поля, иИметь возможность сориентировать поле в разных направлениях (см. Рисунок 6B ). Будет использоваться устройство с 2 парами электродов, и сигнал на каждой паре электродов будет наблюдаться на двух отдельных осциллографах.
    1. Расположите электроды на 1 мм выше культуры и на расстоянии 10-11 мм друг от друга. Убедитесь, что обе пары электродов плавают (не имеют заземления), и не имеют общего заземления, измеряя сопротивление между любыми наборами электродов и проверяя отсутствие коротких замыканий между любыми электродами. Убедитесь, что все используемое оборудование, которое подключено к электродам (например, осциллографы, усилители, генераторы сигналов и т. Д.), Плавает относительно земли, проверяя, что все оборудование находится в плавании и что ни один из эталонных электродов не соприкасается Любое заземленное оборудование.
    2. Чтобы изменить ориентацию поля, измените амплитуду напряжения, подаваемого на две пары электродов, с помощью resPECT друг с другом (см рисунок 7A). Так, например, при 0 ° Использование ± 22 В на пары электродов, которые расположены перпендикулярно к шаблону и 0 В для другого электрода. При 45 °, использовать ± 15,6 В на обеих парах электродов, без фазовой задержки, для амплитуды векторной сумме 15,6 2 15,6 2 = 22 2.
    3. Чтобы применить вращающееся поле использовать одну единственную форму волны синусоидальной импульса напряжения и одну единственную форму сигнала импульса напряжения косинуса к двум парам электродов для получения фиксированной амплитуды вращающегося электрического поля (рис 6В).
      Примечание: Как можно увидеть на фиг.6В, при использовании одного цикла синусоидальной волны с ± 22 V в одном электроде и один цикл волны косинуса с ± 22 V в другом электроде, векторная сумма представляет собой вращающееся электрическое поле с длительность цикла же, как и волны синуса и косинуса, и с амплитудой ± 22 В.
  4. Для измерения и вычисления Chronaxie и реобаза аксонов в культуре нейронов по сравнению дендритов в той же культуре выполнить следующие шаги.
    1. Используйте кальций чувствительный флуоресцентный краситель для визуализации кальция , как описано в Таблице Материалы / Реагенты и в 1.5) с культурой 1D рисунком на тонких (170 мкм), длинный (10 мм) линии. Кальций чувствительный краситель будет применяться к культуре, и инкубировали в течение 45 минут. Краситель будет промывают путем замены со свежим раствором записи.
    2. Отключить сеть, чтобы достичь демографических статистических данных прямого ответа на электрическую стимуляцию, без эффекта синаптической передачи. Для этого применяют комбинацию 40 мкМ бикукуллина, который блокирует ингибирующее действие гамма-аминомасляная кислота-A (ГАМК А) рецепторов, 10 мкМ 6-циано-7-нитрохиноксалин-2,3-дион (CNQX) , чтобы блокировать α-амино-3-гидрокси-5-метил-4-изоксазолпропионова (АМРА) и каинатные рецепторы и 20 мкМ (2R) -амино-5-phosphonovaleRIC кислоты (APV), который блокирует N-метил-D-аспартат (NMDA) рецепторов. Блокаторы будут добавлены к раствору записи.
    3. Применить прямоугольный импульс, как описано в разделе 2.1 и 2.3 с переменным времени длительностью от 100 мкс до 4 мс. Сигнала можно наблюдать на осциллографе.
    4. С помощью флуоресцентного микроскопа с программой захвата изображений (см 1.5), чтобы контролировать интенсивность переходного кальция на несколько трансформировании, каждый из которых содержит несколько сот нейронов. Получение изображений с помощью чувствительного EMCCD камеры (смотрите список материалов), способные к скорости сбора данных изображения, по меньшей мере, 20 кадров в секунду. Изменение интенсивности света пропорционально количество нейронов, которые стимулировали. Оценить долю нейронов, стимулированных с помощью относительного изменения интенсивности.
    5. Для каждой длительности импульса (100 мкс до 4 мс), изменение амплитуды напряжения, подаваемого на электроды, начиная при напряжении, где никаких изменений в интенсивности не видно (несколько вольт), чтобы йе напряжения, где изменения в интенсивности за счет приложенного напряжения имеет насыщенный (до ± 22 В).
      Примечание: Изменение интенсивности будет распределено в виде кумулятивной гауссовые 5 относительно приложенного напряжения для стимуляции для каждой временной длительности импульса напряжения.
    6. Установить кумулятивное гауссово распределение для интенсивности против приложенного напряжения для каждой длительности и извлечь Gaussian среднего из этой подгонки.
      Примечание: Это среднее значение является представителем напряжения, к которому нейроны ответили.
    7. В конце этого процесса получает для каждой длительности стимуляции среднего напряжения, к которому ответили нейроны. Используйте эти пары длительностей и сильные стороны, чтобы построить кривые Strength-Duration (рисунок 7).

3. Магнитная стимуляция культур

Примечание: Базовая установка для магнитной стимуляции показана на рисунке 2. В правом верхнем углу отображаетсяинвертированный флуоресцентный микроскоп, который используется для чувствительных изображений кальция красителей в нейронах. Магнитная катушка (синие кружки) расположен около 5 мм концентрично над кольцом нейрональной культуры, (синий контур). Катушка срабатывания (красный круг) по окружности чашки Петри контролирует напряжение, вызванное магнитным импульсом. В левом верхнем углу показано измеренные динамику магнитного стимулятора (МС) катушки с нагрузкой конденсатора напряжения 5000 кВ, а интегрированный от катушки съема. Индуцированное электрическое поле (вычислено для радиуса кольца 14 мм) изображена зеленым цветом, а магнитное поле изображено синим цветом. На дне показаны изображения нейрональной культуры. В нижнем левом углу является светлое поле изображение узорной 24-мм покровным. Белые области являются нейронами. Сфотографировали узор состоит из концентрических кольцевых культур с различными радиусами. В правом нижнем углу является увеличение на коротком отрезке колец, показывая отдельные нейроны. Для шкалы, WID колецго составляет около 200 мкм.

  1. Grow нейронов по круговой схеме кольца (травлению, как описано в 1.2.5) для стимуляции 1D культуры. Используйте кальций чувствительный флуоресцентный краситель для визуализации кальция (как описано в разделе 1.5) с 1D культурой штриховки на тонких (170 мкм), длинными (10 мм) линиями.
    1. Используйте круглую магнитную катушку и поместить в чашку Петри приблизительно на 5 мм ниже, а концентрические с катушкой. Используйте пользовательскую катушку приблизительно на 30 мм (внутренний диаметр, 46 мм наружный диаметр) катушки с индуктивностью L = 90 мГн , приводимый в действие самодельных или коммерческих MS загруженных с максимальным напряжением 5 кВ.
    2. Разряд высокого напряжения и тока через проводящую катушку с помощью переключателя высокого тока высокого напряжения, чтобы стимулировать магнитно-нейрональные культуры. Магнитный стимулятор (МС) может быть построен , как описано в 21 с использованием больших конденсаторов, порядка 100 мФа, чтобы получить высокое напряжение 1 - 5 кВ. В качестве альтернативы используют коммерческидоступен МС (см Таблица материалов / реагентов).
      Примечание: Используйте 0,254 мм толщины и широкой 6,35 мм полиэфирного покрытия прямоугольных медную проволоку для изготовления домашней катушки 21. Включите провода на выполненных на заказ рам, с изоляцией из стекловолокна и эпоксидной смолы в гипсе (см таблицу материалов / реагентов). В качестве альтернативы используют коммерчески доступные катушки (см Таблицу материалов / реагентов).
  2. Использование вращающихся магнитных полей для стимуляции 2D культур.
  3. Теперь, используя вращающиеся магнитные поля, чтобы стимулировать 2D культур. Пожар в TMS, без культуры в чашке, при различной интенсивности, чтобы показать линейную корреляцию чтения катушки с интенсивностью.
  4. Далее, во время записи переходного кальция с нейрональной культурой, начинает обжиг ТМСА при увеличении интенсивности во время записи оба переходного кальция и катушки. Во-первых, сетевые всплески наблюдаются как больших переходных кальция, шопакетирования не синхронизируются с подцепить катушки TMS шипы. Продолжая увеличивать интенсивность, в какой-то момент, переходные процессы кальция начинают становиться синхронизировано с шипами TMS. В качестве альтернативы, или в дополнение, после достижения синхронизированный ответа, начинает уменьшаться интенсивности до тех пор, синхронизация не отменяется, чтобы определить порог TMS.
    Примечание: Условия должны быть сохранено строго фиксированными для каждого из установок, используя точный объем каждый раз, одни и те же сосуды и точные позиции катушки и ориентацию.
    1. Установите катушку съема на основании тарелки записи так, что она находится в плоскости, параллельной нейрональной культуре, и в фиксированном положении по отношению к культуре.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это гарантирует, что зависимость от расположения съема катушки относительно магнита верна позиции культуры, и что любые расхождения в позиционировании будут незначительными по показаниям срабатывания катушки.
      1. Используйте две независимые катушки, которые являютсярасположены перпендикулярно друг к другу (фиг.8В) , чтобы генерировать вращающееся магнитное и индуцированное электрическое поле. Подключите каждую катушку к своему собственному MS. Убедитесь , что стимуляторы разряд подобных токов на фазовую задержке 90 градусов (рис 10А), в результате чего вращающегося магнитного поля , которое сканирует 270 градусов в реальном пространстве при максимальном поле ~ 270 В / м (рис 10B).
      2. Поместите нейронную культуру внутри сферической стеклянной емкости, заполненной наружным регистрирующим раствором (ЭМ).
      3. Монитор стимуляции (изменение в интенсивности флуоресценции нейронов) с помощью камеры, как описано в шаге 2.4.4.
      4. В случае поперечных катушек (рис 8B), расположить параллельно пикап катушки и на определенном расстоянии ниже нейрональной культуры. Тщательно сохранить эту конфигурацию на протяжении экспериментов.
  5. Вычислить аналитически электрическое поле для 1D configuraции по E макс = K 1 Br, где Е макс является максимальная амплитуда индуцированного электрического поля и направлен по касательной колец с радиусом г. В является амплитуда магнитного импульса и к 1 является размерная константа пропорциональности , которая может быть измерена с использованием катушки съема (рис 8а).
  6. Использование численного моделирования пакета (список материалов) для численного моделирования электрического поля 21.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Протокол представлен позволяет легко кучность нейрональных культур. В сочетании с несколькими методами , которые мы разработали для стимуляции, она позволяет производить измерения некоторых внутренних свойств нейронов , такие как хроноксия и реобазами 5, чтобы сравнить свойства здоровых и больных нейронами 27, чтобы найти оптимальные способы стимулирования культур в зависимости от их структура и многие другие новые подходы. Некоторые примеры представлены на следующих рисунках.

Рисунок 3 показывает 1D с рисунком конфигураций, которые выгравированы на био-режекции слоя. Тонкие линии около 170 мкм ширины , как правило , вписаны , которые могут, например, быть концентрическими кольца с переменным радиусом (рис 3А) или параллельными линиями, как правило , длиной ~ 11 мм (фигура 3В).

нт»ВОК: Keep-together.within-странице =„1“> Верхняя панель Рисунок 4 показывает типичную картину флуоресцентной активности в культуре, взятой с зарядовой связью (CCD) и показывает изображение флуоресцентно меченных нейроны в 2D - культуры. в этом примере показаны три различных трансформирования, отмечены черными, зеленый и красный. Интегральные следов интенсивности флуоресценции, показаны в нижней панели, показанной на фиг.4, измеренный в этих трех различных трансформирования (следы в соответствующем цвете из трансформирования). Как показывает вкладной, в разрешении 200 мса от момента захвата кадра, при котором был принят это конкретные данные, все нейроны в три различном трансформировании взрыв одновременно.

Основной аппарат , используемый для стимуляции с помощью однонаправленного, постоянного электрического поля показан на фигуре 5А. Электродные проволоки погружают в носителе записи, около 1 мм над нейрональной культурой.Основная форма импульса используется для электрической стимуляции показана на фигуре 5В. При применении этого импульса напряжения он создает постоянное электрическое поле, которое переворачивает свою ориентацию на 180 ° после половины цикла. Изменение направления поля после половины цикла используется, чтобы избежать электролиза и повреждение электродов. Типичные напряжения, прикладываемые к электродам составляют ± 22 В, и типичная длительность импульса для стимуляции 2D культур составляет порядка 100 - 500 мкс.

Для контроля любой анизотропии в росте невритов, мы убедились, что стимуляция 2D культуры изотропна. С помощью ручного вращения электродов во всех 360 ° при разрешении 15 ° (рис 5C) видно , что не существует никакого предпочтения ориентации для стимуляции. Каждый цвет на рисунке 5С представляет собой стимуляцию другой культуры. Расстояние от начала координат представляет собой минимальную дуРацион необходимо для стимуляции с постоянной амплитудой. Очевидно, что, с хорошим приближением, 2D культуры не имеют предпочтительную ориентацию для электрической стимуляции.

Так как одна пара электродов ограничена наличие одного определенного направления для поля (хотя это может быть перевернуто), мы разработали устройство для электрической стимуляции с двумя парами электродов (рис 6А). Схематические культур (серого кругового фоне, темные пятна являются клеточными телами) и электродов (параллельные толстые линии) показаны на фиг.. Когда сигналы, показанные в виде голубых и зеленых вставок в фиг.6В, являются косинус и синус волны и применяются вместе , то вращающийся векторное поле Е производится. Когда импульсы напряжения являются квадратными, имеют различные амплитуды и имеют нулевую задержку по фазе между ними, то они создают постоянное поле с желаемой ориентацией, определяемой гelative амплитуда между двумя парами электродов. Это электрическое вращение является очевидным усовершенствованием по сравнению с ручным, механическим вращением , который был использован , чтобы получить угловое распределение сильных стимуляции на рисунке 5С. Конечно, как показано на фиг.6С, можно также использовать эту конфигурацию , чтобы возбудить только одно фиксированное направление, возможно , в качестве контроля, путем активации только одну пару электродов.

Эти конфигурации были использованы для возбуждения 2D нейрональных культур либо с вращающимся полем или полем с фиксированным углом, с тем же самым среднеквадратичными (RMS) напряжений, а затем сравнить длительность импульса, необходимую для возбуждения культуры, когда амплитуда фиксируются. Мы обнаружили, что при использовании вращающегося электрического поля с постоянной амплитудой ± 22 V, средняя длительность 150 ± 14 мкс было необходимо для достижения стимуляции, в то время как с одним направлением электрического поля средняя продолжительностьтребовалось 290 ± 30 мкс. Соотношение между длительностями, необходимыми для возбуждения культуры с вращающимся по сравнению с полем фиксированного угла, следовательно, 0,53 ± 0,02.

Так как в 2D культуры аксоны распространяются во всех направлениях, вращающееся поле способно возбуждать многие из аксонов. В противоположность этому, с одним полем ориентации есть только несколько аксоны ориентированных в этом конкретном угле и аксонов возбуждения не достигается. Когда продолжительность увеличивается, есть возможность возбуждения других частей нейрона, а также, в частности, дендриты. Это далее объяснено ниже в описании измерений хроноксии. Тот факт, что гораздо короче длительности необходимы для возбуждения той же культуры при использовании вращающегося поля имеет большое значение при использовании внешних полей для стимуляции мозга, поскольку часто существуют технические ограничения по длительности импульсов.

рисунке 7. На фигуре 7А отключенная сеть 1D стимулируется с электрическим полем либо вдоль линия культуры (при 0 ° С в течение аксонов стимуляции) или перпендикулярно к линии культуры (при 90 ° С в течение дендритной стимуляции) с помощью двух пар электродов. По мере увеличения напряжения, больше нейронов будет стимулироваться, и это отражается от гриппаИнтенсивность orescence, которая пропорциональна количеству нейронов , стимулированных (рис 7В). Увеличение амплитуды напряжения используются, чтобы постепенно стимулировать всю культуру. Каждый нейрон имеет минимальное пороговое напряжение (для определенной длительности импульса), что она будет реагировать на, и по закону больших чисел, распределение этих порогов, как ожидается, будет гауссовым. Поэтому, если мы посмотрим на количество нейронов , которые откликнулись и построить его от приложенного напряжения, распределение будет кумулятивное распределение Гаусса, которая является функцией Error (ERF) 5. Количество нейронов , которые реагируют на определенную амплитуду электрического поля имеет приблизительно гауссово распределение, и , следовательно, флуоресценции хорошо описываются его интегральной - функция ошибки амплитуды стимулирующего поля (рис 7C).

На фиг.7Се используется для электронногоXtract один параметр, ожидание (среднее значение) распределения. Это делается путем установки кумулятивного распределения Гаусса и получения наилучшего. Это ожидание приложенное напряжение, к которому 50% клеток будут реагировать. Этот процесс повторяется в течение нескольких длительности импульсов (от 100 мкс до 4 мс). Среднее напряжение, к которому культура ответила отложено по сравнению с длительностью импульса, чтобы получить кривое сила-длительность. Было проведено два набора измерений. В первом поле было параллельно образцу, а во втором она была перпендикулярно к ней. Ранее было показано , 15, 23 , что аксоны выравнивать с рисунком, в то время как дендриты растут во всех направлениях. Это дает две различных кривые сила-длительность, которые очень полезны для получения четкого различия между аксонами и дендритами возбуждением. Полное разделение дендритных и аксонов вкладов достигается известным фактом, что аксональ постоянное время для возбуждения намного короче , чем те , дендритных 2, 3, 4.

Кривые сила-длительность затем подходит к уравнению распада хроноксии Уравнение 2 , Где V отн является напряжение реобазы и С является хроноксии. При длительности импульса Т <1мс это аксоны, которые возбуждаются первым и вызывают нейрон огня, имеющего более низкое значение для напряжения возбуждения на кривой сила-длительность. Аксоны хроноксия Рассчитанные 110 мкс. В разительном контрасте, для возбуждения при больших длительностях (T> 1 мс) дендритное отделение является источником возбуждения для нейрона с дендритной хроноксией, рассчитанный на 900 мкс.

Принципы, лежащие в основе стимуляции 2D и 1D культур с CIRКруглая катушка описаны на рисунке 8 . Для лучшего понимания физической ситуации, численное моделирование магнитного и индуцированного электрических полей производится с использованием пакета COMSOL. Для стимуляции 1D культур используется круговая магнитная катушка, расположенная концентрично над чашкой Петри. Нейроны выращиваются в круглых кольцах на круглом покровном стекле, которое помещается внутри чашки Петри для записи. В этом случае индуцированное электрическое поле может быть вычислено аналитически и равно E max = k 1 Br , где E max - максимальная амплитуда наведенного электрического поля и направлена ​​по касательной колец с радиусом r . B - амплитуда магнитного импульса, k 1 - постоянная размерной пропорциональности, которая может быть измерена с помощью катушки срабатывания.

Численный расчет COMSOL магнитного поля created катушки в культуре 1D показана на верхней панели фиг.8А (красные линии тока). В нижней панели фиг.8 расчет представлен для индуцированного электрического поля. Стимулирование 2D - культуры с конфигурацией скрещенных катушки показано на фиг.. Для стимулирования 2D культур был использован кросс катушки, который производит вращающиеся магнитные поля, расположенные с 2D нейрональной культуры внутри него, помещали в стеклянный контейнер сферической, который заполнен средой записи (ЭМ). В этом случае индуцированное электрическое поле может больше не быть вычислена аналитически. Крест катушка изображена на верхней панели фиг., со сферической емкостью , расположенной внутри два катушек и покровным стекла , поддерживающей 2D культуры , помещенной в нижней части контейнера. Для шкалы, внутренний диаметр внутренней катушки 65мм. Численное моделирование с использованием Comsol с Токи 3D модели Eddy показаны в нижней панели,изображая электрическое поле, создаваемое во внутренней поверхности сферического контейнера. Яркое поле микроскопа изображение покровного стекла с типичными 1D нейрональных культур , используемых для стимуляции показано на фиг.8С. Белые линии показывают нейроны на узорных линий, которые ориентированы как по касательной и радиально для экспериментального сравнения и контроля на эффекте направленности.

Геометрия 1D культуры играет большую роль в определении того, будет ли культура огня в ответ на магнитную стимуляцию. Только 22% кольцевые культуры 1D ответил на магнитную стимуляцию. Успеха скорость возбуждения сильно зависит от линейной длины культуры, и как показано на рисунке 9A показывает, что более чем 60% культур, которые больше , чем 80 мм реагируют на магнитной стимуляции. Это означает, что особые условия необходимы для магнитного отклика. Для того, чтобы исследовать эту зависимость геометрических культуры Wпрежде чем выращенные в конфигурациях , которые являются частями колец - имеющие одинаковый радиус , но разной длины с помощью рисунка их дуг , а не на полных кругов (рис 8C)

Всестороннее исследование полевых порогов магнитных в зависимости от радиуса 1D кольцевых культур показано на фиг.. Белые кружки представляют экспериментальные измерения порогов стимуляции, в то время как цветовое кодирование обозначает расчетную вероятность для измерения порога возбуждения. Порог стимуляции определяется как самое слабое поле, которое до сих пор вызывает отклик для данной культуры нейронов.

9В подчеркивает тенденцию , что более крупные кольца имеют более низкие пороги стимуляции, с четкой обратной корреляцией между радиусом колец и порогом стимуляции. Например, в среднем 14 мм кольцо реагирует на НАМАГН.ПТEtic импульсы с амплитудой 1,5 T в то время как в среднем на 7 мм кольцо реагирует только на 3 Т или более. Это, как ожидается, от теоретического расчета индуцированного электрического поля, который изображен как цвет предсказал вероятность пожара. Действительно, электрическое поле, индуцированное 3Т на радиусе 7 мм равно, что индуцированное 1,5 T в два раза радиуса. Таким образом, среднее пороговое электрическое поле 301 ± 128 (стандартное отклонение) В / м, зависит от радиуса кольцевых культур.

В отличии от одной круговой катушки, которые не могут вызывать реакцию в 2D-культурах, 15 из 30 2D культур, которые были стимулированы путем вращения поля магнитной стимуляции ответили с разрывным нейрональным возбуждением. Две независимые катушки, которые расположены перпендикулярно друг к другу (фиг.8В) генерируют вращающихся магнитных и электрических полей , индуцированных. Каждая катушка подключена к своему собственному MS, оба из которых ДишаАРГ подобных токов при фазовом отставании в 90 градусов. Амплитуда электрического поля , создаваемого каждым из двух катушек в конфигурации поперечного катушки показана на фигуре 10А, и те же самые следы представлены на фиг.10В полярным представлением направления и амплитуды наложенного электрического поля обеих катушек , В результате чего индуцированное электрическое поле сканирует 270 градусов в реальном пространстве при максимальном поле ~ 270 В / м.

Рисунок 1
Рисунок 1: Схема установки Используется для электрической стимуляции нейронных культур. Требуемый сигнал вырабатывается генератором сигналов с двумя выходами, которые не имеют общую основу. Эти сигналы усиливаются, чтобы дать выходное напряжение до ± 30 В. Электрические сигналы затем подают через два отдельных пар электродов, стимулирующих нейронов культуры в ТВто ортогональны и независимое направление. Стимуляция нейронов может быть просмотрена и контролирует с помощью красителей кальция. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

фигура 2
Рисунок 2: Схема установки Используется для магнитной стимуляции нейрональных культур. A. На верхней показано на магнитную катушку (синие кружки), который расположен в 5 мм концентрично над нейрональной кольцевой культуры, помещенный в чашку Петри (синий контур). Катушка срабатывания (красный круг), расположенная по окружности чашки Петри измеряет напряжение, индуцированное магнитным импульс. На дне измеренной динамика магнитного стимулятора катушки показана (с использованием MS нагрузки конденсатора напряжения 5000 кВ), так как интегрирована с катушки съема. Индуцированное электрическое поле (CalculatEd для радиуса кольца 14 мм) изображается зеленым цветом, тогда как магнитное поле изображено синим В. Образы инвертированного микроскопа флуоресцентные красители, чувствительные к переходным процессам кальция нейронов, реагирующих на магнитные импульсы. C. Нейроны, выращенные на структуре концентрических колец, используются для эффективной стимуляции кольцевым магнитным стимулятором. D. Яркое полевое изображение микроскопа нейронов, выращенных на одной линии рисунка. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3
Рисунок 3: Примеры образцов 1D нейронных культур, используемых для ориентации электрического поля с направлением аксонального роста. A. Круговая диаграмма используется для круговой магнитной катушки, когда индуцированный элемент ctric поле имеет круговую ориентацию. Шаблоны Б. Линейные используется , когда индуцированный или прямое электрическое поле имеет единственную ориентацию.

Рисунок 4
Рисунок 4: Пример Следы транзиентов кальция изображаемых Во время синхронной сети очередей. А. Изображение нейронов , которые были окрашены в предыдущем эксперименте с красителем кальция. Б. Следы интенсивности в зависимости от времени из трансформирования в А с цветом следа , представляющего цвет границы ROI в A. Значительное увеличение интенсивности синхронизированы в течение трех трансформирования представляет собой сетевой взрыв. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

54357fig5.jpg»/>
Рисунок 5: Основные настройки для электрической стимуляции, с помощью одной пары параллельных ванной электродов Определить , что 2D культуры не имеют никакой предпочтительной ориентации электрической стимуляции. A. Устройство используется для стимуляции культуры. Электрическое поле создается путем подачи напряжения на платиновой проволоки электродов. Расстояние между двумя проводами составляет 13 мм. Б. Пример сигнала напряжения, подаваемого на электроды в A. Биполярная форма импульса помогает предотвратить электролиз раствора записи на электродах. С. При стимулировании культуры 2D в различных вращениях электродов, есть изотропность нейронального ответа. Д. Пример измерения электрического поля с использованием зонда , описанный в пункте 2.2. Электрическое поле однородно с погрешностью до 10%. Эта цифра была изменена с 5.загрузить / 54357 / 54357fig5large.jpg»цель =„_blank“> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 6
Рисунок 6: электростимуляция с двумя парами электродов Позволяет вращения электрического поля и для стимуляции в любом требуемом угле. А. Для того, чтобы производить более сложные формы электрического поля, необходимы две независимые пары электродов. В. Применение образного импульса напряжения косинуса с одним электродом и синусоидальной импульс второго электрода создает вращающееся электрическое поле с постоянной амплитудой. С. Применяя прямоугольный импульс напряжения для одной пары электродов создает однонаправленное однородное электрическое поле. Эта цифра была изменена с 5. Пожалуйста , клИк здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 7
Рисунок 7: Сеть Разъединение по Блокировка синаптических входов (как описано в разделе 2.4.2) позволяет вести наблюдение в общей численности населения отдельных клеток, которые стимулируются заданной электрическим полем. А. Применяя различные амплитуды импульсов напряжения до двух пар электродов, электрическое поле может быть ориентированно на каждый угол без необходимости вручную повернуть культуру. Б. Пример запись переходного кальция с электрической стимуляцией при различных напряжениях. Четыре трассы показана, слегка сдвинута по вертикали, чтобы позволить просмотр. Значения напряжений записываются под синим трассам. С. При применении постоянной длительности электрического поля, число нейронов , которые будут срабатывать в ответ на электрическое поле имеет кумулятивный DISTРебритная функция (CDF), которая является кумулятивным распределением Гаусса (или функцией erf) в зависимости от амплитуды напряжения (которая пропорциональна напряженности поля). D. Пример кривой силы-времени, полученной при использовании этого протокола. Этот показатель был изменен с 5 . Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 8
Рисунок 8: Конфигурация магнитной катушки и расчет индуцированного электрического поля. А. В верхней части круглая катушка (синие кружки) расположена на 5 мм выше одномерных культур нейронных колец (синий диск). Кольца параллельны и концентричны с катушкой, которая создает магнитный импульс, который ориентирован вдоль красных линий. От закон Фарадея, индуцированное электрическое поле лежит на плоскостях, параллельных катушки вдоль колец концентрических с ней. В нижней части представляет собой горизонтальный поперечный разрез по плоскости кольца культур. Относительная величина электрического поля имеет цветовое кодирование, с направлением, обозначенными стрелками. Большие кольца приложить большую площадь потока и, следовательно, электрическое поле, индуцированное там выше. Б. Изображение поперечного катушки магнитного стимулятора (сверху) и моделирование электрического поля, которая индуцируется ею. С. шаблон используется для выращивания нейронов , которые могут быть стимулированы либо с круговым электрическим полем или радиальным электрическим полем. Эта цифра была изменена с 21, 28. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

9" SRC = "/ файлы / ftp_upload / 54357 / 54357fig9.jpg" />
Рисунок 9: Реакция кольцо культур к магнитному полю. A. Уровень успешности стимуляции возрастает с радиусом культуры. Столбики ошибок обозначают стандартное отклонение (SE). В. Соотношение между размером кольца и напряженности магнитного поля изображено. Вероятность возбуждения культуры имеет цветовую маркировку. Действительно самый успешные возбуждения культур лежат в перекрытии между экспериментально доступным фазовым пространством (белым прямоугольником) и областью с высокой вероятностью (красной). Эта цифра была изменена с 21. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 10
Рисунок 10: вращающееся магнитное поле настройки поля. </ сильный> А. Для того , чтобы вызвать вращающееся электрическое поле при стимуляции с кросс-катушки магнитного стимулятора, фазовый сдвиг 90 градусов необходим между двумя катушками. Показана электрическое поле, индуцированное в катушке захвата, расположенной на 2 соседних крыльев катушки листа клевера. Катушки были вытеснены отдельно 2 коммерческих стимуляторы. Б. реконструкция, используя кривые , показанные на A, полученные в результате амплитуды электрического поля и направление во время импульса катушки листа клевера. Эта цифра была изменена с 21, 28. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

1D является важным инструментом, который может быть использован для различных приложений. Например, мы использовали паттерн 1D для создания логических вентилей из нейронных культур 29 и более недавно для измерения Chronaxie и Rheobase нейронов гиппокампа крысы 5 и замедления скорости распространения сигнала активности обжига в нейронах гиппокампа с синдромом Дауна по сравнению с Нейроны гиппокампа дикого типа (WT) 27 . Предлагаемый протокол для 1D-паттерна является надежным и легко сформировать любую желаемую схему. Мы предлагаем наблюдать 1D-культуру до того, как измерения будут знать о возможных разъединениях сети, что может повлиять на ее работу.

Химическое структурирование нейронных конфигураций имеет выдающуюся историю 30 , 31 , 32 . Мы обнаружили, что наш подход даетСхожего с химическим структурированием, но они более надежны и легче достижимы. Недавно выбор для микрожидкостного паттерна нейронов стал интересной альтернативой предлагаемому нами подходу, со сравнимой простотой и простотой использования 33 , 34 . Микрожидкостный подход используется в нашей лаборатории параллельно с описанным здесь методом травления.

Как мы показали 5 , двумерные культуры не имеют предпочтительной ориентации и их стимуляция изотропна и не зависит от ориентации применяемого поля. Для стимуляции двумерных культур, когда поле вращается, необходимы более короткие длительности. Напротив, культуры 1D очень сильно зависят от ориентации поля. Когда поле ориентировано с узором (и, следовательно, с направлением роста аксона), продолжительность поля фиксированной амплитуды, необходимого для стимуляции, намного короче, чем при ориентации поляред перпендикулярно к образцу. Точно так же, если длительность сохраняется постоянной, то поле, необходимое для возбуждения культуры меньше, если поле и структура параллельны. При стимуляции перпендикулярно, пульс поле должно быть гораздо больше (в порядке миллисекунды, когда сеть отключена), а затем в основном дендриты стимулируются. Когда электрические поля (либо прямые или индуцированное магнитное поле) используются для стимуляции мозга, это имеет крайне важное значение. Если область мозга мишень, как известно, имеют пучки аксонов, эти аксоны могут быть возбуждены ориентирующим поле в их направлении, а затем необходимо меньше энергии, или более короткую продолжительность поля для стимуляции. Если область мозга мишень не имеет предпочтительную ориентацию, то вращающееся поле является более эффективным для стимуляции. Если дендриты являются мишенью стимуляции, более длинные импульсы являются более эффективными.

Магнитные поля могут стимулировать активность нейронов, когда магнитный импульс яnduces электрического поля, которое возбуждает нейроны. Поскольку в настоящее время достижимые магнитные импульсы длительности микросекунды, дендриты, чье время отклика порядка миллисекунд, как ожидается, не чувствительны к магнитной стимуляции. В противоположность этому , аксонов, чей время отклика быстрее, являются мишенью стимуляции 2, 3. Реакция аксонов к электрическому возбуждению является максимальной , когда они параллельны электрическим полем , и уменьшается , когда они находятся перпендикулярно к ней 1, 35; Таким образом, в магнитном возбуждении, мы стремиться к созданию систем, где индуцированное электрическое поле ориентирует параллельно целевые аксоны. Таким образом, при стимуляции 1D кольцо, поле должно быть ориентировано параллельно аксонов, а размер кольца определяет порог стимуляции. Аналогично для прямой стимуляции ванны электродов, чтобы стимулировать 2D культуру, вращающийся индуцированный еLectric поле является гораздо более эффективным.

Сочетание паттерна нейронов и внешнего возбуждение с электрическим или магнитным полем является мощной технологией с большим количеством возможных будущими приложениями. Хроноксии и реобазы, а также порог активации и распространение активации динамики и скорости все параметры, которые говорят о внутренних свойствах нейронов культуры. В частности, терапевтические процедуры и эффект от лекарственных средств или медикаментозного лечения могут быть немедленно протестированы непосредственно на нейронах. Это позволило бы эффективное обследование обоих модельных нейронов заболеваний и протоколов для TMS стимуляции. На более концептуальное направлении, способность стимулировать нейронные культуры именно приводит к новым возможностям в отношении обработки информации аспектов нейронных конфигураций и позволяет предусмотреть микро напечатанной схему, которая сочетает в себе электронную стимуляцию с живыми нейронных сетей для обеспечения нового вычисленияAl устройства и новые мозговые взаимодействия устройств.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Acknowledgments

Авторы благодарят Офер Фейнерман, Фред Вольф, Менахем Сегал, Андреас Неф и Эйтан Ревени за очень полезные обсуждения. Авторы благодарят Илан Брескин и Хорди Сориано~d для разработки ранних версий технологии. Авторы благодарят Цви Тлустого и Жан-Пьер Экмана за помощью теоретических концепций. Это исследование было поддержано Минервом Фондом, Министерство науки и техники, Израиль, и грантом Израиля научного фонда 1320/09 и грант Bi-National Science Foundation 2008331.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
APV Sigma-Aldrich A8054 Disconnect the network. Mentioned in Section 2.4.2
B27 supp Gibco 17504-044 Plating medium. Mentioned in Section 1.1.1
bicuculline Sigma-Aldrich 14343 Disconnect the network. Mentioned in Section 2.4.2
Borax (sodium tetraborate decahydrate) Sigma-Aldrich S9640 Borate buffer. Mentioned in Section 1.1.2
Boric acid Frutarom LTD 5550710 Borate buffer. Mentioned in Section 1.1.2
CaCl2 , 1 M Fluka  21098 Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2
CNQX Sigma-Aldrich C239 Disconnect the network. Mentioned in Section 2.4.2
COMSOL COMSOL Inc Multiphysics 3.5 Numerical simulation. Mentioned in Section 3.5.2
D-(+)-Glucose, 1 M Sigma-Aldrich 65146 Plating medium, Extracellular recording solution. Mentioned in Sections 1.1.1 and 1.5.2
D-PBS Sigma-Aldrich D8537 Cell Cultures. Mentioned in Sections 1.2.4 and 1.2.6
FCS (FBS) Gibco 12657-029 Plating medium. Mentioned in Section 1.1.1
Fibronectin Sigma-Aldrich F1141 Bio Coating. Mentioned in Section 1.2.6
Fluo4AM Life technologies F14201 Imaging of spontaneous or evoked activity. Mentioned in Sections 1.5.1, 1.5.3, and 1.5.5
FUDR Sigma-Aldrich F0503 Changing medium. Mentioned in Section 1.4.1
Gentamycin Sigma-Aldrich G1272 Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Section 1.1.1
GlutaMAX 100x Gibco 35050-038 Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Section 1.1.1
Hepes, 1 M Sigma-Aldrich H0887 Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2
HI HS BI 04-124-1A Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Sections 1.1.1, 1.4.1, and 1.4.2
KCl,  3 M Merck 1049361000 Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2
Laminin  Sigma-Aldrich L2020 Bio Coating. Mentioned in Section 1.2.6
MEM x 1 Gibco 21090-022 Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Section 1.4.1    1.4.2
MgCl2 , 1 M Sigma-Aldrich M1028 Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2
NaCl, 4 M Bio-Lab 19030591 Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2
Octadecanethiol Sigma-Aldrich 01858 Cleaning Cr-Au coated coverslips (1D cultures). Mentioned in Section 1.2.3
Pluracare F108 NF Prill BASF Corparation  50475278 Bio-Rejection Coating, Bio Coating. Mentioned in Sections 1.2.4 and 1.2.6
Poly-L-lysine 0.01% solution  Sigma-Aldrich  P47075 Promote cell division. Mentioned in Section 1.1.4
Sucrose, 1 M Sigma-Aldrich S1888 Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2
Thiol  Sigma-Aldrich 1858 Bio-Rejection Coating. Mentioned in Section 1.2.3
URIDINE Sigma-Aldrich U3750 Changing medium. Mentioned in Section 1.4.1
Sputtering machine AJA International, Inc ATC Orion-5Series  coating glass with thin layers of metal. Mentioned in Section 1.2.2
Pen plotter  Hewlett Packard  HP 7475A Etching of pattern to the coated coverslip. Mentioned in Section 1.2.5
Electrodes wires  A-M Systems, Carlsborg WA 767000 Electric stimulation of neuronal cultures. Mentioned in Sections 2.1, 2.2, 2.3, and 2.4.5
Signal generator BKPrecision 4079 Shaping of the electric signal. Mentioned in Section 2.3
Amplifier Homemade Voltage amplification of the signal from the signal generator to the electrodes. Mentioned in Section 2.3
Power supply Matrix  MPS-3005 LK-3  Power supply to the sputtering machine. Mentioned in Section 1.2.2.3
Transcranial magnetic stimulation Magstim, Spring Gardens, UK Rapid 2 Magnetic stimulation of neuronal culture. Mentioned in Sections 3.1, 3.3, and 3.4
Epoxy Cognis Versamid 140 Casting of homemade coils. Mentioned in Section 3.4
Epoxy Shell EPON 815  Casting of homemade coils. Mentioned in Section 3.4
Platinum wires 0.005'' thick; A-M Systems,   Carlsborg WA  767000 Electric stimulation of neuronal cultures. Mentioned in Section 2.1
Circular magnetic coil Homemade Magnetic stimulation of neuronal culture. Mentioned in Section 3.3
WaveXpress SW B&K Precision  Waveform editing software. Mentioned in Section 2.1.32
Xion Ultra 897 Andor Sensitive EMCCD camera. Mentioned in Section 2.4.4

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nagarajan, S. S., Durand, D. M., Warman, E. N. Effects of induced electric fields on finite neuronal structures: a simulation study. IEEE Trans Biomed Eng. 40 (11), 1175-1188 (1993).
  2. Nowak, L. G., Bullier, J. Axons but not cell bodies, are activated by electrical stimulation in cortical gray matter. II. Evidence from selective inactivation of cell bodies and axon initial segments. Exp Brain Res. 118 (4), 489-500 (1998).
  3. Ranck, J. B. Which elements are excited in electrical stimulation of mammalian central nervous system: a review. Brain Res. 98 (3), 417-440 (1975).
  4. Rattay, F. The basic mechanism for the electrical stimulation of the nervous system. Neuroscience. 89 (2), 335-346 (1999).
  5. Stern, S., Agudelo-Toro, A., Rotem, A., Moses, E., Neef, A. Chronaxie Measurements in Patterned Neuronal Cultures from Rat Hippocampus. PLoS One. 10 (7), e0132577 (2015).
  6. Brunelin, J., et al. Examining transcranial direct-current stimulation (tDCS) as a treatment for hallucinations in schizophrenia. Am J Psychiatry. 169 (7), 719-724 (2012).
  7. Cruccu, G., et al. EFNS guidelines on neurostimulation therapy for neuropathic pain. Eur J Neurol. 14 (9), 952-970 (2007).
  8. Kennedy, S. H., et al. Canadian Network for Mood and Anxiety Treatments (CANMAT) Clinical guidelines for the management of major depressive disorder in adults. IV. Neurostimulation therapies. J Affect Disord. 117, Suppl 1. S44-S53 (2009).
  9. Minzenberg, M. J., Carter, C. S. Developing treatments for impaired cognition in schizophrenia. Trends Cogn Sci. 16 (1), 35-42 (2012).
  10. Vaidya, N. A., Mahableshwarkar, A. R., Shahid, R. Continuation and maintenance ECT in treatment-resistant bipolar disorder. J ECT. 19 (1), 10-16 (2003).
  11. Bartlett, W. P., Banker, G. A. An electron microscopic study of the development of axons and dendrites by hippocampal neurons in culture. II. Synaptic relationships. J Neurosci. 4 (8), 1954-1965 (1984).
  12. Bartlett, W. P., Banker, G. A. An electron microscopic study of the development of axons and dendrites by hippocampal neurons in culture. I. Cells which develop without intercellular contacts. J Neurosci. 4 (8), 1944-1953 (1984).
  13. Beggs, J. M., Plenz, D. Neuronal avalanches in neocortical circuits. J Neurosci. 23 (35), 11167-11177 (2003).
  14. Breskin, I., Soriano, J., Moses, E., Tlusty, T. Percolation in living neural networks. Phys Rev Lett. 97 (18), (2006).
  15. Feinerman, O., Moses, E. Transport of information along unidimensional layered networks of dissociated hippocampal neurons and implications for rate coding. J Neurosci. 26 (17), 4526-4534 (2006).
  16. Soriano, J., Rodriguez Martinez,, Tlusty, M., T,, Moses, E. Development of input connections in neural cultures. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (37), 13758-13763 (2008).
  17. Deisseroth, K. Optogenetics. Nat Methods. 8 (1), 26-29 (2011).
  18. Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. The development and application of optogenetics. Annu Rev Neurosci. 34, 389-412 (2011).
  19. Williams, S. C., Deisseroth, K. Optogenetics. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (41), 16287 (2013).
  20. Rotem, A., Moses, E. Magnetic stimulation of curved nerves. IEEE Trans Biomed Eng. 53 (3), 414-420 (2006).
  21. Rotem, A., Moses, E. Magnetic stimulation of one-dimensional neuronal cultures. Biophys J. 94 (12), 5065-5078 (2008).
  22. Feinerman, O., Moses, E. A picoliter 'fountain-pen' using co-axial dual pipettes. J Neurosci Methods. 127 (1), 75-84 (2003).
  23. Feinerman, O., Segal, M., Moses, E. Signal propagation along unidimensional neuronal networks. J Neurophysiol. 94 (5), 3406-3416 (2005).
  24. Papa, M., Bundman, M. C., Greenberger, V., Segal, M. Morphological analysis of dendritic spine development in primary cultures of hippocampal neurons. J Neurosci. 15 (1 Pt 1), 1-11 (1995).
  25. Bikson, M., et al. Effects of uniform extracellular DC electric fields on excitability in rat hippocampal slices in vitro. J Physiol. 557 (1), 175-190 (2004).
  26. Rahman, A., et al. Cellular effects of acute direct current stimulation: somatic and synaptic terminal effects. J Physiol. 591 (10), 2563-2578 (2013).
  27. Stern, S., Segal, M., Moses, E. Involvement of Potassium and Cation Channels in Hippocampal Abnormalities of Embryonic Ts65Dn and Tc1 Trisomic Mice. EBioMedicine. 2 (9), 1048-1062 (2015).
  28. Rotem, A., et al. Solving the orientation specific constraints in transcranial magnetic stimulation by rotating fields. PLoS One. 9 (2), e86794 (2014).
  29. Feinerman, O., Rotem, A., Moses, E. Reliable neuronal logic devices from patterned hippocampal cultures. Nat Phys. 4 (12), 967-973 (2008).
  30. Kleinfeld, D., Kahler, K. H., Hockberger, P. E. Controlled outgrowth of dissociated neurons on patterned substrates. J Neurosci. 8 (11), 4098-4120 (1988).
  31. Bugnicourt, G., Brocard, J., Nicolas, A., Villard, C. Nanoscale surface topography reshapes neuronal growth in culture. Langmuir. 30 (15), 4441-4449 (2014).
  32. Roth, S., et al. Neuronal architectures with axo-dendritic polarity above silicon nanowires. Small. 8 (5), 671-675 (2012).
  33. Peyrin, J. M., et al. Axon diodes for the reconstruction of oriented neuronal networks in microfluidic chambers. Lab Chip. 11 (21), 3663-3673 (2011).
  34. Renault, R., et al. Combining microfluidics, optogenetics and calcium imaging to study neuronal communication in vitro. PLoS One. 10 (4), e0120680 (2015).
  35. Roth, B. J., Basser, P. J. A model of the stimulation of a nerve fiber by electromagnetic induction. IEEE Trans Biomed Eng. 37 (6), 588-597 (1990).

Tags

Нейронаука выпуск 123 нейронные сети электрическое стимулирование магнитная стимуляция хроноксия реобазы визуализация кальция узорчатые культуры
Внешнее возбуждение Нейроны Использование электрических и магнитных полей в одно- и двумерных культур
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Stern, S., Rotem, A., Burnishev, Y., … More

Stern, S., Rotem, A., Burnishev, Y., Weinreb, E., Moses, E. External Excitation of Neurons Using Electric and Magnetic Fields in One- and Two-dimensional Cultures. J. Vis. Exp. (123), e54357, doi:10.3791/54357 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter